KR100687247B1 - 크립토탄시논을 함유하는 간질환 치료 및 예방을 위한조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 크립토탄시논을 함유하는 간질환 치료 및 예방을 위한 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 간세포를 보호하고, 간섬유화 및 간경화의 직접적 원인이 되는 간성상세포의 자가사멸을 유도하는 효능이 있는 크립토탄시논을 유효성분으로 함유하는 간질환 치료 및 예방 효과가 뛰어난 약학조성물 및 건강보조식품을 제공할 수 있다.

크립토탄시논, 간질환, 간성상세포.

Description

크립토탄시논을 함유하는 간질환 치료 및 예방을 위한 조성물 {Composition comprising Cryptotanshinone for treating or preventing liver disease}

도 1은 크립토탄시논에 의해 자가사멸되고 있는 간성상세포의 DNA단편화를 보여준 도면이다.

도 2는 크립토탄시논에 의해 자가사멸되고 있는 간성상세포의 캐스파제 활성화 및 폴리 폴리머라아제 분해 (poly(ADP-ribose) polymerase cleavage)를 보여준 도면이다.

본 발명은 간세포에서 산화성 또는 비산화성 손상을 억제하고, 간섬유화 및 간경화의 직접적 원인이 되는 간성상세포의 자가사멸을 유도하는 크립토탄시논을 유효성분으로 함유한 간질환 치료 및 예방을 위한 조성물에 관한 것이다.

간은 소화기계와 전신순환계 사이에 위치함으로써 소화기계로 들어온 생체외 물질로부터 전신을 방어하는 기능을 수행하고 있는 매우 중요한 장기이다. 일단 생 체내로 들어온 생체외물질이 간을 통과하는 까닭에 간은 영양소외에도 많은 독성물질에 노출 위험이 다른 장기보다 많아 그만큼 손상될 확률도 다른 장기에 비해 높다.

간조직중에는 영양물질 흡수 및 대사, 저장, 혈장단백질 합성 등과 같은 간의 주요기능을 수행하는 간세포(hepatocyte), 간내대식세포(macrophage)인 쿠퍼세포(Kupffer cell), 간 손상시 결합조직을 과다 합성함으로써 간섬유화를 초래하는 간성상세포(hepatic stellate cell; HSC) 및 내피 세포(Endothelial cell), 오목 세포(Pit cell) 등이 존재한다. 이중 간세포는 간조직을 구성하는 전체 세포의 약 90%이상을 차지하며, 간의 주요기능을 수행하는 실질 세포(parenchymal cell)로써 간질환시 간기능 저하는 바로 이 간세포 손상으로 인해 초래되는 것이다.

간은 재생 능력이 우수한 장기로 간세포가 약간 손상된 경우에는 충분히 정상으로 회복된다. 그러나 지속적으로 간세포가 손상될 경우 간세포가 완전히 파괴되면서 파괴된 부분이 정상적으로 회복되지 못하고 결합조직이 과다 축적되어 간조직에 상처가 형성되고 간 기능이 정상으로 회복되지 못하는 상태가 되는 것이다(Lissoos, et al., J. Clin. Gastroenterol., 15(1), pp.63-67, 1992).

이러한 간 손상의 원인은 알코올, 담즙, 바이러스 등 다양하지만 손상이 지속되어 만성 간질환(chronic liver disease; CLD) 상태가 되면 그 원인과는 상관없이 염증상태 지속, 세포외 기질(extra cellular matrix ; ECM)의 질적 및 양적 변화가 유발되게 된다. 세포수준의 변화에는 활성화된 간성상세포, 대식세포와 쿠퍼 세포가 관여하게 되며 분자적 수준의 변화에는 여러 생장 인자(growth factor), 사 이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), ECM 조직(organization) 및 구성(composition)의 변화 그리고 산화적 스트레스-관련성 분자(oxidative stress-related molecule)가 주요한 역할을 담당하게 된다.

