KR102009449B1 - Chir99021을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 생물학적 활성 증가용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
Chir99021을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 생물학적 활성 증가용 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 CHIR99021을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 생물학적 활성 증가용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 CHIR99021은 줄기세포의 생물학적 기능, 즉 증식, 분화, 이동, 침윤, 혈관 형성능 등을 전반적으로 향상시키는 우수한 효과를 가지고 있다. 따라서, 본 발명의 CHIR99021은 기존의 문제점들을 극복한 기능강화 줄기세포 제공의 기틀을 마련한 것이며, 허혈성 심혈관 질환에 적용 가능한 새로운 기능강화 줄기세포 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 CHIR99021을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 생물학적 활성 증가용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 줄기세포를 이용한 치료의학은 난치로 알려진 여러 질병에서 큰 가능성을 보이고 있는데 여러 난치질환 가운데서도 특히 허혈성 질환의 경우 높은 유병률과 허혈조직의 제한적인 재생능으로 인해 약물 및 외과적 치료기술의 발달에도 불구하고 치료적 한계를 보이고 있어 근본적인 치료법의 개발이 시급한 상황이다.
심근경색과 같은 중증의 허혈성 질환을 앓고 있는 환자의 경우 환자 자신에게서 이용할 수 있는 세포의 수가 상당이 제한적이고 그 기능 또한 현저히 저하되어있을 뿐만 아니라 병태생리학적 환경에 의해 세포치료제를 사용하였을 경우에도 이식하는 세포의 기능저하가 발생하기 때문이다.
한편, 혈관내피전구세포(Endothelial progenitor cell, EPC)는 골수에서 파생된 세포로서 혈관을 형성하는 내피세포(endothelial cell)로 성숙해질 수 있는 세포이다 (Alev, C. et al., (2011) Antioxid Redox Signal 15: 9490965). 전체 혈액에서 특정한 마커(CD31, CD34, CD133, CD144 (vascular endothelial cadherin), 및 CD309(vascular endothelial growth factor receptor-2)등)를 검출하는 것으로 혈관내피 전구세포를 동정할 수 있다.
또한 혈관내피 전구세포는 혈관의 재생(re-endothelialization)과 신혈관 형성(neovascularization)에 중요한 역할을 한다. 혈관내피 전구세포는 성인 말초혈액으로부터 처음 분리되었으며 이후 골수와 다른 조직으로부터 유래되는 것으로 나타났다 (Asahara, T. et al. (2011) Stem Cells, 29: 1650-1655). 혈관내피 전구세포는 새롭게 생성되는 혈관에서 직접적인 결합 또는 전혈관 생성 요소의 분비에 의해서 혈관재생에 기여한다(Urbich, C. et al. (2005) J Mol Cell Cardiol 39: 733-742). 혈관내피 전구세포는 말초혈액 또는 골수에서 분리된 단핵구세포를 배양함으로써 발견되었다. 배양 시 부착된 세포들은 CD31과 같은 혈관내피계통의 표지의 발현, 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor)의 농도기울기에 따른 세포의 이동, 혈관내피 관구조의 형성, 그리고 생체 내 혈관내피전구세포의 이식 후 허혈조직(ischemic tissue) 내 혈관의 형성을 통한 조직재생 등의 효과를 나타내었다 (Asahara, T. et al. (1999) Circ Res 85: 221-228). 혈관내피 전구세포 이식은 허혈조직 내 새로운 혈관의 형성을 촉진함으로써 심근경색, 뇌졸중, 말초혈관폐쇄성 질환(당뇨병성 족부괴양, 버거씨병 등)을 포함하는 허혈성 질환의 치료에 제공될 것이라 기대된다. 이에 따라 혈관내피 전구세포를 이용해 허혈성 질환에 대한 세포치료제를 개발하고자 하는 다양한 임상연구가 국내외에서 진행 중이다 (Raval, Z. et al. (2013) Circ Res 112: 1288-1302).
