KR101555941B1 - 후코이단을 이용한 줄기세포 생물작용 활성 증가, 및 이를 포함하는 줄기세포 치료 보조제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 후코이단을 이용한 줄기세포 생물작용 활성 증가, 및 이를 포함하는 줄기세포 치료 보조제에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 후코이단을 포함하는 줄기세포의 노화 억제, 증식 촉진 또는 분화 유도용 조성물, 및 이를 이용한 방법을 통해서 종래 줄기세포 치료의 단점으로 지적되었던 줄기세포의 수급 문제, 표적 장기로의 이동 문제, 조직 내에서의 생존율이 낮은 문제점들을 효과적으로 개선하여 새로운 줄기세포 치료 보조제로써 유용하게 사용될 수 있다.

Description

후코이단을 이용한 줄기세포 생물작용 활성 증가, 및 이를 포함하는 줄기세포 치료 보조제{Process for Enhancing Stem Cell Bioactivity Using Fucoidan, and The Cellular Therapeutic Supplementary Agent Comprising The Same}

본 발명은 후코이단을 이용한 줄기세포 생물작용 활성 증가, 및 이를 포함하는 줄기세포 치료 보조제에 관한 것이다.

허혈성 질환은 지속적으로 증가하는 순환기 계통의 주요 질병이다. 대표적인 질환으로, 심혈관 질환은 세계적으로 가장 사망률이 높은 질환 중 하나이다. 말초동맥질환 중 중증하지 허혈성질환 역시 혈관 폐쇄로 발생하는 질병으로서 심각한 경우 사지 절단의 위험을 가지고 있다. 21세기로 들어서면서, 이러한 허혈성 질환은 스트레스, 잘못된 식습관, 흡연, 고령화, 운동 부족, 당뇨 등과 같은 여러 가지 위험 요인에 의해 발병률이 급증하고 있는 상황이다. 이에 대한 치료법으로서 약물요법과 수술요법이 개발되어 있으나, 현재까지 확립된 치료방법으로 완치되지 못하는 경우가 많으며 심혈관 질환의 경우 합병증을 동반함으로서 만족스러운 치료가 불가능한 실정이다. 혈관 신생을 위한 유전자 요법이 여러 연구를 통해 임상시험이 진행되고는 있으나 그 효과가 미비하며 여러 가지 부작용과 안전성 문제가 제기되어 실질적인 도입까지는 더 많은 연구가 필요하다. 결국 허혈성 질환은 치료법의 한계에 따라 개인의 삶의 질적 저하뿐만 아니라 사회경제적으로도 상당한 부담이 되는 가장 심각한 질환이다.

이러한 한계점을 극복하기 위해 새로이 부각되고 있는 치료법으로 줄기세포를 이용한 세포치료제가 제안되고 있다. 환자 자신의 세포를 혈액이나 골수 및 기 보관된 제대혈로부터 채취하여 심근 경색 부위 혹은 손상된 허혈 조직 주위에 다시 이식하여 손상된 혈관 수복 및 조직재생에 상당한 효과가 있다는 연구결과가 상당히 도출되고 있다. 이러한 줄기세포를 이용한 세포치료법은 환자 자신의 세포를 채취하여 다시 주입할 수 있는 편의성뿐만 아니라 줄기세포에 치료유전자를 직접 주입하여 이식할 수 있는 장점이 있어 현재 여러 난치성 질병치료를 위해 세계적으로 연구가 활발이 진행되고 있다.

현재 줄기세포를 이용한 허혈성 질병 치료를 위한 혈관신생 및 재생 분야에서는 임상적용을 위해 성체줄기세포를 이용하고 있다. 성체줄기세포는 배아줄기세포에 비해서 윤리적 문제가 없고 환자 자신의 몸에서 추출하여 손상을 입은 조직에 자가 이식이 가능하며 손상을 입은 표적 장기에 상당부분 분화가 진행된 상태이므로 표적 장기 재생에 적용하는데 특화되어 있다. 또한 배아줄기세포의 경우 손상된 조직과 일치하는 방향으로 정확한 분화 유도 방법을 구축해야 하지만 성체줄기세포의 경우 이러한 과정을 거치지 않고도 임상적으로 적용할 수 있는 장점이 있다. 하지만 성체줄기세포를 이용한 임상적용에서 여러 가지 장애물도 존재한다. 손상된 조직 재생을 위한 충분한 수의 성체줄기세포를 획득하는데 어려움이 있다. 그리고 식습관, 흡연, 운동부족, 과음, 스트레스, 고령화, 당뇨병과 같은 만성질환 등에 의해 성체줄기세포의 기능저하가 되는 측면도 고려해야 할 사항이다. 이러한 문제를 해결하려는 노력의 일환으로 충분한 수의 성체줄기세포를 획득하기 위해 여러 연구를 통해 체외 배양 증폭 방법이 개발되어 적은수의 성체줄기세포를 충분한 양을 증폭하는 방법이 구축되고 있지만, 체외 증폭과정에서 누적된 증식활동으로 인하여 성체줄기세포의 노화현상이 일어나 이로 인한 기능저하 또한 해결해야 할 문제로 제기되고 있다.

