KR101224504B1

KR101224504B1 - 크립토탄신온의 신규 용도

Info

Publication number: KR101224504B1
Application number: KR1020100096039A
Authority: KR
Inventors: 신진희; 김경수; 이일규
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2010-10-01
Filing date: 2010-10-01
Publication date: 2013-01-22
Also published as: KR20120034458A; WO2012044139A3; US9233128B2; WO2012044139A2; US20140134138A1; US20130183275A1

Abstract

본 발명은 크립토탄신온을 포함하는 중간엽 줄기세포의 골모세포로의 분화 촉진용 조성물 및 크립토탄신온 및 중간엽 줄기세포를 포함하는 골 형성 촉진제를 제공한다.
본 발명에 따르면, 크립토탄신온을 중간엽 줄기세포에 처리하게 되면 골모세포로의 분화가 촉진되므로, 이렇게 분화가 유도된 중간엽 줄기세포를 직접 환자에게 이식하여 환자의 골 형성을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물 또는 골 형성 촉진제는 골다공증, 골절, 임플란트용 치조골 이식을 포함한 골 이식, 기타 골 결손 등 골 형성 촉진이 요구되는 장애를 가지고 있는 환자의 치료를 위해 사용될 수 있다.

Description

크립토탄신온의 신규 용도{Novel use of cryptotanshinone}

본 발명은 크립토탄신온의 신규 용도에 관한 것이다.

각종 질환으로 인해 손상된 조직과 장기를 치료하는 기술로서, 자가복제(self-renewal) 및 분화(differentiation)가 가능한 세포를 재생이 필요한 조직 및 장기에 주입하는 방법이 주목받고 있다. 이러한 세포의 대표적인 예로 중간엽 줄기세포를 들 수 있다.

중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC)는 보다 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 다능성(multipotency)을 지닌 줄기세포이다. 중간엽 줄기세포는 골모세포(osteoblast), 연골세포(chondrocyte), 지방세포(adipocyte), 신경세포(neuronal cell), 상피세포 (epithelial cell), 근육(muscle) 등과 같은 인체를 구성하는 각종 세포와 조직으로 분화(differentiation)할 수 있으므로, 재생의학의 실용화 측면에서 가장 핵심적인 세포로 각광받고 있다. 그러나, 만족할만한 치료 효과를 거두기 위해는 조직에 주입된 중간엽 줄기세포가 해당 조직에 적합하게 분화되어 생착되는 것이 중요하다.

지방세포는 중간엽 기원의 줄기세포에서 기원하며, 이 줄기세포는 지방세포뿐 아니라 골모세포로의 분화가 가능하다. 여러 연구를 통하여 골수 유래 줄기세포에서 지방세포와 골모세포의 분화 사이에 상반관계가 있음을 보여 주었다(Dorheim MA, et al., J Cell Physiol 1993;154:317-28. ; Beresford JN, et al., J Cell Sci 1992;102:341-51.). 즉 지방세포의 분화가 억제되면서 골 형성이 증가할 수 있다는 것으로 여러 전사인자와 세포내외 신호 전달 체계가 줄기세포에서 지방세포와 골모세포로 분화하는 과정에서 밀접하게 연관되어 조절되고 있으며, 이 중peroxisome proliferator activated receptorγ(PPARγ)는 지방세포의 분화를 증가시키면서 골모세포의 분화를 감소시키는 결과를 보여주었다(Schwartz AV, et al., J Clin Endocrinol Metab 2006;91:3349-54.; Gimble JM, et al., Mol Pharmacol 1996;50:1087-94.⁾.

한편, 크립토탄신온(cryptotanshinone)은 말린 단삼의 뿌리(dried root of SalviamilitorrhizaBunge)에서 추출된 지용성 diterpene 계열의 화합물로서 약리적 작용으로 식욕 저하 효과가 보고되었고, 비만쥐를 대상으로 한 동물실험에서도 cryptotanshinone 복용 후 식욕의 저하와 함께 30%의 체중 감소 효과가 관찰된 바 있다. 그러나 크립토탄신온이 줄기세포의 골모세포로의 분화를 촉진함에 대해서는 아직까지 보고된 바 없었다.

본 발명은 크립토탄신온의 신규 용도를 제공하고자 한다.

본 발명자들은 크립토탄신온이 지방조직 유래 중간엽 줄기세포에서 지방세포로의 분화를 억제할 수 있는지 연구하는 과정에서 놀랍게도 크립토탄신온이 중간엽 줄기세포의 골모세포로의 분화를 촉진할 수 있음을 밝혀냈다.

