KR102088767B1 - 혼합물 4f를 이용한 줄기세포 생물학적 활성 증가용 조성물 - Google Patents

혼합물 4f를 이용한 줄기세포 생물학적 활성 증가용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혼합물 4F를 이용한 줄기세포 생물학적 활성 증가용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 혼합물 4F를 처리한 줄기세포는 미분화 특성(stemness)을 획득할 뿐만 아니라 세포증식능 및 이동능을 향상시키는 효과가 있어, 줄기세포를 체내에 이식한 후 세포 생존 및 생착률을 향상시키고 혈관 및 조직 재생능을 보다 높일 수 있는바, 줄기세포 분화, 허혈성 질환 예방 또는 치료 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.

Description

혼합물 4F를 이용한 줄기세포 생물학적 활성 증가용 조성물{Composition for increasing stem cell biologic activity using mixture 4F}
본 발명은 혼합물 4F를 이용한 줄기세포 생물학적 활성 증가용 조성물에 관한 것이다.
심장 질환, 뇌혈관 질환, 말초 혈관성 질환 등의 허혈성 혈관 질환은 40%의 높은 유병률을 가지며 세계적으로 가장 사망률이 높은 질환 중 하나이다. 이에 대한 기존의 주된 치료방법은 약물 투여 중심의 내과적 치료법과 혈관에 대한 기계적인 중개적 치료 및 외과적인 우회수술치료 세 가지이나 이러한 치료를 모두 시행하여도 산소 및 양분의 원활한 공급이 일어나지 않은 허혈 조직의 제한적인 재생으로 인하여 만족스러운 치료가 불가능한 경우가 적지 않은 실정이다. 때문에 현재 의학기술로 치료가 불가능한 광범위한 혈관 질환의 경우 대안 치료로 허혈 부위 주변의 조직으로부터 혈관신생을 촉진하여 허혈조직의 혈류를 확보하고 조직손상을 줄이고자 하는 혈관신생 치료법이 제안되고 있다.
세포로 이루어진 혈관조직의 형성을 위해서는 혈관을 만드는 세포의 공급이 필요하다. 따라서 치료전략으로 혈관신생 촉진인자를 직접 또는 이의 유전자를 투여하여 혈관내피세포의 증식 및 발달을 촉진하는 방법이 다수 진행되고 있으나 그 효과가 미비하며 여러 부작용 및 안전성 문제가 제기되어 실절적인 도입까지는 더 많은 연구가 필요한 실정이다.
한편, 혈관내피전구세포는 손상된 혈관 수복 및 허혈성 조직재생에 이미 그 효과가 입증된 세포로 발견 후 현재에 이르기까지 혈관을 만드는 세포를 직접 투여함으로써 혈관신생을 촉진하고자 하는 연구가 다양하게 시도되고 있다. 현재 줄기세포를 이용한 혈관신생 및 재생 분야에서는 임상적용을 위해 성체줄기세포를 이용하고 있는데 환자 자신의 몸에서 추출하여 필요한 조직에 자가 이식이 가능하며 배아줄기세포와 비교하여 윤리적 문제가 없다는 장점을 가지고 있다. 하지만 서구화된 식생활과 운동의 감소, 고령화 등으로 인한 환자유래 세포의 노화 및 기능저하로 인하여 실용화 단계로 이어지는데 어려움이 있다. 때문에 줄기세포의 증폭 및 생물활성 증진을 위한 연구는 세포 치료 실용화를 위한 핵심 요소로서 이를 위해 인체에 안전한 기능강화 인자들을 발굴하고 각 인자들의 작용기전을 분석하여 기능적으로 보다 더 우수한 줄기세포를 수급할 수 있는 시스템을 갖추는 것이 필요하며, 이러한 요구에 최근 줄기세포 치료제 실용화를 위한 세포기능강화 연구가 활발히 진행되고 있는 추세이다. 유전자 도입을 이용한 연구는 특정 유전자의 증폭 및 결손을 통해 세포의 기능을 향상시키는 방법으로 그 안정성에 대한 추가적인 연구가 필요하다.
이에 본 발명자들은 전술한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자를 포함하는 혼합물 4F를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 노화 억제, 증식 촉진 또는 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물을 줄기세포에 처리하는 단계;를 포함하는 무이종 배양방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 치료 보조제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 노화 억제, 증식 촉진 또는 분화 유도용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물을 줄기세포에 처리하는 단계;를 포함하는 무이종 배양방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 치료 보조제를 제공한다.
본 발명에 따른 혼합물 4F를 처리한 줄기세포는 미분화 특성(stemness)을 획득할 뿐만 아니라 세포증식능 및 이동능을 향상시키는 효과가 있어, 줄기세포를 체내에 이식한 후 세포 생존 및 생착률을 향상시키고 혈관 및 조직 재생능을 보다 높일 수 있는바, 줄기세포 분화, 허혈성 질환 예방 또는 치료 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 혼합물 4F가 세포의 표현형에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 혼합물 4F의 처리에 따른 세포 이동능을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 하지허혈 동물모델에서 본 발명에 따른 혼합물 4F의 혈관 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 중증 심근경색 동물모델에서 본 발명에 따른 혼합물 4F의 심기능 증진 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 혼합물 4F에 처리에 따른 세포주기의 변화, 세포 노화 및 콜로니 형성능을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 혼합물 4F 처리에 따른 미분화 줄기세포 관련 마커의 유전자 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 혼합물 4F 처리에 따른 미분화 줄기세포의 사멸률을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 혼합물 4F 처리에 따른 미분화 줄기세포의 증식률 및 마커 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 혼합물 4F 또는 단일 성분 처리에 따른 마커 발현을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 10은 본 발명의 혼합물 4F 또는 단일 성분 처리에 따른 혈관형성능을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 11은 본 발명에 따른 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법을 간략히 나타내는 도이다.