세계적으로 성체줄기세포의 증폭 및 생물활성 증진을 위한 여러 연구가 진행되고 있다. 유전자 도입법을 이용한 연구는 특정 유전자의 증폭을 통해 줄기세포의 기능을 향상시키는 보고가 있지만 그 안정성에 대한 추가적인 연구가 필요하다. 성체줄기세포에 여러 가지 성장인자 (growth factor) 혹은 사이토카인 (cytokine)을 직접적으로 전처리하여 생물활성을 증진시키는 보고도 있지만 성장인자나 사이토카인이 상당한 높은 가격을 형성하고 있어 경제적인 문제점이 있다.

한편, 후코이단은 갈조류에서 추출한 황산다당류(sulfated polysaccharid)로서, 항종양, 면역조절, 항바이러스, 항응고, 항염증 및 항산화 작용 등의 다양한 생물활성이 보고되고 있다.

이러한 생리활성에 유리한 작용에 대해 지속적인 연구에도 불구하고, 후코이단을 이용한 세포치료제 개발, 특히 후코이단이 노화된 성체줄기세포를 회복시키고, 생물활성을 증진시키는 지 여부에 대해서는 알려진 바가 없으며, 종래 줄기세포 치료에 장애물이 되어왔던 제한적인 줄기세포의 수급, 이식한 줄기 세포의 노화 및 허혈 조직 내에서의 낮은 생존율과 혈관으로의 분화능력 저조 등의 문제점과 관련하여 후코이단을 적용한 예는 없었다.

본 발명자들은 기존 줄기세포 치료의 문제점인 줄기세포의 노화현상 및 이로 인한 기능저하를 개선하고, 줄기세포의 기능 증진에 기반한 신규한 세포치료제를 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, 생체이용에 무해한 천연물인 후코이단을 혈관내피 전구세포(endothelial progenitor cell)에 처리하여, 줄기세포 증폭과정에서 일어나는 노화현상의 억제 및 줄기세포의 기능 증진을 확인함으로써, 허혈성 질환에 적용할 수 있는 새로운 세포치료제인 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 후코이단(Fucoidan)을 포함하는 줄기세포의 노화 억제, 증식 촉진 또는 분화 유도용 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 줄기세포에 후코이단(Fucoidan)을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 노화 억제, 증식 촉진 또는 분화 유도 방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포 치료 보조제를 제공하는 데 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 후코이단(Fucoidan)을 포함하는 줄기세포의 노화 억제, 증식 촉진 또는 분화 유도용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "줄기세포"는, 자기복제능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다.

본 발명의 줄기세포는 목적에 따라 적절히 제한 없이 선택될 수 있으며, 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터 유래된 공지된 모든 조직, 세포 등의 성체 세포로부터 유래할 수 있으며, 예를 들어, 골수, 제대혈, 태반(또는 태반 조직세포), 지방(또는 지방조직 세포) 등으로부터 유래할 수 있다.

