KR101625901B1 - 활성이 촉진된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 폐고혈압 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 줄기세포 활성 촉진용 조성물, 줄기세포 활성 촉진용 배지 조성물, 줄기세포 활성 방법, 활성 촉진된 줄기세포 및 상기 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 폐고혈압 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, S1P(sphingosine-1-phosphate) 또는 LL-37(cathelicidin)을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 활성 촉진용 조성물; 줄기세포 활성 촉진용 배지 조성물; 줄기세포 활성 촉진 방법; S1P(sphingosine-1-phosphate) 또는 LL-37(cathelicidin)로 처리된 줄기세포; 상기 줄기 세포를 유효성분으로 포함하는 폐고혈압 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 의하면, 줄기세포에 S1P(sphingosine-1-phosphate) 또는 LL-37(cathelicidin)를 처리한 경우 줄기세포의 활성이 탁월하게 향상되었다. 따라서, 본 발명은 폐고혈압의 예방 또는 치료에 적용될 수 있다.

Description

활성이 촉진된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 폐고혈압 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical Composition for Treating Pulmonary Hypertension Comprising Primed-Stem Cell as an Active Ingredient}

본 발명은 줄기세포 활성 촉진용 조성물, 줄기세포 활성 촉진용 배지 조성물, 줄기세포 활성 방법, 활성 촉진된 줄기세포 및 상기 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 폐고혈압 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

폐고혈압(Pulmonary Hypertension, PH)은 휴지시 평균 폐동맥압(PAP) > 25mm Hg 또는 활동시 > 30mg Hg로 정의된다. 2004년의 유럽 심장학회(European Society of Cardiology)가 발간한 폐고혈압의 진단 및 치료에 관한 현행 지침서(Eur Heart J 25: 2243-2278; 2004)에 따르면, PH의 임상 형태는 (1) 폐동맥성 고혈압(PAH), (2) 좌 심장 질환과 관련된 PH, (3) 폐 호흡 질환 및/또는 저산소증과 관련된 PH, (4) 만성 혈전 및/또는 색전 질환에 의한 PH, (5) 기타 원인 (예를 들어, 사르코이드증)의 PH로서 분류된다. 그룹 (1)은 예를 들어, 특발성 및 가족성 PAH뿐만 아니라 결합 조직 질환(예를 들어, 공피증, 크레스트(CREST)), 선천성 체폐 단락(短絡), 문맥 고혈압, HIV, 약물 및 독소의 섭취(예를 들어, 식욕억제제)의 관점에서의 PAH를 포함한다. COPD에서 발생하는 PH는 그룹 (3)에 속한다. 소형 (500 ㎛ 미만의 직경) 폐 세동맥의 근육화는 PAH(그룹 1)의 병리학적 공통 분모로서 널리 받아들여지지만, 이는 COPD 또는 혈전 및/또는 혈전색전 질환에 기반한 것과 같은 다른 형태의 PH에서 발생할 수도 있다.

폐동맥성 고혈압(Pulmonary artery hypertension, PAH)은, 폐동맥압의 지속적인 상승 및 폐 혈관 저항을 특징으로 하는 드문 질환으로서, 궁극적으로 우심부전 및 사망에 이르게 한다. 새로운 치료법이 도입되기 전의 특발성 PAH의 평균 생존 기간은 2.8 년으로 추정되었다. 지난 10 년간, PAH의 치료는 근본적인 병인에 대한 보다 깊은 이해로 상당히 발달하였다. 그러나, 이러한 치료에도 불구하고, 사망률은 여전히 높다. 따라서, PAH의 치료에 대한 상당한 의학적 필요성이 존재한다.

중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC)는, 뼈, 연골, 근육, 혈관 평활근 세포 및 다른 결합 조직으로 분화 할 수 있는 능력을 갖는 다능성 전구 세포(multipotent progenitor cell)이다. 또한, MSC의 효능은, 사이토카인에 의해 조절되는 세포보호효과(cytoprotective effect)와 같은 측분비인자(paracrine factor), 전혈관형성(pro-angiogenic) 및 전동맥형성(pro-arteriogenic) 효과에 기인한다. MSC는 또한 혈관 내피 성장 인자(VEGF)와 같은 다양한 성장 인자를 분비한다. 이러한 효능에 기반하여, MSC 요법이 연구되었으며, PAH 등 다양한 난치성 질환에 적용되었다. MSC 주입은, 다양한 모델에서의 PAH에 의한 폐 혈관 구조 및 혈역학적 변화를 약화시켰다. 그러나, 이들 연구는 인간의 MSC가 아닌, 동물의 MSC의 기능에 초점을 맞춘 것이다. 동물 모델에서 인간 PAH로 적용하기 위해서는, 인간의 MSC를 이용하는 것이 필수적이지만, 인간의 MSC에 대한 연구는 매우 드물다.