하기 실시예에서는 알칼리 인산 분해효소(alkaline phosphatase, ALP) 염색을 통해 조골세포의 무기질 침착을, von Kossa 염색을 통해 골 형성 과정에서의 칼슘 침착을 확인한 결과 크립토탄신온을 처리한 배지에서 줄기세포가 골모세포로 변화함을 확인하였다. 또한, 골모세포의 분화시 발현되는 유전자인 Runx2, collagen type I, osteonectin과 osteocalcin이 발현됨을 확인할 수 있었다. 또한 크립토탄신온을 처리한 배지의 경우 줄기세포는 파골세포로의 분화가 억제됨을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 크립토탄신온을 포함하는 중간엽 줄기세포의 골모세포로의 분화 촉진용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 골다공증, 골절, 임플란트용 치조골 이식을 포함한 골 이식, 기타 골 결손 등 골 형성 촉진이 요구되는 질환의 치료를 위해 골모 세포를 이식하는 치료법에서 유용하게 사용될 수 있다.

상기 조성물을 이용하여 중간엽 줄기세포를 골모세포로 분화 촉진하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 골 형성이 요구되는 환자에게 이식하기 위한 중간엽 줄기세포의 배양시 배양배지에 상기 조성물을 추가하여 배양함으로써 줄기세포의 골모세포로의 분화를 촉진할 수 있다. 다르게는 중간엽 줄기세포의 이식시 상기 조성물을 함께 처리할 수도 있다.

상기 조성물에 의해 골모세포로의 분화가 촉진될 수 있는 중간엽 줄기세포의 종류는 특별히 한정되지 않는다.

한 구체예에서, 상기 중간엽 줄기세포는 조직, 골수, 제대혈 또는 혈액으로부터 얻은 것일 수 있다. 한 구체예에서, 상기 중간엽 줄기세포는 지방 조직으로부터 얻은 것일 수 있다.

중간엽 줄기세포의 골모세포로의 분화를 촉진할 수 있는 크립토탄신온의 농도는 특별히 한정되지는 않지만, 1 내지 50 μM의 농도로 사용될 수 있다.

한편, 상기 조성물은 중간엽 줄기세포의 배양시 일반적으로 사용되는 배지를 포함할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 이러한 배지로는 예컨대, MEM-alpha (Minimum Essential Medium alpha), MSCGM(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 등이 포함될 수 있다. 또한, 골모세포로의 분화를 촉진할 수 있는 것으로 당업계에 알려져 있는 배지, 예컨대, 덱사메타손, 글리세롤 포스페이트 및 L-아스코르브산 2-포스페이트가 포함된 MEMα과 같은 골모세포 분화 유도 배지를 사용할 수도 있다.

본 발명은 또한 크립토탄신온 및 중간엽 줄기세포를 포함하는 골 형성 촉진제를 제공한다.

앞서 살펴본 바와 같이 크립토탄신온을 중간엽 줄기세포에 처리하게 되면 골모세포로의 분화가 촉진되므로, 이렇게 분화가 유도된 중간엽 줄기세포를 직접 환자에게 이식하여 환자의 골 형성을 촉진시킬 수 있다.

한 구체예에서, 상기 골형성 촉진제는 골다공증, 골절, 임플란트용 치조골 이식을 포함한 골 이식, 기타 골 결손 등 골 형성 촉진이 요구되는 장애를 가지고 있는 환자에게 이식하기 위한 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 중간엽 줄기세포는 그것이 어디로부터 유래한 것인지 관계없이 이용될 수 있다.

조직, 골수, 제대혈, 혈액 등의 채취 대상인 동물은 포유동물일 수 있다. 상기 동물이 인간일 경우 조직, 골수, 제대혈, 혈액은 본 발명의 조성물의 처리에 의해 골모세포로의 분화가 촉진된 중간엽 줄기세포를 세포치료제로서 투여하게 될 환자 자신의 것이나 타인 유래의 것일 수 있다.

본 발명에 따른 크립토탄신온 및 중간엽 줄기세포를 포함하는 골 형성 촉진제에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 크립토탄신온의 처리에 의해 골모세포로의 분화가 유도된 상태일 수 있으나, 경우에 따라 크립토탄신온과 동시에 이식하기 위해 크립토탄신온으로 처리하기 전의 중간엽 줄기세포를 사용할 수도 있다. 또한, 크립토탄신온에 의해 중간엽 줄기세포의 골모세포로의 분화 유도가 어느 정도 진척된 상태라면 크립토탄신온을 포함하지 않고 크립토탄신온으로 분화가 유도된 골모세포 그 자체를 포함할 수도 있다.