예컨대, 상기 줄기세포는 골수, 지방 조직, 근육 조직, ex vivo 배양된 자기조직 간엽 줄기 세포, 동종 이계 간엽 줄기 세포, 제대혈, 배 난황낭, 태반, 제대, 골막, 태아 및 사춘기 피부, 그리고 혈액으로부터 제한없이 얻어지는 줄기세포일 수 있으며, 태아 또는 출생직후 또는 성인으로부터 유래된 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 줄기세포는 혈관내피 전구세포(Endothelial Progenitor Cell), 혈관 줄기세포(Angiogenic Stem Cell), 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell), 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell), 근모세포(Myoblast) 및 심장줄기세포(Cardiac Stem Cell)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 혈관내피 전구세포(Endothelial Progenitor Cell) 또는 혈관 줄기세포(Angiogenic Stem Cell)이며, 가장 바람직하게는 혈관내피 전구세포(Endothelial Progenitor Cell)이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "노화(senescence)"는, 줄기세포가 내부 혹은 외부로부터 받는 다양한 스트레스(예를 들어 연속되는 계대 배양 및 체외 배양시의 고농도의 산소 조건 등)에 대항하여, 세포 성장(cell growth) 및 세포 분열이 정지되거나 유의성 있게 지연되는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "증식(proliferation)"은 특징적인 세포 유형, 또는 동일할 수 있거나 동일하지 않을 수 있는 세포의 시원 세포 집단으로부터의 세포 유형들의 개수의 증가를 의미한다. 증식을 위해 사용되는 시원 세포는 증식으로부터 생성된 세포와 동일하지 않을 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "분화 유도(differentiation induction)"는, 줄기세포에서 특정세포로 완전히 분화가 유도된 경우뿐만 아니라 줄기세포에서 특정세포로의 완전 분화되기 전 중간 단계에서 형성되는 배아유사구조체 (embryonic body)의 형성도 포함하는 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 본 조성물의 후코이단은 0.1 내지 50 ㎍/ml 범위의 농도로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 1 내지 40 ㎍/ml 범위의 농도이고, 보다 더욱 바람직하게는 5 내지 15 ㎍/ml 범위의 농도이며, 가장 바람직하게는 10 ㎍/ml의 농도이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 줄기세포에 후코이단(Fucoidan)을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 노화 억제, 증식 촉진 또는 분화 유도 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 후코이단은 0.1 내지 50 ㎍/ml 범위의 농도로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 1 내지 40 ㎍/ml 범위의 농도이고, 보다 더욱 바람직하게는 5 내지 15 ㎍/ml 범위의 농도이며, 가장 바람직하게는 10 ㎍/ml의 농도이다.

또한, 본 방법은 후코이단을 줄기세포에 처리하고 10 시간 이상 15시간 이하로 공배양할 수 있다.

본 발명에 따르면, 후코이단을 줄기세포와 함께 배양하면, 줄기세포에서 세포 노화 표지자인 p21의 발현이 감소되고, 항-세포 노화 표지자인 SMP30(senescence marker protein 30)의 발현이 증가됨으로써, 줄기세포의 노화가 억제될 수 있다.

본 발명에 따르면, 후코이단을 줄기세포와 함께 배양하면, 줄기세포에서 세포 주기 조절 단백질인 CDK2/4 및 Cyclin D1/E의 발현이 증가될 수 있으며, FAK(focal adhesion kinase), Akt(protein kinase B) 및 Erk(extracellular signal-regulated kinase)의 인산화가 촉진됨으로써 줄기세포의 증식이 촉진될 수 있다.

본 발명에 따르면, 후코이단을 줄기세포와 함께 배양하면, 줄기세포가 특정세포로 완전 분화되는 것을 효과적으로 달성되도록 할 뿐만 아니라 줄기세포에서 배아유사구조체를 형성시키는 데에도 매우 큰 효율성을 나타낸다.

본 발명의 방법은 상술한 후코이단 및 줄기세포를 이용하므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 후코이단을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 치료 보조제를 제공할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "줄기세포 치료 보조제"는, 당업계에서 일반적으로 사용되는 줄기세포 치료제의 효과를 증진시키기 위하여 보조적으로 사용될 수 있는 제재를 말하며, 본 발명에 의한 보조제를 사용함으로써 줄기세포 치료제의 줄기세포의 노화 억제 및 증식을 촉진하여 치료제의 효과를 향상시킬 수 있다.

"세포 치료제"란, 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아 있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 여타 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등 일련의 행위를 통하여 치료, 진단, 예방 목적으로 사용되는 의약품을 말하며, 특히 "줄기세포 치료제" 배아줄기세포 치료제와 성체줄기세포 치료제로 분류할 수 있다.

상기 줄기세포 치료 보조제는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 인체에 투여될 수 있다.

비경구 투여, 예를 들어 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 줄기세포 치료 보조제는 또한 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 줄기세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 투여될 수 있으며, 이런 담체로 생리학적 식염수를 예로 들 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 줄기세포 치료는 허혈성 질환 치료이다.

상기 허혈성 질환은, 바람직하게는 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 허혈성 대머리, 허혈성 뇌졸중 및 허혈성 하지질환으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 보다 바람직하게는 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 뇌졸중 및 허혈성 하지질환으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 허혈성 심근경색 또는 허혈성 하지질환일 수 있다.

