KR101090313B1 - 화학식 １의 화합물을 유효성분으로 포함하는 ｂ형 간염 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 B형 간염 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로 화학식 1의 화합물은 B형 간염 바이러스에서 분비된 항원이 간세포 내 바이러스 수용체에 결합하는 것을 효과적으로 억제하는 등 강한 항바이러스 활성을 가지며 내성 변이 정도가 미미하여 약학적 조성물 또는 식품 조성물 등 다양한 분야에서 사용될 수 있으며 화학식 1의 화합물은 헛개나무 열매로부터 분리 가능하므로 안전하고 경제적인 제공이 가능하다.

Description

화학식 １의 화합물을 유효성분으로 포함하는 Ｂ형 간염 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법{Composition comprising for preventing and treating hepatitis B comprising compound of chemical formula 1 and process for the preparation thereof}

본 발명은 B형 간염 바이러스가 B형 간염 바이러스 수용체에 결합하는 것을 억제하는 활성을 가지는 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 B형 간염 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

간염(hepatitis)이란 여러 원인으로 인해 정상적인 간세포가 파괴되고 간의 고유한 혈관 및 모세담관 구조가 손상되어 간기능이 제한되는 일련의 과정을 말한다. 그 종류는 원인에 따라 바이러스성, 알콜성, 약물중독성, 자가면역성 간염 등으로 나눌 수 있으며, 진행 경과에 따라 급성과 만성으로 나눈다. 급성 간염의 경우엔 대부분 완전히 회복되나 만성 간염으로 악화되면 섬유화의 병변이 동반된다. 세계보건기구에 따르면 2003년 세계인구의 5%인 3억5천만명이 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus; HBV) 보균자이며, 매년 약 3천만명이 HBV에 새롭게 감염되고 있을 뿐만 아니라, 간암의 원인이 되는 질병으로 그 치료제 개발이 시급한 질병임에도 불구하고 현재까진 예방백신 이외에는 특별한 대안이 없는 실정이다. 특히, 만성 B형 간염에 의한 간경변증 및 간암의 사망률 또한 매우 높다. 2000년도 조사에 의하면 미국 및 서구 유럽의 만성 HBV 감염률은 약 10%(5~20%범위), 아시아 및 태평양군도 출신 아메리카의 만성 HBV 감염률은 7%(약 750,000명), 백인, 라틴계 혹은 흑인의 만성 HBV 감염률은 각각 0.1%, 0.1%, 0.5%로 보고되고 있다. 이처럼 HBV의 전파는 세계적인 위협이며, 특히 우리나라와 같은 아시아 국가의 중요한 위험요소가 되고 있어, HBV의 치료를 위한 항바이러스 억제제의 연구 및 개발은 매우 시급하며 중요한 과제이다.

이에, 전세계적으로 만성 B형 간염치료를 위한 면역조절제와 항바이러스제 개발이 시도되고 있으나 아직 만족할 만한 효과를 나타내고 있지 않다. 치료목표는 감염성을 조절하고 바이러스를 박멸하며 간경화증이나 간암진행을 막는 것이나, 아직 어떤 항바이러스 치료도 환자의 HBV를 쉽게 없애주지는 못했다.또한, 현재 만성 B형 간염치료제로서는 인터페론(Interferon, IFN)과 뉴클레오사이드 유사체 화학합성물인 라미뷰딘(Lamivudine), 텔비부딘과 그외 Famciclovir, Adefovir dipivoxil, Emtricitabine, Entecavir, Clevudine 등의 폴리머레이즈 저해제가 주류를 이루고 있다. 인터페론은 고열, 골수억제, 정서장애, 자가면역성 갑상선염, 탈모증, 발진, 설사, 사지의 저림증상 등 부작용이 있으며, 라미뷰딘과 같은 뉴클레오사이드 유사체 화학합성에 의한 치료제들은 일반적으로 사용하기에는 해결되지 않은 문제점이 많다. 라미뷰딘의 가장 큰 한계점은 근본적으로 HBV를 인체에서 제거하지 못하는 점과 돌연변이에 의한 내성 발현을 극복할 수 없다는 점이다. 또한, 치료 종료 후 지속적인 효과를 기대할 수 없는데 국내연구에 따르면 라미뷰딘에 의하여 HBV DNA가 음전되었던 환자의 74~91%에서 치료종료 12개월만에 HBV DNA가 양전되었다. 일반적으로 라미뷰딘 치료를 종료하면 HBV DNA 수준은 치료 전 수준으로 돌아가며 HBV 양성인 모든 환자가 적응증이 되는 것은 아니며 일부 특정 적응증이 있는 환자만 도움이 되는 것으로 알려져 있다. 또한, 그외 폴리머레이즈 저해제 역시 뉴클레오사이드가 가지는 내성변이 단점을 극복하기엔 어려운 것으로 알려져 있다.