도 12는 본 발명에 따른 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 혈관줄기세포의 형태학적 특성을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 13은 본 발명에 따른 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 혈관줄기세포의 미분화 줄기세포 관련 마커의 유전자 발현을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 14는 본 발명에 따른 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 혈관줄기세포의 증식능, 세포주기 변화 및 콜로니 형성능을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 15는 본 발명에 따른 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 혈관줄기세포와 대조군 세포의 유전학적 유사성을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 16은 본 발명에 따른 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 혈관줄기세포와 대조군 세포의 유전자 온톨로지 및 카테고리를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 17은 본 발명에 따른 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 혈관줄기세포와 대조군 세포의 유전자 발현 패턴을 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 18은 본 발명에 따른 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 혈관줄기세포의 혈관형성능을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 19는 본 발명에 따른 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 혈관줄기세포의 주변분비 혈관형성 효과를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 20 및 21은 본 발명에 따른 하지허혈 동물모델에서 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 혈관줄기세포의 혈관 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 노화 억제, 증식 촉진 또는 분화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, “혼합물 4F”는 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자의 혼합물을 의미한다.
본 발명에 있어서, "줄기세포"는 자기복제능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. 상기 줄기세포는 목적에 따라 적절히 제한 없이 선택될 수 있으며, 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터 유래된 공지된 모든 조직, 세포 등의 성체 세포로부터 유래할 수 있으며, 예를 들어, 골수, 제대혈, 태반(또는 태반 조직세포), 지방(또는 지방조직 세포) 등으로부터 유래할 수 있다. 예컨대, 상기 줄기세포는 골수, 지방 조직, 근육 조직, ex vivo 배양된 자기조직 간엽 줄기 세포, 동종 이계 간엽 줄기 세포, 제대혈, 배 난황낭, 태반, 제대, 골막, 태아 및 사춘기 피부, 그리고 혈액으로부터 제한없이 얻어지는 줄기세포일 수 있으며, 태아 또는 출생직후 또는 성인으로부터 유래된 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 상기 줄기세포는 혈관내피 전구세포(Endothelial Progenitor Cell), 혈관 줄기세포(Angiogenic Stem Cell), 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell), 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell), 근모세포(Myoblast) 및 심장줄기세포(Cardiac Stem Cell)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 혈관내피 전구세포(Endothelial Progenitor Cell) 또는 혈관 줄기세포(Angiogenic Stem Cell)이며, 가장 바람직하게는 혈관내피 전구세포(Endothelial Progenitor Cell)이다.
본 발명에 있어서, "노화(senescence)"는 줄기세포가 내부 혹은 외부로부터 받는 다양한 스트레스(예를 들어 연속되는 계대 배양 및 체외 배양시의 고농도의 산소 조건 등)에 대항하여, 세포 성장(cell growth) 및 세포 분열이 정지되거나 유의성 있게 지연되는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, "증식(proliferation)"은 특징적인 세포 유형, 또는 동일할 수 있거나 동일하지 않을 수 있는 세포의 시원 세포 집단으로부터의 세포 유형들의 개수의 증가를 의미한다. 증식을 위해 사용되는 시원 세포는 증식으로부터 생성된 세포와 동일하지 않을 수 있다.
본 발명에 있어서, "분화 유도(differentiation induction)"는 줄기세포에서 특정세포로 완전히 분화가 유도된 경우뿐만 아니라 줄기세포에서 특정세포로의 완전 분화되기 전 중간 단계에서 형성되는 배아유사구조체(embryonic body)의 형성도 포함하는 것이다.
본 발명의 구체예에서, 분화는 혈관신생일 수 있다.
본 발명에 있어서, "혈관신생(angiogenesis)"은, 혈관이 새로 형성되는 과정, 즉, 새로운 혈관이 세포, 조직 또는 기관 내로 발생 및 분화하는 것을 의미한다.
본 발명의 혈관신생은, 내피 세포 활성화, 이동, 증식, 매트릭스 재형성 및 세포 안정화를 비롯한 혈관 형성 과정에 관련된 혈관재생, 혈관회복 및 혈관분화를 포함한다.
혈관 손상으로 인한 허혈성 조직을 회복을 위해서는 새로운 혈관신생 작용이 필수적이다. 기존에 존재하는 혈관 내피세포의 증식만으로는 새로운 혈관신생 및 회복이 불충분하기 때문에 골수로부터 유래된 혈관 줄기세포가 허혈 부위로 동원되어 혈관 수복에 작용하는 것은 혈관신생 과정에서 가장 중요하다.
본 발명에 따르면, 상기 조성물은 골수에서 허혈조직으로의 혈관 줄기세포의 동원을 증진시키고, 혈관 내피세포와의 결합능을 향상시키며, 혈관으로의 분화능을 향상시킨다.
본 발명에 있어서, “후코이단(Fucoidan)”은 기본당인 후코스(fucose) 및 황산기가 결합된 다당류로, 갈조류에 다량 포함되어 있다. 상기 후코이단은 후코이단이 혈액응고방지작용, 항종양작용, 위궤양 치료 촉진작용, 항균작용, 혈압상승억제작용, 간세포증식인자(HGF)생산유도, 혈당상승억제작용, 면역세포조절작용, 항알레르기작용, 항바이러스작용이 있다고 알려져 있다.
본 발명의 구체예에서, 후코이단은 하기 화학식 1로 표시되는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
Figure 112019070267860-pat00001
본 발명의 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 후코이단은 1 내지 300nM 범위의 농도이고, 보다 바람직하게는 50 내지 250nM 범위의 농도이고, 가장 바람직하게는 150nM의 농도이다.
본 발명에 있어서, “타우로우루소데옥시콜산(Tauroursodeoxycholic acid, TUCDA)”는 우르소데옥시콜산(UDCA)의 타우린 접합체를 의미하며, 담석, 간경변, 헌팅턴병, 파킨슨병 및 뇌졸중 등의 치료에 유익하다고 알려져 있다.
본 발명의 구체예에서, 타우로우루소데옥시콜산은 하기 화학식 2로 표시되는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
Figure 112019070267860-pat00002
본 발명의 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 타우로우루소데옥시콜산을 2.5 내지 250μM의 농도로 포함하며, 바람직하게는 12.5 내지 50μM 범위의 농도이고, 보다 바람직하게는 17.5 내지 35μM의 범위이며, 가장 바람직하게는 25μM의 농도이다.
본 발명에 있어서, “올리유로핀(oleuropein)”은 올리브 열매 및 올리브 잎에 존재하는 폴리페놀을 의미한다.