본 발명의 치료 보조제는 상술한 후코이단 및 줄기세포를 이용하므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명에 의하면, 후코이단을 포함하는 줄기세포의 노화 억제 또는 증식 촉진용 조성물 및 이를 이용한 방법을 통해서 종래 줄기세포 치료의 단점으로 지적되었던 줄기세포의 수급 문제, 표적 장기로의 이동 문제, 조직 내에서의 생존율이 낮은 문제점들을 효과적으로 개선하여 새로운 줄기세포 치료 보조제로써 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 노화된 혈관내피 전구세포에 후코이단을 농도별로 처리했을 때 혈관내피 전구세포의 표면 표지자의 발현변화를 측정한 결과이다.
도 2a는 노화된 혈관내피 전구세포에 후코이단을 농도별로 처리했을 때 노화 표지자 중 하나인 베타 갈락토시데이즈 (β-Galactosidase)의 염색을 통하여 노화 회복정도를 측정한 결과이다. 도 2b는 베타 갈락토시데이즈 (β-Galactosidase)의 염색 양성세포를 정량화한 결과이다. 도 2c는 노화된 혈관내피 전구세포에 후코이단을 농도별로 처리했을 때 항노화 단백질인 SMP30과 노화 유발 단백질인 p21의 발현을 웨스턴 블럿팅 방법으로 측정한 결과이다.
도 3a은 노화된 혈관내피 전구세포에 후코이단을 농도별로 처리했을 때 세포 증식을 MTT 분석법을 통화여 측정한 결과이다. 도 3b는 세포주기 조절단백질의 발현을 웨스턴 블럿팅 방법으로 측정한 결과이다.
도 4는 노화 회복 기작 규명을 위해 노화된 혈관내피 전구세포에 최적 농도의 후코이단 (10 ㎍/ml)을 처리한 후, 시간별로 세포 신호 전달자인 FAK, Akt, ERK의 인산화를 웨스턴 블럿팅 방법으로 측정한 결과이다.
도 5a는 도 4에서 확인한 Akt가 노화 회복에 관여하는지를 확인하기 위하여 후코이단과 Akt 억제제를 처리한 후, 베타 갈락토시데이즈 (β-Galactosidase)의 염색을 통하여 노화 회복정도를 측정한 결과이다. 도 5b는 베타 갈락토시데이즈 (β-Galactosidase)의 염색 양성세포를 정량화한 결과이다. 도 5c는 Akt에 의한 항노화 단백질인 SMP30과 노화 유발 단백질인 p21의 발현 조절 변화를 웨스턴 블럿팅 방법으로 측정한 결과이다.
도 6a는 도 5에서 확인한 ERK가 노화 회복에 관여하는지를 확인하기 위하여 후코이단과 ERK 억제제 (U0126)를 처리한 후, MTT 분석법을 이용하여 세포 증식을 확인한 결과이다. 도 6b는 ERK에 의한 세포주기 조절단백질의 발현 조절 변화를 웨스턴 블럿팅 방법으로 측정한 결과이다.
도 7a는 혈관내피 전구세포의 기능 증진을 측정하기 위하여 노화된 혈관내피 전구세포에 후코이단을 농도별로 처리했을 때 혈관내피 전구세포의 튜브 형성능을 확인한 결과이다. 도 7b는 도 7a의 형성된 튜브수를 정량화한 결과이다. 도 7c는 도 4에서 확인한 Akt와 ERK가 노화 회복을 통해 기능 증진에 관여하는지를 확인하기 위하여 Akt와 ERK의 억제제를 처리한 후, 최적 농도의 후코이단 (10 ㎍/ml)을 처리한 다음 혈관내피 전구세포의 튜브형성능을 확인한 결과이다. 도 7d는 도 7c의 형성된 튜브수를 정량화한 결과이다.
도 8a는 하지허혈 동물모델에 후코이단 또는 Akt와 Erk 억제제 처리 후 후코이단을 처리한 노화된 혈관내피 전구세포를 이식 후, 제시된 시간별로 혈류 흐름 개선도를 레이져 도플러 이미지 (Laser Doppler Perfusion Image) 분석법을 이용하여 측정한 결과이다. 도 8b는 정상 다리조직에 비교하여 허혈 부위에 세포를 이식한 다리조직의 혈류 흐름 개선도를 제시된 시간별로 정량화한 결과이다.
도 9a는 하지허혈 동물모델에 각 그룹의 세포 이식 28일 후, 하지 회복 정도를 촬영한 결과이다. 도 9b는 도 9a에서 촬영한 결과를 하지소실 (limb loss), 다리 괴사 (foot necrosis), 발가락 소실 (toe loss), 하지 회복 (limb salvage) 항목으로 나누어 평가한 결과이다.
도 10a는 하지허혈 동물모델에 각 그룹의 세포 이식 후, 28일 경과후 혈관 신생을 확인한 결과이다. 모세혈관과 세동맥 신생을 확인하기 위하여 모세혈관은 CD31의 발현을, 세동맥은 α-SMA의 발현을 면역형광 염색법을 통하여 확인하였다. 이식한 세포의 생존율과 증식율을 확인하기 위하여 세포 이식 3일 후, 세포사 표지자인 caspase-3와 증식 표지자인 PCNA를 이용하여 면역형광 염색법을 이용하여 확인하였다. 도 10b는 도 10a에서 면역형광 염색법을 통하여 확인한 모세혈관 신생, 세동맥 신생, 세포사멸 및 세포 증식을 정량화한 결과이다.
도 11a은 하지허혈 동물모델에 각 그룹의 세포 이식 후, 이식한 세포가 허혈 조직으로 동원되는 능력을 확인하기 위하여 이식 3일 후에 혈관 주위에 동원된 세포를 면역형광 염색법을 통하여 확인한 결과이다. 도 11b는 도 11a의 동원된 이식 세포수를 정량화한 결과이다.
도 12a는 하지허혈 동물모델에 각 그룹의 세포 이식 후, 이식한 세포가 혈관내피 세포로 분화되는 것을 확인하기 위하여 이식 28일 후에 이식한 세포가 혈관내피 세포로의 분화를 면역형광 염색법을 통하여 확인한 결과이다. 도 12b는 분화된 이식 세포수를 정량화한 결과이다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험예 1: 후코이단에 의한 노화된 혈관내피 전구세포의 표면 표지자 발현 변화 실험