B형 간염치료제 시장은 세계시장이 약 20억달러(2000년), 미국시장이 약 5억달러, 국내는 약 1천억원의 시장으로 거대시장을 형성하고 있다. 국내 간염치료제 시장은 간염바이러스에 직접 작용하지 않는 보조치료제 시장만으로도 800억원이 넘어, 간염치료제 개발시 그 시장은 매우 확대될 것으로 추정된다. 또한,‘98년 한국보건사회연구원의 1997년 사망원인 통계결과 우리나라 인구의 사망원인 구조의 3위가 간질환, 5위가 간암으로 보고되었으며, 신생아에서도 예방백신 접종이 요구되는 국가인 것으로 되어 있다. 따라서, B형 간염바이러스 치료제의 국산화가 이뤄지지않음에 따라 그동안 우리나라 인구의 10%에 해당되는 보균자 및 약 4만 명의 환자가 사용함으로써 해외에 유출되었던 많은 외화에 대한 수입대체효과 및 간염치료제 시장 활성화를 통한 시장규모 확대효과를 감안하면 경제적 파급효과는 수천억 이상이 될 것으로 예상된다. 더불어 전체 인구의 15%가 감염자로 추정되고 있는 중국시장에 진출시 그 경제적 파급효과는 수조원으로 불어날 것이다.

이에, 본 발명자들은 화학식 1의 화합물이 B형 간염 바이러스에서 분비된 항원이 간세포 내 바이러스 수용체에 결합하는 것을 억제하는 억제 활성을 가지므로 화학식 1의 화합물이 B형 간염 예방 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하여 B형 간염 바이러스가 B형 간염 바이러스 수용체에 결합하는 것을 억제하는 결합 억제 활성을 가지는 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 B형 간염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 B형 간염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 화학식 1의 화합물 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스의 B형 간염 바이러스 수용체에의 결합 억제 활성을 가지는 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

본 발명자들은 화학식 1의 화합물에 B형 간염 바이러스가 간세포 내 B형 간염 바이러스 수용체에 결합하는 것을 억제하는데 탁월한 효과가 있음을 확인하고 이러한 활성으로부터 항-B형 간염 바이러스 작용을 할 수 있음을 발견하고 본 발명에 이르렀다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명자들은 화학식 1의 화합물과 진주초 에탄올 추출물, 헛개나무 메탄올 추출물 및 헛개나무 n-부탄올 추출물의 분획물(도 1의 헛개 12-7-2, 도 3의 HD-2를 의미함)의 B형 간염 바이러스와 B형 간염 바이러스 수용체와의 결합 억제 활성을 비교한 결과, 화학식 1의 화합물은 진주초 에탄올 추출물 비해 약 4배의 억제 활성을 나타냈으며, 헛개나무 메탄올 추출물에 비해서도 약 2배의 억제 활성을 나타냈을 뿐만 아니라, 헛개나무 n-부탄올 추출물의 분획물(도 1의 헛개 12-7-2, 도 3의 HD-2를 의미함)에 비해서는 약 5배의 억제 활성을 나타내 매우 강한 활성을 나타냄을 알 수 있었다(도 1). 또한, B형 간염 억제제로 공지된 트리플루오로페나진(trifluorophenazine), 시프로헵타딘(cyproheptadine), 케토토펜(Ketotofen)과 화학식 1의 화합물의 B형 간염 바이러스와 B형 간염 바이러스 수용체와의 결합 억제 활성 비교 테스트 결과, 트리플루오로페나진(trifluorophenazine)에 비해 약 1.5배, 시프로헵타딘(cyproheptadine)에 비해 약 2배, 케토토펜(Ketotofen)에 비해 약 2.5배, 주주보사이드 A(jujuboside A)에 비해 약 3배 강한 억제 활성을 나타내 화학식 1의 화합물이 매우 강한 억제 활성을 나타냄을 알 수 있었다(도 2).