다른 구체예에서, 상기 골 형성 촉진제는 담체에 담지되어 있는 형태로 투여될 수 있다. 상기 담체는 줄기세포의 이식을 위해 또는 골 이식을 위해 당업계에서 사용되고 있는 공지의 담체라면 어떠한 것이든 가능하다. 예를 들어, 임플란트용 치조골 이식과 같이 골 이식이 필요한 환자의 경우 일반적으로 인공뼈의 이식이 이루어지고 있는데, 이 때 본 발명의 골 형성 촉진제를 상기 인공뼈에 담지하여 이식할 수 있다. 이 경우 겔 형태의 생체적합성 폴리머 등을 이용함으로써 크립토탄신온의 지속적인 공급을 통한 이식된 중간엽 줄기세포의 골모세포로의 분화 유도 및 생착을 도울 수 있다. 마찬가지로, 골절 환자의 경우에서도 키토산, 히알루론산 등을 포함하는 생체적합성 스캐폴드를 담체로 사용하여 상기 골 형성 촉진제를 이식할 경우 크립토탄신온에 의한 줄기세포의 골모세포로의 분화 유도를 계속적으로 촉진할 수 있게 된다.

한 구체예에서, 상기 크립토탄신온은 1 내지 50 μM의 농도로 포함되어 있는 것일 수 있다.

또한, 상기 중간엽 줄기세포의 유효량은 1×10⁴내지 1×10⁶세포/㎏일 수 있다. 그러나, 이들의 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 상처의 정도에 따라 적의 증감될 수 있다. 본 발명에 따른 제제는 비경구 또는 국소투여에 의해 인체에 적용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 유효성분을 퉁상의 방법에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체에 현탁시키거나 용해시키는데, 이 때 수용성 담체를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 크립토탄신온을 중간엽 줄기세포에 처리하게 되면 골모세포로의 분화가 촉진되므로, 이렇게 분화가 유도된 중간엽 줄기세포를 직접 환자에게 이식하여 환자의 골 형성을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물 또는 골 형성 촉진제는 골다공증, 골절, 임플란트용 치조골 이식을 포함한 골 이식, 기타 골 결손 등 골 형성 촉진이 요구되는 장애를 가지고 있는 환자의 치료를 위해 사용될 수 있다.

도 1은 크립토탄신온의 처리에 의한 지방조직 유래 줄기세포의 골모세포로의 분화 여부를 확인하기 위한 ALP 및 von Kossa 염색 결과를 보여준다.
도 2는 크립토탄신온의 처리에 의한 지방조직 유래 줄기세포의 골모세포로의 분화 여부를 확인하기 위해 골모세포 분화 유도시 발현되는 마커의 발현을 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 보여준다.
도 3은 크립토탄신온의 처리에 의한 지방조직 유래 줄기세포의 파골세포로의 분화 억제 여부를 확인하기 위한 TRAP assay 결과를 보여준다.
도 4는 크립토탄신온의 처리에 의한 지방조직 유래 줄기세포의 파골세포로의 분화 억제 여부를 확인하기 위해 파골세포 분화 및 억제 관련 단백질의 발현 여부를 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 보여준다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[실시예]

실시예 1: 줄기세포의 분리 및 배양

본 연구는 가톨릭 대학교 생명윤리심의위원회(Institutional Review Board) 의 승인과“생명윤리 및 안전에 관한 법률”및 Helsinki 선언에 따른 환자의 서면 동의를 득한 후 인체로부터 채취한 지방조직을 사용하였다.

지방조직 유래 줄기세포(hADSCs)의 분리는 임건일 등(Im GI, et al., Osteoarthritis Cartilage 2005;13:845-53.)에 의해 기술된 방법으로 실험하였다. 특이한 과거력이나 약물 복용력이 없는 25세 여성의 지방흡입술에서 얻은 적출물에서 지방조직을 얻어 1% 항생제 및 항진균제(10× antibiotic & antimycotic, Gibco BRL, Grand island, NY, USA)가 포함된 phosphate buffered saline (PBS, Gibco BRL)에서 세척 후 메스로 잘게 자른 후 0.06% collagenase type I (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)을 처리하여 37℃, 5% CO₂가 함유된 배양기(CO₂incubator, Forma Scientific Inc, Marietta, OH)에 4시간동안 진탕하고, 원심분리 (Large Capacity table top Centrifuge, 한일과학)한 후 침전물을 10% 우태아 혈청(Fetal bovine serum, Hyclone, Logan, Utah)과 1% Penicillin-Streptomycin (P/S, Gibco BRL)을 함유한 Minimum Essential Medium (MEM, Gibco BRL)에 부유시킨 후 40 ㎛ cell strainer (BD Bioscience, Two Oak Park, Bedford, MA)로 조직들을 걸러내고 필터를 빠져 나온 용액을 배양하였다. 이후 매일 형태학적 특성을 도립 현미경하에서 관찰하였으며, 2일에 1회씩 배양액을 교환해 주었다. 배지를 교환할 때 배양접시에 부착되지 않은 세포는 제거하고 부착된 세포만을 배양하였으며 포화상태에 이르렀을 때 Trypsin- EDTA (Gibco BRL)로 분리하였으며 3계대까지 배양하였다.