때문에 허혈성 조직 재생 및 수복에 여러 차례 그 효능이 검증된 혈관내피전구세포를 이용하고자 하는 노력이 국내외 여러 연구그룹에서 있어왔으나, 환자유래 세포의 노화 및 기능저하로 인하여 실용화단계로 이어지는데 어려움이 있는 실정이다.
즉, 혈관내피 전구세포를 이용하여 생체 기능 회복이 가능한 기능성 세포로의 배양기술 개발은 세포 치료 실용화를 위한 핵심적인 요소로서 이를 위해 세포의 기능조절 인자들을 발굴하고 각 인자들의 작용기전을 분석하여 기능적으로 보다 더 우수한 혈관내피 전구세포를 안정적으로 수급할 수 있는 배양 시스템을 갖추는 것이 필요하며, 이러한 요구에 최근 줄기세포 치료제 실용화를 위한 천연물 및 저분자(small molecule)을 활용한 기능강화 세포치료제 관련 연구가 활발히 진행되고 있는 추세이다.
본 발명자들은 줄기세포의 기능 증진에 기반한 신규한 세포치료제를 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, CHIR99021을 혈관내피 전구세포(endothelial progenitor cell)에 처리한 경우, 혈관내피 전구세포의 증식, 분화, 이동, 침윤 및 혈관 형성능이 전반적으로 향상되었음을 확인함으로써, 허혈성 질환에 적용할 수 있는 새로운 세포치료제인 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 CHIR99021 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 줄기세포의 생물학적 활성 증가용 배지 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 줄기세포에 CHIR99021 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 생물학적 활성 증가 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포 치료 보조제를 제공하는 데 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
이 때, 여기서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.
또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 I의 CHIR99021 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 생물학적 활성 증가용 배지 조성물을 제공한다:
[화학식 I]
본 발명에 따른 조성물에 유효성분으로 포함되는 CHIR99021은 다양한 염 형태, 약학적으로 허용가능한 염 형태로 존재할 수 있으며, 예를 들어, 소듐, 칼륨 등의 알칼리 금속염 형태로 존재할 수 있다.
바람직하게는, 본 조성물은 CHIR99021를 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 줄기세포의 생물학적 활성은 증식, 분화, 이동, 침윤 및 혈관 형성으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "줄기세포"는, 자기복제능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다.
본 발명의 줄기세포는 목적에 따라 적절히 제한 없이 선택될 수 있으며, 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터 유래된 공지된 모든 조직, 세포 등의 성체 세포로부터 유래할 수 있으며, 예를 들어, 골수, 제대혈, 태반(또는 태반 조직세포), 지방(또는 지방조직 세포) 등으로부터 유래할 수 있다.
예컨대, 상기 줄기세포는 골수, 지방 조직, 근육 조직, ex vivo 배양된 자기조직 간엽 줄기 세포, 동종 이계 간엽 줄기 세포, 제대혈, 배 난황낭, 태반, 제대, 골막, 태아 및 사춘기 피부, 그리고 혈액으로부터 제한없이 얻어지는 줄기세포일 수 있으며, 태아 또는 출생직후 또는 성인으로부터 유래된 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 줄기세포는 혈관내피 전구세포(Endothelial Progenitor Cell, EPC), 혈관 줄기세포(Angiogenic Stem Cell), 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell), 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell), 근모세포(Myoblast) 및 심장줄기세포(Cardiac Stem Cell)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 혈관내피 전구세포(Endothelial Progenitor Cell) 또는 혈관 줄기세포(Angiogenic Stem Cell)이며, 가장 바람직하게는 혈관내피 전구세포(Endothelial Progenitor Cell)이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "증식(proliferation)" 또는 "성장(growth) "은 특징적인 세포 유형, 또는 동일할 수 있거나 동일하지 않을 수 있는 세포의 시원 세포 집단으로부터의 세포 유형들의 개수의 증가를 의미한다. 증식을 위해 사용되는 시원 세포는 증식으로부터 생성된 세포와 동일하지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "분화(differentiation)"는, 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 본 발명에서 분화는 줄기세포에서 특정세포로 완전히 분화가 유도된 경우뿐만 아니라 줄기세포에서 특정세포로의 완전 분화되기 전 중간 단계에서 형성되는 배아유사구조체(embryonic body)의 형성도 포함하는 것이다.