본 발명의 구체예에서, 올리유로핀은 하기 화학식 3로 표시되는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
Figure 112019070267860-pat00003
본 발명의 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 올리유로핀을 0.05 내지 5μM의 농도로 포함하며, 바람직하게는 0.25 내지 1μM의 범위이며, 보다 바람직하게는 0.35 내지 0.7μM의 범위이며, 가장 바람직하게는 0.5μM의 농도이다.
본 발명에 있어서, “혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)”는 혈관 형성을 자극하는 세포에 의해 생성되는 신호 단백질을 의미한다. 상기 혈관내피성장인자는 맥관 형성(vasculogenesis) 및 혈관 신생(angiogenesis)에 관여한다.
본 발명의 구체예에서, 혈관내피성장인자는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C 및 PIGF로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 혈관내피성장인자를 0.1 내지 10nM 농도로 포함하며, 바람직하게는 1 내지 5nM의 범위이며, 가장 바람직하게는 2.5nM의 농도이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, “허헐성 질환”은 혈관의 수축 또는 폐색에 의해 유발되는 신체기관, 조직 또는 부위로의 혈액공급의 감소로 인하여 발생하는 질환을 의미한다. 상기 조직 또는 부위의 허혈 후에는 혈액의 재관류(reperfusion)가 일어나더라도 신경세포가 손상되어 여러 가지 후유증을 야기하며, 궁극적으로 비가역적인 손상, 즉 세포 및 조직의 괴사로 이어진다. 상기 허혈성 질환은 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 허혈성 대머리, 허혈성 뇌졸중 및 허혈성 하지질환으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 보다 바람직하게는 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 뇌졸중 및 허혈성 하지질환으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 허혈성 심근경색 또는 허혈성 하지질환일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자와 함께 허혈성 질환에 대하여 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 실제 임상투여 시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 이용하는 것이 바람직하다.
상기 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 또한, 상기 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자는 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있으며, 통상의 방법에 의해 제조되는 모든 염, 수화물 및 용매화물이 포함된다.
염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가 염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼 화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로아이오딕산 등을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
상기 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 상기 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며 당업계에서 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 상기 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 상기 약학적 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 그 방식에 있어 특별히 제한되지 아니하며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 상기 비경구 투여 방식으로는 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등이 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물은 허혈성 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, '배지(media)'는 체외배양 조건에서 줄기세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배양액을 의미하고, 줄기세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 또한, 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium; CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, MEM( Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체예에서, 본 발명의 배지 조성물은 기존 배양배지 내 첨가되는 사이토카인이나 성장인자 및 동물혈청(FBS)를 배제한 무이종(xeno-free) 배지인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양용 배지 조성물을 줄기세포에 처리하는 단계;를 포함하는 무이종 배양방법을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 줄기세포는 혈관내피 전구세포(Endothelial Progenitor Cell), 혈관 줄기세포(Angiogenic Stem Cell), 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell), 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell), 근모세포(Myoblast) 및 심장줄기세포(Cardiac Stem Cell)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 혈관내피 전구세포(Endothelial Progenitor Cell) 또는 혈관 줄기세포(Angiogenic Stem Cell)이며, 가장 바람직하게는 혈관내피 전구세포(Endothelial Progenitor Cell)이다.
본 발명에 따른 무이종 배양방법으로 배양된 줄기세포는 미분화 특성(stemness)을 획득할 뿐만 아니라 혈관신생, 세포증식능 및 이동능을 향상시키는 효과가 있어, 혈관내피 전구세포를 체내에 이식한 후 세포 생존 및 생착률을 향상시키고 혈관 및 조직 재생능을 보다 높일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 치료 보조제를 제공한다.
본 발명에 있어서, "세포 치료제"는 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아 있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 여타 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등 일련의 행위를 통하여 치료, 진단, 예방 목적으로 사용되는 의약품을 말하며, 특히 "줄기세포 치료제" 배아줄기세포 치료제와 성체줄기세포 치료제로 분류할 수 있다.
본 발명에 있어서, "줄기세포 치료 보조제"는, 당업계에서 일반적으로 사용되는 줄기세포 치료제의 효과를 증진시키기 위하여 보조적으로 사용될 수 있는 제재를 말하며, 본 발명의 조성물을 사용함으로써 줄기세포 치료제의 줄기세포의 노화 억제 및 증식을 촉진하여 치료제의 효과를 향상시킬 수 있다.
상기 줄기세포 치료 보조제는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 인체에 투여될 수 있다.
비경구 투여, 예를 들어 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 줄기세포 치료 보조제는 또한 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 줄기세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 투여될 수 있으며, 이런 담체로 생리학적 식염수를 예로 들 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 줄기세포 치료는 허혈성 질환 치료이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 혼합물 4F의 제조
후코이단(150nM), 타우로우루소데옥시콜산(25μM), 올리유로핀(0.5μM) 및 혈관내피성장인자(2.5nM)(recombinant human VEGF165, 카탈로그 넘버 100-20)를 혼합하여 혼합물 4F를 제조하였다. 후술되는 실시예에서는 기존 배양배지에 첨가하였던 b-FGF, IGF, EGF, 아스코르브산은 사용하지 않고 기본 배지(EndoGo XF media; Bological Industries, 카탈로그 넘버 05-400-1A)에 4F만을 추가하여 실험에 이용하였다.