실시예 2: 크립토탄신온에 의한 지방조직 유래 줄기세포의 골모세포 로의 분화 유도 확인

1) 골모세포로의 분화 유도

3회 계대배양된 hADSCs를 12웰 플레이트에 웰 당 1x10개씩 분주하고 일반배지(MEMα), 골모분화 유도배지(0.1 ㎛ Dexamethasone, 10 ㎛ glycerol phosphate, 50 ㎛ L-ascorbic acid 2-phosphate이 포함된 MEMα), 또는 크립토탄신온 10 μM 을 각각 처리하고 3일에 1회씩 배지를 교환해 주었다. 크립토탄신온은 표준함량 99.7%인 고형분을 영진제약에서 제공받아 사용하였다.

2) 골모세포의 분화 여부 확인

줄기세포의 골모세포로의 분화 여부 확인을 위해, 먼저 알칼리 인산 분해효소(alkaline phosphatase, ALP) 염색과 von Kossa 염색을 수행하였다. ALP 염색은 푸른색 물질의 형성을 통해 조골세포의 무기질 침착을, von Kossa 염색은 골형성 과정에서 칼슘 침착을 확인함으로써 골 형성을 확인할 수 있다.

알칼리 인산 분해효소(alkaline phosphatase, ALP) 염색을 위해, 각 처리군을 처리일로부터 7일, 14일, 21일, 28일 후 멸균 3차 증류수로 3회 세척하고 Citrate-Acetone-Formaldehyed (Sigma) 고정액으로 고정한 후 멸균 3차 증류수로 3회 세척하였다. Alkline-dye mix (Nitrite, FRV-alkline, Naphthol AS-BI alkline solution, Sigma)로 상온에서 15분간 빛을 차단한 상태에서 염색하고 멸균 3차증류수로 3회 세척하였다. Hematoxylin으로 염색하고 멸균 3차증류수로 3회 세척한 후 도립현미경 하에서 관찰하였다.

von Kossa 염색을 위해, 각 처리군을 처리일로부터 7일, 14일, 21일, 28일 후 멸균 3차 증류수로 3회 세척하고 상온에서 4% paraformaldehyde로 15분간 고정한 후 다시 3차 증류수로 3회 세척하였다. 1% silver nitrate 수용액으로 빛을 차단한 상태에서 30분간 염색하고 3차증류수로 3회 세척한 후 자외선에서 1시간 방치하였다. 0.1% Eosin(Sigma)으로 염색한 후 도립현미경하에서 관찰하였다.

그 결과, 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 골모세포 분화배지에서는 줄기세포의 골모세포로의 분화가 7일째부터 시작하여 28일째까지 증가하였으나 일반배지는 변화가 없었고 10 μM 크립토탄신온을 처리한 배지에서는 28일째부터 골모세포로의 분화가 일어난 것을 확인할 수 있었다 (도 1A 내지 1F).

다음으로, 역전사 중합 효소반응법(RT-PCR)을 이용하여 골모세포 분화 유도시 발현되는 유전자를 확인하였다.

각 처리군을 처리일로부터 7일, 14일, 21일, 28일 후 PBS(Gibco BRL)로 세척한 후 cell scraper (Sarsted, Inc, Newton, NC)를 이용하여 수확하고 QIAGEN RNA extraction kit(QIAGEN, GmbH, Germany)를 이용하여 RNA를 분리한 후 하기 조건을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.

반응 조건:

1. 94℃에서 2분간 인큐베이션

2. 94℃에서 45초간 denaturation

3. 51℃~60℃에서 어닐링

4. 72℃에서 60초 동안 32cycles을 통해 중합

5. 72℃에서 5분간 extension

RT-PCR을 통해 얻어진 산물을 2% 아가로스 겔 전기영동을 통해 2회 분석했다.

그 결과, 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 골모분화배지에 10 μM 크립토탄신온을 처리한 배지에서 28일째부터 골모세포분화시 특이적인 유전 인자인 Runx2, collagen type I, osteonectin과 osteocalcin의 발현이 관찰되었다.

