KR100931527B1 - 오록실린 ａ를 유효성분으로 함유하는 간질환의 치료 및예방을 위한 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 오록실린 A (Oroxylin A)를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 간세포의 DNA 단편화 억제, 캐스파제-3 및 캐스파제-8 활성 억제, 폴리(ADP-리보오소)폴리머라제의 저해 및 JNK 인산화의 억제 효과를 나타내어 간세포의 자가사멸을 억제하는 효능을 확인함으로써, 간질환 치료 및 예방 효과가 뛰어난 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

오록실린 A, 간보호, 간세포 자가사멸, 담즙울체

Description

오록실린 Ａ를 유효성분으로 함유하는 간질환의 치료 및 예방을 위한 조성물{Composition comprising Oroxylin A for treating and preventing liver disease}

본 발명은 오록실린 A를 유효성분으로 함유하는 간질환의 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] Lissoos et al., J Clin. Gastroentero., 15(1), pp63-67, 1992

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[문헌 4] Boulares et al., J. Biol. Chem.,, 277, pp372-378, 2002

[문헌 5] Czaja, M.J., Liver Physiol. 284, ppG875879, 2003

[문헌 6] Mardersteinet al., Surgery. 134, pp280284, 2003

[문헌 7] Gumpricht et al., J. Biol. Chem. 280, pp1055610563,2005

[문헌 8] Park et al., Planta Med. 72, pp661664, 2006

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[문헌 11] Kim JY et al., J Toxicol Environ Health A. 65(5-6), pp373-81, 2002

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[문헌 13] Kim DH et al., Neurobiol Learn Mem. 87(4), pp536-46, 2007

[문헌 14] Tomimori T, Miyaichi Y, Kizu H., Yakugaku Zasshi. 102(4), pp388-91, 1982

[문헌 15] Seglen et al., Exp. Cell. Res., 82, pp391-398, 1973

[문헌 16] Lian et al., Basic Clin. Pharmacol. Toxicol., 96, pp. 495-502, 2005

간은 침묵의 장기로 완충작용이 탁월하여 간의 일부가 손상을 당해 그 기능을 수행하지 못하여도 남은 일부가 그 기능까지 수행함으로써 간 질환 시 초기에 자각증상을 거의 느끼지 못하여 조기진단이 어렵고 말기에서야 발견되기 때문에 그 치료가 쉽지 않다. 또한 치료제도 거의 없는 실정으로 우리나라에서도 연간 15,000명 이상이 간 질환으로 사망하는 등 조기진단의 어려움과 더불어 높은 사망률로 사회적인 문제를 야기하고 있다.

간은 소화기계와 전신순환계 사이에 위치함으로써 소화기계로 들어온 생체외 물질로부터 전신을 방어하는 기능을 수행하고 있는 매우 중요한 장기이다. 일단 생체내로 들어온 생체외 물질이 간을 통과하는 까닭에 간은 영양소외에도 많은 독성물질에 노출될 위험이 다른 장기보다 많아 그만큼 손상될 확률도 다른 장기에 비해 높다.

간은 재생능력이 우수한 장기로 약간의 간세포 손상의 경우에는 충분히 정상으로 회복된다. 그러나 지속적으로 손상될 경우 간세포가 완전히 파괴되면서 파괴된 부분이 정상적으로 회복되지 못하고 결합조직이 과다 축적되면서 간 조직에 상흔(scar)이 형성되고 간 기능이 정상으로 회복되지 못하는 상태가 된다(Lissoos et al., J Clin. Gastroentero., 15(1), pp63-67, 1992). 간 손상의 원인은 알콜, 담즙, 바이러스 등으로 매우 다양하지만 손상이 지속되어 만성 간 질환(chronic liver disease; CLD) 상태가 되면 그 원인과는 상관없이 염증상태 지속, 세포외기 질(extracellular matrix; ECM)의 질적양적 변화가 유발된다.

간세포 손상은 간질환에서 일반적 현상으로 간세포의 괴사(necrosis) 또는 자가사멸을 유도한다. 급성 간장애와 같이 스트레스가 심한 상태에서는 주요 세포 구조(미토콘드리아와 세포골격단백질), 거대분자(DNA, 지질, 효소단백질) 및 대사경로(metabolic pathway)가 손상되어 결국 괴사를 초래하게 된다. 스트레스가 상대적으로 약한 경우 즉, 미토콘드리아 기능을 비가역적으로 완전히 손상시킬 수 없는 경우에는 간세포가 괴사보다는 자가사멸이 유도되는 것으로 보고되고 있다. 담즙산염의 경우 여러 가지 경로로 간세포 자가사멸을 유도하는 것으로 보고되고 있으며 그중 원인으로 산화적 스트레스가 거론되고 있다(Patel et al., Toxicol Appl. Pharmacol. 142(1), pp116-22, 1997).