이상에서 설명한 바와 같이, 여러 원인에 의한 만성 간손상은 공통적으로 간섬유화를 초래하게 되며 그 기전을 요약하면 다음과 같다. 여러 원인에 의해 간세포가 손상되고, 간 내 대식세포(macrophage)인 쿠퍼 세포(Kupffer cell)가 활성화되어 여러 사이토카인을 분비하게 되면 이에 의해 간성상세포가 활성화되어 결합조직을 생성한다. 간 손상이 지속되게 되면 손상당한 간세포가 결합조직으로 대치되는 간질 복구가 유발되어 간조직 내 결합조직 과다축적으로 인한 상처가 형성되고 간세포 손상으로 인해 간기능이 저하되면서 간섬유화 및 간경화가 초래되는 것이다(Friedman, J. Hepatol., 38(Suppl 1), pp38-53, 2003).

간섬유화 치료제는 간섬유화시 가장 문제가 되는 과다한 결합조직을 생성하는 간성상세포(hepatic stellate cell, HSC)를 중심으로 연구되고 있다. 기존에는 간섬유화 치료제의 개발을 위하여 페니실라민, 16,16-디메틸 프로스타글란딘 E2, 콜키친, 글루코코르티코이드, 말로틸산(malotilate), 감마 인터페론, 펜톡시필린(pentoxifylline), 피리딘-2,4-디카르복실릭-디에틸아미드, 피리딘-2,4-디카르복실릭-디(2-메톡시에틸) 아미드 등의 약물과 같이 간성상세포 활성 억제 또는 결합조직 합성 억제 및 분해 촉진에 초점을 맞추어 연구되었었다 (Boker, et al., J. Hepatol., 13(Suppl 3), pp35-40, 1991; Bataller et al., Semin Liver Dis., 21, pp437-451, 2001). 그러나 최근 간섬유화 동물에서 정상간으로 회복기간 중 간성상 세포의 자가사멸이 유도됨이 보고되면서 새로운 간섬유화 치료법으로서 간성상세포의 자가사멸 유도가 부각되고 있다 (Iredale et al., Gastroenterology, 121(3), pp685-98, 2001; Iredale et al., Gut. 48(4), pp548-557, 2001).

자가사멸(또는 고사, apoptosis, programmed cell death)은 1972년 케르(Kerr)에 의해 소개된 명칭으로 1980년대 중반 이후 많이 연구되기 시작한 분야이다. 자가사멸은 조직 항상성(tissue homeostasis)을 유지하기 위한 필수 과정으로, 정상조직에서 세포의 신생과 균형을 유지하고 있는 세포의 손실 과정이다. 자가사멸 유도시 세포는 온전한 세포기관(intact organelle)과 원형질막의 막-결합 (membrane-bound) 소체로 분리된다. 명령된 DNA 단편화는 자가사멸의 대표적인 특징으로 활성화된 엔도뉴클레아제(endonuclease)는 DNA를 먼저 50 내지 300kb의 크기로 절단한 후 다시 180 내지 200 염기쌍의 단편으로 조각낸다. 이러한 DNA 단편화 (DNA laddering)는 자가사멸되는 세포 대부분에서 관찰된다. 자가사멸이 완전히 진행된 세포는 아폽토시스 소체(apoptotic body)라 지칭되며 이러한 아폽토시스 소체는 생체내에서 식세포(phagocytes)에 의해 제거된다. 일반적으로, 자가사멸은 세포내 구성요소가 세포내에 그대로 존재하는 상태로, 구성요소가 세포 외부로 유출되는 괴사와는 달리 염증반응을 유발하지 않고 제거되는 것이다. 즉, 염증의 유발 없이 세포를 제거할 수 있다는 점에서 자가사멸 유도가 암세포 제거방법으로 각광받고 있다.