축적된 증거들은, 손상된 장기 조직을 복구하기 위하여 MSC를 비롯한 줄기세포들이 활성적으로 말초혈액(PB)으로 동원된다는 것을 제시한다. 순환성 줄기세포(Circulating stem cells)는 케모카인(예를 들면, stromal cell derived factor-1, SDF-1)을 포함한 화학 주성 인자(chemotactic factors) 및 일부 성장 인자(예를 들면, VEGF; basic fibroblast growth factor, bFGF; 또는 hepatocyte growth factor, HGF)에 반응한다. 또한, 화학 주성 펩타이드 외에 HSPC(hematopoietic stem/progenitor cells)의 이식 및 동원에 대한 연구를 기반으로 한 일부 분자는 순환성 줄기세포의 동원 과정에서 중요한 역할을 한다. 이들은, 막 지질 래프트(membrane lipid raft)으로의 CXCR4, SDF-1 수용체 키나제의 도입을 자극함으로써, SDF-1 화학 주성 구배(chemotactic gradient)에 대한 HSPCs의 반응성을 향상시킨다. "프라이밍(Priming)"으로 불리는 이러한 현상은, 줄기 세포 트레피킹(trafficking)에 있어 SDF-1의 생리적 낮은 용량이 "보다 생물학적으로 중요하게" 만든다. 이러한 프라이밍 분자들은 complement C3 cleavage fragments (C3a and _desArgC3a), sMAC(soluble membrane attack complex) C5b-9 (Leukemia, 2013), LL-37(cathelicidin), β2-defensin, cationic peptides released from activated granulocytes (Lee et al. 2009b), thrombin (Huber-Lang et al. 2006; Shirvaikar et al. 2010), hyaluronic acid (Avigdor et al. 2004; Shirvaikar et al. 2010), 및 membrane-derived microvesicles (Janowska-Wieczorek et al. 2001)을 포함한다. 특히, 스핑고신 -1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate, S1P) 및 세라마이드-1-포스페이트 (ceramide-1-phosphate, C1P)와 같은 생체 활성 지질은 HSC에 대해 강력한 화학 유인 물질이며, 아마도 이식된 HSPCs의 SDF-1-독립적 호밍(homing)(Kim et al. 2010a, b)에 관여할 것이다. 따라서, 프라이밍 분자가 MSC의 기능과 생존을 향상시킬 수 있는지 여부를 조사하는 것은 타당하다.

본 발명자들은 줄기세포의 기능 증진에 기반한 신규한 폐고혈압 치료제를 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 프라이밍 분자인 S1P (sphingosine-1-phosphate) 또는 LL-37(cathelicidin)을 처리하여, MSC의 이동 성 활성화, 콜로니 형성능 증가, 항-염증 반응 향상 및 폐동맥 고혈압 동물 모델에서 탁월한 치료 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 줄기세포 활성 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 줄기세포 활성 촉진용 배지 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포의 활성 촉진 방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 폐고혈압의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 S1P(sphingosine-1-phosphate) 또는 LL-37(cathelicidin)을 유효성분으로 포함하는, 줄기세포 활성 촉진용 조성물을 제공한다.

상기 활성 촉진은 본 발명의 S1P(sphingosine-1-phosphate) 또는 LL-37(cathelicidin)에 의하여 해당 줄기세포가 프라이밍(Priming)됨으로써 줄기세포의 기능이 향상 또는 증진되는 것을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이밍(Priming)"은 줄기세포의 치료 효능을 증진시키기 위하여 반응성(활성)이 향상되는 현상을 의미하며, 본 발명에서는 상기 프라이밍을 유도하는 프라이밍 분자인 S1P(sphingosine-1-phosphate) 또는 LL-37(cathelicidin)을 이용하여 해당 줄기세포의 활성을 촉진시킨다.

본 발명에서 활성 촉진 또는 프라이밍 유도는 줄기세포에 S1P(sphingosine-1-phosphate) 또는 LL-37(cathelicidin)를 직접 처리한 경우 줄기세포의 프라이밍이 유도되는 것뿐만 아니라, 상기 프라이밍 처리(전-처리)에 의하여 줄기세포의 활성이 향상된 줄기세포를 이용하여 다른 분화가 유도되는 것도 포함한다.

또한, 상기 활성 촉진용 조성물은 치료를 위한 세포치료제와 혼합하여 생체 내 주입함으로써 세포치료제의 생체 내 효과를 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 줄기세포 자체에 본 조성물을 처리한 후 기능이 증가된 세포치료제를 생체 내 이식하는 방법으로도 사용될 수 있다.

예컨대, 본 발명의 프라이밍은 줄기세포의 세포 이동성, 콜로니 형성능 및 항-염증 반응을 비롯한 줄기세포성에 관련된 기능을 향상시키는 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 본 조성물의 S1P(sphingosine-1-phosphate)는 1 내지 500 nM 범위의 농도로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 500 내지 400 nM 범위의 농도이고, 보다 더욱 바람직하게는 50 내지 300 nM 범위의 농도이며, 가장 바람직하게는 200 nM의 농도이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 본 조성물의 LL-37(cathelicidin)는 0.1 내지 6 ㎍/ml 범위의 농도로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.1 내지 4 ㎍/ml 범위의 농도이고, 보다 더욱 바람직하게는 0.5 내지 4 ㎍/ml 범위의 농도이며, 가장 바람직하게는 2.5 ㎍/ml 의 농도이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "줄기세포"는, 자기복제능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다.