B형 간염 바이러스에서 분비되는 S 항원이 B형 간염 바이러스 수용체에 결합하여 B형 간염이 발병 또는 악화되므로 S 항원과 B형 간염 바이러스 수용체에의 결합을 차단 또는 그 효율을 감소시키거나 결합된 S 항원을 제거하거나 또는 감소시킴으로써 B형 간염을 예방 또는 치료할 수 있다. 따라서, S 항원과 B형 간염 바이러스 수용체에의 결합은 B형 간염과 중요한 관계가 있으므로 S 항원과 B형 간염 바이러스 수용체에의 결합 여부가 B형 간염의 중요한 지표가 된다.

본 발명에서 사용되는 용어, "염"은 통상적인 방법으로 제조한 염을 의미하며, 당업자에게 공지되어 있다. "염"은 약리학적 또는 생리학적으로 허용되는 다음 무기산과 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 포함할 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 알칼리 금속, 예를 들어, 나트륨, 알칼리코금속, 예를 들어, 마그네슘, 암모늄 등을 포함할 수 있다.

화학식 1의 화합물은 B형 간염 바이러스가 간세포 내 B형 간염 바이러스 수용체에 결합하는 것을 억제하는데 탁월한 효과가 있으므로 B형 간염에 대한 우수한 예방 또는 치료 활성을 갖는바, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 B형 간염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 B 형 간염에는 종류에 따라 바이러스성, 알콜성, 약물중독성, 자가면역성 간염이 모두 포함되고, 진행 경과에 따라 급성 간염과 만성 간염이 모두 포함된다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물의 투여로 상기 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

본 발명에 따른 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있고, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의하여 투여될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 B형 간염 예방 또는 치료용 약학 조성물의 처리량은 약학적으로 유효한 양이어야 한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 B형 간염 예방 또는 치료용 약학 조성물의 약학적 처리 형태는 이들의 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 B형 간염 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 약학적 제형으로 제조될 수 있다. 제형의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 B형 간염 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있고, 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들어, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크같은 윤활제들도 사용된다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되고, 흔히 사용되는 단순희석제인 물,리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 B형 간염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물에서 포함할 수 있는 필수 성분으로서 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물 외 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

또한, 상기 언급한 바와 같이 식품보조첨가제를 추가로 첨가할 수도 있는바 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품보조첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다.

상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.

본 발명의 화학식 1의 화합물은 천연물질, 바람직하게 헛개나무 열매 추출물 또는 그의 분획물로부터 분리할 수 있고, 당 분야의 공지된 방법으로 화학적 합성법에 의해 제조될 수도 있다.

헛개나무 열매 추출물은 천연, 잡종, 변종 식물의 열매로부터 분리될 수 있으며 종래 묏대추나무(Zizyphus jujuba Mill . var . jujuba) 및 헛개나무 잎에서 화학식 1의 화합물을 분리 정제해냈음이 보고된 바 있으나, 헛개나무 열매로부터 화학식 1의 화합물을 분리해낸 바 없으며 이는 본 발명자들이 최초로 밝혀낸 것이다.

헛개나무 열매 추출물로부터 분리한 화학식 1의 화합물은 인공적으로 합성된 화합물이 아니라 천연 추출물로부터 획득한 성분을 기초로 하므로 안전하고 독성, 부작용이 거의 없으므로 장기간의 복용이 가능하다는 장점이 있다. 또한, 상기 조성물은 인간뿐만 아니라, 비만 관련 질환이 발생될 수 있는 소, 개 등의 동물에게 사용될 수도 있다.