현재 간섬유화 치료에 대한 많은 연구에도 불구하고 아직까지 독성 없이 임상에서 확실한 효과를 나타내는 치료제는 개발되지 않은 실정이다. 간은 침묵의 장기로 완충작용이 탁월하여 간의 일부가 손상을 당해 그 기능을 수행하지 못하여도 남은 일부가 그 기능까지 수행함으로써 간질환시 초기에 자각증상을 거의 느끼지 못하여 조기진단이 어렵고 말기에서야 발견되기 때문에 그 치료가 쉽지 않다. 또한 치료제도 거의없는 실정으로 우리나라에서도 연간 15,000명 이상이 간질환으로 사망하는 등 조기진단의 어려움과 더불어 높은 사망률로 사회적인 문제를 야기하고 있다.

이에, 본 발명자들은 간을 보호하고 간섬유화 또는 간경화를 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 효능의 물질을 찾고자 연구를 거듭한 결과, 단삼으로부터 분리된 성분인 크립토탄시논(cryptotanshinone)이 간세포의 손상을 방지하여 간 보호 효과를 확인하였고, 간섬유화 또는 간경화의 새로운 치료법으로 대두되고 있는 간성상세포의 자가사멸을 촉진하여 간섬유 및 간경화 치료에 이용될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 간세포의 손상을 방지효과와 간성상세포의 자가사멸을 촉진효과를 갖는 크립토탄시논을 유효성분으로 함유하는 간질환 치료 및 예방을 위한 조성물을 제공하는데 있다.

상기한 목적에 따라, 본 발명은 하기 화학식 1의 크립토탄시논을 유효성분으로 함유한 간질환 치료 및 예방을 위한 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 크립토탄시논은 당업계에 잘 알려진 방법으로 추출 또는 화학적 합성법에 의해 제조될 수 있으며, 시중에 시판가능한 것을 사용할 수 있으며, 그 방법 또는 물질은 특별히 한정되지 않는다.

상기 간질환에는 간염, 간경화, 간섬유화 등의 질환을 포함한다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

예를들어, 크립토탄시논은 단삼으로부터 분리하거나 또는 상업적으로 시판되는 것, 즉 중국 약물생물제품 검정소(Chinese Institute for Drug and Biological Product Control, Beijing, China)에서 공급되는 시판품 (제품번호 0852-9902)을 구입하여 사용하여, 무게의 약 1내지 10배, 바람직하게는 2내지 5배의 물, 메탄올 또는 에탄올 등의 저급알코올의 극성용매, 바람직하게는 에탄올로 1 내지 12시간, 바람직하게는 2 내지 5시간동안 가열 환류 추출, 냉침, 열수추출, 초음파 추출방법, 바람직하게는 가열 환류추출을 이용하여 수득한 추출액을 여과, 감압농축하여 극성용매에 가용한 조추출물을 얻는 제 1단계;

상기의 조추출물을 물 또는 메탄올 등과 같은 극성용매 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 60% 수성 메탄올에 현탁하여, 이를 현탁액의 약 1내지 100배, 바람직하게는 약 1내지 20배 부피의 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄과 같은 비극성용매, 바람직하게는 헥산과 클로로포름을 가하여 극성용매가용층에 비극성용매 가용층을 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회 분획하고 감압농축하여 비극성용매가용 및 극성용매가용부를 얻는 제 2단계;

이어서 상기 비극성용매가용부를 디클로로메탄-에틸아세테이트 혼합용매를 용출용매로 하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 용출물을 박층 크로마토그래피(TLC 실리카 겔)의 패턴에 따라 1 내지 7개, 바람직하게는 2내지 6개의 분획으로 분리하여 그 분획물을 얻는 제 3단계 ;

상기 분획물중 2번째 분획물인 분획 2를 헥산: 에틸아세테이트 중량대비 10:1 내지 1:10 바람직하게는 7 : 1~ 1 : 7 의 배합비를 가지는 이동상을 이용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 1~10개, 바람직하게는 2~8개의 소분획물을 얻는 제 4단계;

마지막으로 상기 소분획 6을 헥산: 아세톤 중량대비 20 : 1 내지 1 : 20 바람직하게는 10 : 1~ 1 : 10 의 배합비를 가지는 이동상을 이용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 크립토탄시논을 수득하는 제 5 단계로 구성된 분리 공정을 통하여 분리가 가능하다.