본 발명의 줄기세포는 목적에 따라 적절히 제한 없이 선택될 수 있으며, 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터 유래된 공지된 모든 조직, 세포 등의 성체 세포로부터 유래할 수 있으며, 예를 들어, 골수, 제대혈, 태반(또는 태반 조직세포), 지방(또는 지방조직 세포) 등으로부터 유래할 수 있다.

예컨대, 상기 줄기세포는 골수, 지방 조직, 근육 조직, ex vivo 배양된 자기조직 간엽 줄기 세포, 동종 이계 간엽 줄기 세포, 제대혈, 배 난황낭, 태반, 제대, 골막, 태아 및 사춘기 피부, 그리고 혈액으로부터 제한없이 얻어지는 줄기세포일 수 있으며, 태아 또는 출생직후 또는 성인으로부터 유래된 줄기세포일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 줄기세포는 신경 줄기세포, 간 줄기세포, 조혈 줄기세포, 제대혈 줄기세포, 표피 줄기세포, 위장관 줄기세포, 내피 줄기세포, 근육 줄기세포, 중간엽 줄기세포 및 췌장 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 간 줄기세포, 조혈 줄기세포, 제대혈 줄기세포 및 중간엽 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 중간엽 줄기세포이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대혈로부터 유래된 것이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 S1P(sphingosine-1-phosphate) 또는 LL-37(cathelicidin)을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 활성 촉진용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "배지(culture media)"는 인 비트로에서 줄기세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 줄기세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.

또한 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다.

S1P(sphingosine-1-phosphate) 또는 LL-37(cathelicidin)을 이용하여 줄기세포의 활성을 촉진하고자 하는 본 발명의 목적상, 배지의 종류와 배양 방식에 특별히 제한 없이, 줄기세포 배지에 S1P(sphingosine-1-phosphate) 또는 LL-37(cathelicidin)을 포함하여 사용할 수 있다. 이 때, S1P(sphingosine-1-phosphate) 또는 LL-37(cathelicidin)을 단독으로 사용하거나 기존에 알려진 하나 이상의 특정 물질과 함께 사용하는 등 다양한 응용이 가능하다.

예컨대, 본 발명은 상기 줄기세포의 분비물을 유효성분으로 유효성분으로 포함할 수 있다.

즉, 상기 줄기세포, 이의 분비물, 배지 성분을 모두 포함하는 형태, 분비물 및 배지성분만을 포함하는 형태, 분비물만을 분리하여 단독으로 또는 줄기세포와 함께 사용하는 형태, 또는 줄기세포만을 투여하여 체내에서 분비물을 생성하는 형태로 사용하는 것도 모두 가능하다.

상기 줄기세포는 통상적으로 당업계에 공지된 어떠한 방법을 이용하여 획득할 수 있다.

본 발명의 배지 조성물은 상술한 S1P(sphingosine-1-phosphate) 또는 LL-37(cathelicidin)를 이용하여 줄기세포 활성을 촉진시키므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 줄기세포에 S1P(sphingosine-1-phosphate) 또는 LL-37(cathelicidin)을 처리하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 활성 촉진 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 상술한 S1P(sphingosine-1-phosphate) 또는 LL-37(cathelicidin)를 이용하여 줄기세포 활성을 촉진시키므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 S1P(sphingosine-1-phosphate) 또는 LL-37(cathelicidin)로 처리된 줄기세포를 제공한다.

본 발명의 S1P(sphingosine-1-phosphate) 또는 LL-37(cathelicidin)로 처리된 줄기세포는 특정 질환의 치료를 위한 세포치료제로 이용될 수 있으며, 상기 처리는 상기 분자들의 직접적인 처리 또는 전-처리일 수 있다.

상기 "세포치료제"란, 세포와 조직의 기능을 복원하기 위하여 살아 있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 여타 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등 일련의 행위를 통하여 치료, 진단, 예방 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

상기 세포 치료제는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 인체에 투여될 수 있다.

비경구 투여, 예를 들어 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 세포 치료제는 또한 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 줄기세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 투여될 수 있으며, 이런 담체로 생리학적 식염수를 예로 들 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 줄기 세포를 유효성분으로 포함하는 폐고혈압 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 폐고혈압은 특발성 폐동맥성 고혈압; 가족성 폐동맥성 고혈압; 콜라겐 혈관 질환, 선천성 체폐 단락(短絡), 문맥 고혈압, HIV 감염, 약물 또는 독소와 관련된 폐동맥성 고혈압; 티로이드 장애, 글리코겐 저장 질환, 고셔(Gaucher) 질환, 유전성 출혈성 모세혈관 확장, 혈색소병증, 골수증식장애 또는 비장절제술과 관련된 폐동맥성 고혈압; 폐 모세혈관 혈관종증과 관련된 폐동맥성 고혈압; 신생아의 지속성 폐고혈압; 만성 폐쇄성 폐 질환, 간질성 폐 질환, 저산소증 유도 폐포 저환기 장애, 저산소증 유도 수면장애 호흡 또는 높은 고도에의 만성 노출과 관련된 폐고혈압; 발달 이상과 관련된 폐고혈압; 및 원위 폐동맥의 혈전색전성 폐쇄에 의한 폐고혈압으로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 특발성 폐동맥성 고혈압, 가족성 폐동맥성 고혈압 또는 만성 폐쇄성 폐 질환이고, 가장 바람직하게는 특발성 폐동맥성 고혈압이다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 국소 주입, 근육 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상술한 줄기세포를 이용하므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명에 의하면, 줄기세포에 S1P(sphingosine-1-phosphate) 또는 LL-37(cathelicidin)를 처리한 경우 줄기세포의 활성이 탁월하게 향상되었다. 따라서, 본 발명은 폐고혈압의 예방 또는 치료에 적용될 수 있다.