본 발명에서 분화 유도는 줄기세포에 CHIR99021을 직접 처리한 경우 특정 세포로의 분화가 유도되는 것뿐만 아니라, 상기 CHIR99021 직접 처리에 의하여 분화능이 향상된 줄기세포를 이용하여 다른 분화가 유도되는 것도 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "이동(migration)"는, 생물학적 또는 환경적인 신호에 의하여 세포가 이동하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "침윤(invasion)"는, 조직 내에서 유주하던 세포가 한 부위에 모여있는 것을 의미한다
본 명세서에서 사용되는 용어 "혈관형성(angiogenesis)" 또는 "혈관신생"은, 혈관이 새로 형성되는 과정, 즉, 새로운 혈관이 세포, 조직 또는 기관 내로 발생 및 분화하는 것을 의미한다.
본 발명의 혈관형성은, 내피 세포 활성화, 이동, 증식, 매트릭스 재형성 및 세포 안정화를 비롯한 혈관 형성 과정에 관련된 혈관재생, 혈관회복 및 혈관분화를 포함한다.
혈관 손상으로 인한 허혈성 조직을 회복을 위해서는 새로운 혈관 신생 작용이 필수적이다. 기존에 존재하는 혈관 내피세포의 증식만으로는 새로운 혈관 신생 및 회복이 불충분하기 때문에 골수로부터 유래된 혈관 줄기세포가 허혈 부위로 동원되어 혈관 수복에 작용하는 것은 혈관 신생 과정에서 가장 중요하다.
본 발명에 따르면, 상기 조성물은 골수에서 허혈조직으로의 혈관 줄기세포의 동원을 증진시키고, 혈관 내피세포와의 결합능을 향상시키며, 혈관으로의 분화능을 향상시킨다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 본 조성물의 CHIR99021은 1 내지 20 ㎍/ml 범위의 농도로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 1 내지 10 ㎍/ml 범위의 농도이고, 보다 더욱 바람직하게는 1 내지 5 ㎍/ml 범위의 농도이며, 가장 바람직하게는 3 ㎍/ml의 농도이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 줄기세포에 상기 CHIR99021을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 생물학적 활성 증가 방법을 제공한다:
또한, 본 방법은 CHIR99021을 줄기세포에 처리하고 10 시간 이상 15시간 이하로 공배양할 수 있다.
본 발명에 따르면, CHIR99021을 줄기세포, 특히, 혈관 재생 및 신생에 특화되어 있는 혈관내피 전구세포와 함께 배양하면, Wnt 신호의 활성화를 유도하여, 타겟 유전자 발현을 통한 세포의 효과적인 생물학적 활성 증가가 달성되도록 한다.
본 발명의 방법은 상술한 CHIR99021 및 줄기세포를 이용하므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 조성물을 포함하는 줄기세포 치료 보조제를 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "줄기세포 치료 보조제"는, 당업계에서 일반적으로 사용되는 줄기세포 치료제(세포 치료제)의 효과를 증진시키기 위하여 보조적으로 사용될 수 있는 제재를 말하며, 본 발명에 의한 보조제를 사용함으로써 줄기세포 치료제의 줄기세포의 노화 억제 및 증식을 촉진하여 치료제의 효과를 향상시킬 수 있다.
상기 "세포 치료제"란, 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아 있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 여타 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등 일련의 행위를 통하여 치료, 진단, 예방 목적으로 사용되는 의약품을 말하며, 특히 "줄기세포 치료제" 배아줄기세포 치료제와 성체줄기세포 치료제로 분류할 수 있다.