또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne, J.B., Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed., pp6-7, 1998).

본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 크립토탄시논 화합물을 유효성분으로 함유하는 간질환 치료 및 예방을 위한 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 크립토탄시논은 간세포에서 3차 부틸 하이드로페록사이드(tertiary-butyl hydroperoxide ; tBH)에 의한 산화적 간세포 손상 및 D-갈락토사민 (D-Galactosamine ; GalN)에 의한 비산화적 간세포 손상시 세포 괴사의 지표인 락테이트 디하이드로게나제(Lactate dehydrogenase ; LDH)의 배양액중으로의 유출을 억제하고 간세포 사멸을 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다.

또한, 본 발명에 따른 크립토탄시논은 간 손상시 결합조직을 과다생성함으로써 간섬유화 또는 간경화 유발의 결정적 원인이 되는 간성상세포의 자가사멸을 유도함으로써 간질환 치료 및 예방을 위한 조성물으로도 이용될 수 있다.

본 발명의 간질환 치료 및 예방용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카 카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 간질환 예방 및 개선 효과를 나타내는 크립토탄시논 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강보조식품을 제공한다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 간질환 예방 및 개선을 위한 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물 을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 화합물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용 이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 크립토탄시논의 분리 및 구조동정

1-1. 단삼 조추출물의 제조

건조한 단삼 600g을 경동시장에서 구입하여 분말화한 후, 에탄올 2 L를 가하여 2시간 동안 가열 환류 추출하고, 진공 여과하여 상층액을 회수하였다. 이 과정을 3회 반복하여 상층액을 모은 후, 감압 농축(EYELA사, N-1000, 일본)하여 단삼 조추출물 120g을 수득하였다.

1-2. 단삼 비극성용매가용추출물의 제조

상기 실시예 1-1 단계에서 얻은 단삼 조추출물 120g을 60% 메탄올 1 L에 현탁시킨 후, 헥산과 클로로포름을 가각 0.8 L씩 가하여 2회씩 순차적으로 분배한 다음 각각의 용매 분획을 감압농축하여 헥산 가용부와 클로로포름 가용부를 얻었다.

1-3. 단삼 추출물로부터 크립토탄시논의 분리

상기 실시예 1-2에서 얻은 클로로포름 가용부 10.5g을 세파덱스 LH-20 컬럼에 걸은 다음 디클로로메탄 0.5 L 디클로로메탄과 메탄올 25:1 혼합용매 2.0 L로 용출하고, 상기 용출물을 박층 크로마토그래피(TLC 실리카 겔)의 패턴에 따라 4개 분획으로 나누었다. 그 중 분획 2(2.22 g)를 헥산 : 에틸아세테이트 (6:1, v/v) 혼합용매1 L를 이동상으로 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 실시 후 8개의 소분획물을 얻어 이 중 소분획 6(970 mg)을 헥산 : 아세톤 (10:1, v/v) 혼합용매를 이동상으로 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하였 다. 그 결과, 하기 물성치를 갖는 적갈색의 침상결정물의 크립토탄시논 (65 mg)을 분리하여 하기 실험의 시료로 사용하였다.

융점; 181-182 ℃

¹H-NMR (400MHz, CDCl₃) ppm; 7.63 (1H, d, J=7.8 Hz), 7.48 (1H, d, J=8.2 Hz), 4.88 (1H, t, J=9.2 Hz), 4.36 (1H, t, J=6.0 Hz), 3.59(1H, m), 3.21(2H, t, J=6.4 Hz), 1.76-1.80(2H, m), 1.64-1.66 (2H, m), 1.35 (3H, d, J=6.4 Hz), 1.30 (6H, br.s)

¹³C-NMR (100MHz, CDCl₃) ppm; 184.36, 175.78, 170.86, 152.45, 143.78 , 132.65, 128.49, 126.34, 122.59, 118.82, 81.53, 37.88, 34.93, 34.69, 32.02, 31.97, 29.75, 19.14, 18.93.