실시예 2. 혼합물 4F 처리에 따른 혈관내피 전구세포의 형태학적 특성 확인
4F 처리가 세포 표현형에 미치는 영향을 알아보고자 주요 세포 표지자들을 크게 미분화 마커(stem cell marker)와 내피세포 계열 마커(Endothelial lineage marker)로 나누어 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다. 구체적으로, 제대혈 유래 혈관내피전구세포(L-EPC)에 혼합물 4F(Fucoidan, TUDCA, Oleuropein, VEGF)를 혈관내피세포 배양용 기본배지(EBM2, Lonza)에 5%의 FBS, 1%의 페니실린/스트렙토마이신과 함께 추가하여 다양한 기간 조건으로 처리한 후 미분화 마커(CD34, CD90, c-kit, CXCR4), 내피세포 계열 마커(Tie2, CD31)의 발현을 유세포 분석기(flowcytometry)를 이용하여 분석하였다. 결과의 재현성 검증을 위해 5명 산모 유래 제대혈에서 L-EPC를 분리·배양(n=5)하여 각 마커의 발현을 확인하였다. 혼합물 4F 처리에 따른 혈관내피 전구세포의 형태학적 특성을 확인한 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 혼합물 4F 처리일수 의존적으로 미분화 마커를 발현하는 세포군과, 미분화 성격을 지니며 동시에 내피세포 계열의 뚜렷한 분화 마커를 발현하는 세포군이 크게 증가함을 확인하였다. 이를 통해 혼합물 4F의 처리가 본래 세포가 가지는 내피세포 계열의 분화적 특성을 유지하는 동시에 미분화 특성(stemness)만을 증가시킴으로써 내피세포와 유사한 표현형 및 기능을 가지며 그 상위단계로서 내피세포로의 단분화능을 가진다고 알려진 혈관줄기세포의 특징을 보다 더 획득함을 확인하였다.
실시예 3. 혼합물 4F 처리에 따른 세포 이동능 확인
4F 처리일수 의존적으로 줄기세포의 이동능을 조절한다고 알려져 있는 CXCR4의 발현 증가를 확인하였으므로, 이를 토대로 CXCR4의 리간드인 SDF-1α를 이용하여 혈관형성 및 재생에 필수 과정인 세포 이동능을 분석하였다. 구체적으로, 케모카인 자극에 의한 세포 이동능을 분석하기 위해 트랜스웰 이동 분석(transwell migration assay)을 실시하였다. 실험 그룹별 세포(5x104 cells)가 시딩된 8.0μm 메쉬 멤브레인 인서트를 배양 플레이트에 삽입하고 하부에 세포 이동을 자극하는 케모카인인 SDF-1α(100ng/ml)를 첨가한 후 배양하였다. 6시간 후 하부의 SDF-1α 자극에 의해 메쉬 멤브레인의 포어(pore)를 빠져나온 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 이동한 세포를 계수하였다. SDF-1α는 허혈조직에서 분비되어 혈관 및 조직 재생에 관여하는 세포들을 리쿠르팅하는 주요 사이토카인이다. 혼합물 4F 처리에 따른 세포의 이동능을 확인한 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 세포의 이동능이 혼합물 4F의 프라이밍에 의해 대조군 대비 유의적으로 증가하였다. 또한 특정 자극 없이 진행한 음성 대조군은 양성 대조군과 유사한 수준의 이동능이 관찰되었으나 혼합물 4F 처리에 따른 SDF-1α 자극에 의한 세포 이동능이 3배 이상 증가함을 확인하였다. 상기 결과는 혼합물 4F의 프라이밍에 의해 세포의 SDF-1α에 대한 반응성 및 허혈 조직으로의 특이적 이동능을 증진시킨다는 것을 의미한다.
실시예 4. 하지허혈 동물모델에서 본 발명에 따른 혼합물 4F의 혈관 재생 효과 확인
중증 혈관질환 모델인 하지허혈 동물모델을 제작하여 혼합물 4F 처리에 의해 기능이 강화된 혈관줄기세포의 치료 효능을 평가하였다. 구체적으로, 레이저 도플러 속도계를 이용하여 세포 이식 후 혈류의 개선정도를 혈역학적으로 분석하였다. 구체적으로, 중증 허혈성 동물모델에서 혼합물 4F로 프라이밍된 세포의 치료 효능 확인을 위해 7-8주령의 누드 마우스(male)를 이용하여 하지허혈 동물모델을 제작하였다. 하지허혈 동물모델은 대퇴동맥 절제(femoral artery ligation)에 의해 하지 혈류를 차단하는 방식으로 만들어지며 혈관 절제 후, 세포(5x105 cells/PBS 50μl)를 근육주사하여 일별(3, 7, 14일)로 차단된 혈류의 회복정도를 레이저 도플러 속도계를 이용하여 혈역학적으로 분석하였다. 또한 이식한 세포의 생착 및 생존, 혈관신생 효과는 생존세포 이미징을 통해 조직학적 분석을 통해 확인하였으며, 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, 4F 처리 세포 이식 시, 체내 혈관재생이 대조군 대비 유의적으로 증진됨을 확인하였다.
도 3b에 나타낸 바와 같이, 생체 내 이미징 기법을 활용하여 GFP 태깅된 세포 이식 후 3일차에 혈관 봉합 부위를 생존 상태로 이미징한 결과, 봉합된 동맥 혈관 주위로 이식해준 GFP+ 세포가 다수 관찰되는 것을 관찰하였다. 상기 결과는 혼합물 4F 처리에 의해 생존능이 증진된 혈관줄기세포가 혈관 재생을 위하여 리쿠르팅 되었음을 의미한다.
실시예 5. 중증 심근경색 동물모델에서 혼합물 4F 처리에 따른 심기능 증진 효과 확인
중증 심근경색 동물모델을 활용하여 혼합물 4F로 프라이밍된 세포의 치료 효능을 확인하였다. 구체적으로, 7-8주령 누드 마우스를 이용하여 중증 심근경색 모델을 제작하였다. 상기 중증 심근경색 모델은 좌관상동맥 절제를 통해 제작되었으며, 개체 당 5x105 cells를 심장의 허혈부위에 직접 이식하였다. 심근경색 유발 후 28일 경과 시점의 심기능은 심초음파를 이용하여 좌심실의 질량, 용적[Left ventricle end diastolic diameter(LVEDD), left ventricle end systolic diameter(LVESD)], 좌심실 구혈률[Left ventricular ejection fraction(LVEF)] 등을 측정하였다. 또한 동물모델의 심박출량, 좌심실의 이완기 기능을 평가하였다. 심초음파, 심박출량 및 좌심실 이완기 기능을 분석한 결과는 도 4a에 나타내었다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, 심근경색 유발 후 28일 경과 시점의 심기능 평가 결과 박출율(Ejection Fraction, EF), 분절감소(Fractional Shortening, FS)는 혼합물 4F 처리군이 대조군 대비 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 상기 결과는 혼합물 4F가 기존의 혈관줄기세포 기능을 더욱 향상시킨다는 것을 의미한다.