상기 헛개나무(Hovenia dulcis Thunb)는 높이 10m이고 수피는 검은빛을 띤 회색으로 세로로 갈라지고 벗겨진다. 잎은 어긋나고 넓은 달걀모양 또는 타원모양으로 가장자리에 잔거치가 있다. 잎의 앞면은 녹색으로 털이 없고 뒷면은 연한 녹색으로 맥위에 털이 없거나 있다. 열매는 9~10월에 익으며 둥근모양이고 갈색을 띤다. 낙엽활엽교목이고 원산지는 한국이고 전국 각지에 분포한다.

보다 구체적으로 하기 방법에 의해, 화학식 1의 화합물은 헛개나무 열매 추출물 또는 그의 분획물로부터 분리할 수 있다.

상기 헛개나무 열매 추출물은 헛개나무 열매를 세척하고 건조시킨 후 분쇄하는 단계; 및 상기 분쇄된 헛개나무 열매를 물, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 용매로 추출하여 수득할 수 있다. 상기 헛개나무 열매 추출물은 물, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 용매, 바람직하게는 n-부탄올로 추출한 것을 포함한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 추출물에는, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나도 포함하는 것으로 한다.

추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다.

본 발명에서, 본 발명의 헛개나무 열매 추출물의 분획물은 헛개나무 열매를 세척하고 건조시킨 후 분쇄기로 분쇄하는 단계; 상기 분쇄된 헛개나무 열매를 물, 메탄올, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 용매로 추출하여 헛개나무 열매 추출물을 얻는 단계; 및 상기 헛개나무 열매 추출물을 물, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 용매으로 분획하는 단계를 포함하여 제조한다.

보다 구체적으로 헛개나무 열매 추출물의 용매 분획물은 헛개나무 열매 추출물을 물로 현탁한 후 n-부탄올 등과 같은 용매를 사용하여 분획함으로써 분획물을 수득할 수 있다. 본 발명에서, 구체적인 일 양태로서 용매 분획물로는 클로로포름 및 메탄올 혼합 용매에 의한 분획물, 물 및 메탄올 혼합 용매에 의한 분획물, 및 에틸아세테이트 및 메탄올 혼합 용매에 의한 분획물이 제공된다.

본 발명에서 헛개나무 열매 추출물의 분획물을 얻기 위한 방법은 다음과 같다. 상기에서 얻은 헛개나무 열매 추출물을 물에 현탁한 후, 현탁액의 약 1 내지 100배, 바람직하게는 약 1 내지 5배 부피의 용매를 가하여 1회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 5회에 걸쳐 용매 가용층을 추출, 분리하여 수득할 수 있다. 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다(Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern techniques of plant analysis , 3rd Ed. p6-7, 1998).

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, n-BuOH 추출물로부터 실리카 겔(silica gel)을 충진제로 사용하고 메탄올 및 클로로포름을 이용해 칼럼크로마토그래피하여 얻어진 활성 분획에 대해 물 및 메탄올을 이용한 ODS 겔(ODS gel) 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 가장 강한 활성을 보이는 분획물(도 3의 12-7)을 수득한 다음 모니터링을 실시하여 화합물의 존재를 확인하였고, 활성 화합물의 특정화를 위해 물 및 메탄올을 이용한 ODS 겔(ODS gel) 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성물질인 화학식 1의 화합물(도 3의 HD-3)을 순수 분리하였다.

최종적으로 상기 헛개나무 열매 추출물 및 이의 분획물로부터 화학식 1의 화합물을 분리 정제할 수 있다. 화학식 1의 화합물은 상기 추출물 또는 분획물에 대해 크로마토그래피를 1회 이상 순차적으로 수행함으로써 분리할 수 있으며, 크로마토그래의 컬럼의 종류와 전개 용매는 다양하게 조절될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 화학식 1의 화합물을 수득하기 위해 헛개나무 열매 추출물 및 이의 분획물의 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 분석을 수행하였다.

본 발명에서는 헛개나무 열매 추출물 및 이의 분획물로부터 화학식 1의 화합물을 분리 정제하는 방법을 제공한다.

즉, 헛개나무 열매를 세척하고 건조시킨 후 분쇄기로 분쇄하는 단계; 상기 분쇄된 헛개나무 열매를 물, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 이들의 혼합 용매로부터 선택된 용매로 추출하여 헛개나무 열매 추출물을 얻는 단계; 상기 헛개나무 열매 추출물을 물, 메탄올, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 용매로 분획하여 분획물을 얻는 단계; 및 상기 분획물을 고성능 액체 크로마토그래피를 수행하여 하기 화학식 1의 화합물을 얻는 단계를 포함하는 헛개나무 열매로부터 분리한 화학식 1의 화합물 제조방법을 제공한다.