(+)-ESI-MS; [M+Na]⁺ m/z 319, [M+H]⁺m/z 297

참고예 1. 흰쥐로부터 간세포 분리 및 배양

새글랜(Seglen) 등의 방법 (Seglen et al., Exp. Cell. Res., 82, pp391-398, 1973)에 따라 흰쥐로부터 간세포를 분리하였다. 흰쥐를 마취하여 복부를 절개한 후, 간문맥에 삽관하여 5% CO₂ 및 95% O₂의 혼합기체를 불어넣은 37℃의 Ca²⁺, Mg²⁺없는 행크의 균형염 용액(Ca²⁺, Mg²⁺-free Hank's balanced salt solution)을 관에 흘려보내 간 내 혈액을 제거하였다. 그 후, 0.05% Ⅳ형 콜라겐나아제(collagenase type IV) 및 1mM CaCl₂ 용액을 흘려보냈다. 간 조직을 몸체로부터 떼어낸 다음 간세포 현탁액을 만들어 50ㅧg에서 2분간 원심분리하고 침전된 간세포를 취해 Ca²⁺, Mg²⁺-없는 행크의 균형염 용액으로 2회 세척한 다음 1형 콜라겐으로 코팅된 배양용기에 10%(v/v) 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS, GibcoBRL), 10^-8 M 인슐린, 50 U/㎖의 페니실린 및 50 ㅅg/㎖의 스트렙토마이신(Sigma)이 첨가된 윌리암스 배지 E(Williams'Medium E; WME, GibcoBRL, USA)를 배양액으로 하여 세포수가 1×10⁶ 세포수/㎖ 되도록 한 후, 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다. 2시간 배양 후 세포를 행크의 균형염 용액으로 세척하여 붙지 않은 간세포는 제거하고 새 배양액으로 교체한 다음 5% CO₂, 37℃의 조건에서 16시간동안 배양시킨 다음 실험에 사용하였다.

참고예 2. 1차 배양 간세포에서 간손상 유도 및 크립토탄시논 처리

2-1. 3차 부틸 하이드로페록사이드에 의한 간손상 유도

참고예 1과 같이 분리배양한 간세포에 산화적 손상을 유발하기 위하여 1.5 mM 3차 부틸 하이드로페록사이드 (tBH, Sigma, USA)를 처리하였다. 간세포에 크립 토탄시논을 함유하는 배양액을 가한 다음 1.5 mM tBH를 1.0시간 동안 처리하였다. tBH는 150 mM이 되도록 HBSS로 희석한 다음 배양액에 가하여 1.5 mM이 되도록 준비한 것을 사용하였다. 실험군은 하기 표 1과 같이 설정하였다.

1군	정상 배양액 처리
2군	1.5 mM tBH 함유 배양액 처리
3군	1.5 mM tBH와 크립토탄시논 (40 μM) 함유 배양액 처리
4군	1.5 mM tBH와 크립토탄시논 (20 μM) 함유 배양액 처리
5군	1.5 mM tBH와 크립토탄시논 (10 μM) 함유 배양액 처리
6군	1.5 mM tBH와 크립토탄시논 (5 μM) 함유 배양액 처리

2-2. D-갈락토사민(D-galactosamine)에 의한 간손상 유도

크립토탄시논의 간세포 보호효과가 비산화적 손상에 대해서도 유효한지 여부를 알아보기 위하여 D-갈락토사민(GalN, Sigma, USA)으로도 간세포 손상을 유도하여 그 보호효과를 확인하였다. GalN은 사람에서의 바이러스성 간염과 유사한 간 손상을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 우리딘 뉴클레오티드 (uridine nucleotide)를 고갈시킴으로써 원형질막 단백질 (plasma membrane protein)과 RNA 합성을 저해함으로써 간세포 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다(Wu. et al., Hepatology, 23(2), pp.359-65, 1996).