도 1a은 S1P 또는 LL-37을 처리한 hCB-MSC에서의 세포이동성 결과를 보여준다. 도 1b은 S1P 또는 LL-37을 처리한 hAD-MSC에서의 세포이동성 결과를 보여준다.
도 2a는 hCB-MSC에서의 에서의 시그널링 전달(signalling transduction)에 대한 S1P 및 LL-37의 영향을 보여준다. 도 2b는 hAD-MSC에서의 에서의 시그널링 전달(signalling transduction)에 대한 S1P 및 LL-37의 영향을 보여준다.
도 3a는 S1P 또는 LL-37로 프라이밍된 MSC의 표면 마커들의 발현 양상을 보여준다. 도 3b는 S1P 또는 LL-37로 프라이밍된 MSC의 MTT 어세이 결과를 보여준다. 도 3c는 S1P 또는 LL-37으로 프라이밍된 MSC의 골 세포 계통으로의 인 비트로 분화능 결과를 보여준다. 도 3d는 S1P 또는 LL-37으로 프라이밍된 MSC의 지방 세포 계통으로의 인 비트로 분화능 결과를 보여준다. 도 3e는 유도된 지방 세포 유전자(예컨대, C/EBP-β, AP2, PPAR-γ 및 렙틴) 또는 골 세포 유전자(예컨대, RUNX2 및 오스테오칼신)의 mRNA 발현 수준을 보여준다.
도 4a는 S1P 또는 LL-37로 프라이밍된 MSC의 클론원성 CFU-F(fibroblast colony-forming units) 형성능을 보여준다. 도 4b는 S1P 또는 LL-37로 프라이밍된 MSC의 항-염증반응 효능을 보여준다.
도 5a는 MCT-유도 PAH 동물 모델에서의 S1P 매개에 의한 RVSP의 차이를 보여준다. 도 5b는 MCT-유도 PAH 동물 모델에서의 S1P 매개에 의한 RV/(LV+S)의 차이를 보여준다. 도 5c는 MCT-유도 PAH 동물 모델에서의 S1P 매개에 의한 폐 혈관 벽(pulmonary vessel wall)의 두께의 차이를 보여준다. 도 5d는 조직학적 분석 결과를 보여준다.
도 6은 MCT-유도 PAH 동물 모델에서의 S1P 매개에 의한 신규혈관형성에 관여하는 성장인자들과 그 수용체들의 발현의 차이를 보여준다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험재료 및 방법

인간 MSC 배양

인비트로젠 사(Carlsbad, CA, USA)에서 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포(Human adipose derived MSCs, hAD-MSCs)를 구입하여, 당업계에 공지된 방법으로 배양하였다. 본 연구에 이용된 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(Human cord blood derived MSCs, hCB-MSCs)는 메디포스트(주)(서울, 한국)으로부터 기증받았다. 제대혈은, 산모의 동의 하에 신생아 출산 후 제대 정맥에서 채혈하였다. UCB-MSC를 당업계에 개시된 방법으로 분리한 후, 2mM L-글루타민, 20mM HEPES (pH7.3), MEM 넌에센셜 아미노산 솔루션, 페니실린/스트렙토마이신(Cellgro, Pittsburgh, PA, USA), 1㎍/mL 아스코르브산(Sigma, St Louis, MO, USA), 10% 열-불활성화 FBS(Hyclone), 5ng/mL hEGF(human epidermal growth factor), 10ng/mL bFGF(basic fibroblast growth-factor), and 50㎍/mL LONG R3 IGF-1(Long R3-insulin-like growth-factor-1, Prospec, Rehovot, Israel)을 함유한DMEM(Dulbecco? modified Eagle? medium)-고-글루코오스(Hyclone, Pittsburgh, PA, USA) 배지로 5% CO₂, 37℃에서 배양하였다. MSC 모두는 다능성을 유지하기 위하여, 4번째까지만 계대배양하였다. 세포 표면의 에피토프(epitope)를 분석하기 위하여, 2% FBS가 포함된 DMEM에 재현탁한 5.0 X 10⁵ hAD- 또는 hCB-MSC를 항체로 얼음 위에서 30 분 동안 표지한 후, 2회 세척하고, LSR II 유세포 분석기(flow cytometer, BD Biosciences, Mountain View, CA)를 이용하여 분석하였다. 상기 이용된 항-마우스 모노클로날 항체들은 BD 파민겐(BD Pharmingen, 샌디에고, CA, USA)에서 구입하였다: CD105 (APC conjugated, clone 266), CD29 (PE, clone MAR4), CD44 (FITC, clone GoH3), CD45 (FITC, clone GoH3), CD34 (FITC, clone GoH3), and CD49f (FITC, clone GoH3)

세포 이동 어세이(Cell migration assay)