추가적으로, 심근경색 유발 28일 후 아교섬유를 특징적으로 염색할 수 있는 Masson‘s trichrome 염색을 실시하여 심근의 섬유화 정도(파란색 염색부분)를 분석하였으며, 그 결과는 도 4b에 나타내었다.
도 4b에 나타낸 바와 같이, 왼쪽 심실은 섬유화 정도가 혼합물 4F 처리에 의해 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.
또한 중증 심근경색 모델에 GFP로 라벨링된 세포를 이식한지 3일 후에 심근 내 세포의 생착 및 증식률 세포의 증식 마커인 PCNA를 면역염색하여 확인하였으며, 그 결과를 도 4c에 나타내었다.
도 4c에 GFP와 머지(merge)되는 PCNA의 발현이 혼합물 4F 처리군에서 다수 관찰되었다.
상기 결과는 중증 심근경색 동물모델에서 이식된 혼합물 4F로 프라이밍된 혈관줄기세포가 증식을 통해 심장 내 심근회복 및 심기능을 증진시킨다는 것을 의미한다.
실시예 6. 혼합물 4F 처리에 따른 증식능 , 세포주기 변화, 세포 노화 및 콜로니 형성능 분석
세포 증식능 분석을 위해 96 웰 플레이트에 10000개의 세포를 시딩한 후 혼합물 4F 처리일수에 따라 MTS 분석을 통해 세포 증식능을 확인하였다. 또한 세포 증식 조절인자인 CDK 억제제(p21, p16)의 단백질 발현을 확인하기 위해 단백질 용해 버퍼를 이용하여 대조군의 세포 내 단백질을 분리, 추출 및 정량한 후 동량의 단백질을 사용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 단백질은 SDS-PAGE 후 PVDF 멤브레인으로 옮겨 5% 탈지유에서 30분 동안 블로킹(blocking)하였다. 블로킹 후 1:1000의 비율로 희석된 각 1차 항체{p53(abcam), p27(abcam), p21(abcam), p16(abcam) 및 b-actin(santacruz)}와 멤브레인을 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 멤브레인을 세척한 후 HRP가 결합된 2차 항체와 상온에서 1시간 반응시켰으며, LAS3000(Fujifilm)을 이용하여 단백질의 발현을 시각화하였다. 또한 세포의 증식능 저하가 미분화 특성 증가로 유도된 세포주기 정지에 의한 것임을 확인하기 위하여, PI 염색법 및 Hst/PY 염색법으로 세포주기를 분석하였다. 구체적으로, 60-70% 컨플루언트 배양된 세포에 PI(santacruz), hoechst 33342(santacruz), PY(santacruz) 염색을 하여 유세포분석을 이용하여 세포주기를 분석하였다. 혼합물 4F 처리에 따른 세포증식율 및 세포주기 변화를 확인한 결과는 도 5a 및 5b에 나타내었다.
도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같이, 세포증식능은 혼합물 4F 처리일수에 의존적으로 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 혼합물 4F를 처리한 세포는 세포 증식 조절인자인 CDK 억제제(p21, p16)의 단백질 발현이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 또한 세포주기 분석 결과, 혼합물 4F 처리 시(4일) DNA의 복제와 세포질의 분열이 일어나는 S기와 G2/M기가 대조군에 비해 유의적으로 감소한 반면, G0/G1기는 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 혼합물 4F 처리 시(4일) 휴면기 상태인 G0기의 세포 군집이 대조군 대비 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.
세포주기가 정지된 세포 및 반복계대를 통해 노화된 세포(old)의 노화정도를 분석하였다. 세포 노화 분석은 SA-β-gal 분석키트(cell signaling)를 이용하였으며, 제조사의 매뉴얼에 따라 실험하였다. 현미경 이미징을 통해 세포그룹 당 노화된 세포(β-gal positive-초록색)의 수를 측정하여 그래프화하였으며, 그 결과를 도 5c에 나타내었다.
도 5c에 나타낸 바와 같이, 혼합물 4F 처리에 의한 세포주기 정지가 세포 손상이나 노화에 의한 것이 아니라 미분화 특성의 증가로 유도된 것임을 확인 하였다.
또한 세포의 콜로니 형성능 확인을 위해 96 웰 플레이트에 1% 젤라틴을 코팅한 후 세포를 시딩하고, 14 내지 20일 동안 배양하였다. 현미경 이미징을 통해 배양 세포를 콜로니가 형성된 웰 수를 측정하여 그래프화하였으며, 이를 도 5d에 나타내었다.
도 5d에 나타낸 바와 같이, 단일세포 콜로니 분석을 통해 단일 세포의 콜로니 형성능을 분석한 결과, 혼합물 4F의 프라이밍에 의해 혈관줄기세포가 휴지 상태에 빠지며 줄기세포로서의 미분화 특성이 크게 증가된다는 것을 확인하였다.
실시예 7. 혼합물 4F 처리에 따른 줄기세포 분화 관련 유전자 발현 분석
혼합물 4F 처리에 따른 혈관내피세포의 미분화 또는 분화 관련 유전자의 발현을 측정하였다. 구체적으로, 혼합물 4F로 프라이밍된 혈관내피세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA 2μg을 준비하여 Teragen 사에 RNA 시퀀싱을 의뢰하였다. DEG(Differentially expressed gene)분석은 Cuffdiff 방법을 기반으로 q-value threshold가 0.05미만을 추출하여 분석하였다. 줄기세포 분화 관련 유전자 발현을 분석한 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 전사체를 RNA 시퀀싱을 통해 분석한 결과, 혼합물 4F로 프라이밍된 세포는 완전히 분화된 혈관내피세포(HUVEC)와 분명한 유전학적 차이가 있었으며, 일부 미분화 줄기세포 관련 마커(CD34, KIT, HEY1, PODXL 등)의 발현이 outgrowing EC(OEC, L-EPC)에 비해 유의적으로 증가된 것을 확인하였다. 분화된 혈관내피세포 특이적 유전자들의 발현 또한 outgrowing EC(OEC, L-EPC)와 비슷한 수준 또는 다소 감소되는 것을 확인하였다. 상기 결과는 혼합물 4F로 프라이밍된 세포가 미성숙(immature) 특성을 획득한다는 것을 의미한다.