화학식 1의 화합물은 B형 간염 바이러스에서 분비된 항원이 간세포 내 바이러스 수용체에 결합하는 것을 효과적으로 억제하는 등 강한 항바이러스 활성을 가지며 내성 변이 정도가 미미하여 약학적 조성물 또는 식품 조성물 등 다양한 분야에서 사용될 수 있으며 화학식 1의 화합물은 헛개나무 열매로부터 분리 가능하므로 안전하고 경제적인 제공이 가능하다.

도 1은 화학식 1의 화합물과 진주초 에탄올 추출물, 헛개나무 메탄올 추출물, 헛개나무 n-부탄올 추출물의 분획물(도 1의 헛개 12-7-HD-2)간의 B형 간염 바이러스와 B형 간염 바이러스 수용체와의 결합 억제 활성 비교 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 화학식 1의 화합물과 트리플루오로페나진(trifluorophenazine), 시프로헵타딘(cyproheptadine), 케토토펜(Ketotofen) 및 주주보사이드 A간의 B형 간염 바이러스와 B형 간염 바이러스 수용체와의 결합 억제 활성 비교 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 헛개나무 열매로부터 화학식 1의 화합물을 분리하기 위한 분리 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 헛개나무 열매로부터 화학식 1의 화합물 분리 과정 중 수득한 n-부탄올 추출물층과 물 추출물층의 B형 간염 바이러스가 B형 간염 바이러스 수용체에 결합하는 것을 억제하는 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다. #73은 헛개 나무 열매의 100% 메탄올 추출물의 억제 활성을 측정한 것이다.
도 5는 헛개나무 열매로부터 화학식 1의 화합물 분리 과정 중 수득한 n-부탄올 추출물의 분획물이 B형 간염 바이러스가 B형 간염 바이러스 수용체에 결합하는 것을 억제(attachment inhibition)하는 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 여기서 각각 HDB는 n-부탄올 추출물, HDB11은 도 3의 n-부탄올 추출물의 11번 분획물, HDB12는 도 3의 n-부탄올 추출물의 12번 분획물, HDB13은 도 3의 n-부탄올 추출물의 13번 분획물 및 HDB14는 도 3의 n-부탄올 추출물의 14번 분획물을 의미한다. 또한, 여기서 각각 HDB12-1은 도 3의 n-부탄올 추출물의 12번 분획물을 물 및 메탄올을 이용한 ODS 겔(ODS gel) 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 수득한 1번 분획물, HDB12-2는 도 3의 n-부탄올 추출물의 12번 분획물을 ODS 겔(ODS gel) 컬럼 크로마토그래피하여 수득한 2번 분획물, HDB12-3은 도 3의 n-부탄올 추출물의 12번 분획물을 ODS 겔(ODS gel) 컬럼 크로마토그래피하여 수득한 3번 분획물, HDB12-3은 도 3의 n-부탄올 추출물의 12번 분획물을 ODS 겔(ODS gel) 컬럼 크로마토그래피하여 수득한 3번 분획물, HDB12-4는 도 3의 n-부탄올 추출물의 12번 분획물을 ODS 겔(ODS gel) 컬럼 크로마토그래피하여 수득한 4번 분획물, HDB12-5는 도 3의 n-부탄올 추출물의 12번 분획물을 ODS 겔(ODS gel) 컬럼 크로마토그래피하여 수득한 5번 분획물, HDB12-6은 도 3의 n-부탄올 추출물의 12번 분획물을 ODS 겔(ODS gel) 컬럼 크로마토그래피하여 수득한 6번 분획물, HDB12-7은 도 3의 n-부탄올 추출물의 12번 분획물을 ODS 겔(ODS gel) 컬럼 크로마토그래피하여 수득한 7번 분획물을 의미한다.
도 6은 화학식 1의 화합물의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 화학식 1의 화합물의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8은 화학식 1의 화합물의 DEPT 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 9는 화학식 1의 화합물의 HMQC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10은 화학식 1의 화합물의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 11은 화학식 1의 화합물의 COSY 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 12는 화학식 1의 화합물의 ROESY 스펙트럼을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 화학식 1의 화합물의 B형 간염 바이러스와 B형 간염 바이러스 수용체와의 결합 억제 활성 테스트