상기 줄기세포 치료 보조제는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 인체에 투여될 수 있다.
비경구 투여, 예를 들어 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 줄기세포 치료 보조제는 또한 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 줄기세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 투여될 수 있으며, 이런 담체로 생리학적 식염수를 예로 들 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 줄기세포 치료는 허혈성 질환 치료이다.
상기 허혈성 질환은, 바람직하게는 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 허혈성 대머리, 허혈성 뇌졸중 및 허혈성 하지질환으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 보다 바람직하게는 허혈성 심장질환, 허혈성 심근경색, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 뇌졸중 및 허혈성 하지질환으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 허혈성 심근경색 또는 허혈성 하지질환일 수 있다.
본 발명의 CHIR99021은 줄기세포의 생물학적 기능, 즉 증식, 분화, 이동, 침윤, 혈관 형성능 등을 전반적으로 향상시키는 우수한 효과를 가지고 있다. 따라서, 본 발명의 CHIR99021은 기존의 문제점들을 극복한 기능강화 줄기세포 제공의 기틀을 마련한 것이며, 허혈성 심혈관 질환에 적용 가능한 새로운 기능강화 줄기세포 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 CHIR99021을 처리하여 증폭 배양한 CD34+ 세포(혈관줄기세포)의 형태학적 특성 및 증식능을 확인한 결과이다. 도 1b는 CHIR99021 처리 후 혈관줄기세포로부터 혈관내피세포계열로의 분화능을 확인한 결과이다.
도 2a는 CHIR99021 처리 시 혈관내피 전구세포의 증식능을 확인한 결과이다. 도 2b 및 도 2c는 CHIR99021 처리로 인한 혈관내피 전구세포 내 세포주기의 변화 및 세포주기 조절 인자들의 단백질 발현정도를 확인하고 분석한 결과이다.
도 3a 및 도 3b는 CHIR99021 처리에 의한 혈관내피 전구세포의 이동능 변화를 확인하고 정량한 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 CHIR99021 처리 시 혈관내피 전구세포의 기능 관련 표지자(VEGFR2, CXCR4) 발현의 변화를 단백질 및 유전자 수준에서 확인하고 정량한 결과이다.
도 5a 및 도 5b는 CHIR99021 처리에 의한 세포의 침윤능 변화와 관련 조절 인자들의 단백질 발현정도를 확인하고 정량한 결과이다.
도 6은 CXCR4가 CHIR99021 처리로 인한 Wnt 신호의 direct transcriptional target인지 promoter activity를 통해 확인한 결과이다.
도 7은 CHIR99021 처리에 의한 혈관형성능을 확인하고 정량한 결과이다.
도 8은 하지허혈 동물모델을 이용하여 CHIR99021의 혈관재생능을 분석한 결과이다.
도 2a는 CHIR99021 처리 시 혈관내피 전구세포의 증식능을 확인한 결과이다. 도 2b 및 도 2c는 CHIR99021 처리로 인한 혈관내피 전구세포 내 세포주기의 변화 및 세포주기 조절 인자들의 단백질 발현정도를 확인하고 분석한 결과이다.
도 3a 및 도 3b는 CHIR99021 처리에 의한 혈관내피 전구세포의 이동능 변화를 확인하고 정량한 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 CHIR99021 처리 시 혈관내피 전구세포의 기능 관련 표지자(VEGFR2, CXCR4) 발현의 변화를 단백질 및 유전자 수준에서 확인하고 정량한 결과이다.
도 5a 및 도 5b는 CHIR99021 처리에 의한 세포의 침윤능 변화와 관련 조절 인자들의 단백질 발현정도를 확인하고 정량한 결과이다.
도 6은 CXCR4가 CHIR99021 처리로 인한 Wnt 신호의 direct transcriptional target인지 promoter activity를 통해 확인한 결과이다.