참고예 1에서와 같이 분리 배양한 간세포에 손상을 유발하기 위하여 30 mM D-GalN을 처리하였다. 간세포에 크립토탄시논을 함유하는 배양액을 가하여 10분 동안 전처리한 후 30 mM GalN를 가하여 24시간 동안 처리하였다. GalN는 HBSS에 용해한 다음 배양액에 가하여 30 mM이 되도록 준비한 것을 사용하였다. 실험군은 하기 표 2과 같이 설정하였다.

1군	정상 배양액 처리
2군	30 mM GalN 함유 배양액 처리
3군	30 mM GalN과 크립토탄시논 (40 μM) 함유 배양액 처리
4군	30 mM GalN과 크립토탄시논 (10 μM) 함유 배양액 처리
5군	30 mM GalN과 크립토탄시논 (2.5 μM) 함유 배양액 처리
6군	30 mM GalN과 크립토탄시논 (0.625 μM) 함유 배양액 처리

참고예 3. 간성상세포 분리배양 및 크립토탄시논 처리

프리에드만 등의 방법 (Friedman et al., Hepatology. 15(2), pp.234-243, 1992)을 수정하여 흰쥐로부터 간성상세포를 분리하였다. 흰쥐를 마취하여 복부를 절개한 후, 간문맥에 삽관하여 5% CO₂ 및 95% O₂의 혼합기체를 불어넣은 37℃의 Ca²⁺, Mg²⁺-없는 행크의 균형염 용액(Ca²⁺, Mg²⁺-free Hank's balanced salt solution)을 관에 흘려보내 간 내 혈액을 제거하였다. 그런 다음, 0.05% Ⅳ형 콜라게나아제(collagenase type IV) 및 1mM CaCl₂ 용액을 흘려보냈다. 간 조직을 몸체로부터 떼어낸 다음, 간세포 현탁액을 만들어 50×g에서 2분간 원심분리한 후, 침전된 간세포를 제거한다. 간세포가 제거된 상층액을 11.5% 및 17% 메트리자마이드(metrizamide, Sigma)층 위에 쌓고, 1,700×g에서 15분간 원심분리하여 간성상세포층을 획득하였다. 이 간성상세포층을 행크의 균형염 용액으로 세척한 다음, 코팅되지 않은 배양용기에 10%(v/v) 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS, GibcoBRL), 50U/㎖의 페니실린 및 50 μg/mL의 스트렙토마이신(Sigma)이 첨가된 윌리암스 배지 E(Williams' Medium E; WME, GibcoBRL, USA)를 배양액으로 하여 세포수가 5×10⁵ 세포수/㎖ 되도록한 후, 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다. 계대배양한 간성상세포를 10% 대신 1%의 FBS가 첨가된 배양액으로 바꿔 크립토탄시논을 처리하였다. 크립토탄시논은 2.5, 5, 10μM로 24시간 처리하거나 또는 10 μM로 8, 12, 16, 20, 24시간동안 처리하였다.

실험예 1. 산화적 손상에 대한 보호효과 측정

참고예 2-1에서와 같이 간세포에 tBH를 처리한 다음 산화적 손상에 의해 간세포로부터 배양액 중으로 흘러나온 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase;LDH) 수치를 자동건조 화학 분석기(autodry chemistry analyzer; SPOTCHEM^TM SP4410, Arkray, Japan)를 이용하여 측정하였다.

간세포의 생존율을 측정하기 위하여 tBH와 크립토탄시논 함유 배양액을 걷어내고 3-(4,5-디메틸티아졸-1-일)2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-1-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide ; MTT)를 0.5 ㎎/㎖ 함유하는 배양액 중에서 2시간 동안 배양한 다음 살아있는 간세포에 의하여 생성된 포마잔(formazan)을 디메칠술폭시드(dimethylsulfoxide)에 용해하여 540nm에서의 흡광도값를 구하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

군 번호	LDH (1군에 대한 %)	생존율 (1군에 대한 %)
1	100±8	100±5
2	389±35a	13.5±0a
3	146±15a,b	29±5a,b
4	115±16b	32±4a,b
5	133±12a,b	31±5a,b
6	292±30a,b	24±4a
[주] a : P< 0.01, 1군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임 b : P< 0.01, 2군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임