B형 간염 바이러스와 B형 간염 바이러스 수용체와의 결합 능력 테스트는 B형 간염 바이러스의 분비 항원인 S 항원이 바이러스 수용체에 결합하는 것을 억제할 수 있는지 알아보는 실험이다.

① HepG2 cell로부터 세포막 분리

먼저 B형 간염 바이러스 수용체를 가지는 HepG2 세포를 준비하였다. 준비한 세포주의 세포막(plasma membrane)을 분리하기 위해 하기 기술하는 과정을 수행하였다. 플레이트에서 HepG2 세포를 떼어내고 10분 동안 4 ℃에서 100×g로 원심분리하여 세포를 얻었다. U937 도 같은 방법으로 떼어내서 원심분리하였다. 각각의 세포를 차가운 PBS로 세 번 세척하고 2.5 배의(4 ml/1.5 g of cells) STM으로 세포를 풀어주었다.(0.25M STM : 0.25M Sucrose, 5mM Tris-HCl pH8, 0.5mM MgCl_{2 .})_. Dounce-type glass에서 루즈 피팅 페슬(loose fitting pestle)을 이용해 세포를 4 ℃에서 균질화시켰다. 핵(nuclei)과 세포 찌꺼기(cell debris)를 제거하기 위해 10분 동안 4 ℃에서 280×g 원심분리하였다. 상청액은 잠시 보관하고 펠렛은 Dounce에서 0.5 vol.으로 처음과 같은 방법으로 균질화하였다. 상청액은 10분 동안 4℃에서 280×g로 원심분리하여 처음 보관했던 상청액과 두 번째 상청액을 합쳐서 10분 동안 4℃에서 1500×g로 원심분리한 후 얻은 펠렛을 2 ml의 0.25 M STM 에 넣고 용해한 후 2 M STM을 이용하여 당 농도를 1.18g/㎤까지 적정하였다.(2 M STM: 2 M Sucrose, 5 mM Tris-HCl pH8, 0.5 mM MgCl_{2 .).} 1.18 g/㎤ 과 같은 양의 STM 을 넣고. 2 ml의 0.25 M STM 을 더 넣고 4 ℃. 25,000 rpm에서 1시간 동안 원심분리하여 모아진 세포막은 -80℃에 보관하였다. 분리한 HepG2 세포막을 50 ㎍/㎖ 농도로 96웰에 코팅하고 밤새 4 ℃에서 부화시켰다. 다음날 아침 0.05% 트윈(tween)이 함유된 PBS(PBST)로 5회 세척하였다. 10% BSA로 6시간 동안 블로킹시킨 후 PBST로 5회 세척하였다. HepG2 세포의 세포막(plasma membrane)을 50 ㎍/㎖ 농도로 96well에 코팅하고 밤새 4 ℃에서 부화하였다.

② S-항원의 비오틴화

결합시킬 S항원은 비오틴화된 펩티드(Biotin-preS1 21-47 peptide, Peptron)를 구입하였다. 상기 S항원은 HBsAg 전체 서열이 아닌 수용체에 결합한다고 알려진 펩티드 부분인 pre 21-47 region을 Peptron사에서 합성하여 사용하였다(J Peptide Res. 2001. 57, 390-400). 사용한 S항원의 서열은 다음과 같다.

Sequence : Biotin-PLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNP

③ ELISA 반응

코팅된 플레이트에 농도별(1.25, 2.5, 5, 10 ug/ml)로 희석된 진주초 에탄올 추출물, 헛개나무 열매 메탄올 추출물, 헛개나무 열매 n-부탄올 추출물의 분획물(도 1의 12-7-2), 및 화학식 1의 화합물(도 1의 헛개 12-7-3)과 함께 50 ug/ml 농도로 준비된 S항원을 HepG2 세포막에 처리하여 4℃에서 밤새 반응시켰다.