실시예 8. 혼합물 4F 처리에 따른 미분화 줄기세포의 사멸률 분석
미분화 줄기세포의 경우 허혈 자극과 같은 병태생리학적 환경에 대한 방어능으로 생존능이 높아져 이식 및 생착률이 분화세포에 비해 더 높다. 이를 확인하기 위해 허혈 상태(무양분 및 저산소 상태)를 체외 구현하여 세포의 사멸률을 분석하였다. 세포 사멸률 분석은 각 세포그룹을 FBS, 성장인자 및 사이토카인이 제거된 무영양 배지, 1% O2의 저산소 조건에서 24시간 동안 배양하여 체내 허혈상태를 체외에서 구현하였다. 그 후 아넥신 V/PI 염색 키트(BD Biosciences)를 사용하여 유세포 분석을 실시하였으며, 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 혼합물 4F로 프라이밍된 세포의 생존 세포 군집은 대조군 대비 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 상기 결과는 혼합물 4F 처리는 세포의 미분화 특성을 증가시키며, 이는 곧 허혈자극에 대한 방어기작을 증진시킴으로써 세포 생존능 향상에 기여한다는 것을 의미한다.
실시예 9. 혼합물 4F 처리에 따른 미분화 줄기세포의 증식률 및 마커 발현 분석
혼합물 4F 처리에 의해 세포 주기가 정지된 세포를 기존 세포 배양에 사용하는 영양배지(b-FGF, EGF, IGF-1, ascorbic acid 첨가)로 재관류시켰을 때 세포 증식능 및 마커발현의 회복을 분석하였다. 구체적으로, 혼합물 4F를 4일 동안 처리하여 세포주기가 정지된 세포에 영양 배지(b-FGF, EGF, IGF-1, ascorbic acid 첨가) 조건에서 5일 동안 배양(reperfusion)하였다. 영양 배지로 교환한 후 3 및 5일차에 세포의 증식능 회복을 MTS 분석 키트를 이용하여 확인하였다. 상기 MTS 분석은 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 세포 증식률 및 마커 발현 분석 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 혼합물 4F로 프라이밍된 세포는 영양 배지 재관류에 의해 감소되었던 증식능이 회복될 뿐만 아니라 마커발현 또한 대조군과 비슷한 수준으로 회복되는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터 혼합물 4F 처리에 의해 일어난 세포주기 정지 및 이로 인한 세포 증식능의 저하가 세포 손상이 또는 노화와 같은 비가역적 현상이 아니라 세포의 미분화 성격 증가와 함께 나타나는 휴지기 세포의 일반적 특징이며, 필요 자극에 의해 충분히 회복될 수 있는 가역적 현상임을 확인하였다.
실시예 10. 혼합물 4F 또는 단일 성분 처리에 따른 마커 발현 및 혈관형성능 비교
혼합물 4F 또는 단일 성분(후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 또는 혈관내피성장인자)처리에 따른 마커 발현 및 혈관형성능을 비교하였다. 본 실험의 실험군은 혼합물 4F를 처리하였으며, 대조군은 무처리군(con), 후코이단 처리군(Fu, 0.1μg/ml), 타우로우루소데옥시콜산 처리군(TD, 25μM), 올리유로핀 처리군(OLP, 0.5μM) 및 혈관내피성장인자 처리군(VEGF, 100ng/ml)을 이용하였다.
먼저, 혼합물 4F로 프라이밍된 세포의 마커 발현은 실시예 1의 방법으로 분석하였으며, 그 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 혼합물 4F 처리군은 각 성분의 단일 처리 조건 대비 미분화 마커(CD34, CD90, c-kit, CXCR4)를 발현하는 세포 군집이 크게 증가하는 것을 확인하였다.
혈관형성능 분석은 96 웰 플레이트에 마트리젤 GFR(BD Biosciences)을 60μl씩 첨가하여 굳힌 후 세포 10000개를 시딩하여 배양하였다. 배양 6시간 후 튜브 유사 네트워크의 형성정도를 현미경으로 관찰하였다. 현미경 관찰 결과를 이미지 J 소프트웨어를 이용하여 형성된 가짓수 계수(branch number counting)를 통해 세포의 혈관형성능을 그래프화하였으며, 그 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 혼합물 4F 처리군은 각 성분의 단일 처리 조건 대비 혈관형성능이 크게 증가하는 것을 확인하였다.
상기 결과는 혼합물 4F를 처리하는 것이 단일 성분을 처리하는 것에 비해 세포의 미분화 특성 및 혈관형성능을 현저히 증가시킨다는 것을 의미한다.
실시예 11. 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법
도 11은 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법을 간략히 나타낸 도이다. 구체적으로, 혈관내피전구세포(EPC)의 분리 및 배양은 양산부산대학교 병원 산부인과에 내원한 산모의 제대혈(IRB승인번호 05-2017-053, 50cc이상)을 공급받아 ficoll을 이용한 밀도차 원심분리로 단핵구(MNCs)를 수득하였다. 적혈구 용해 후 피브로넥틴(1μg/cm2)이 코팅된 6 웰 플레이트에 세포를 시딩(7x106cells/well)하고, 37℃, 5% CO2, 각 배지(혼합물 4F 포함 무이종 배지 또는 기존 혈관내피세포분화배지 알려진 배지(EGM2 media; Lonza, 카탈로그 넘버 cc-4147) 조건에서 5일 동안 배양하였다. 상기 혼합물 4F를 포함하는 무이종 배지는 기존 배양배지 내 첨가되는 사이토카인이나 성장인자 및 동물혈청(FBS)를 배제하고 기본배지에 혼합물 4F와 인간 혈청(2%)만을 첨가한 것이다. 배양 후 매일 배지를 교환하였으며, EPC 콜로니 부착을 확인하여 70% 이상 컨플루언트 상태인 경우 계대배양하였다. 배양된 세포는 배양 배지의 종류에 따라, 기존의 혈관내피세포 분화배지로 배양하여 획득한 세포를 ‘E-EPC', 'L-EPC', 혼합물 4F를 포함하는 무이종 배지로 배양하여 획득한 세포를 'X-EPC'라고 명명하였다.