8 μm 폴리카보네이트 막을 1.0% 겔라틴(Sigma) 50 ㎕로 1 시간 동안 코팅하였다. MSC를 트립신-EDTA로 분리시킨 후, 세척하고, 0.5% BSA를 함유한 DMEM에 재현탁하여, 3 X 10⁴ 세포/웰 밀도로 트렌스웰 인서트(Transwell inserts, Costar Transwell; Corning Costar)의 상부 챔버에 접종하였다. 하부 챔버에는 0.5% BSA를 함유한 DMEM에 넣은 S1P(Cayman Chemical, Michigan, USA) 또는 LL-37(ANASPEC, Fremont, CA, USA)로 채웠다. 24 시간 후, 트렌스웰 플레이트로부터 인서트를 제거하였다. 상부 챔버에 남아있는 세포들을 탈지면으로 긁어내고, 이동한 세포들을 고정한 후, 0.5 % 크리스탈 바이올렛(Sigma)으로 염색하였다. 이미지 Pro 5.0 소프트웨어(Media-Cybernetics, Rockville, MD, USA)로 디지털 이미지를 분석하여, 막의 하부면에 있는 염색된 세포들을 정량하였다.

세포 증식 및 CFU-F(colony forming unit-fibroblast) 어세이

지정된 시간 동안 S1P 또는 LL-37을 처리한 후, 제조사의 프로토콜에 따라 MTT 어세이(Sigma)를 실시하여 세포 증식을 확인하였다. 4 시간 후, 마이크로 플레이트 분광 광도계(Molecular Devices)로 570 nm에서 흡광도를 측정하여 MTT 시약의 환원을 정량하였다.

또한, 하루 동안 S1P 또는 LL-37을 처리한 MSC를, 6-웰 배양 플레이트(각 웰당 60 세포)에 동일한 밀도로 재-플레이팅하여 CFU-F 어세이를 실시하였다. 추가적으로 hCB-MSC 배양 배지에 14 일 동안 배양하였다. 결과물인 콜로니들을 PBS로 2회 세척하고, 고정한 후, 0.5 % 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.

인 비트로 분화 어세이

당업계에 공지된 방법으로 골 세포 또는 지방 세포로의 인 비트로 분화(In vitro differentiation)를 실시하였다. 간략하게는, 정상적인 성장 배지하에서 배양된 세포를 지방 세포 분화 배지(5% FBS, 1 μM 덱사메타손, 10 μM 인슐린, 200 μM 인도메타신, 및 0.5 mM 이소부틸메틸잔틴이 함유된 DMEM) 또는 골 분화 배지(5% FBS, 50 μM L-아스코르베이트-2-포스페이트, 0.1 μM 덱사메타손, 및 10 mM 글리세로포스페이트가 함유된 DMEM)에서 배양하였다. 세포 내 지질의 축적을 특징으로 하는 지방 세포의 분화는, 오일 레드 O 염색에 의해 가시화하고, 100 % 이소프로필 알코올로 용출한 후, 마이크로 플레이트 분광 광도계(Molecular Devices)로 500 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.

골 분화는, 칼슘에 특이적인 알리자린 레드 염색으로 확인하였다. 알리자린 레드 S 염색법은 1 시간 동안 세틸피리디늄 클로라이드 100 mM(Sigma)를 이용하여 정량하였다. 가용화된 알리자린 레드 S의 방출은 분광 광도계를 이용하여 570 ㎚에서 측정하였다.

MSCs의 항-염증 어세이

쥐 폐포대식세포 세포주인 MH-S를 10 % 열-불활성화 FBS 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM-고 글루코오스로 배양하였다. 염증 분석을 위하여, 1 X 10⁵ MH-S 세포들을 12-웰 배양 플레이트에 접종한 후, 하루 동안 0.2 μM S1P 또는 2.5 μM LL-37로 처리한 IMR90 또는 hCB-MSC로부터 얻은 조건 배지(CM, conditioned medium)의 부재 또는 존재 하에서, 0.1 ㎍/mL LPS(Sigma)로 자극하였다. 5 시간 후, MH-S 대식세포에 의한 조정 배지를 수집하고, 10 분 동안 500 ×g로 원심 분리하였다℃. 뮤린 TNFα ELISA 키트(Thermo Scientific)에 MH-S 배지 중 총 50 μL을 이용하였다.

웨스턴 블롯(Western blot)

37℃, 0.5 % BSA를 함유하는 DMEM에서 하루 동안 MSC를 결핍(starvation)시키고, 지정된 농도의 S1P 또는 LL-37으로 5 분 또는 10 분 동안 자극한 후, 단백질 분해효소와 포스파타아제 억제제를 함유한 RIPA 용해 버퍼(Santa-Cruz)로 얼음에서 30 분 동안 용해시켰다. 세포 추출물(30 ㎍)을 12 % SDS-PAGE 젤에서 분리하여, MAPK^p42/44 및 AKT(Ser473)(Cell Signaling Technology Inc, Danvers, MA, USA)의 인산화를 분석하였다. 동일한 로딩 양을 총 MAPK^p42/44 및 총 AKT(Ser473)(Cell Signaling Technology Inc)에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체로 평가하였다.