1-1. 혈관내피 전구세포의 배양

제대혈에서 얻은 단핵구를 혈관내피 전구세포 분화 배지인 EGM-2를 사용하여 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기에서 5일간 배양하였다. 미부착 세포를 제거한 후, 14일간 매일 배지를 교환하여 혈관내피 전구세포를 분리하였다. 분리된 혈관내피 전구세포를 노화시키기 위해 16회 이상 계대 배양하여 노화된 혈관내피 전구세포를 획득하였다.

1-2. 혈관내피 전구세포 표면 표지자 발현 검증

노화된 혈관내피 전구세포에 다양한 농도 (0, 0.1, 1, 10, 30 ㎍/ml)의 후코이단을 24시간 처리하였다. 혈관내피 전구세포의 표면 표지자인 CD34, KDR, c-Kit, CXCR4를 유세포 분석 기법 (FACS analysis)을 이용하여 표면 표지자의 발현을 확인하였다. 그 결과 농도 의존적으로 표면 표지자들의 발현이 증가하는 것을 확인하였으며, 특히 줄기세포 표면 표지자로 알려진 c-Kit의 발현이 10 ㎍/ml을 처리한 구간에서 가장 높게 발현됨을 확인하였다 (도 1).

실험예 2: 후코이단에 의한 노화 회복 효과

2-1. 후코이단에 의한 노화 표지자의 변화

베타 갈락토시데이즈 염색법은 세포 노화를 확인하는 실험 방법으로서, 세포의 노화가 진행되었을 때, 염색결과 녹색으로 염색되는 실험 기법이다. 노화된 혈관내피 전구세포에 후코이단을 다양한 농도 (0, 0.1, 1, 10, 30 ㎍/ml)로 처리한 후, 노화 회복 정도를 노화 관련 베타 갈락토시데이즈 염색법 (senescence-associated β-Galactosidase staining)을 이용하여 확인하였다. 그 결과 10 ㎍/ml 이상의 농도를 처리한 구간에서 후코이단을 처리하지 않은 그룹과 비교하여 가장 큰 유의적인 차이를 나타내며 베타 갈락토시데이즈 양성 세포가 줄어듦을 확인하였다 (도 2a-b).

2-2. 후코이단에 의한 노화 표지자 단백질 발현 변화 검증

Western blotting 기법을 이용하여 세포 노화 표지자 단백질인 senescence marker protein 30(SMP30)과 p21의 발현을 확인하였다. SMP30은 세포 노화가 진행될수록 발현이 감소하는 단백질이며, p21은 세포 노화가 진행될수록 발현이 증가하는 단백질이다. 노화된 혈관내피 전구세포에 후코이단을 다양한 농도 (0, 0.1, 1, 10, 30 ㎍/ml)로 처리한 후, 세포 노화 표지자 단백질인 SMP30과 p21의 발현을 확인한 결과, 후코이단 농도 구배에 의존적으로 SMP30의 발현이 증가하고 p21의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 2c).