일반적으로 자가사멸은 염증반응을 유발하지 않으므로 세포의 자가사멸은 생리적 변화에 미치는 영향이 크지 않지만, 간세포 자가사멸은 이러한 일반적인 상태와는 많이 다른 것으로 보고되고 있다. 간세포 자가사멸이 심각한 경우 간세포 내 여러 효소수치가 혈중 증가되며 또 탐식세포에 의한 제거가 충분하지 못한 상태가 되어 결국에는 염증반응이 유발되며 간조직의 정상적인 구조가 파괴된다. 과거에 괴사에 의해서 유도된다고 알려졌던 많은 질환들에서도 자가사멸이 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다. 알콜, 바이러스 및 담즙정체 등으로 인한 간질환에서도 심각한 간 손상 및 간 기능 저하는 간세포 자가사멸에 의함이 보고되고 있다 (Gores et al., J. Hepatol. 37(3), pp400-410, 2002).

담즙정체(cholestasis)는 여러 만성 진행성 간질환(chronic progressive liver disease)에서 발견되는 특징으로 결국에는 간 부전(liver failure), 간경변증(cirrhosis)을 유발하며 결국 사망까지 초래한다. 담즙 정체시 케노데옥시콜레이트(chenodeoxycholate)와 데옥시콜레이트(deoxycholate)와 같은 소수성 담즙산염(hydrophobic bile salt)이 간세포 내 축적됨으로써 간 손상이 유도된다. 담즙정체에 의한 간 손상 시 임상에서의 조직관찰 결과 간세포 괴사보다 간세포의 자가사멸이 더 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. 1차 배양한 간세포에 20-100μM의 글리코세노디옥시콜레이트(glycochenodeoxycholate; GCDC)와 같은 소수성 담즙산염을 처리함으로써 간세포 자가사멸을 유도하는 시험관 내 실험모델(in vitro model)은 내인성 독성물질에 의한 간세포 자가사멸 연구에 유용하게 사용되고 있다. GCDC와 같은 소수성 산(hydrophobic acid)는 Fas 올리고중합화(Fas oligomerization)을 유도함으로써 자가사멸을 유발시킨다. Fas 올리고중합화(Fas oligomerization)에 의해 프로캐스파제-8(procaspase-8)이 caspase-8으로 분할(cleavage) 및 활성화되어 다운스트림 캐스파제(downstream caspase 또는 effector caspase; 캐스파제-3,-6,-7), 대표적으로는 캐스파제-3를 활성화시킴으로써 자가사멸이 유도된다.

자가사멸 과정 중 활성화된 캐스파제-3은 116-kDa의 폴리(ADP-리보오스)폴리머라제(PARP)을 89- 와 24-kDa의 크기로 절단시켜 불활성화시킨다. PARP는 외부환경의 스트레스에 의해 손상된 DNA 복구에 필요한 효소로 알려져 있다(Duriez and Shah, Biochem Cell Biol., 75, 337-49, 1997). 캐스파제-3 활성형에 의해 절단됨으로써 PARP이 불활성화되면서 엔도뉴클리아제(endonuclease)가 활성화되어 핵 내의 DNA 단편화가 유도되는 것으로 보고되고 있으며, 이 단편화된 DNA는 자가사멸 과정의 특이적인 현상으로 간주되고 있다(Boulares et al., J. Biol. Chem. 277, pp372-378, 2002).

미토겐 활성화된 단백질 키나제(MAPK)는 여러 환경적 스트레스에 의한 세포내 신호 전달을 매개하는 것으로 알려져 있으며 ERK, p38과 더불어 JNK가 대표적인 MAPK로 보고되고 있다. 그중 JNK의 인산화는 간세포 자가사멸에 있어서 중요한 경로로 보고되고 있다. JNK 인산화후 자가사멸에 이르는 자세한 경로는 분명히 제시되고 있지는 않으나 자가사멸이 유도된 간세포에서는 JNK가 인산화(활성화)되어 있으며 JNK의 인산화가 저지될 경우 간세포 자가사멸이 억제됨이 잇달아 보고됨으로써 JNK 인산화 억제는 간세포 자가사멸 억제기전으로 인식되고 있다(Czaja, M.J., Liver Physiol. 284, ppG875879, 2003; Mardersteinet al., Surgery 134, pp280284, 2003; Gumpricht et al., J. Biol. Chem. 280, pp1055610563, 2005; