KR20110109159A

KR20110109159A - 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도를 위한 ｐｋｃ 활성화제의 용도

Info

Publication number: KR20110109159A
Application number: KR1020100028761A
Authority: KR
Inventors: 황기철; 장양수
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2010-03-30
Filing date: 2010-03-30
Publication date: 2011-10-06

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도를 위한 PKC 활성화제의 용도 및 PKC 활성화에제 의해 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 심장성 세포를 포함하는 심장질환 치료용 의약 조성물에 관한 것이다. 중간엽 줄기세포의 심장으로의 이식은 경색된 심장의 면역학적 및 기능적 개선을 가져다 주긴 하나 전기적 안정성을 제공할 수 없는 반면, PKC 활성화제로 처리된 중간엽 줄기세포는 심장특이적 마커를 발현하는 심장성 세포로 분화 유도됨으로써 호스트 심장 조직과의 전기기계적 통합이 개선되어 전기적 안정성을 제공하게 되므로 심장 질환을 효과적으로 치료할 수 있게 된다.

Description

중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도를 위한 ＰＫＣ 활성화제의 용도{USE OF PKC ACTIVATOR FOR INDUCING DIFFERENTIATION OF MESENCHYMAL STEM CELLS TO CARDIOGENIC CELLS}

본 발명은 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도를 위한 PKC 활성화제의 용도 및 PKC 활성화제에 의해 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 심장성 세포를 포함하는 심장질환 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.

많은 다양한 세포 유형들이 허혈성 심장에 대한 줄기세포 치료제의 후보로서 고려되었지만, 전기기계적 통합의 측면에서 이상적인 세포 유형은 아직까지 발견되지 않고 있다(Segers, V.F. & Lee, R.T. Nature 451, 937-942 (2008)). 실제로, 순수한 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)의 심근세포로의 분화는 생체 내에서 극히 낮은 비율로 관찰되었을 뿐만 아니라, 이식된 줄기세포와 심장근육과의 전기기계적 통합 능력은 불확실하다(Chang, M.G., et al. Circulation 113, 1832-1841 (2006)).

사실, 본 발명자들은 이전에 중간엽 줄기세포의 이점을 증가시키기 위한 많은 연구(Song, S.W., et al. Stem Cells 27, 1358-1365 (2009); Chang, W., et al. Stem Cells 27, 2283-2292 (2009); Song, H., et al. Stem Cells 25, 1431-1438 (2007))의 수행을 통해 이식 세포의 생존율을 향상시키거나 경색 심장의 기능적인 향상을 유도하였으나, 중간엽 줄기세포의 이식이 경색 후의 급작스런 사망의 발생을 줄이지는 못하는 것을 발견하였다. 기능의 향상에도 불구하고 생존율이 개선되지 못하는 것은 이식한 줄기세포와 심장 근육과의 이종성으로 인해 전기적인 통합성을 이루지 못하기 때문이다.

본 발명은 중간엽 줄기세포의 심근경색에 대한 세포치료제로서의 활용을 위해 중간엽 줄기세포로부터 이식 후 심장근육과의 전기기계적인 통합성을 이룰 수 있는 세포인 심장성 세포로의 분화를 유도하는 방법을 제공하고자 한다.

이식된 세포와 심근 간의 이종성을 피하기 위해서는 중간엽 줄기세포를 경색된 심장으로 전달하기 전에 심인성 특성에 대한 중간엽 줄기세포의 조절이 필요할 수 있으며, 이는 수축 기능과 전기적 안전성의 개선을 가져다 줄 수 있을 것이다.

이러한 점에 착안하여 본 발명자들은 중간엽 줄기세포를 심근세포로 유도할 수 있는 방법에 대해 지속적으로 연구하였다. 그 결과, 단백질 키나아제 C(Protein Kinase C, PKC) 활성화제가 중간엽 줄기세포를 심장성 세포로 분화 유도할 수 있음을 밝혔다. 하기 실시예에서는 PKC 활성화제에 의해 엑스 비보(ex vivo) 상에서 변형된 랫트의 중간엽 줄기세포가 변형을 거치치 않은 순수한 중간엽 줄기세포와 비교하여 심장특이적 마커를 발현하며, 면역학적 기능적 개선뿐만 아니라 전기적 안정성을 제공함을 보여준다.

따라서, 본 발명은 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도를 위한 PKC 활성화제의 용도, PKC 활성화제를 중간엽 줄기세포에 처리하는 것을 포함하는 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도 방법 및 PKC 활성화제를 포함하는 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도에 사용되는 PKC 활성화제의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 한 구체예에서, PKC 활성화제는 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate, PMA)일 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서 심장성 세포로의 분화 유도를 위해 사용되는 중간엽 줄기세포의 종류 또한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 중배엽 줄기세포는 그것이 어디로부터 유래한 것인지 관계없이 이용될 수 있다. 중간엽 줄기세포는 공지의 중간엽 줄기세포 공급원, 예를 들어 골수, 조직, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻을 수 있다. 골수, 조직 등의 채취 대상인 동물은 포유동물일 수 있다. 상기 동물이 인간일 경우 골수, 조직 등은 본 발명의 조성물의 처리에 의해 심장성 세포로의 분화가 유도된 중배엽 줄기세포를 세포치료제로서 투여하게 될 환자 자신의 것이나 타인 유래의 것일 수 있다. 이러한 공지의 중간엽 줄기세포 공급원으로부터 중간엽 줄기세포를 수득하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.

한편, 중간엽 줄기세포에 대해 PKC 활성화제를 처리하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 일정 시간 동안 PKC 활성화제와 중간엽 줄기세포를 접촉시켜 중간엽 줄기세포 내의 PKC가 활성화될 수 있기만 하면 된다. 한 구체예에서, PKC 활성화제의 처리는 중간엽 줄기세포를 PKC 활성화제를 포함하는 배지에서 배양함으로써 수행할 수 있다.

중간엽 줄기세포에 처리되는 PKC 활성화제의 농도는 구체적은 PKC 활성화제의 종류에 따라 달라질 수 있을 것이다. 한 구체예에서, PKC 활성화제의 농도는 0.01 내지 100 μM의 범위에서 사용될 수 있다.

중간엽 줄기세포의 분화 유도에 일반적으로 요구되는 시간을 고려할 때, PKC 활성화제를 포함하는 배지에서의 배양은 5일 내지 15일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 중간엽 줄기세포에 대한 PKC 활성화제의 처리의 기간은 처리되는 PKC 활성화제의 종류 또는 농도에 따라 달라질 수 있을 것이다.

본 발명에 있어서 "심장성 세포"는 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 심근세포 또는 심근세포로의 분화 과정에 있는 세포를 모두 포함한다. 본 명세서에서 "심장성 세포"와 "심근세포"는 상호교환적으로 사용된다. 본 발명에 있어서, PKC 활성화제의 처리에 의해 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 심장성 세포는 심장 특이적 마커의 발현을 나타낸다. 본 발명의 방법에 따라 수득한 심장성 세포는 심장 특이적 마커의 발현이 중간엽 줄기세포에 비해 증가되어 있는 것일 수 있다. 심장 특이적 마커는 이에 제한되는 것은 아니나, cTnT(cardiac troponin T), MLC(myosin light chain) 및 MHC(myosin heavy chain)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 상기 심장성 세포는 Cx43(connexin 43)의 발현이 중간엽 줄기세포에 비해 증가되어 있는 것일 수 있다. 추가로, 상기 심장성 세포는 Ca²⁺ 항상성-관련 단백질 의 발현이 중간엽 줄기세포에 비해 증가되어 있는 것일 수 있다. Ca²⁺ 항상성-관련 단백질은 이에 제한되는 것은 아니나, SERCA 2a 또는 LTCC일 수 있다.

본 발명은 또한 PKC 활성화제를 포함하는 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다. 앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에서 사용되는 PKC 활성화제의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 한 구체예에서, PKC 활성화제는 포르볼 미리스테이트 아세테이트일 수 있다. 상기 조성물은 중배엽 줄기세포의 배양시 일반적으로 사용되는 배지를 포함할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 이러한 배지로는 예컨대, MEM-alpha (Minimum Essential Medium alpha), MSCGM(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 등이 포함될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 방법에 의해 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 심장성 세포를 포함하는 심장질환 치료용 의약 조성물을 제공한다. 상기 의약 조성물은 줄기세포의 이식을 위해 당업계에서 사용되고 있는 공지의 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 심장성 세포의 유효량은 1×10⁴ 내지 1×10⁸ 세포/㎏일 수 있다. 그러나, 이들의 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 병변의 정도에 따라 적의 증감될 수 있다. 본 발명에 따른 제제는 비경구 또는 국소투여에 의해 인체에 적용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 유효성분을 퉁상의 방법에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체에 현탁시키거나 용해시키는데, 이 때 수용성 담체를 사용하는 것이 바람직하다.

중간엽 줄기세포의 심장으로의 이식은 경색된 심장의 면역학적 및 기능적 개선을 가져다 주긴 하나 전기적 안정성을 제공할 수 없는 반면, PKC 활성화제로 처리된 중간엽 줄기세포는 심장특이적 마커를 발현하는 심장성 세포로 분화 유도됨으로써 호스트 심장 조직과의 전기기계적 통합이 개선되어 전기적 안정성을 제공하게 되므로 심장 질환을 효과적으로 치료할 수 있게 된다.

도 1은 손상 및 치료 후 11일 동안의 대조군(n=12), sham-주입된 랫트(n=27), 및 MSCs-이식된 랫트(n=19)에서의 급사 발생율을 보여주는 그래프이다.
도 2는 심근 조직의 생존력을 평가하고 심근 경색 크기를 측정하기 위한 TTC 염색의 결과를 보여준다.
도 3은 세포 이식체 내의 간질 섬유화를 탐지하기 위한 Masson's trichrome 염색의 결과를 보여준다.
도 4는 세포자멸사 세포 수의 측정을 위한 TUNEL 어세이의 결과를 보여준다.
도 5는 염증성 세포 침윤물의 측정을 위한 H & E 염색 결과를 보여준다.
도 6은 경색된 심장의 실제 이미지 및 활동성 맵을 보여준다.
도 7은 대조군, sham-주입된, MSCs-, 및 CPMs-이식된 심장에서의 활동 전위를 보여준다.
도 8은 중간엽 줄기세포가 이식된 구역으로부터 기록된 활동 전위 지속시간(action potential durations, APDs)을 보여주는 그래프이다.
도 9는 sham-주입된 심근 내 변연부에서의 이소성 박동을 보여주는 도면이다.
도 10은 sham-주입된 심장 및 MSCs 이식된 심장에서의 국부 전도 속도(CV)를 보여주는 그래프이다.
도 11은 초고속 조율 프로토콜(burst pacing protocol)에 따른 전기적 취약성 테스트의 결과를 보여준다.
도 12는 MSCs-이식된 부위에서의 심실성 빈맥(VT) 동안의 순차적인 전압도(voltage map)를 보여준다.
도 13은 MSCs를 심근성 세포로 분화 유도할 수 있는 화합물의 스크리닝을 위한 Principle component analysis (PCA)의 결과를 보여준다.
도 14는 치료 후 지정 일자에서의 대조군인 MSCs 및 CPMs에서의 MSCs 특이적 마커인 CD90, 및 심장 특이적 마커인 cTnT(cardiac troponin T), MLC(myosin light chain), MHC(myosin heavy chain) 및 Cx43의 발현 변화에 대한 면역세포화학적 측정 결과를 보여준다.
도 15는 심장성 표현형이 CPMs에서 고르게 상향조절됨을 보여주는 면역세포화학적 분석 결과를 보여준다.
도 16 내지 도 18은 MSCs 및 CPMs 이식군에서의 α-아드레날린성, β-아드레날린성 및 무스카린성 수용체의 mRNA 발현의 변동을 보여주는 그래프이다.
도 19는 노르에피네프린(NE) 자극에 의한 인산화된 ERK1/2의 수준 변화를 보여준다.
도 20은 노르에피네프린에 의해 유도된 hypertrophic signals이 α-아드레날린성 수용체 차단제인 프라조신(prazocin)에 의해 차단됨을 보여준다.
도 21은 대조군인 MSCs 및 CPMs에서의 Ca²⁺ 항상성-관련 단백질인 SERCA 2a 및 LTCC의 발현 변화를 보여준다.
도 22는 경색 영역 내 주입된 세포와 주변의 심근세포들 간의 면역조직학적 분석 결과를 보여준다.
도 23은 MSCs-이식된 영역 및 CPMs-이식된 영역에서의 CV 맵을 나타낸 것이다.
도 24는 MSCs- 및 CPMs-이식된 심장에서의 실제 심장 이미지 및 CV 벡터를 보여준다.
도 25는 각 실험군에서의 활동 전위기 0의 상승 시간을 보여주는 그래프이다.
도 26은 각 실험군에서의 초고속 조율 프로토콜(burst pacing protocol)에 의한 전기적 취약성 테스트의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 27A는 좌심실 경색 크기의 측정을 위한 TTC 염색 결과를, 도 27B는 섬유화 지역의 측정을 위한 Masson's trichrome 염색 결과를, 도 27C는 세포자멸 세포 수의 측정을 위한 TUNEL 어세이 결과를 보여준다.
도 28은 섬유성 마커인 콜라겐 I, 파이브로넥틴 및 α-SMA에 대한 면역염색 결과를 보여준다.
도 29은 CPMs-이식된 영역에서의 염증성 세포 침윤물을 측정하기 위한 H & E 염색 결과를 보여준다.
도 30 내지 도 32은 각 실험군 내 경색된 영역에서의 염증성 사이토카인의 mRNA 발현 변화를 보여주는 RT-PCR 결과를 보여준다.
도 33은 복강내 이소프로테레놀 주사 동안 6 lead ECG 로 기록된 각 실험군에서의, 조기 심실 수축(PVCs)의 횟수를 보여준다.
도 34은 좌심실 혈류역학에 미치는 CPMs이 미치는 영향을 보여준다.
도 35는 손상 및 치료 후 11일 동안의 각 실험군에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선을 보여준다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[실시예]

랫트 MSCs의 분리 및 배양

4주령 수컷 Sprague-Dawley 랫트의 대퇴골 및 경골의 골수천자액(약 100g)으로부터 MSCs를 얻고, 10% FBS와 1% 항생-페니실린/스트렙토마이신 용액(Invitrogen)이 보충된 10 ml의 DMEM-저 글루코스 배지에서 배양하였다. 수집된 배지를 1,600 rpm으로 5 분 동안 원심분리하고, MSC 배지 중에 재현탁시킨 다음, Ficoll-PaqueTM PLUS (GE Healthcare Life Sciences)로 퍼콜 밀도 구배 원심분리를 1,600 rpm으로 30 분 동안 수행하였다. 원심분리 후 중간 인터페이스로부터 골수 단핵구 세포들을 회수하고, PBS로 2회 세척한 후, 10% FBS-DMEM 중에서 재현탁시키고, 100 cm² 플라스크에 플레이팅하였다. 배양 조건은 5% CO2를 포함하는 습윤한 대기에서 37℃를 유지시켰다. 72 시간 후, 비-부착된 세포들을 플라스크로부터 떨구어 내어 버리고, 부착된 세포들은 PBS로 2회 완전히 세척하였다. 신선한 MSC 배지를 가하고, 약 10일 동안 매 3일마다 배지를 교체하여 MSCs를 얻었다. MSCs의 특성을 면역표현형분석(immunophenotyping)에 의해 검증하였다. 세포들을 형광 항체와 컨쥬게이션되는 다양한 마커에 대해 라벨링하고 (CD14, CD34, CD71, CD90, CD105 및 ICAM-1; Santacruz Biotechnology), 유세포분석 및 면역형광분석에 의해 분석하였다.

PKC 활성화에 의한 랫트 MSCs의 엑스 비보 변형

2계대에서, MSCs를 60 mm 플레이트에 2 x 105 cells/ml로 위와 동일한 배지를 이용하여 분주하고, 단백질 키나아제 C(PKC) 활성화제인 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate, PMA) (Sigma)를 최종 농도 1 μM로 처리하고 매 3일에 한번씩 PMA를 함유한 신선한 배지로 교체하여 9일간 배양하였다.

신생 랫트 심실 심근세포의 분리 및 배양

심근세포는 Sprague-Dawley 신생 랫트 심장으로부터 얻었다. 적혈구를 감소시키기 위해, 분리된 심장 조직을 Dulbecco's phosphate-buffered saline solution (pH 7.4 Gibco BRL, NY)으로 세척하였다. 마이크로-절개용 가위를 이용하여, 심장을 대략 0.5 mm³ 조각이 되도록 절개하고, 4 ml의 콜라게나아제 II(1.4 mg/ml, 270 units/mg, Gibco BRL, NY)로 5분 동안 37℃의 습윤한 챔버에서 처리하였다. 그런 다음, 상청액을 제거하고 10% FBS DMEM로 세척하였다. 세포들을 10% FBS를 함유한 동량의 신선한 배지에 재현탁하였다. 남아있는 조직들을 신선한 콜라게나아제 II 용액으로 추가 5분간 처리하였다. 조직이 완전히 분해될 때까지 인큐베이션 과정을 반복하였다. 생성된 상청액을 실온에서 2000 rpm으로 2분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛을 5 ml의 세포 배양 배지에 재현탁하고, 이를 배양 접시에 플레이팅하고 5% CO₂인큐베이터 내에서 37℃에서 적어도 2시간 동안 인큐베이션하였다. 부착된 세포들은 섬유아세포이고, 비-부착된 세포들은 심근세포이다. 부착되지 않은 심근세포들을 100 mm 배양 접시에 다시 플레이팅하고(5 × 10⁵cell/ml), 10% FBS가 보충된 α-MEM으로 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포들을 37℃의 CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 섬유아세포에 의한 오염을 박기 위해, 0.1mM 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (Brd-U) (Sigma, MO)이 포함된 α-MEM을 사용하였다.

심근경색의 유도 및 세포의 이식

동물 연구에 대한 모든 실험 과정은 연세대학교 의과대학 실험동물운영위원회에 의해 승인을 받았으며, 동물 보호에 대한 위원회의 가이드라인과 조정에 따라 수행되었다. 심근 경색은 8주령의 Sprague-Dawley 수컷 랫트에서 이전에 기술된 방법에 따라(Song, S.W., et al. Stem Cells 27, 1358-1365 (2009)) 좌전하방(LAD) 관상 동맥의 수술로 인한 폐색에 의해 야기되었다. 요약하면, 졸레틸 (20 mg/kg) 및 자일라진 (5 mg/kg)으로의 마취 유도 후, 3번째와 4번째 갈비뼈를 잘라 흉부를 열고, 심장을 늑간 공간을 통해 몸 밖으로 꺼내었다. 심장을 2-cm 좌외 개흉술을 통해 노출시켰다. 심장막을 자르고, 6-0 실크 봉합사(Johnson & Johnson)를 좌심방 부속물 아래의 왼쪽 관상동맥의 근위 부분에 두었다. 결찰사의 끝은 짧은 길이의 플라스틱 튜브를 통해 통과시켜 올가미를 형성하였다. 관상동맥 폐색을 위해, 올가미를 관상동맥 바로 위의 심장 표면 상으로 누르고 올가미에 지혈기를 적용하였다. 50분간의 폐색 후, 지혈기를 제거하고 재관류를 위해 올가미를 풀어 결찰사가 심장 표면 상으로 느슨해 지게 두었다. 이식을 위해, 세포들을 30 μl의 PBS에 현탁시키고(1 × 10⁶ cells), 30-게이지의 바늘을 가진 Hamilton syringe (Hamilton Co.)를 이용하여 손상된 영역에서부터 변연부까지 주입하였다. 수술 동안, 동물을 하버드 산소호흡기를 이용하여 95% O2 및 5% CO2로 산소호흡시켰다. 생존 세포에 대해 DAPI로 MSCs로 레이블링하기 위해, 멸균 DAPI 용액을 50 μg/ml의 최종 농도로 이식한 날 배양 배지에 가하였다. 염료는 배양 접시에 30분 동안 남아있게 하였다. 세포를 6회 PBS로 세척하여 모든 과량 및 결합되지 않은 DAPI를 제거하였다. 레이블링된 세포를 0.25% (wt/vol) 트립신으로 탈착시키고 이식을 위해 PBS 중에 현탁시켰다. 이식된 랫트는 심근경색 1주 후 형태학적 분석을 위해, 그리고 경색 3주째에 심장초음파검사를 위해 이용되었다. Sham 집단은 심근경색 유발 랫트에 동일한 양의 PBS만을 주입하였다.

경색 크기의 측정

심근 조직의 생존력을 평가하고 심근 경색 크기를 측정하기 위하여 TTC 염색이 사용되었다. 조직 조각을 pH 7.4의 1% 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드 (TTC) 용액 중에서 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 조직을 10% PBS-완충 포르말린으로 4℃에서 밤새 고정하였다. 심장을 횡축으로 절단하고, 심근경색의 크기를 전체 좌심실의 단면적에 대한 좌심실의 경색된 조직의 단면적의 퍼센테이지로서 평가하였다. 각 TTC-염색된 조직 조각의 양 측면을 디지털 카메라로 촬영하였다. 경색된 영역은 Image J 1.40g software를 이용하여 측정하였다.

세포가 이식된 심장의 면역학적 분석

각 군에 해당하는 세포들을 이식한 후, 수 회의 간격을 두고 이식체를 희생시키고 그들의 심장을 잘라내었다. 심장을 10% (vol/vol) 중성 완충 포름알데히드로 24시간 동안 살포-고정하고, 4개의 동등하게 두꺼운 절편으로 횡으로 절단하고, 통상의 방법으로 파라핀으로 포매시켰다. 5-μm 두께의 절편을 젤라틴-코팅된 글라스 슬라이드 상에 마운팅하여, 이식 지역을 통한 조직 컷의 연속적인 절편 상에 상이한 염색이 이용될 수 있도록 하였다. 면역학적 분석은 제조자의 지시서를 이용하여 수행하였다(Vector Laboratories). 요약하면, 조직 절편을 탈파라핀화하고, 재수화시키고, PBS로 헹구었다. 항원 검출(antigen retrieval)은 10 mM 소듐 시트레이트(pH 6.0)로 10분 동안 마이크로웨이빙(microwaving)함으로써 수행하였다. 절편을 3% H2O2 중에서 인큐베이션하여 내재적인 퍼옥시다아제를 퀀칭하였다. 샘플을 2.5% 정상 호오스 혈청 중에서 블로킹하고, 1차 항체(CD31, collagenⅠ, fibronectin, alpha smooth muscle actin)로 인큐베이션하였다. 비오틴화된 pan-특이적 다능적 2차 항체 및 스트렙타비딘/퍼옥시다아제 복합 시약이 심장 절편에 대해 사용되었으며, 이들은 DAB 기질 키트를 이용하여 항체로 염색되었다. 대비염색은 1% 메틸 그린으로 수행되었으며, 탈수는 100% N-부탄올, 에탄올 및 자일렌으로 진행되었다. 다른 순차적인 절편은 래빗 항-커넥신 43으로 분석했다. FITC-컨쥬게이트된 염소 항-래빗 IgG를 2차 항체로서 사용하였다. 모든 이미지는 반사광 형광 현미경(reflected light fluorescence microscopy) 하에서 여기 필터(excitation filter)를 이용하여 만들었으며, MetaMorph software ver. 4.6 (Universal Imaging Corp)이 구비된 컴퓨터로 전송했다. 세포 이식체 내의 간질 섬유화를 탐지하기 위해, Masson's trichrome 염색을 이용하여 분석하고 Image J 1.40g 소프트웨어로 측정하였다. 헤마토실린 및 에오신 (HE) 염색을 수행하여 형태적 변화 및 염증성 세포 침윤물을 측정하고, 처리에 대해 모르는 3 사람이 조심스럽게 분석하였다.

시각적 맵핑(Optical mapping)

성체 수컷 랫트(250-300 g)에게 헤파린 (200 U/kg)에 더하여 졸레틸(20 mg/kg) 및 자일라진 (5 mg/kg)을 주입하였다. 심장을 절단해 내고, 대동맥을 통해 95% O2 및 5% CO2 조건으로 pH 7.4의 Tyrode's solution 용액(125 NaCl, 24 NaHCO3, 1.0 MgCl2, 4.0 KCl, 1.2 NaH2PO4, 5 Dextrose, 25 Mannitol, 1.25 CaCl2(in mM))을 역으로 관류시켰다. 온도를 37.0 ± 0.2℃로 유지하고 연동 펌프(peristaltic pump )로 관류 압력을 ~ 60 mm Hg로 조절하였다. 심장을 전압 민감성 염료, di-4 ANEPPS (Invitrogen)로 염색하고, 2.5 l의 스톡 용액(1 mg/ml of dimethyl sulfoxide, DMSO)을 대동맥 카눌라 상의 버플 트랩을 통해 운반했다. 심장을 챔버에 두어 온도를 유지시키고 움직임에 의한 인위적인 결과를 감소시키고, 5 M 블레비스타틴(blebbistatin)을 상기 관류액에 가하였다. 심장을 두 개의 녹색 LED 램프(LL-50R30-G25, Optronix, Seoul, Korea)를 이용하여 준-단색광(quasi-monochromatic light)(500 ± 30 nm)으로 조명하였다. 발광된 형광을 Vm 레코딩을 위해 600nm의 컷오프 파장을 갖는 장파장 필터(long-pass filter)를 통해 필터링하였다. 심장의 전방 표면으로부터 얻은 형광 이미지를 픽셀당 78 x 78 m2 의 공간 해상도 및 490 frames/sec 의 최대 시간 해상도를 갖는 CCD 카메라(Model CA D1-0128T, Dalsa, Waterloo, Ontario, Canada)로 촬영했다. 시야는 1.0 x 1.0 cm²로 조정하여 동시에 128 x 128 sites를 획득했다. 리듬의 광학적 레코딩은 Biopac System (BIOPAC Systems Inc.)을 이용하여 bipoles(좌심실의 꼭대기에 하나, 우심실의 고측벽에 다른 하나)을 넓게 위치시켜 얻은 ECGs에 의해 계속적으로 모니터링하였다. VT에 대한 취약성은 300 ms으로 시작하여 10-ms씩 단계적으로 감소시켜 90 ms까지 낮춘 stimulation cycle length (S1S1-CL)로 수행된 심실의 급작스러운 자극(burst stimulations)에 의해 시험하였다. 데이터는 Matlab (Mathworks, Natick)을 이용한 상용화된 소프트웨어로 분석하였다. 각 부위에서의 활동 및 재분극 시점은 (dF/dt)max 및 (d2F/dt2)max 로부터 측정하였으며, 이는 baseline에 대한 ~97% 재분극 및 불응으로부터의 회복과 동시에 일어나는 것으로 보였다. 데이터는 공간 영역 내에서 일계도함수/이계도함수(dF/dt, d2F/dt2)는 시간 영역에서의 다항식 필터(3rd order, 13 points)를 이용하여 계산하였다. 활동의 등시도(isochronal maps)는 이전에 기술된 바와 같이 생성하였다(Choi, B.R. & Salama, G., J Physiol 529 Pt 1, 171-188 (2000)). 경색 또는 정상 영역에서의 전도 속도는 20 박동에 대해 280 ms의 사이클 길이에서 포인트 자극(point stimulation) 하에서 측정되었다. 국부적인 전도 속도 벡터는 그것의 시간적 파장의 활동 시간 내의 각 픽셀의 7개의 가장 가까운 픽셀들로부터 추정하였다(Efimov, I.R., et al., Circulation 90, 1469-1480 (1994)). 국부적인 CV의 분포는 근접한 곳, 전층활동(transmural activity)에 의해 야기되는 운동 인공물(motion artifact) 및 파장 간의 충돌과 같은 고빈도의 성분들을 가질 수 있다. 국부적인 CV의 SNR(신호 대 노이즈 비율)을 개선하기 위해, 국부적인 CV는 7 x 7 nearest neighbor gaussian convolution를 이용하여 공간적으로 여과하였으며, 그 크기의 극한 변화를 로그-변환을 이용하여 억제하였다. 상승 시간은 활동 전위로부터의 10% 내지 90%의 활동-전위 진폭으로부터 측정하였으며, 1ms의 averaging kernel로 저역-통과 필터링을 하였다 (low-pass filtered).

면역형광법

MSCs의 면역세포화학적 특성화는 아래와 같이 검증되었다. 세포를 4-웰 슬라이드 챔버에서 배양하고, PBS로 세척하고, 1% 파라포름알데히드 용액으로 10분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 0.1% Triton X-100로 7분 동안 침투시켰다. 이 후, 세포들을 블로킹 용액(2% 소 혈청 알부민 및 10% 말 혈청을 함유한 PBS)으로 1시간 동안 블로킹시키고, 2차 항체로서 사용된 FITC-컨쥬게이트된 마우스, 래빗 및 염소 항체(Jackson Immunoresearch Laboratories)를 결합시켰다. 그런 다음 공초점 현미경(Carl Zeiss)으로 그들을 탐지하였다.

Sandwich ELISA

100 ng의 포획항체(Capture antibody)를 폴리비닐클로라이드(PVC) 마이크로타이터 고결합성 플레이트(96 웰)에 4℃에서, 밤새 결합시켰다. 플레이트를 PBS로 2회 세척하고, 5% BSA를 함유한 PBS로 포획항체를 습윤 대기 하 실온에서 밤새 블로킹시켰다. PBS로 플레이트를 2회 세척한 후, 5 ug의 세포분해물을 블로킹 버퍼와 함께 각 웰에 가하고, 플레이트를 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.02% tween-20을 함유한 PBS로 4회 세척하였다. 탐지 항체(detector antibody)를 가한 후, 플레이트를 습윤 대기하 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 0.02% tween-20을 함유한 PBS로 4회 세척하였다. 그런 다음, 플레이트를 3% BSA를 이용해 1:1000으로 희석된 퍼옥시다아제가 컨쥬게이션되어 있는 2차 항체로 다시 37℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이션하고, 또한 0.02% tween-20을 함유한 PBS로 4회 세척하였다. 최종적으로, 100 μl의 테트라메틸벤지딘(TMB) 용액(Sigma)을 기질(substrate)로서 부었다. 10분 후, 25 μl의 0.1 M H2SO4을 가하여 반응을 중지시킨 후, 즉시 ELISA 플레이트 리더기(Bio-Rad)로 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

웨스턴 블롯

세포들을 PBS로 1회 세척하고, 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM Na2-EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2.5 mM 소듐 피로포스페이트, 1 mM β-글리세로포스페이트, 1 mM Na3VO4, 1 mg/ml 류펩틴 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드를 함유하는 용해 버퍼(Cell Signaling Technology)로 약 20분 동안 용해시켰다. 세포용해물을 12,000 g로 10분 동안 원심분리시키고, 상청액을 얻었다. 단백질 농도는 Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad)를 이용하여 측정하였다. 정량적인 단백질은 12% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔로 분리하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인(Millipore)으로 이동시켰다. 5% 무지방 분유를 함유한 Tris-buffered saline-Tween 20 (TBS-T, 0.1% Tween 20)으로 멤브레인을 블로킹 한 후, 멤브레인을 TBS-T로 2회 세척하고, 1차 항체 (ERK 및 p-ERK; Santa Cruz Biotechnology)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 멤브레인을 TBS-T로 10분 동안 3회 세척한 다음, 호오스래디쉬 퍼옥시다아제-컨쥬게이트된 2차 항체로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 광범위한 세척 후, 밴드를 향상된 화학발광 시약(GE Healthcare Life Sciences)으로 탐지하였다. 밴드 강도는 Image J 1.40g software (NIH)를 이용하여 정량하였다.

RT-PCR

다양한 유전자의 발현 수준은 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 분석하였다. 전체 RNA를 60 mm 플레이트 당 500 μl의 Tri-reagent (Sigma)로 추출하였다. Tri-reagent 위에 100 μl의 클로로포름을 붓고 약 10초 동안 샘플을 볼텍싱하였다. 그런 다음, 샘플을 12,000 g로 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 이 후, 튜브에 3개의 층이 나타났고, 맨 위의 투명한 층을 새로운 튜브로 모았다. 그런 다음, 250 μl의 2-프로판올을 상기 샘플에 가하고, 혼합물을 다시 약 30초 동안 볼텍싱하였다. 그리고 나서 원심분리를 12,000 g로 4℃에서 10분 동안 수행하였다. 다음으로, 상청액을 버리고, 펠렛을 에틸피로카보네이트 (DEPC; Sigma) water에 희석된 75% 에탄올 (Duksan)으로 세척하였다. 이 시점에서 원심분리를 7,500 g로 4℃에서 5분 동안 수행하고, 펠렛을 실온에서 약 7분 동안 건조시켰다. 최종적으로 뉴클라아제가 없는 30 μl의 물을 가했다. RNA의 질과 양은 DU 640 spectrophotometer (Effendorf)를 이용하여 OD260/OD280 값으로 측정하였다. 상보적인 DNA를 제조자의 지시에 따라 Reverse Transcription System (Promega)으로 생성하였다. 1㎍의 전체 RNA를 5 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L Tris-HCl (pH 9.0 at 25℃), 50 mmol/L KCl, 0.1% Triton X-100, 1 mmol/L dNTP, 20 U of RNase 저해제, 0.5 ㎍ oligo-(dT)15 프라이머, 10 U의 역전사효소를 함유하는 20 ㎕의 반응 혼합물(reaction mix)로 42℃에서 15분 동안 역전시키고, 99℃에서 5분 동안 가열하여 반응을 종결시켰다. PCR 믹스는 총 부피 25 ㎕로 200 mM Tri-HCl (pH 8.8), 100 mM KCl, 1.5 mmol/L MgSO4, 1% Triton X-100, 0.1 mM dNTP 및 1.25 U의 Taq 폴리머라아제와 함께 10 pmol/㎕의 각각의 프라이머를 함유하고 있다. PCR 조건은 다음과 같았다: 94℃에서 3분간 denaturing을 1 사이클, 94℃에서 30초간 denaturation 35 사이클, 49℃에서 30초간 annealing, 그리고 72℃에서 2분간 extension, 72℃에서 10분간 최종 extension. RT-PCR 산물을 1.2% 아가로즈 겔에서 전기영동으로 분리하고, 에티듐 브로마이드로 염색하여 가시화하였다.

사이토카인의 탐지

세포가 주입된 영역 내의 사이토카인의 발현 수준을 rat cytokine array 3.1 (RayBiotech)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 측정하였다. 조직으로부터 단백질을 추출하기 위해 1 x Cell Lysis Buffer를 사용하였다. 추출 후, 샘플을 원심분리하여, 상청액을 저장하였다. 단백질 농도를 측정하고, H2O를 포함한 2 x Cell Lysis Buffer로 희석하였다. 샘플에 2 ml 1 x Blocking Buffer를 가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여 멤브레인을 블로킹하였다. 멤브레인을 1 ml의 샘플과 함께 실온에서 1-2시간 동안 인큐베이션하고, 각 용기로부터 옮기고, 쉐이킹하면서 2 ml의 1X Wash Buffer I으로 실온에서 5분 동안 3회 세척하였다. 그런 다음 블롯을 쉐이킹하면서 2 ml의 1 x Wash Buffer II로 실온에서 5분 동안 2회 세척하였다. 100 μl의 비오틴-컨쥬게이션된 항-사이토카인을 1 x 블로킹 버퍼와 부드럽게 혼합하고, 1-2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. Wash Buffer I 및 II를 블롯으로 5회 붓고, 1,000 배 희석된 HRP-컨쥬게이션된 스트렙타비딘을 각 멤브레인에 실온에서 2시간 동안 주입하였다. Wash Buffer I 및 II를 블롯에 5회 붓고, 샘플을 250 μl의 1 x Detection Buffer C 및 250 μl의 1 x Detection Buffer D와 함께 실온에서 2분 동안 가하였다. 최종적으로, 어레이를 x-선 필름에 노출시키고, 화학발광 이미징 시스템을 이용하여 신호를 탐지하였다.

Surface ECG

surface 6-lead ECG (lead II는 도면에 도시)를 대조군, sham, MSCs, 및 CPMs이 이식된 랫트에서 5분 동안 얻었다. R-R 간격, PR 간격, QRS 지속시간, QT 및 보정된 QT 지속시간을 이전에 기술한 바와 같이 연속적인 평가에 의해 측정하였다. 모든 데이터는 Bard stamp amplifier System (C.R. Bard Inc.)을 이용하여 1 ksps (kilo-sample per second)에서 획득하였다.

이소프로테레놀의 전신 투여

2mg/kg의 이소프로테레놀을 무선 ECG 측정기 부착 후 복강내로 주사하였다. 주사 직후 15분 동안 조기 심실 수축의 발생 회수를 계산하였다.

좌심실 카테터 삽입

침범적인 혈류역학적 조사를 위해, 좌심실 카테터 삽입을 수술 7일 내지 11일째에 수행하였다. 졸레틸(20 mg/kg) 및 자일라진(5 mg/kg) 마취하에서 Millar Mikro-tip 2 F pressure transducer (model SPR-838, Millar Instruments, Houston, TX)를 우측 경동맥을 통해 좌심실 내로 삽입하였다. 맹검 조사자에 의해 실시간 압력-부피 루프(Real time pressure-volume loops)를 기록시켰으며, 모든 데이터는 PVAN 3.5 software (Millar)을 이용하여 오프라인으로 분석하였다.

통계학적 분석

연속적인 변수에 대한 데이터는 평균±SE로 표현하고, 카테고리별 변수에 대해서는 비율로 표현했다. 두 군에 대한 통계학적 분석은 Student's t-test에 의해 수행했다. 둘 이상의 군에 대한 시험은 bonferroni test 를 이용하는 one-way ANOVA 에 의해 수행하였다. 카테고리별 변수에 대해서는 hi-square test 또는 Fisher exact test를 수행하였다. 생존율은 log-rank test를 포함하는 the Kaplan-Meier method에 의해 수행하였다. P value <0.05로 유의성을 고려하였다.

[비교실험예 1] 경색된 심근에서의 MSCs 이식의 효과 확인

심근세포로의 분화 유도 과정을 거치지 않은 순수한 MSCs를 경색된 심근에 이식한 효과를 다각도로 조사하였다.

(1) 급사 발생율의 조사

먼저 MSCs를 이식한 군의 급사 발생율을 조사하였다. 도 1은 손상 및 치료 후 11일 동안의 대조군(n=12), sham-주입된 랫트(n=27), 및 MSCs-이식된 랫트(n=19)에서의 급사 발생율을 보여주는 그래프이다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 중간엽 줄기세포의 이식이 급작스런 사망의 발생을 줄일 수는 있지만 생존율의 개선에 있어서는 명백히 차선책일 수 밖에 없음을 발견했다.

(2) 면역학적 분석

다음으로, MSCs-이식된 심근을 상기 기술된 면역학적 분석을 통해 조사하였다. 도2는 심근 조직의 생존력을 평가하고 심근 경색 크기를 측정하기 위한 TTC 염색의 결과를 보여준다. 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, sham-주입 영역에 비해 중간엽 줄기세포가 이식된 영역에서 경색의 크기가 줄어듦을 알 수 있다. 도 3은 세포 이식체 내의 간질 섬유화를 탐지하기 위한 Masson's trichrome 염색의 결과를 보여준다. sham-주입 영역에 비해 중간엽 줄기세포가 이식된 영역에서 re-entry 를 촉진시키는 생존한 심근과 섞인 섬유화의 정도가 감소하였음을 알 수 있다. 또한, 도 4는 세포자멸사 세포 수의 측정을 위한 TUNEL 어세이의 결과를 보여준다. sham-주입 영역에 비해 중간엽 줄기세포가 이식된 영역에서 허혈에 의해 유도된 세포자멸성 세포의 수가 유의하게 감소하였음을 알 수 있다.

이들 결과는 밀집한 섬유증이 세포의 재생에 대한 엄청난 물리적 장벽이 되며(Segers, V.F. & Lee, R.T. Nature 451, 937-942 (2008)), re-entry 를 촉진하는 직접적인 파장 전달을 방해하는 전기적 장벽으로 나타난다(de Bakker, J.M., et al. Circulation 88, 915-926 (1993); Anderson, K.P., et al. J Clin Invest 92, 122-140 (1993))는 보고들에 의해 뒷받침된다.

또한, 과도한 염증은 비균일한 전도 및 지연된 재분극을 야기할 수 있을 뿐만 아니라(Hoffman, B.F., et al., J Cardiovasc Electrophysiol 8, 679-687 (1997); Ishii, Y., et al. Circulation 111, 2881-2888 (2005).), 전구 세포들의 보충 및 생존의 방해를 야기할 수 있다(Poss, K.D., Wilson, L.G. & Keating, M.T. Heart regeneration in zebrafish. Science 298, 2188-2190 (2002))고 알려져 있다. 따라서, 중간엽 줄기세포의 이식에 따른 염증성 세포 침윤물의 변화를 추가로 조사하였다. 도 5는 염증성 세포 침윤물의 측정을 위한 H & E 염색 결과를 보여준다. 중간엽 줄기세포-주입군이 변연 부위에서 sham-주입된 군에 비해 염증성 세포 침윤물이 더 적은 것을 발견하였다.

(3) 심장초음파 분석

중간엽 줄기세포의 이식에 따른 심장의 기능적 개선 여부를 경흉부 심장초음파(transthoracic echocardiography)를 통해 조사하였다. 그 결과, 아래 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 경흉부 심장초음파에 의해 측정된 수축기 수행능 및 심치수가 중간엽 줄기세포가 주입된 래트에서 개선되었음을 확인하였다.

[표 1]

- 위 표에서, 수치는 평균 ± SE로 나타내었다.

- 각각 *p<0.01, **p<0.001 vs. 정상; 각각 †p<0.01, ††p<0.001 vs. Sham

약어: LVEDD(left ventricular end diastolic diameter, 좌심실이완기말직경); LVESD(left ventricular end systolic diameter, 좌심실수축기말직경); FS(fractional shortening, 좌심실 단축률); LVEDV(left ventricular end diastolic volume, 좌심실이완기말용적); LVESV(left ventricular end systolic volume, 좌심실수축기말용적); LVEF(left ventricular ejection fraction, 좌심실박출계수).