실험예 3: 후코이단에 의한 세포 증식 효과

3-1. 후코이단에 의한 세포 증식력 검증

WST-1 assay 기법을 이용하여 후코이단에 의한 세포 증식력을 검증하였다. 노화된 혈관내피 전구세포에 후코이단을 다양한 농도 (0, 0.1, 1, 10, 30 ㎍/ml)로 처리한 후, 세포 증식력을 확인한 결과 후코이단 농도 구배에 의존적으로 세포 증식력이 유의적으로 증가함을 확인하였으며, 10 ㎍/ml 의 농도를 처리하였을 때 가장 세포 증식력이 우수함을 확인하였다 (도 3a).

3-2. 후코이단에 의한 세포 주기 조절 단백질 발현 변화 검증

Western blotting 기법을 이용하여 세포 주기 조절 단백질인 cyclin E, cdk2, cyclin D1 및 cdk4의 발현을 확인하였다. 노화된 혈관내피 전구세포에 후코이단을 다양한 농도 (0, 0.1, 1, 10, 30 ㎍/ml)로 처리한 후, 세포 주기 조절 단백질의 발현을 확인한 결과 후코이단 농도 구배에 의존적으로 cyclin E, cdk2, cyclin D1 및 cdk4의 발현이 증가함을 확인하였다(도 3b).

실험예 4: 후코이단에 의한 세포 신호 조절 기작 검증

후코이단 자극으로 인한 세포 신호 조절 기작을 확인하기 위해 western blotting 기법을 이용하여 세포 생존과 증식과 관련된 세포 신호 인자의 활성도를 확인하였다. 후코이단과 integrin이 결합한다는 이전의 보고를 기초로하여 integrin 하위 신호전달자인 focal adhesion kinase (FAK)의 활성과 FAK의 하위 신호전달 인자 중 세포 생존과 관련된 Akt와 세포 증식과 관련된 extracellular signal-regulated kinase (Erk)의 활성을 인산화 유무를 통하여 확인하였다. 위의 실험예들을 통해 10 ㎍/ml의 후코이단이 최적의 농도임을 확인하였다. 노화된 혈관내피 전구세포에 10 ㎍/ml의 후코이단을 시간별로 처리 (0, 5, 10, 30, 60, 120 분) 후, 시간에 따른 FAK, Akt, Erk의 인산화를 확인한 결과, FAK (5분) → Akt, Erk (각 10분)의 순으로 인산화 됨을 확인하였다. 이러한 결과는 후코이단이 FAK의 인산화를 통해 Akt와 Erk의 인산화를 유도하여 세포 조절에 관여하며 Akt와 Erk 두 신호가 후코이단 자극에 의해 세포 활성을 조절함을 확인하였다.

실험예 5: 후코이단 자극에 의해 활성화된 Akt와 세포 노화 회복 기작 연관성 검증

5-1. Akt에 의한 세포 노화 표지자 발현 변화 검증

베타 갈락토시데이즈 염색법을 통해 후코이단에 의한 세포 노화 회복기작에서 Akt 신호 조절의 연관성을 검증하였다. 후코이단만을 처리한 그룹과 Akt 신호 전달 억제제를 처리후 후코이단을 처리한 그룹을 베타 갈락토시데이즈 염색한 결과 Akt 신호 전달을 억제제를 처리한 그룹에서 베타 갈락토시데이즈 양성세포의 수가 유의적으로 증가함을 확인하였다 (도 5a-b).

5-2. Akt에 의한 세포 노화 표지자 단백질 발현 변화 검증

Western blotting을 통해 후코이단에 의한 세포 노화 표지자 단백질의 발현 변화와 Akt 신호 조절의 연관성을 검증하였다. 후코이단만을 처리한 그룹과 Akt 신호 전달 억제제를 처리후 후코이단을 처리한 그룹을 western blotting을 이용하여 세포 노화 표지자 단백질인 SMP30과 p21의 발현을 확인한 결과, Akt 신호 전달 억제제를 처리한 그룹에서 SMP30의 발현이 감소하고 p21의 발현이 증가함을 확인하였다 (도 5c). 이러한 결과를 통해 후코이단에 의한 세포 노화 회복 기작에서 Akt 신호가 핵심적인 역할을 하는 것을 검증하였다.

실험예 6: 후코이단 자극에 의해 활성화된 Erk와 세포 증식 연관성 검증

6-1. Erk에 의한 세포 증식력 변화 검증

WST-1 assay를 통해 후코이단에 의한 세포 증식 기작에서 Erk 신호 조절의 연관성을 검증하였다. 후코이단만을 처리한 그룹과 Erk 신호 전달 억제제를 처리 후 후코이단을 처리한 그룹을 WST-1 assay를 통해 세포 증식력을 확인하였다. 그 결과, Erk 신호 전달 억제제를 처리한 그룹에서 세포 증식력이 유의적으로 감소함을 확인하였다 (도 6a).

6-2. Erk에 의한 세포 주기 조절 단백질 발현 변화 검증

Western blotting을 통해 후코이단에 의한 세포 주기 조절 단백질 발현 변화와 Erk 신호 조절의 연관성을 검증하였다. 후코이단만을 처리한 그룹과 Erk 신호 전달 억제제를 처리 후 후코이단을 처리한 그룹을 western blotting을 이용하여 세포 주기 조절 단백질인 cyclin E, cdk2, cyclin D1, cdk4의 발현을 확인한 결과, Erk 신호 전달 억제제를 처리한 그룹에서 세포 주기 조절 단백질의 발현이 감소함을 확인하였다 (도 6b). 이려한 결과를 통해 후코이단에 세포 증식 기작에서 Erk 신호가 핵심적인 역할을 하는 것을 검증하였다.

실험예 7: 후코이단 자극에 혈관내피 전구세포의 튜브 형성능 검증

7-1. 후코이단 자극에 의한 혈관내피 전구세포의 튜브 형성능 확인

혈관내피 전구세포의 특징인 혈관 모양의 튜브 형성 능력을 검증하기 위하여 Matrigel assay를 실시하였다. 노화된 혈관내피 전구세포에 후코이단을 다양한 농도 (0, 0.1, 1, 10, 30 ㎍/ml)로 처리한 후, Matrigel assay를 이용하여 튜브 형성능을 확인한 결과, 후코이단 농도 구배에 의존적으로 튜브 형성 능력이 유의적으로 증가함을 확인하였다 (도 7a-b).

7-2. 후코이단에 의한 혈관내피 전구세포의 튜브 형성능과 Akt, Erk 신호와의 연관성 검증

위의 실험예들을 통해 확인한 Akt와 Erk 신호가 튜브 형성능에도 관여하는지를 확인하기 위해 후코이단을 처리한 그룹과 Akt 혹은 Erk 신호 전달 억제제를 각각 처리후 후코이단을 처리한 그룹을 Matrigel assay를 통하여 튜브 형성능을 확인하였다. 그 결과, 이들 두 억제제를 처리한 그룹이 후코이단만을 처리한 그룹과 비교하여 튜브 형성능력이 유의적으로 감소함을 확인하였다. 이들 결과를 통해 후코이단을 통해 활성화된 Akt와 Erk 신호가 혈관내피 전구세포의 튜브 형성능에도 관여함을 확인하였다 (도 7c-d).

실험예 8: 동물실험을 이용하여 후코이단을 처리한 노화된 혈관내피 전구세포의 생물학적 기능 향상 및 혈관 수복 능력 검증

8-1. 마우스 하지허혈 모델 제작 및 혈관내피 전구세포의 이식

마우스 하지허혈 모델을 제작 후, 노화된 혈관내피 전구세포, 후코이단이 처리된 노화된 혈관내피 전구세포, Akt 혹은 Erk 억제제를 각각 처리 후 후코이단이 처리된 노화된 혈관내피 전구세포를 각각 이식하였다. 그 후, laser Doppler perfusion imaging assay를 통하여 28일간 하지허혈 조직의 혈류 개선도를 측정하였다 (도 8a). 그 결과, 다른 그룹과 비교하여 후코이단을 처리한 노화된 혈관내피 전구세포를 이식한 그룹이 혈류 개선도가 유의적으로 증가함을 확인하였다 (도 8b).

8-2. 마우스 하지허혈 모델에서 세포 이식 후, 회복 능력 확인

마우스 하지허혈 모델에 각 그룹의 세포를 이식 후, 하지허혈 조직의 회복능력을 확인하였다. 그 결과, 후코이단을 처리한 노화된 혈관내피 전구세포를 이식한 그룹과 비교하여 다른 그룹들에서 발가락 소실, 허혈조직 다리 괴사 및 다리 소실이 확인되었다 (도 9a-b).

실험예 9: 마우스 하지허혈 모델에서 세포 이식 후, 하지 허혈부위 조직 분석

9-1. 마우스 하지허혈 모델에 세포 이식 후, 혈관 신생 능력 검증

마우스 하지허혈 모델에 각 그룹의 세포를 이식 28일 후, 하지 허혈 조직 부위를 적출하여 혈관 신생 정도를 면역형광염색을 통하여 확인하였다. 모세혈관 표지자인 CD31 (초록색)과 소동맥 표지자인 alpha smooth muscle actin (α-SMA, 빨간색)의 발현을 확인한 결과 다른 그룹들과 비교하여 후코이단을 처리한 노화된 혈관내피 전구세포를 이식한 그룹에서 모세혈관 형성능력과 소동맥 형성능력이 유의적으로 증가함을 확인하였다 (도 10a-b).