상기 결과로부터, 본 발명에 따른 크립토탄시논은 산화적 간세포 손상 유도시 LDH 유출 억제 및 세포 사멸을 억제함으로써 간세포 보호효과를 가짐을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 비산화적 손상에 대한 보호효과 측정

참고예 2-2에서와 같이 간세포에 30 mM GalN를 처리하여 발생한 손상에 의해 간세포로부터 배양액 중으로 흘러나온 락테이트 디하이드로게나제 수치를 자동건조 화학 분석기를 이용하여 측정하였다.

간세포의 생존율을 측정하기 위하여 GalN과 크립토탄시논 함유 배양액을 걷어내고 3-(4,5-디메틸티아졸-1-일)2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드를 0.5 ㎎/㎖ 함유하는 배양액 중에서 2시간 동안 배양한 다음 살아있는 간세포에 의하여 생성된 포마잔을 디메칠술폭사이드에 용해하여 540nm에서의 흡광도값을 구하였다.

군 번호	LDH (1군에 대한 %)	생존율 (1군에 대한 %)
1	100±8	100±6
2	262±15a	35±3a
3	211±29a	39±6a
4	177±12a,b	62±7a,b
5	211±14a,b	46±3a,b
6	240±22a	36±5a
[주] a : P< 0.01, 1군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임 b : P< 0.01, 2군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임

상기 표 4의 결과에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 크립토탄시논은 비산화적 간세포 손상 유도시에도 LDH 유출 억제 및 세포 사멸을 억제함으로써 간세포 보호효과를 가짐을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 간성상세포의 자가사멸 유도효과 측정

3-1. DNA 단편화 유도측정

크립토탄시논에 의한 간성상세포의 자가사멸 유도효과를 단편화된 DNA를 아가로스젤에 전기영동하여 확인하였다.

참고예 3에서와 같이 분리된 간성상세포에 크립토탄시논을 2.5, 5, 10 uM로 24시간동안 또는 10 uM을 8, 12, 16, 20, 24 시간동안 처리한 간성상세포의 DNA를 시판되는 키트 (Wizard Genomic DNA purifiction kit ; Promega, USA)를 이용하여 추출 및 정량한 다음 30 ㎍의 DNA를 2% 아가로스 겔에서 50 mV, 40분간 전기영동하여 UV하 DNA 단편화를 확인하였다. 도 1에서 나타낸 바와 같이 크립토탄시논 2.5, 5, 10 uM을 24시간동안 처리한 경우 DNA 단편화를 확인하였으며; 10 uM을 처리한 경우는 12시간이 경과하면서 DNA의 단편화를 확인하였다. 이로부터 크립토탄시논이 간성상세포의 자가사멸을 탁월하게 유도함을 확인할 수 있었다.

3-2. 캐스파제-3 (caspase-3)활성 측정

크립토탄시논에 의한 간성상세포의 자가사멸 유도효과를 캐스파제-3 (caspase-3)활성을 측정하였다. 캐스파제-3 (CPP-32, Yama, Apogain)은 세포사멸과정의 주효소로 세포내 전효소형태로 세포사멸 존재하다가 세포사멸과정 중 활성되어 폴리 ADP-리보스 폴리머라제(poly ADP-ribose polymerase; PARP )등을 분해하는 것으로 알려져 있다 (Allen et al., Pharmacol Toxicol Methods, 37, pp.215-228, 1997; Duriez et al., Biochem. Cell Biol., 75, pp337-349,1997).

캐스파제의 활성은 시판되는 키트 (캐스파제-3 activity colorimetric assay kit; R&D Systems,Inc.,USA)를 이용하여 참고예 3에서와 같이 처리한 간성상세포 실험군을 대상으로 측정하였으며 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 하기 표 5에서 나타난 바와 같이 크립토탄시논 10 uM 및 20 uM을 24시간동안 간성상세포에 처리하였을 경우 캐스파제-3이 유의적으로 활성화됨을 확인하였다.