도 7은 CHIR99021 처리에 의한 혈관형성능을 확인하고 정량한 결과이다.
도 8은 하지허혈 동물모델을 이용하여 CHIR99021의 혈관재생능을 분석한 결과이다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험예 1: CHIR99021 처리 배양조건에 따른 CD34+세포(혈관내피 전구세포, Endothelial Progenitor Cell)의 증식능 및 분화능 검증
1-1. 혈관줄기세포의 분리 및 배양
인간유래 제대혈로부터 단핵세포를 밀도차에 의한 분획법으로 추출한 후, MACS ; magnetic cell separation 방법을 통해 CD34+ 세포(혈관줄기세포, 혈관내피 전구세포)만을 획득하여 일반 배지와 CHIR99021이 농도 별로 첨가된 배지로 7일간 증폭 배양하였다.
1-2. CHIR99021처리에 의한 세포의 형태학적 변화 및 증식능 분석
증폭 배양된 혈관줄기세포에서 CHIR99021 처리 농도에 따른 세포의 형태학적 변화 및 증식능을 확인하였다.
그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 처리된 CHIR99021의 농도 의존적으로 증폭 배양된 세포의 수가 증가함을 확인하였으나 6 uM(㎍/ml) 이상의 고농도에서 배양 중 세포독성문제가 발견되어 3uM의 농도에서 혈관줄기세포가 가장 효과적으로 증폭됨을 확인하였다.
이하, 하기 실시예에서는 세포 독성 및 증식능 실험결과를 토대로 3 ㎍/ml의 농도를 최적의 농도로 설정 후, 세포 배지에 첨가하여 48 시간동안 배양하는 방식으로 처리하였다.
1-3. CHIR99021처리에 의한 세포의 분화능 분석
혈관줄기세포의 분화능 분석을 위해 세포외기질과 유사한 성분으로 이루어진 반고체 상태의 배지를 활용하여 혈관줄기세포를 배양하면서 하나의 세포로부터 형성된 콜로니를 비교 분석하였다.
그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 미분화세포의 군집인 small colony와 비교적 분화가 진행 된 세포의 군집인 large colony의 수가 CHIR99021 처리 배양조건에서 유의적으로 증가함을 확인하였다.
실험예 2: CHIR99021처리에 의한 혈관내피 전구세포의 증식능 및 세포주기 변화 분석
2-1. cell counting assay를 통한 세포의 증식능 분석
혈관내피전구세포에 CHIR99021을 처리하고 일정 시간 배양한 후, trypan blue 염색법을 이용하여 살아있는 세포만을 계수하였다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, CHIR99021 처리 배양 조건에서 시간의존적으로 대조군에 비해 세포의 수가 증가함을 확인하였다.
2-2. CHIR99021 처리에 의한 세포주기 조절인자들의 단백질 발현 변화 검증
혈관내피전구세포에 CHIR99021을 처리하고 일정 시간 배양한 후, 세포로부터 전체 단백질을 분리하였다. 상기 단백질을 이용하여 공지된 방법에 따라, Western blotting 기법을 통하여 세포주기 조절인자 CyclinD1, CDK4, CyclinE, CDK2의 발현정도를 확인하였다. CyclinD1, CDK4, CyclinE, CDK2는 세포주기 중에서도 G1기에서 DNA의 복제가 일어나 세포의 분열을 준비하는 S기로의 진행과정을 조절한다고 알려져 있다.
그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, CHIR99021처리로 인한 인자들의 발현정도를 확인한 결과 대조군에 비해, 세포주기 조절 인자의 발현 정도가 유의적으로 증가함을 확인하였다.
2-3. PI 염색법을 이용한 세포주기 분석
혈관내피전구세포에 CHIR99021을 처리하고 일정 시간 배양한 후, PI 염색을 수행하였다. Propidium Iodide(PI)는 DNA binding dye로 G1, S, G2, M기로 이어지는 세포주기동안 일어나는 세포의 DNA양 변화를 확인하여 세포주기를 분석하는데 이용하였다.