9-2. 마우스 하지허혈 모델에 이식한 세포 생존능력 및 세포 증식능력 검증

마우스 하지허혈 모델에 각 그룹의 세포를 이식 3일 후, 하지 허혈 조직 부위를 적출하여 이식한 세포의 생존능력 및 세포 증식능력을 면역형광염색을 통하여 확인하였다. 혈관내피 전구세포를 human nuclei antigen (HNA) antibody 로 확인하였다. 세포 사멸 표지자인 caspase-3 (초록색)의 발현과 HNA (빨간색)의 발현을 확인한 결과, 후코이단을 처리한 노화된 혈관내피 전구세포를 이식한 그룹에서 세포 사멸 표지자의 발현이 유의적으로 감소함을 확인하였다 (도 10a-b). 또한 세포 증식 표지자인 PCNA (초록색)의 발현과 HNA (빨간색)의 발현을 확인한 결과, 후코이단을 처리한 노화된 혈관내피 전구세포를 이식한 그룹에서 세포 증식 표지자의 발현이 유의적으로 증가함을 확인하였다 (도 10a-b).

실험예 10: 마우스 하지허혈 모델에 이식한 혈관내피 전구세포의 동원능 및 분화능 검증

10-1. 마우스 하지허혈 모델에 세포 이식 후, 허혈조직 혈관 주위로 혈관내피 전구세포 동원능 검증

마우스 하지허혈 모델에 각 그룹의 세포를 이식 3일 후, 하지 허혈 조직 부위를 적출하여 이식한 혈관내피 전구세포가 허혈조직 혈관 주위로 동원되는 능력을 면역형광염색을 통하여 확인하였다. CD31 양성 (초록색)의 혈관 주위에 HNA 양성세포 (붉은색)의 존재를 통해 이식 세포의 동원능을 확인한 결과, 다른 그룹들과 비교하여 후코이단을 처리한 노화된 혈관내피 전구세포를 이식한 그룹에서 이식한 세포가 허혈조직 혈관 주위로 동원되는 세포의 수가 유의적으로 증가함을 확인하였다 (도 11a-b).

10-2. 마우스 하지허혈 모델에 세포 이식 후, 혈관 세포로의 분화능 검증

마우스 하지허혈 모델에 각 그룹의 세포를 이식 28일 후, 하지 허혈 조직 부위를 적출하여 이식한 혈관내피 전구세포가 혈관으로 분화되는 능력을 면역형광염색을 통하여 확인하였다. CD31과 HNA 양성세포 통하여 혈관내피 전구세포의 혈관 분화능을 확인한 결과, 다른 그룹들과 비교하여 후코이단을 처리한 노화된 혈관내피 전구세포를 이식한 그룹에서 이식한 세포가 혈관으로의 분화가 유의적으로 증가함을 확인하였다(도 12a-b).

Claims (12)

1. 후코이단(Fucoidan)을 유효성분으로 포함하는 혈관내피 전구세포(Endothelial Progenitor Cell)의 노화 억제용 배지 조성물로서, 상기 노화 억제는 세포주기조절에 의한 것인 배지 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 후코이단은 0.1 내지 50 ㎍/ml 범위의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제1항에 있어서, 상기 후코이단은 세포 노화 표지자인 노화 p21의 발현 수준 감소; 및 항-세포 노화 표지자인 SMP30(senescence marker protein 30)의 발현 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 후코이단은 세포주기 조절 단백질인 CDK2(Cyclin-dependent kinase 2), CDK 4(Cyclin-dependent kinase 4), 사이클린 D1(Cyclin D1) 및 사이클린 E(Cyclin E)의 발현 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
9. 제1항에 있어서, 상기 후코이단은 FAK(focal adhesion kinase), Akt(protein kinase B) 및 Erk(extracellular signal-regulated kinase)의 인산화를 증진시키는 물질임을 특징으로 하는 배지 조성물.
10. 제1항, 제2항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 배지 조성물을 생체로부터 분리된 혈관내피 전구세포(Endothelial Progenitor Cell)에 처리하는 단계를 포함하는 혈관내피 전구세포의 노화 억제 방법.
11. 삭제
12. 삭제

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