그러나, 이러한 면역학적 및 기능적 개선에도 불구하고, 이식 7일 내지 11일 후의 대부분의 이식된 중간엽 줄기세포가 여전히 cardiac troponin T (cTnT)를 발현하지 않음을 발견하였는데, 이는 그들이 여전히 심근세포로 분화되지 않았으며, 따라서 그들이 전류 싱크로서 작용함으로써 회귀성 부정맥을 유도할 수 있음을 제시한다.

(4) 전기적 안정성 분석

따라서, 손상 및 치료 7일 내지 11일 후 대조군인 sham-주입된 심장 및 줄기세포-이식된 심장에서, Langendorff 관류 및 전기적 약점 테스트를 이용한 광학적 맵핑에 의해 경색된 심장에서 중간엽 줄기세포가 전기적 안정성에 미치는 효과에 대해 추가로 평가하였다.

도 6은 경색된 심장의 실제 이미지(좌측 패널)를 보여준다. 경색된 영역은 청색성 색상 변화에 의해 확연하게 확인되며, 느린 전파가 발생하는 변연부(2)는 활동성 맵으로부터 확인할 수 있다(중간 및 우측 패널). 도 7은 대조군, sham-주입된, MSCs-, 및 CPMs-이식된 심장에서의 활동 전위를 보여준다. 동방결절 리듬 및 전기적 자극 하에서, 심근경색의 부정맥발생의 메커니즘으로서 특징되는 경색된 심근의 변연부로부터의 빈번한 자발적인 중심 활동(frequent spontaneous focal activity)의 존재와는 달리, 이소성 박동은 중간엽 줄기세포가 이식된 심장에서 더 억제되었다 (sham-이식된 군 46%, n=13, 중간엽 줄기세포 이식된 군 22%, n=9). 게다가, 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, 중간엽 줄기세포가 이식된 구역으로부터 기록된 활동 전위 지속시간(action potential durations, APDs)은 미-경색된 영역과 유사한 반면(MSCs-이식된 심장에서 101.9±14.9 ms vs.103.5±14.1 ms, 그리고 sham-주입된 심장에서 92±7.4 mm/ms vs. 93.2±7.1 mm/ms, p>0.05), sham-operated heart의 변연부(border zone)는 정상 구역과 비교하여 단축된 APDs를 나타냈다(93.9±16.2 ms vs.128.8±18 ms, *p<0.05).

그러나, 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 중간엽 줄기세포가 이식된 심장에서, APDs는 경색 구역으로 전파되긴 하지만 비 균일하며 느린 전파를 나타냈는데, 이는 안정한 회귀 순환 운동(circuit movement)을 이끌어 내기 위해 요구되는 조건들이 제거되지 않았음을 나타낸다(Takahashi, T., et al. Heart Rhythm 1, 451-459 (2004)). 도 10은 sham-주입된 심장 및 MSCs 이식된 심장에서의 국부 전도 속도(CV)를 보여주는 그래프이다. sham-주입된 심장에서 미-경색된 영역과 비교하여 변연부에서 측정된 CV는 감소하였다 (n=8, 0.14±0.1mm/ms vs. 0.91±0.07 mm/ms, ***p<0.0001). MSC 이식된 병변에서는 이보다 3배 이상 증가되어 있긴 하나, MSC 이식된 병변의 CV는 정상부위와 비교하여 여전히 침체되어 있다 (n=7, 0.45±0.1mm/ms vs. 0.91±0.1mm/ms, **p<0.001). 도 10으로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 활동 전위의 활성화 시점으로부터의 국부적인 전도 속도 (CV)는 다른 미-경색된 영역과 비교하여 중간엽 줄기세포가 이식된 영역에서 여전히 낮았는데, 이는 중간엽 줄기세포의 자극에 반응하지 않는 본성과 전류 싱크로서 작용하는 그들의 능력에 기인하는 것일 수 있음을 제시한다(Chang, M.G., et al. Circulation 113, 1832-1841 (2006); Beeres, S.L., et al. J Am Coll Cardiol 46, 1943-1952 (2005)).

도 11은 초고속 조율 프로토콜(burst pacing protocol)에 따른 전기적 취약성 테스트의 결과를 보여준다. 도 11의 좌측 패널에서는 정상, sham-주입군 및 MSCs-이식군의 심실성 빈맥(VT) 또는 심실 세동(VF) 유도성에 대한 그래프를 나타내었다. 대조군(n=12)과 비교하여 sham 주입된 군(n=13)에서 VT 또는 VF 유도에 대해 현저하게 감수성이 증가되어 있다(sham에서 69.2% vs. 대조군에서 0%, p=0.0005). sham 주입군과 비교하여 MSCs (n=9) 이식이 VT 유도성을 감소시키는 경향이 있긴 했지만 (MSCs 이식군에서 44.4% vs. sham 주입군에서 69.2%, p=0.38), 치명적인 심실성 부정맥은 MSCs의 이식 후에도 빈번하게 남아있다 (MSCs 이식군에서 44.4% vs. 대조군에서 0%, p=0.017). 도 11의 우측 패널에서는 초고속 조율 프로토콜(burst pacing protocol) 전기적 취약성 엑스 비보 시험에서의 ECG의 대표적인 예들을 보여준다. 220ms의 cycle length (CL)의 급작스러운 자극(burst stimulations)은 sham-operated 심장에서 VT를 유도했다. CL을 단계적으로 90ms까지 감소시키는 동안, VT가 MSC 이식된 심장에서 100ms의 CL에서 쉽게 유도된 반면, 정상 대조군에서는 90ms의 CL에서도 유도되지 않았다. 화살표는 전기적 자극을 나타낸다.

도 12는 MSCs-이식된 부위에서의 심실성 빈맥(VT) 동안의 순차적인 전압도(voltage map)를 보여준다. 나선형 파장을 형성하는 Single re-entry가 천천히 MSCs-주입 영역(적색 동그라미)으로 전파되고(좌측 패널의 상부 도면), MSCs-주입 영역으로 고정됨을 확인할 수 있다(좌측 패널의 하부 도면). 여기에서 흰색 화살표는 파두 전파의 방향을 나타낸다. 우측 패널은 활동 전위를 시각적 레코딩을 보여준다. 이는 전기의 흐름이 MSCs 주입 부위에서 원활하지 않음을 보여주는 결과이다.

[실험예 1] MSCs를 PKC 활성화제로 분화유도한 심근성 세포(CPMs)의 특성 확인

본 발명자들은 중간엽 줄기세포를 심근세포로 분화 유도할 수 있는 방법에 대해 지속적으로 연구하고, 심근세포로 분화유도할 수 있는 화합물을 스크리닝하고자 조사하였다. 도 13은 MSCs를 심근성 세포로 분화 유도할 수 있는 화합물의 스크리닝을 위한 Principle component analysis (PCA)의 결과를 보여준다. 단백질 키나아제 C(Protein Kinase C, PKC) 활성화제인 6번 화합물, 즉 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate, PMA)가 특이적으로 심근세포 특이적 마커의 발현을 높게 유도하는 것으로 보아 중간엽 줄기세포를 심근세포로 분화 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.

(1) 심장특이적 마커의 발현 여부 확인

PMA에 의해 PKC 활성이 변형된 MSCs(PKC-활성화된 MSCs로부터의 심장성 세포: CPMs)에서 심장 특이적 마커가 특이적으로 발현되는지 확인하였다. 도 14는 치료 후 지정 일자에서의 대조군인 MSCs 및 CPMs에서의 MSCs 특이적 마커인 CD90, 및 심장 특이적 마커인 cTnT(cardiac troponin T), MLC(myosin light chain), MHC(myosin heavy chain) 및 Cx43의 발현 변화에 대한 면역세포화학적 측정 결과를 보여준다. 청색은 핵에 대한 Dapi 염색이고, 녹색은 심장 특이적 마커들에 대한 FITC 염색이다. CPMs의 면역세포화학적 염색 결과는 cTnT, MLC 및 MHC과 같은 심장 특이적 마커의 증가된 형광성을 보여준 반면, MSCs의 특이적 마커인 CD90은 9일째에 감소되었다. 흥미롭게도, 갭-정션인 Cx43의 형광성이 CPMs에서 눈에 띄게 증가하였다. 사실, Cx43-발현 세포가 경색후 부정맥(post-infarct arrhythmia)을 예방한다는 것은 보고된 바 있다(Roell, W., et al. Nature 450, 819-824 (2007)). 또한, 도 15에서 볼 수 있는 바와 같이, 심장성 표현형이 CPMs에서 고르게 상향조절됨을 관찰하였는데, 이는 PKC 활성의 변형이 MSCs를 심장성 특성을 갖는 세포들로 균일하게 변경하도록 촉진할 수 있다는 것을 제시한다. 추가로, 심박수 및 심근수축성과 같은 심장 기능을 조절하는데 중요한 역할을 하는 아드레날린성 및 무스카린성 수용체의 발현이 α1D 을 제외하고는 순수한 MSCs와 비교하여 CPMs에서 유의하게 상향조절되었음을 관찰하였다(도 16 내지 도 18).