PAH 동물 모델

모든 동물 실험은 울산대학교 의과대학의 실험동물운영위원회(IACUC-2012-02-174)에 의해 승인되었다. 수컷 SPF(specific-pathogen-free) 루이스 랫트(8 주령, 250~280g)를 식이 및 급수에 제한을 두지 않고, 조절된 실내 온도 및 조명(12 시간 명암 사이클) 하에서 사육하였다. 모노크로타린(monocrotaline, MCT, 60 mg/kg, Sigma Aldrich, St. Louis, USA)을 피하 주사하여 PAH를 유도하였다. 대조군 랫트에게는 동일한 부피의 PBS를 주사하였다. MCT 또는 PBS 주사 2 주 후, MSC(2.5 X 10⁵ 세포/ 200 μL), S1P 프라이밍-MSC(S1P-MSC, 2.5 × 10⁵ 세포/ 200 μL) 또는 PBS를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. S1P 프라이밍은, 주사전 3시간 동안 200 nM S1P을 처리하여 실시하였다.

RVSP(right ventricular systolic pressure) 및 RVH(right ventricular hypertrophy)의 측정

MCT 또는 PBS 주사 4 주 후, 당업계에 공지된 방법으로 인공 호흡기(Harvard apparatus inspira asv, Holliston, USA) 및 마취제인 졸레틸(40mg/kg)과 럼푼(10mg/kg)에 의한 호흡 하에서 환자 모니터(MDE Escort II patient monitor, Arleta, USA)에 연결된 26-G 바늘을 이용해서 횡격막을 관통하는 직접 구멍을 뚫어서 우심실 수축기 혈압(RVSP, right ventricular systolic pressure)을 측정하였다. 우심실 압력(RVP, Right ventricular pressure)은 인공호흡기로 호흡을 유지하였다. RVH을 결정하기 위하여, 심장의 우심실(RV, right ventricle)을 심실 중격으로부터 분리시키고, 우심실의 무게 및 심실 중격을 포함하는 좌심실(LV +S)의 무게를 측정하였다.

조직학적 분석(Histological analysis)

H & E-염색 또는 α-SMA(α-smooth muscle actin)-염색된 4 μm 두께의 절편 내에 직경 25-100 μm인 혈관을 무작위로 5 개 이상 선택하여, 선택한 구역을 400 배 배율로 캡춰하였다. 또한, 혈관 신생(neovascularization)을 확인하기 위하여, CD31-염색 부분도 조사하였다. 항-CD31 항체(1:100, Thermo, Fremont, USA) 및 항-α-SMA 항체(1:100, Abcam, Cambridge, USA)를 제조사의 권장 프로토콜에 따라 적용 및 인큐베이션하였다. NIH ImageJ에 프로그램(http://rsbweb.nih.gov/ij/)을 이용하여 당업계에 공지된 방법으로 중막 두께(Medial wall thickness)를 측정하였다. 중막 두께 지수를 (외부 직경-내부 직경)/ 외부 직경으로 정의하였다.

Real-Time quantitative PCR

RNeasy-미니 키트(Qiagen Inc. Valencia, CA, USA)를 이용하여 MSC로부터 총 RNA를 분리하고, DNA-프리 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 제거하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 Taqman Reverse-Transcription-Reagents(Applied Biosystems)를 이용하여 mRNA(400ng)를 역전사하였다. 당업계에 공지된 바와 같이, SYBR Green PCR 마스터 믹스(Applied Biosystems) 및 PikoReal^TM Real-Time PCR 시스템(Thermo Scientific) 상의 RQ-PCR(real-time quantitative PCR)을 이용하여, 지방 세포 분화 관련 유전자 또는 골세포 분화 관련 유전자의 발현 수준의 정량적 평가를 실시하였다.

상기 유전자들에 대한 프라이머 서열은 서열목록 1 내지 30에 나타내었다.

통계적 분석

스튜던트 t 테스트(Student's t test) 또는 일원변량분석(one-way ANOVA with the Bonferroni post-hoc test)을 이용하여 내압측정(cystometric) 및 RQ-PCR 결과의 차이점을 분석하였다. GraphPad Prism 5.0 소프트웨어(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)를 이용하여 모든 분석을 실시하였고, 통계적 유의성은 p<0.05 또는 0.01로 정의하였다.

실시예 1. hAD- 및 hCB-MSC에서의 세포이동성에 대한 S1P 및 LL-37의 영향 확인

S1P 및 LL-37과 같은 손상 조직에서 방출되는 일부 생리 활성 지질 및 양이온성 펩타이드는 대식세포와 HSPCs에 대한 화학 유인 물질로 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 이러한 HSPC 프라이밍 분자들이, 비-조혈 줄기 세포이며 줄기세포 치료제로 대중적으로 이용되고 있는 MSC를 이동시키는 지의 여부에 대하여 실험을 진행하였다. 이 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 트렌스웰 세포이동 분석을 이용하여, 인간 지방 조직(hAD-) 및 제대혈(hCB-)에서 유래된 MSC에 대한 S1P 및 LL-37의 화학 유인 활성(chemotatic activity)을 분석하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, S1P 및 LL-37은 MSC 모두를 이동시켰고, 이는 S1P 및 LL-37가 줄기세포의 다양한 유형의 이동 활성을 자극할 수 있다는 것을 제시한다. 특히, 이러한 프라이밍 분자들이 hAD-MSC보다 강하게 hCB-MSC를 이동시킨다는 것을 관찰하였다(도 1).