실시예 12. 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 혈관줄기세포의 형태학적 특성 확인
세포의 형태학적 비교는 70 내지 80% 컨플루언트 상태에서 현미경 이미징하여 세포의 형태학적 특징을 확인하였다. 구체적으로, 내피세포계열의 특이적 기능평가인 Ac-LDL 흡수 및 UEA-1 결합 분석은 10-20% 컨플루언트한 상태로 배양한 세포를 2시간 동안 혈청 기아 상태(serum starvation)로 배양하였다. 배양된 세포에 Ac-LDL(Invitrogen) 10μg/ml 농도로 처리한 후 4시간 동안 37℃에서 반응 시켰다. 반응된 세포를 4% PFA를 이용하여 상온에서 10-15분 고정하였고, UEA-1(sigma aldrich) 10μg/ml농도로 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응된 세포를 PBS로 세척한 후 DAPI 염색법으로 염색한 후 형광현미경으로 관찰하였다. 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 혈관줄기세포의 형태학적 특성을 분석한 결과는 도 12에 나타내었다.
도 12는 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양한 세포(X-EPC)는 기존 배양방법으로 배양한 세포(E-EPC, L-EPC)와 같은 표현형을 가지고 있다는 것을 확인하였다. 또한 혼합물 4F를 활용한 무이종 배양방법에 의한 세포의 특별한 형태학적 변화는 없음을 확인하였다.
실시예 13. 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 혈관줄기세포의 미분화 줄기세포 관련 마커의 유전자 발현 분석
상기 실시예 11에서 배양된 세포의 조혈 계열 마커(CD11b, CD14, CD45), 미분화 마커(CD34, c-kit, CXCR4), 내피세포 계열 마커(VEGFR2, PECAM, VE-cadherin)의 발현을 분석하였다. 구체적으로, 실시예 11에서 배양된 세포를 트립신-EDTA와 1:100, 4℃에서 30분 동안 반응시켜 배양 플레이트로부터 떼어냈다. 상기 세포의 미분화 줄기세포 관련 마커 유전자 발현을 유세포 분석기(flowcytometry)를 통해 분석하였으며, 그 결과는 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 세포(X-EPC)는 기존 배양방법으로 획득한 세포그룹(E-EPC, L-EPC, HUVEC)과 비교하여 조혈 계열 마커(CD11b, CD14, CD45)의 발현은 거의 확인 할 수 없었으며, 미분화 마커 및 혈관내피세포 계열의 마커 발현은 높게 유지하는 결과를 확인하였다(제대혈 donor별 3개의 lot 확보. 대표마커인 CD34, CXCR4, VE-카데린의 발현은 지속적인 계대배양 후에도 L-EPC 대비 높게 유지됨을 확인함). 이를 통해 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 획득한 세포(X-EPC)가 기존 배양방법으로 배양된 세포보다 높은 미분화 특성을 가지는 혈관줄기세포임을 확인하였다.
실시예 14. 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 혈관줄기세포의 증식능 , 세포주기 변화 및 콜로니 형성능 분석
상기 실시예 11의 방법에 따라 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 세포를 단일 세포로 분리하여 실시예 6과 같은 방법으로 증식능, 세포주기 변화 및 콜로니 형성능을 분석하였다. 본 실시예의 대조군은 기존 배양방법으로 배양한 세포(L-EPC)와, 무이종 배지에 각 단일성분을 포함한 배지로 배양한 세포[후코이단 처리군(Fu, 0.1μg/ml), 타우로우루소데옥시콜산 처리군(TD, 25μM), 올리유로핀 처리군(OLP, 0.5μM) 및 혈관내피성장인자 처리군(VEGF, 100ng/ml)]을 이용하였다. 콜로니 형성능을 분석한 결과는 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 세포는 콜로니 형성능이 우수하고, 분열시간이 짧은 것을 확인하였다. 그러나 단일 성분을 처리한 대조군은 EPC 콜로니가 형성되지 않았다. 다만, 혈관내피성장인자 처리 세포는 EPC 콜로니가 확인되었으나, VE-카데린의 발현이 낮았으며, 세포의 분열 시간 또한 길어져 세포의 증식능이 감소한 것을 확인하였다.
실시예 15. 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 혈관줄기세포의 줄기세포 분화 관련 유전자 발현 분석
상기 실시예 11의 방법에 따라 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 세포의 줄기세포 분화 관련 유전자의 발현을 실시예 7의 방법으로 분석하였다. RNA 시퀀싱 결과를 토대로 유전자 온톨로지, 카테고리 및 발현패턴을 분석하였다. 줄기세포 분화 관련 유전자 발현을 분석한 결과는 도 15 내지 17에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 세포(X-EPC)는 기존 배양방법으로 획득한 L-EPC와 유전학적 차이가 있으며, 각 세포 그룹별 상관관계를 PCA 분석한 결과 높은 유사성을 보이는 HUVEC/L-EPC와는 달리 X-EPC의 경우 각 세포 그룹과의 유사성이 낮은 것을 확인하였다.
도 16에 나타낸 바와 같이, X-EPC에서 L-EPC에 비해 2배 이상 발현차이를 보이는 유전자들을 대상으로 유전자 온톨로지 및 카테고리를 분석한 결과, 내피세포활성(endothelial cell activation), 혈관신생(angiogenesis), 내피세포 이동(endothelial cell migration)등에 관련된 유전자의 발현 변화 정도가 큰 것을 확인 하였다.
도 17에 나타낸 바와 같이, X-EPC는 일부 미분화 줄기세포 관련 유전자(CD34, KIT, HEY1, PODXL등)의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다.
실시예 16. 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 혈관줄기세포의 혈관형성능 확인
상기 실시예 11의 방법에 따라 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 세포의 혈관형성능을 실시예 10의 방법으로 확인하였다. 추가적으로, 3D 비즈 발아 분석은 배양용 비즈와 각 세포를 4시간 동안 배양하여, 비즈를 세포로 코팅하였다. 세포로 코팅된 배양 피브리노겐/트롬빈 겔에 100 내지 200개의 세포 코팅 비즈를 시딩하여 37℃에서 배양하였다. 배양 중 비즈의 혈관신생 발아 정도를 관찰하였다. 2D 및 3D 혈관형성능 분석 결과는 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 세포(X-EPC)는 L-EPC 및 HUVEC보다 혈관형성능이 향상되었으며, 보다 오래 지속되는 것을 확인하였다.