(2) 노르에피네프린(NE) 자극에 의한 CPMs 기능적 행동 조사

우리는 추가로 노르에피네프린(NE) 자극에 의한 CPMs 기능적 행동을 조사하였다. 그 결과, 도 19에서 볼 수 있는 바와 같이, 인산화된 ERK1/2의 수준이 노르에피네프린(NE)에 의해 시간의존적 방식으로 심근세포뿐만 아니라 CPMs에서 유의하게 증가되었으나, 대조군인 MSCs에서는 그렇지 않았다. 또한, 도 20에서 볼 수 있는 바와 같이, 노르에피네프린에 의해 유도된 hypertrophic signals은 α-아드레날린성 수용체 차단제인 프라조신(prazocin)에 의해 차단됨을 확인할 수 있다. 이는 CPMs이 심근세포와 같이 기능적으로 활성화된 세포임을 나타낸다. 이들 결과는 노르에피네프린이 심장의 수축 특성에 영향을 미치며 심근세포에서의 α-아드레날린성 수용체를 통한 비후성 표현성(hypertrophic phenotype)의 일련의 변화 특성을 유도한다는 최근 연구(Chien, K.R., et al., FASEB J 5, 3037-3046 (1991))에 의해 뒷받침된다.

(3) Ca ²⁺ 항상성-관련 단백질의 발현 여부 확인

도 21은 대조군인 MSCs 및 CPMs에서의 Ca²⁺ 항상성-관련 단백질인 SERCA 2a 및 LTCC의 발현 변화를 보여준다(*p<0.05, **p<0.01). 도 21로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 심근세포에서의 Ca²⁺ 유입에 의해 작동되는 흥분-수축 결합(excitation-contraction coupling)과 밀접하게 관련된, 근소포체 Ca²⁺ ATPase (SERCA 2a) 및 L-type Ca²⁺ 채널 (LTCC)의 발현 수준 또한 시간 의존적 방식으로 CPMs에서는 유의하게 증가하였으나, 대조군 MSCs에서는 그렇지 않았다.

위에서 살펴본 이들 우세한 증거들은 CPMs이 심근세포로의 분화 단계에 존재하거나 성숙한 심근세포임을 제시한다. 이 새로운 모델은 MSCs의 심근세포로의 분화를 조절하는 전사적 활성화의 캐스케이드를 명확히 하는 것을 도와준다.

[실험예 2] MSCs를 PKC 활성화제로 분화유도한 심근성 세포(CPMs)의 이식의 효과 확인

(1) 면역조직화학적 분석

인비보 모델을 통해 경색 영역 내 주입된 세포들과 주변 심근세포들간의 면역조직화학적 분석을 수행하였다. 도 22에서 볼 수 있는 바와 같이, 이식된 MSCs에서 Cx43(connexin 43)은 세포막을 통해 반점 형상으로 우세하게 발현된 반면, CPMs에서는 근세포와 같이 플라크로서 주로 존재하였으며, 이식된 CPMs은 Cx43을 통해 호스트 심근세포와 잘 결합함을 확인하였다.

(2) 전기 안정성 시험

추가로 CPMs-이식된 랫트에서의 전기적 안정성을 시험하였다. 광학적 맵핑 상에서, LV 베이스의 미-경색된 부위로부터의 프로그램된 전기적 자극 동안 파장 전파는 CPMs-이식된 심장에서 현저하게 개선되었다(비디오 데이터로서 미도시).

CPMs-이식된 영역으로부터의 APDs는 미-경색된 영역의 것과 유사하였다 (도 8).

도 23은 MSCs-이식된 영역 및 CPMs-이식된 영역에서의 CV 맵을 나타낸 것이다(78m x 78m). CV 맵은 국부적인 CV의 회복과 함께 CPMs-이식된 영역에서 CV의 현저한 복원을 보여주었다(0.84±0.15mm/ms, n=6). 이는 MSCs-이식된 영역에서의 CV의 부분적인 복원과는 대조적이었다(0.45±0.1mm/ms, n=7).

도 24는 MSCs- 및 CPMs-이식된 심장에서의 실제 심장 이미지 및 CV 벡터를 보여준다. CV 벡터의 방향은 MSCs-이식된 영역에서 보다 흩어져있는 반면 (좌측 패널의 적색 박스), CPMs-이식된 영역에서는 균일하였다(우측 패널의 적색 박스). 흑색 박스는 10mmx10mm의 광학 뷰 지역을 나타낸다.

한편, 도 25는 MSCs-이식된 심장, CPMs-이식된 심장 및 sham-주입된 심장에서의 활동 전위기 0의 상승 시간을 보여주는 그래프이다. 대표적인 예로, MSCs에서 측정된 활동 전위의 상승시간은 39ms, 변형된 MSCs-이식된 영역에서 측정된 활동 전위의 상승시간은 28ms, 그리고 sham-주입된 영역에서 측정된 활동 전위의 상승시간은 53ms였다. 도 25의 하단 그래프에서 확인할 수 있는 바와 같이, MSCs-이식된 심장과는 대조적으로, 경색된 심장 내의 미-경색된 영역과 CPMs-이식된 영역 간의 활동 전위기 0의 상승 시간에서의 차이가 없었다. 구체적으로 살펴보면, MSCs-이식된 랫트 (n=6) 및 sham-주입된 랫트(n=8)에서 이식된 부위에서의 상승 시간은 미-경색된 부위보다 더 연장된 반면 (MSCs-이식된 심장에서 32.5±2.78 mm/ms vs. 28.4±0.61mm/ms 및 sham-주입된 심장에서 42.1±4.74 mm/ms vs. 28.7±0.96 mm/ms, **p<0.001), CPMs-이식된 랫트에서(n=7), 이식된 부위에서 측정된 상승시간(29.4±1.09 mm/ms) 및 미-경색된 영역에서 측정된 상승시간(28.8±0.98 mm/ms)은 유사했다(p>0.05). 이는 심장성 특성의 획득에 의한 수동적인 전기긴장 전류 흐름의 약화를 반영하는 것이다.

한편, 도 26에서 볼 수 있는 바와 같이, 초고속 조율 프로토콜(burst pacing protocol)에 의한 전기적 취약성 테스트에서, VT 유도는 CPMs-이식된 군에서 극심하게 억제되었다(CPMs- 및 sham-주입된 군에서 각각 13%, n=8 및 69.2%, n=13).

(3) 조직학적 분석

그러나, CV의 복원 및 관련된 부정맥 보호는 주위 조직에 대한 CMPs의 추가적인 측분비 효과(paracrine effect)에 기인한 것일 수 있다. 따라서, 우리는 세포 이식된 영역에서의 섬유화, 세포자멸 및 염증을 조직학적 분석을 통해 조사하였다.

도 27A는 좌심실 경색 크기의 측정을 위한 TTC 염색 결과를, 도 27B는 섬유화 지역의 측정을 위한 Masson's trichrome 염색 결과를, 도 27C는 세포자멸 세포 수의 측정을 위한 TUNEL 어세이 결과를 보여준다. 도 27에서 볼 수 있는 바와 같이, MSCs-주입된 랫트와 비교하여 CPMs-주입된 랫트에서 경색 크기 및 간질 섬유화가 현저하게 줄어들었으며, 이식된 영역 내 허혈에 의해 유도된 세포자멸성 세포의 수가 MSCs-주입 동물에 비해 CPMs-주입된 동물에서 유의하게 감소하였다. 또한, 도 28의 면역 염색 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 섬유성 마커인 콜라겐 I 및 파이브로넥틴의 수준이 감소하였으며, α-SMA는 MSCs와 비교하여 CPMs-주입된 영역에서 증가하였다.