한편, 이와 별도로 코팅된 플레이트에 농도별(2.5, 5, 10, 20 uM)로 희석된 트리플루오로페나진(trifluorophenazine), 시프로헵타딘(cyproheptadine), 케토토펜(Ketotofen), 주주보사이드 A(jujuboside A), 화학식 1의 화합물과 비오틴화된 s항원 펩티드(Biotin-preS1 21-47 peptide, Peptron)를 함께 100 ug/ml 농도로 처리하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음날 아침 PBST로 4회 세척하고, streptavidin-HRP를 100 ㎕ 씩 넣고 37 ℃에서 30 분간 반응시켰다. PBST로 4회 세척하고 TMB 작용액을 75 ul 씩 넣고 10~30 분간 반응시킨 뒤, 75 ㎕ 의 TMB 종결액을 넣어 발색반응을 450 nm 흡광도에서 측정한 후 S항원의 결합 억제 효과를 분석하였다.

④ 결과

화학식 1의 화합물(도 1의 헛개 12-7-3)의 B형 간염 바이러스와 B형 간염 바이러스 수용체와의 결합 억제 활성 테스트 결과, 진주초 에탄올 추출물 비해 약 4배의 억제 활성을 나타냈으며, 헛개나무 열매 메탄올 추출물에 비해서도 약 2배의 억제 활성을 나타냈을 뿐만 아니라, 헛개나무 열매 n-부탄올 추출물의 다른 분획물(도 1의 헛개 12-7-2)에 비해서는 약 5배의 억제 활성을 나타내 매우 강한 활성을 나타냄을 알 수 있었다(도 1).

또한, B형 간염 억제제로 공지된 트리플루오로페나진(trifluorophenazine), 시프로헵타딘(cyproheptadine), 케토토펜(Ketotofen)과 화학식 1의 화합물(도 2의 jujuboside B)의 B형 간염 바이러스와 B형 간염 바이러스 수용체와의 결합 억제 활성 비교 테스트 결과, 트리플루오로페나진(trifluorophenazine)qhek에 비해 약 1.5배, 시프로헵타딘(cyproheptadine)에 비해 약 2배, 케토토펜(Ketotofen)에 비해 약 2.5배, 주주보사이드 A(jujuboside A)에 비해 약 3배 강한 억제 활성을 나타냈다(도 2).

실시예 2. 화학식 1의 화합물 제조방법(도 3)

① 추출

건조한 헛개나무 열매(이하, 지구자)를 메탄올로 24 시간 동안 실온에서 3 회 반복 추출하여 메탄올 추출물을 얻었다. 결과물에 대해서 액체-액체 분획(liquid-liquid partition)을 이용하여 극성 순서대로 n-Hexane, CHCl₃, EtOAc, n-BuOH 및 H₂O 추출물을 얻었다. 추출액을 진공 농축하였고 농축액을 진공 건조하여 추출 분말을 얻어 이를 이용해 생리활성 테스트를 수행하였다.

② 분획 및 화학식 1의 화합물 분리

건조한 지구자의 추출물에 대하여 수용체 결합 분석(receptor binding assay)을 이용한 스크리닝에서, n-BuOH 추출물이 강한 활성을 나타냈다(도 4). 활성이 인정된 n-BuOH 추출물에 대해 수용체 결합 억제 활성을 지표로 하여 실리카 겔(silica gel), ODS 겔(ODS gel)을 충진제로 이용한 각종 칼럼크로마토그래피를 수행하여 활성이 집중된 분획을 얻었다. 보다 구체적으로, 실리카 겔(silica gel)에 대해서는 CHCl₃, MeOH, 및 EtOAc을 이용하였고, ODS 겔(ODS gel)에 대해서는 용출용매로서 MeOH 및 H₂O를 이용하여 분획화를 하였다. 즉, 얻어진 분획물에 대하여 활성 테스트를 하였는바, n-BuOH 추출물로부터 실리카 겔(silica gel)을 충진제로 사용하고 메탄올 및 클로로포름을 이용해 수행한 칼럼크로마토그래피로부터 수득한 활성성분들 중 가장 강한 활성을 보이는 분획물을 수득하였다(도 3의 6, 11, 12, 13). 얻어진 활성 분획에 대해 물 및 메탄올을 이용한 ODS 겔(ODS gel) 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 가장 강한 활성을 보이는 분획물을 수득한 다음(도 3의 12-7) 모니터링을 실시하여 화합물의 존재를 확인하였고, 활성 화합물의 특정화를 위해 물 및 메탄올을 이용한 ODS 겔(ODS gel) 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성물질인 화학식 1의 화합물을 순수 분리하였다(도 3의 HD-3). 활성 부분에 대해서는 HPLC 및 TLC를 이용하여 화합물의 최대흡수파장, 화합물골격, 극성 정도 등을 파악하였다.