실시예 17. 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 혈관줄기세포의 주변분비 혈관형성 효과 확인
상기 실시예 11의 방법에 따라 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 세포의 주변 분비에 의한 혈관형성 효과를 분석하였다. 구체적으로, 트리졸을 이용하여 실시예 11의 세포로부터 전체 RNA를 추출하였고, 이를 기반으로 cDNA를 합성하였다. 또한 합성된 cDNA를 주형으로 하는 qPCR을 수행하여 주요 혈관형성자극인자(VEGF-A, IL-8, b-FGF, Ang2)의 mRNA 발현을 분석하였다. 상기 PCR에 사용한 프라이머는 표 1과 같으며, qPCR 결과는 도 19에 나타내었다.
Forward Reverse
VEGF-A GCTCGGTGCTGGAATTTGAT GCCCGATTCAAGTGGGGAAT
IL-8 CACCGGAAGGAACCATCTCACT TCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTCC
b-FGF GGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAG CCAGTTCGTTTCAGTGCCACATACCAA
Ang2 GGGAAGGGAATGAGGCTTAC AAGTTGGAAGGACCACATGC
b-actin AGCGAGCATCCCCCAAAGTT GGGCACGAAGGCTCATCATT
도 19에 나타낸 바와 같이, 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 세포(X-EPC)는 혈관형성을 자극하는 주요 성장인자 및 사이토카인의 발현이 대조군(L-EPC, E-EPC, HUVEC)에 비해 유의적으로 높은 것을 확인하였다.
실시예 18. 하지허혈 동물모델에서 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 혈관줄기세포의 혈관 재생 효과 확인
상기 실시예 11의 방법에 따라 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 세포를 실시예 4와 동일한 방법으로 혈관 재생 효과를 확인하였으며, 그 결과를 도 20 및 21에 나타내었다.
도 20 및 21에 나타낸 바와 같이, 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 세포(X-EPC)가 이식된 하지허혈 동물모델은 체내 혈관 재생이 대조군에 비해 유의적으로 증진되는 것을 확인하였다. 또한 혼합물 4F를 이용한 무이종 배양방법으로 배양된 세포(X-EPC)가 이식된 하지허혈 동물모델은 봉합된 동맥 혈관 주위로 이식해준 GFP+ 세포가 다수 관찰되었고, 기존의 혈관에 들어가는 현상을 확인하였다. L-EPC가 이식된 하지허혈 동물모델은 이식 7일 후 세포의 잔해만 관찰되는데 반해, X-EPC가 이식된 하지허혈 동물모델은 이식 21일차까지 생존 세포의 GFP 신호가 검출되었다. 상기 GFP 신호의 검출은 세포의 생착 및 생존률이 향상되었음을 의미한다. 또한 X-EPC가 이식된 하지허혈 동물모델은 CD31(red; mouse vessel) 양성 혈관도 L-EPC 이식 그룹 대비 더 많은 것을 확인하였다. 상기 결과는 X-EPC가 체내에서(in vivo) 혈관 재생 효과가 우수하다는 것을 의미한다.
종합적으로 본 발명자들은 후코이단, 타우로우루소데옥시콜산, 올리유로핀 및 혈관내피성장인자를 포함하는 혼합물 4F를 혈관내피 전구세포에 처리하면, 혈관내피 전구세포가 미분화 특성(stemness)을 획득할 뿐만 아니라 혈관신생, 세포증식능 및 이동능을 향상시키는 효과가 있어, 혈관내피 전구세포를 체내에 이식한 후 세포 생존 및 생착률을 향상시키고 혈관 및 조직 재생능을 보다 높일 수 있는바, 줄기세포 분화, 허혈성 질환 예방 또는 치료 분야에서 다양하게 활용할 수 있다.
이하, 제제예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 제제예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 제제예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다.
제제예 1. 약학적 조성물의 제조
1-1. 산제의 제조
혼합물 4F 20mg
유당 100mg
탈크 10mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1-2. 정제의 제조
혼합물 4F 10mg
옥수수전분 100mg
유당 100mg
스테아린산 마그네슘 2mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
1-3. 캡슐제의 제조
혼합물 4F 10mg
결정성 셀룰로오스 3mg
락토오스 14.8mg
마그네슘 스테아레이트 0.2mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
1-4. 주사제의 제조
혼합물 4F 10mg
만니톨 180mg
주사용 멸균 증류수 2974mg
Na2HPO42H2O 26mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1-5. 액제의 제조
혼합물 4F 20mg
이성화당 10g
만니톨 5g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. 50 내지 250nM의 후코이단, 17.5 내지 35μM의 타우로우루소데옥시콜산, 0.35 내지 0.7μM의 올리유로핀 및 0.1 내지 5nM의 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는, 제대혈 유래 줄기세포의 노화 억제 또는 증식 촉진용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 50 내지 250nM의 후코이단, 17.5 내지 35μM의 타우로우루소데옥시콜산, 0.35 내지 0.7μM의 올리유로핀 및 0.1 내지 5nM의 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는, 제대혈 유래 줄기세포의 혈관신생 유도용 조성물.
  8. 50 내지 250nM의 후코이단, 17.5 내지 35μM의 타우로우루소데옥시콜산, 0.35 내지 0.7μM의 올리유로핀 및 0.1 내지 5nM의 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 50 내지 250nM의 후코이단, 17.5 내지 35μM의 타우로우루소데옥시콜산, 0.35 내지 0.7μM의 올리유로핀 및 0.1 내지 5nM의 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 제대혈 유래 줄기세포 배양용 배지 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 배지 조성물은 무이종(xeno-free) 배지인, 배지 조성물.
  11. 제9항에 따른 배지 조성물을 제대혈 유래 줄기세포에 처리하는 단계;를 포함하는 무이종 배양방법.
  12. 삭제
  13. 50 내지 250nM의 후코이단, 17.5 내지 35μM의 타우로우루소데옥시콜산, 0.35 내지 0.7μM의 올리유로핀 및 0.1 내지 5nM의 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 제대혈 유래 줄기세포 치료 보조제.
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