우리는 또한 CPMs-이식된 영역에서의 염증성 세포 침윤물을 측정하기 위해 H & E 염색을 수행하였다. 그 결과, 도 29에서 볼 수 있는 바와 같이, CPMs-이식된 영역이 MSCs가 이식된 영역에 비해 더 적은 염증 세포 침윤물을 가짐을 관찰하였다.

(4) 염증성 사이토카인의 mRNA의 발현 분석

뿐만 아니라, 우리는 대조군, Sham-주입된, MSCs- 및 CPMs-이식된 심장에서의 염증성 사이토카인의 mRNA의 발현 수준의 변화를 RT-PCR을 이용해 측정하였다. 3회의 독립적인 실험을 통해 값은 평균 ± SEM로 나타냈다(**p<0.01). 그 결과, 도 30 내지 도 32 및 표 2로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 심근경색에 의해 IFN-γ, IL-1a, IL-1b, IL-6 및 TNF-α와 같은 염증촉진성 사이토카인(proinflammatory cytokines)의 증가된 수준이 MSCs-주입된 영역에 비해 CPMs-주입된 영역에서 더 많은 양으로 유의하게 감소되었음을 관찰하였다.

[표 2]

따라서, 우리는 손상된 심근에서 CPMs의 측분비 효과가 조직 이질성의 제거 그리고 결과적으로 CV의 복원에 추가적으로 기여할 수 있음을 밝혔다.

(5) 심전도 기록(ECG) 분석

MSCs- 및 변형된 MSCs-이식된 랫트의 Surface ECG 레코딩 (lead II)을 분석하였다.

[표 3]

표 3은 Surface 6-lead 심전도 기록 (ECG)을 보여준다. QRS 간격은 대조군과 비교하여 sham 주입군에서 유의하게 증가하였다(*;p<0.05). 대조군과 비교하여 MSC가 이식된 랫트에서는 QRS 지속기간이 약간 증가하였다. CPM이 이식된 군에서는 sham 주입군(§; <0.01) 및 MSCs 이식군(**;<0.05)과 비교하여 QRS 지속기간이 짧아졌다. 이는 CPMs-이식된 심근의 보다 균일한 심실 흥분을 나타내는 것이다. 대조군과 비교하여 sham 주입군에서 연장된 QTc 간격이 관찰된 반면(Ŧ;<0.05), CPM이 이식된 군에서는 sham 주입군과 비교하여 QTc 간격이 복구되었다 (ŧ;<0.05). baseline surface ECG에서의 심실수축(PVCs)은 CPMs-이식된 랫트에서 발생하지 않았다 (0%, n=12).

(5) 카테콜아민성 자극에 대한 CPMs의 전기적 안정성 확인

비정상적인 자발운동성을 유도하고 활동성을 촉발할 수 있는 카테콜아민성 자극에 대한 CPMs의 전기적 안정성을 확인하기 위해, 우리는 이소프로테레놀의 전신 투여 동안의 PVCs의 발생을 조사하였다. 도 33은 복강내 이소프로테레놀 주사 동안 6 lead ECG 로 기록된 대조군 (n=6), sham (n=10), MSCs (n=6), 및 CPMs (n=7) 군에서의, 조기 심실 수축(PVCs)의 횟수를 보여준다. PVCs은 sham-injected rats (45.6±16.7)에서 빈번히 관찰된 반면, 대조군에서는 발생하지 않았다. MSCs 군에서의 PVCs의 횟수는 26.7±21.2, CPMs 군에서의 PVCs의 횟수는 7.4±11.8였다(*p<0.05). 카테콜아민성 자극은 CPMs-이식된 랫트에서 PVCs의 발생을 증가시키지 않았다.

(6) 심장초음파검사

MSCs 이식된 심장과 비교한 경색된 심장에 대한 CPMs의 기능적인 효과는 손상 및 이식 7 내지 11일 후 심장초음파검사 및 카테터삽입에 의해 측정하였다.

[표 4]

- 위 표에서, 수치는 평균 ± SE로 나타내었다.

- **p<0.01

표 4에서 볼 수 있는 바와 같이, CPMs-이식된 군에서 좌심실 이완기말 치수(LVEDD)는 감소하였으며, 박출 계수(EF)는 증가하였다. 또한, 도 34에서 확인할 수 있는 바와 같이, sham-이식된 랫트 및 MSCs-이식된 랫트와 비교하여, CPMs-이식된 랫트에서 좌심실 확장은 적었으며, LVEDP 및 타우(tau)는 감소하였다. CPMs 이식으로 인해 카테터삽입으로 측정한 박출 계수가 더 좋아졌으며 dP/dt가 개선되었는데, 이는 CPMs 이식에 의한 심장 재생을 제시한다.

마지막으로, 본 연구에서 CPMs 이식된 랫트의 급사 발생율을 조사하였다. 도 35는 손상 및 치료 후 11일 동안의 대조군(n=12), sham-주입된 랫트 (n=27), MSCs- (n=19) 및 CPMs-이식된 랫트 (n=12)에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선을 보여준다. 도 35에서 확인할 수 있는 바와 같이, CPMs-이식된 랫트에서 급사의 발생이 감소하였다(CPMs-주입된 군에서 8.3% vs. 대조군에서 0%, p=0.38). MSCs- 및 CPMs-이식된 랫트 간의 통계학적 차이는 없었지만(MSCs 군에서 31.6% vs. CPMs 군에서 8.3%, p=0.12), CPMs 군에서의 급사는 sham-주입된 군과 비교하여 엄청나게 줄어들었다 (CPMs 군에서 8.3% vs. sham-주입된 군에서 55.6%, § p<0.01). ** p<0.005; sham vs. 대조군. *p<0.05; 대조군 vs. MSCs).

MSCs는 심장 수복을 위한 다른 줄기세포에 비해 여러가지 잠재적인 이점을 갖긴 하지만, 그들은 여전히 전임상 연구에서 해결되어야 할 몇 가지 과제에 직면해 있다. 유전적 변형을 포함한 MSCs의 전제조건화가 치료적 효능을 증가시키기 위해 수행되었음에도 불구하고, 대부분의 분명한 관심사는 어떻게 이식된 MSCs가 호스트 조직과의 전기기계적 통합을 완성시킬 수 있을지에 대한 것이다. 우리의 결과는 MSCs로부터 유래한 새로운 세포 타입이 이식 후 순수한 MSCs에 의해 야기되는 급사의 차선적 예방을 극복함을 최초로 보여주며, 심근 경색에 대한 세포-기반의 치료법에서 전자기계적 통합을 향상시키기 위한 새로운 전략을 제공한다. 결론적으로, 이식 후 숙주 조직의 전기기계성과의 조화시킬 수 있는 PKC 활성화제에 의한 MSCs의 심근세포로의 변형은 경색된 심근에 대한 MSCs의 임상적 적용을 위한 최상의 치료적 전략일 수 있다.

Claims

PKC(Protein Kinase C) 활성화제를 중간엽 줄기세포에 처리하는 것을 포함하는 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도 방법.
제1항에 있어서,
PKC 활성화제는 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate, PMA)인 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도 방법.
제1항에 있어서,
골수, 조직, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻은 것인 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도 방법.
제1항에 있어서,
PKC 활성화제의 처리는 중간엽 줄기세포를 PKC 활성화제를 포함하는 배지에서 배양함으로써 수행되는 것인 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도 방법.
제4항에 있어서,
배양은 5일 내지 15일 동안 수행되는 것인 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도 방법.
제1항에 있어서,
심장성 세포는 심근세포 특이적 마커의 발현이 중간엽 줄기세포에 비해 증가되어 있는 것인 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도 방법.
제6항에 있어서,
심근세포 특이적 마커는 cTnT(cardiac troponin T), MLC(myosin light chain) 및 MHC(myosin heavy chain)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도 방법.
제1항에 있어서,
심장성 세포는 Cx43(connexin 43)의 발현이 중간엽 줄기세포에 비해 증가되어 있는 것인 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도 방법.
제1항에 있어서,
심장성 세포는 Ca²⁺ 항상성-관련 단백질의 발현이 중간엽 줄기세포에 비해 증가되어 있는 것인 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도 방법.
제9항에 있어서,
Ca²⁺ 항상성-관련 단백질은 SERCA 2a 또는 LTCC인 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도 방법.
PKC(Protein Kinase C) 활성화제를 포함하는 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도용 조성물.
제11항에 있어서,
PKC 활성화제는 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate, PMA)인 중간엽 줄기세포의 심장성 세포로의 분화 유도용 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 심장성 세포를 포함하는 심장질환 치료용 의약 조성물.
제13항에 있어서,
심장질환은 심근경색증인 심장질환 치료용 의약 조성물.