실시예 2: 크립토탄신온에 의한 지방조직 유래 줄기세포의 파골세포 로의 분화 억제 확인

1) 파골세포로의 분화 유도

3회 계대배양된 hADSCs를 각 배양접시에 분주하고 100 nM 덱사메타손(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO), 파골세포 분화배지 (DMEM include 4 mM L-glutamine, 1.0 mM sodium pyruvate, 10% fetal bovine serum, 1% P/S, 20 ng/mL M-CSF and 100 ng/mL RANKL), 100 nM 덱사메타손에 10 μM 크립토탄신온을 첨가한 배지, 파골세포 분화배지에 10 μM 크립토탄신온을 첨가한 배지에 각각 7일간 배양하며 3일에 1회씩 배지를 교환해 주었다.

2) 파골세포로의 분화 여부 확인

TRAP(tartrate resistant acid phosphatase)은 활발하게 골의 재흡수를 할 수 있는 파골세포에서 분비되는 물질로 이 물질을 확인함으로 파골세포의 형성을 관찰할 수 있다. 따라서, 파골세포로의 분화 여부를 확인하기 위해, TRAP(tartrate resistant acid phosphatase) 활성을 측정하였다.

먼저, 파골세포 분화배지, 파골세포 분화배지에 10 μM 크립토탄신온을 첨가한 배지 및 일반배지를 각각 처리하고 처리일로부터 7일 후 PBS로 3회 세척한 후 4% 파라포름알데히드로 고정하고 TRAP assay kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan)를 이용하여 염색한 후 도립현미경 하에서 관찰하였다.

그 결과, 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 100 nM 덱사메타손을 처리한 배지와 파골세포 분화배지에서는 7일후 파골세포의 분화가 관찰되었으며 각 배지에 10μM 크립토탄신온을 처리한 경우에는 분화된 파골세포의 감소가 관찰되어 파골세포의 분화 억제를 확인할 수 있었다.

또한, 파골세포 분화 유도시 발현되는 단백질 확인을 확인하기 위하여 웨스턴블럿을 수행하였다.

60mm 배양접시에 3 X 10⁶cells/well개씩 분주하고 파골세포 분화배지 또는 파골세포 분화배지에 10 uM cryptotanshinone 첨가한 배지를 처리하고 7일간 배양하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 RIPA-B buffer (0.5% Nonidet P-40, 20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM sodium chloride, 50 mM Sodium fluoride, 100 Sodium orthovanadate, 1mM DTT, 50 /ml phenylmethanesulphonyl fluoride)를 처리하고 1시간 동안 4℃에서 방치한 후, 4℃, 2,000 rpm에서 원심분리하여 단백질을 얻었다. 얻어진 단백질을 통법을 이용하여 단백질 전기영동장치 및 transfer 장비를 이용하여 nitrocellulose membrane으로 이동시키고 5% skin milk (phosphate-buffered saline containing 5% skim milk and 0.05% Tween 20) 으로 blocking 하고 RANKL(Millipore; Concord Road, Billerica, MA), RANK(Millipore), OPG(Millipore) 또는 GAPDH (Millipore) 1차항체 및 HRP가 부착되어있는 2차항체 (Millipore)를 처리한 후 ECL (Amersham, Arlington, Heights, IL) 용액을 처리하여 X-Ray film(Fuji film, Nishiazabu, Minato-ku, Tokyo, Japan)에 감광시켜 확인하였다.

그 결과, 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이 파골세포분화배지에 크립토탄신온을 처리한 배지에서 7일째 파골세포분화를 유도하는 RANKL은 발현이 억제되었으나 파골세포분화 억제인자로 알려진 OPG는 발현이 증가되었다.

Claims

크립토탄신온을 포함하는 중간엽 줄기세포의 골모세포로의 분화 촉진용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 크립토탄신온은 1 내지 50 μM의 농도로 포함되어 있는 것인 조성물.
크립토탄신온 및 중간엽 줄기세포를 포함하는 골 형성 촉진제.
제3항에 있어서,
상기 골 형성 촉진제는 골다공증, 골절 또는 골 결손을 가지고 있거나 골 이식이 요구되는 환자에게 이식하기 위한 것인 골 형성 촉진제.
제3항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 지방 조직, 골수, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻은 것인 골 형성 촉진제.
삭제
제3항에 있어서,
상기 골 형성 촉진제는 담체에 담지되어 투여되는 것인 골 형성 촉진제.
제3항에 있어서,
상기 크립토탄신온은 1 내지 100 μM의 농도로 포함되어 있는 것인 골 형성 촉진제.
제3항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포의 유효량은 1×10⁴ 내지 1×10⁶세포/㎏인 골 형성 촉진제.