그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, PI를 이용한 세포주기 분석 결과 CHIR99021 처리 시 세포의 S기(%)가 대조군에 비해 유의적으로 증가함을 확인하였다.
실험예 3: CHIR99021처리에 의한 혈관내피 전구세포의 이동능 변화 분석
3-1. scratch wound healing 기법을 통한 이동능 분석
혈관내피전구세포에 CHIR99021을 처리하고 일정 시간 배양한 후, 이동능을 분석하였다. 구체적으로, scratch wound healing assay는 세포의 이동능 분석을 위한 기법 중 하나로 70% 이상의 confluency로 배양된 단일 세포층에 일정한 wound를 주어 damaged area로 세포가 이동하는 현상을 관찰하였다.
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, CHIR99021 처리 후 damaged area로의 세포의 이동정도가 대조군에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.
3-2. transwell migration 기법을 통한 이동능 분석
혈관내피전구세포에 CHIR99021을 처리하고 일정 시간 배양한 후, 이동능을 분석하였다. 구체적으로, transwell migration assay는 또 다른 세포의 이동능 분석법 중 하나로 세포의 이동을 자극하는 특정 attractant를 이동능을 보고자 하는 세포와 함께 transwell을 이용하여 공배양 하여 attractant를 향한 세포의 이동능을 분석하였다.
그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, CHIR99021 처리 후 세포의 이동능이 대조군 비교 유의적으로 증가함을 확인하였다.
실험예 4: CHIR99021 처리로 인한 세포 표지자 발현 변화 검증
4-1. CHIR99021 처리 후 세포의 표지자 발현 분석
이동능 결과를 토대로 CHIR99021처리로 인한 Wnt 신호의 활성화가 줄기세포의 이동능을 조절한다고 알려진 CXCR4의 발현과 관계가 있을 것이라 추측하고 FACS 분석을 통하여 CHIR99021 처리 후 일어나는 세포의 기능 관련 표지자(VEGFR2, CXCR4)의 발현 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, CXCR4의 발현이 CHIR99021 처리에 의해 2배 이상 증가함을 확인하였다.
4-2. CXCR4의 mRNA수준에서의 발현 분석
reverse transcription pcr을 이용하여 CXCR4의 발현을 유전자 수준에서 분석하였다.
그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, CHIR99021 처리 후 단백질 수준에서 뿐만 아니라 유전자 수준에서도 CXCR4의 발현이 대조군에 비해 유의적으로 증가함을 확인하였다.
이를 통해, CXCR4가 CHIR99021 처리에 의해 활성화 되는 Wnt 신호의 타켓 유전자일 가능성이 있음을 확인하였다.
실험예 5: CHIR99021 처리 후 혈관내피 전구세포의 침윤능 및 관련 조절인자 발현 분석
5-1. invasion 기법을 활용한 세포의 침윤능 분석
혈관내피전구세포에 CHIR99021을 처리하고 일정 시간 배양한 후, 세포 침윤 정도를 분석하였다. 구체적으로, invasion assay는 세포외기질과 유사한 성분이 코팅된 membrane이 장착되어있는 transwell을 이용하여 attractant를 향해 세포외기질성분을 뚫고 이동하는 세포의 침윤능을 확인하기 위한 실험 기법이다.
그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 혈관내피 전구세포가 각 조직사이를 뚫고 새롭게 혈관을 형성하는데 아주 중요한 능력으로 CXCR4의 ligand인 SDF-1a를 attractant로 처리하여 실험한 결과 세포의 침윤능이 CHIR99021이 처리된 그룹에서 크게 증가하는 것을 확인하였다.