실시예 3. 화학식 1의 화합물의 특성 분석

상기 실시예 2에 기술된 과정을 통해 정제된 화합물 (7.1 mg)의 물성은 백색 무결정 분말이며 MP 255-257℃ 및 FAB-MS 에서 m/z 1059 [M+H]+를 나타내는 것으로부터 분자량(C₅₃H₈₆O₂₁)을 추정하였다. 먼저 1_H NMR (도 6) 스펙트럼에서 당부분의 특징적인 시그널 (δH 4.45, 5.19, 4.73, 4.61)이 관찰되었고, 그에 상응하는 13_C NMR (도 7) 시그널에서도 테트라사카라이드(tetrasaccharide)의 존재를 증명하였다(표 2 및 표 3). 또한, 페닐 그룹(prenyl group) 유래의 시그널 (δH 5.15), 옥시게네이티드 메틴 프로톤(oxygenated methine protons) (δH 4.67, 4.02, 3.87, 3.10) 및 7개의 메틸 그룹(methyl group) 유래의 시그널이 관찰되었으며, 이들 결과를 종합하여 본 화합물은 Dammarane type의 사포닌임을 확인하였다. 다음으로 HMBC (도 5, 10) 스펙트럼을 이용하여 각 관능기 및 당부분의 결합위치를 확인하였으며, ROESY (도 12)를 측정하여 각 부분의 상대배열을 확인하였다. 이상의 결과로부터 본 화합물은 화학식 1의 화합물(표 1)로 결정하였다.

하기 표 1은 화학식 1의 화합물의 물성의 특성을 나타낸 것이고, 표 2 및 3은 화학식 1의 화합물의 아글리콘(aglycon) 부위의 1H, 13C-NMR data(6a) 및 당(sugar) 부위의 1H, 13C-NMR data(6b)를 나타낸 것이다.

Claims (11)

1. 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스의 B형 간염 바이러스 수용체 결합 억제 활성을 가지는 조성물:
   [화학식 1]
   

   

   
   
2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 헛개나무(Hovenia dulcis Thunb) 열매 추출물 또는 그의 분획물에서 분리된 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 헛개나무 열매 추출물은 물, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출한 추출물인 조성물.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 용매는 n-부탄올인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제2항에 있어서, 상기 분획물은 물, 메탄올, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 용매로 분획한 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 용매는 물과 메탄올의 혼합용매인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제1항의 조성물을 포함하는 B형 간염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
8. 제1항의 조성물을 포함하는 B형 간염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   
9. 헛개나무 열매를 세척하고 건조시킨 후 분쇄기로 분쇄하는 단계;
   상기 분쇄된 헛개나무 열매를 물, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 이들의 혼합 용매로부터 선택된 용매로 추출하여 헛개나무 열매 추출물을 얻는 단계;
   상기 헛개나무 열매 추출물을 물, 메탄올, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 용매로 분획하여 분획물을 얻는 단계; 및
   상기 분획물을 고성능 액체 크로마토그래피를 수행하여 하기 화학식 1의 화합물을 얻는 단계를 포함하는 헛개나무 열매로부터 분리한 하기 화학식 1의 화합물 제조방법:
   [화학식 1]
   

   

   
   
10. 제9항에 있어서, 상기 헛개나무 열매 추출물은 n-부탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    
11. 제9항에 있어서, 상기 헛개나무 열매 분획물은 물과 메탄올의 혼합용매 분획물인 것을 특징으로 하는 제조방법.
    
    
    

Images