실시예 2. MSC에서의 시그널링 전달(signalling transduction)에 대한 S1P 및 LL-37의 영향 확인

HSPC의 이동이 강화되는 동안, S1P 및 LL-37 모두는 일부 시그널 경로를 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 이것들이, MSC에서 유사한 시그널링 전달을 활성화할 수 있는 지의 여부에 대하여 평가하였다. S1P 및 LL-37에 노출된 hCB-MSC가 MAPK 및 AKT 시그널링 전달을 자극하였다. 이는 MAPKp42/44 및 AKT 단백질의 인산화가 증가하는 것으로 평가하였다(도 2a). 또한, S1P 및 LL-37는 hAD-MSC의 AKT 단백질의 인산화는 활성화시켰으나, MAPK 시그널 경로는 약간의 영향을 받았다(도 2b).

이러한 결과는 S1P 및 LL-37에 반응하는 여러 가지 줄기 세포의 프라이밍이 유사한 분자 메커니즘에 의해 매개될 수 있음을 시사한다.

실시예 3. MSC의 특성에 대한 S1P 및 LL-37의 효과 확인

본 발명자들은 프라이밍 분자가, 치료 효능에 관련될 수 있는 MSC의 생물학적 효과에 영향을 줄 수 있는지의 여부에 대하여 실험하였다.

그 결과, S1P 또는 LL-37로 프라이밍된 MSC의 CD29, CD105, 및 CD49f와 같은 표면 마커들의 발현 양상이 비-처리된 MSC의 양상과 유사하였다(도 3a). 반면, S1P 및 LL-37 모두는 hAD- 및 hCB-MSC의 증식 활성에 유효한 영향을 미치지 않았다(도 3b).

또한, 골 세포 또는 지방 세포 계통으로의 인 비트로 분화능을 실험한 결과, S1P 또는 LL-37으로 전-처리된 hAD- 및 HCB-MSC은 비-처리된 세포과 비교하여 약간의 차이를 나타냈다(도 3c 및 3d). 유도된 지방 세포 유전자(예컨대, C/EBP-β AP2, PPAR-γ 및 렙틴) 또는 골 세포 유전자(예컨대, RUNX2 및 오스테오칼신)의 발현 수준도 약간의 차이를 나타냈다(도 3e).

반면, S1P 또는 LL-37로 프라이밍된 MSC는 용량-의존적으로 MSC에 대한 클론원성 전구세포(clonogenic progenitor)인 클론원성 CFU-F(fibroblast colony-forming units) 형성능을 증가시켰다(도 4a).

MSC가 염증 반응을 감소시켜 조직 손상에 대한 유익한 효과를 제공한다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 S1P 또는 LL-37로 MSC를 프라이밍시킨 후 MSC의 항-염증반응 효능을 비교하고자 하였다.

이를 위해, 본 발명자들은 LPS로 MH-S 폐포 대식세포를 전-처리한 후, S1P 또는 LL-37로 하루 동안 처리한 hCB-MSC로부터 얻은 조건 배지(CM, conditioned medium)의 존재 하에서, MH-S 세포로부터의 TNFα 분비가 억제될 수 있는 지의 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, hCB-MSC로부터 얻은 hCB-CM의 존재에 의하여 현저하게 TNFα 분비가 감소되었고, S1P 또는 LL-37로 프라이밍된 줄기세포로부터 얻은 CM에 의하여 더욱 감소되었다. 반면, 자극된 대식세포에 의한 TNFα 분비는, 인간 폐 섬유아세포주인 IMR90으로부터 얻은 CM에 의해 약간 영향을 받았다.

이러한 결과들은, S1P 또는 LL-37로 프라아밍된 hCB-MSC가 그들의 치료 효능에 매우 중요한 줄기세포성(stemness) 및 항 염증 효능을 향상시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 4. PAH 동물 모델에서의 S1P 매개에 의한 MSC 치료 효능 향상 확인

본 발명자들은 PAH를 타겟팅한 MSC 치료법에 있어서의 MSC 프라이밍의 효과를 확인하였다.

MCT 주사 4 주 후, RVSP가 크게 증가하였다. MSC 또는 S1P-MSC 를 주입한 경우, MCT(monocrotaline)로 유발된 RVSP 상승을 유의성 있게 약화시켰다. S1P-MSC 주입한 마우스의 RVSP 평균이 MSC를 주입한 마우스의 평균보다 낮았다(도 5a).

또한, MCT 주사에 의해 RV/(LV+S)가 크게 증가하였다. S1P-MSC를 주입한 경우, 이러한 RV 비대를 유의성 있게 약화시켰으나, MSC의 경우 RV/(LV+S)를 유의성 있게 감소시키지 못했다(도 5b).

또한, MCT는 폐 혈관 벽(pulmonary vessel wall)의 두께를 크게 증가시켰다. S1P-MSC를 주입한 경우, MCT(monocrotaline)로 유발된 폐 혈관 벽의 두께를 유의성 있게 약화시켰으나, MSC의 경우 이러한 PAH 모델의 혈관 벽 두께를 개선시키지 못했다(도 5c).