5-2. 침윤능 관련 조절 인자들의 단백질 발현 변화 검증
Western blotting기법을 통하여 침윤능 관련 조절 인자 Cathepsin B, D, MMP9 의 발현정도를 확인하였다. 대표적인 ECM 분해 효소로 잘 알려진 MMP9 뿐만 아니라 Cathepsin B, D 또한 lysosomal protease로 ECM 분해를 통해 혈관내피 전구세포의 혈관생성과정에 관여한다고 알려져 있다.
그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, CHIR99021 처리 시 침윤능 관련 조절 인자들의 단백질 발현이 유의적으로 증가함을 확인함으로써 혈관 내피 전구세포의 침윤능이 ECM remodeling 효소들의 발현과 연관되어있음을 확인하였다.
실험예 6: CHIR99021처리로 인한 Wnt 신호의 타겟 유전자 분석
혈관내피 전구세포의 표지자 발현 분석 결과를 토대로 CXCR4가 Wnt 신호의 직접적인 타겟인지 확인하기 위해 luciferase assay를 통하여 타겟 유전자인 CXCR4의 프로모터 활성도를 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, CXCR4 프로모터에 Wnt 타겟 유전자의 발현을 조절하는 전사인자(TCF/LEF)가 결합할 수 있는 site가 존재함을 확인하였으며 CHIR99021 처리에 반응하여 프로모터의 활성도가 증가함을 확인함으로써 CXCR4의 발현이 Wnt 신호의 직접적인 조절에 의한 것임을 확인하였다.
실험예 7: CHIR99021 처리 후 혈관내피 전구세포의 혈관형성능 변화 분석
tube formation assay를 통해 혈관내피 전구세포의 혈관형성능을 비교 분석하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, CHIR99021 처리 시 세포의 혈관형성능이 유의적으로 증가할 뿐만 아니라 CXCR4의 antagonist인 AMD3100처리 시 증가하였던 세포의 혈관형성능이 다시 유의적으로 감소하는 것을 확인함으로써 Wnt 신호 의존적으로 활성화되는 CXCR4에 의해 혈관내피 전구세포의 혈관형성능이 증진되는 것임을 확인하였다.
실험예 8: 하지 허혈 동물모델을 이용한 CHIR99021의 혈관재생능 분석
하지허혈 동물모델을 제작한 후, 각 동물모델에 일반 혈관내피 전구세포 또는 CHIR99021 처리로 인하여 기능이 증진된 혈관내피 전구세포를 이식하였다. 혈관 재생능을 laser doppler를 이용하여 혈역학적으로 분석하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 대조군인 일반 혈관내피 전구세포를 이식한 경우보다 CHIR99021을 전처리하여 기능을 증진시킨 혈관내피 전구세포를 이식한 경우 혈관의 재생능이 유의적으로 증진되어있음을 확인함으로써 Wnt 신호 조절물질인 CHIR99021이 중증 허혈성 질환을 치료하는데 있어 새로운 전략이 될 수 있음을 제시하였다.
결론적으로, 본 발명의 CHIR99021은 Wnt 신호 활성화를 통하여 세포 기능과 밀접한 관련이 있는 다양한 타겟 유전자의 발현을 유도하여, 줄기세포의 생물학적 기능을 전반적으로 향상시키며 이를 통해 줄기세포 활성을 증진시켰다.
Claims (8)
- 하기 화학식 I의 CHIR99021 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 혈관내피 전구세포(Endothelial Progenitor Cell, EPC)의 이동, 침윤 및 혈관 형성 증가용 배지 조성물:
[화학식 I]
.
- 제1항에 있어서, 상기 CHIR99021은 1 내지 20 ㎍/ml 범위의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 혈관내피 전구세포(Endothelial Progenitor Cell, EPC)에 하기 화학식 I의 CHIR99021 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 생체외에서의 혈관내피 전구세포(Endothelial Progenitor Cell, EPC)의 이동, 침윤 및 혈관 형성 증가 방법:
[화학식 I]
.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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