군 분류	캐스파제-3 활성(%)
정상군	100±7
크립토탄시논 5 uM 처리군	114±12
크립토탄시논 10 uM 처리군	183±16a
크립토탄시논 20 uM 처리군	375±31a
[주] a : P< 0.01, 정상군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임

이상의 결과로부터 크립토탄시논은 캐스파제-3의 활성을 증대시켜, 간성상 세포의 자가사멸을 촉진시킴을 확인할 수 있었다.

3-3. 면역블롯 어세이법(immunoblot assay)

본 실시예에서는 크립토탄시논이 간성상세포에 대한 자가사멸작용을 면역블롯 어세이법(immunoblot assay)로 캐스파아제-3의 활성형 증가 및 PARP 분열을 확인하고자 하였다.

PARP 분해에 미치는 크립토탄시노의 효과는 참고예 3와 같이 처리한 간성상세포 실험군에서 다음과 같이 실시하였다. 크립토탄시논를 처리한 간성상세포를 용해성 완충액(lysis buffer; 10mM Tris, pH 8.0, 120mM NaCl, 0.5% NP-40, 1mM EDTA, 0.1mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1mM dithiothreitol, 1㎍/㎖ aprotinin)로 용해한 다음 14000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상층의 단백질 농도를 검사 키트(Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 측정한 다음 단백질 20㎍을 각각 10%(w/v) SDS 겔(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)에서 200 V로 1시간동안 전기영동시켰다. 전기영동에 의해서 겔 내 단백질은 분자량크기에 따라 분리되고, 이러한 단백질을 니트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane; Millipore)에 30mA로 16시간동안 트랜스퍼(transfer)시켰다. PARP 분열의 경우 트랜스퍼된 니트로셀룰로오스막을 5% 탈지유(skim milk)로 블로킹한 다음, 200배 희석된 마우스 항-PARP 항체(purified mouse anti-human PARP monoclonal antibody; BD Pharmingen) 를 1차 항체로 사용하여, 2시간동안 실온에서 반응시켰다. 2차 항체로서 서양고추냉이 퍼옥시다아제-결합된 항-마우스 면역글로블린 G (horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-mouse IgG; Santacruz)를 2,000배 희석한 것을 사용하여 1시간 동안 반응시켰다.

캐스파제-3 활성형의 경우 트랜스퍼된 니트로셀룰로오스막을 5% 탈지유(skim milk)로 블로킹한 다음, 200배 희석된 토끼 캐스파제-3 항체(rabbit anti-caspase-3 polyclonal antibody; Santa cruz) 를 1차 항체로 사용하여, 2시간동안 실온에서 반응시켰다. 2차 항체로서 서양고추냉이 퍼옥시다아제-결합된 항-토끼 면역글로블린 G (horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-rabit IgG; Santacruz)를 2,000배 희석한 것을 사용하여 1시간 동안 반응시켰다. 발색은 강화된 화학발광 웨스턴 블롯 검출 시스템 키트(Enhanced chemiluminescence(ECL) western blotting detection system kit; Amersham)를 이용하여, 사용자 설명서에 따라 X-ray 필름(Agfa, EC)에 노출시켜 확인하였으며 그 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에서 보는 바와 같이, 크립토탄시논을 처리한 간성상세포에서는 분열된 PARP (85 kDa) 및 캐스파제-3의 활성형(17 kDa)이 크립토탄시논 농도 및 처리시간에 따라 증가하고 비활성의 캐스파제-3은 감소함을 확인할 수 있었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 크립토탄시논은 산화 및 비산화적 손상에 의한 간세포 손상을 유의성 있게 억제하며, 간성상세포의 자가사멸 유도에 탁월한 효과를 보여 간질환 치료 및 예방을 위한 약학조성물 및 건강보조식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (5)

1. 크립토탄시논 (Cryptotanshinone)을 유효성분으로 하는 간염, 간경화 또는 간섬유화의 치료 및 예방용 약학조성물.
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