이는 도 5d에 나타낸 바와 같이, α-SMA(α-smooth muscle actin)-염색하여 혈관의 두께를 확인하였다(왼쪽 위쪽 패널; CTL, 오른쪽 위쪽 패널; MCT, 왼쪽 아래쪽 패널; MSC + MCT, 오른쪽 아래쪽 패널; S1P-MSC + MCT).

또한, MCT는 신규혈관생성 (angiogenesis)에 관여하는 성장 인자들과 그들의 수용체의 발현을 크게 감소시켰다. S1P-MSC를 주입한 경우, MCT(monocrotaline)로 유발된 신규혈관생성 관련 성장인자들과 수용체들의 발현을 유의성 있게 호전시켰으나, MSC의 경우 이러한 PAH 모델의 혈관 벽 두께를 개선시키지 못했다(도 6).

<110> THE ASAN FOUNDATION <120> Pharmaceutical Composition for Treating Pulmonary Hypertension Comprising Primed-Stem Cell as an Active Ingredient <130> Asan1.102p <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGAPDH_qRT_F1 <400> 1 ccaggtggtc tcctctgact tc 22 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGAPDH_qRT_R1 <400> 2 gtggtcgttg agggcaatg 19 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hRunx2_qRT_F1 <400> 3 tcttagaaca aattctgccc ttt 23 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hRunx2_qRT_R1 <400> 4 tgctttggtc ttgaaatcac a 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hOCN_qRT_F1 <400> 5 agcaaaggtg cagcctttgt 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hOCN_qRT_R1 <400> 6 gcgcctgggt ctcttcact 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hMSX2_qRT_F1 <400> 7 ccctggagcg caagttccgt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hMSX2_qRT_R1 <400> 8 ggcgggatgg gaagcacagg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hALP_qRT_F1 <400> 9 gacctcctcg gaagacactc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hALP_qRT_R1 <400> 10 tgaagggctt cttgtctgtg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPPARr_qRT_F1 <400> 11 cctccgggcc ctggcaaaac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPPARr_qRT_R1 <400> 12 ctcctgcaca gcctccacgg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hLeptin_qRT_F1 <400> 13 gaagaccaca tccacacacg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hLeptin_qRT_R1 <400> 14 agctcagcca gacccatcta 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> haP2_qRT_F1 <400> 15 gggtcacagc accctcctga 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> haP2_qRT_R1 <400> 16 ggtttggcca tgccagccac 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rGapdh_qRT_F1 <400> 17 agagagaggc cctcagttgc t 21 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rGapdh_qRT_R1 <400> 18 ggatggaatt gtgagggaga tg 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rSdf1a-qRT-F1 <400> 19 cagttacagg tggtggcatt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rSdf1a-qRT-R1 <400> 20 actctcggca aggaatctgt 20 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rCxcr4-qRT-F1 <400> 21 ccatggaaat atacacttcg ga 22 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rCxcr4-qRT-R1 <400> 22 aatagatggt gggcaggaag 20 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rPdgfc_qRT_F1 <400> 23 gagccagatc gatggcagat ag 22 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rPdgfc_qRT_R1 <400> 24 acaggaaagc tttgcccaaa a 21 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rVegfa_qRT_F1 <400> 25 ggaaagaccg attaaccatg tca 23 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rVegfa_qRT_R1 <400> 26 caggctttct ggattaagga ctgt 24 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rVegfb_qRT_F1 <400> 27 ggcccctgtg tcccagtt 18 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rVegfb_qRT_R1 <400> 28 tgtggcacgt gcataaacat c 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rVegfr2_qRT_F1 <400> 29 caccatgcag acgctgacat 20 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rVegfr2_qRT_R1 <400> 30 gcctgtagga gcatgcttct tc 22

Claims (11)

1. S1P(sphingosine-1-phosphate)를 전처리한, 중간엽 줄기 세포를 유효성분으로 포함하는 폐고혈압 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 중간엽 줄기세포의 세포 이동성, 콜로니 형성능 및 항-염증 반응을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 S1P은 1 내지 500 nM 범위의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 지방 조직 또는 제대혈로부터 유래된 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 제1항에 있어서, 상기 폐고혈압은 특발성 폐동맥성 고혈압; 가족성 폐동맥성 고혈압; 콜라겐 혈관 질환, 선천성 체폐 단락(短絡), 문맥 고혈압, HIV 감염, 약물 또는 독소와 관련된 폐동맥성 고혈압; 티로이드 장애, 글리코겐 저장 질환, 고셔(Gaucher) 질환, 유전성 출혈성 모세혈관 확장, 혈색소병증, 골수증식장애 또는 비장절제술과 관련된 폐동맥성 고혈압; 폐 모세혈관 혈관종증과 관련된 폐동맥성 고혈압; 신생아의 지속성 폐고혈압; 만성 폐쇄성 폐 질환, 간질성 폐 질환, 저산소증 유도 폐포 저환기 장애, 저산소증 유도 수면장애 호흡 또는 높은 고도에의 만성 노출과 관련된 폐고혈압; 발달 이상과 관련된 폐고혈압; 및 원위 폐동맥의 혈전색전성 폐쇄에 의한 폐고혈압으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.

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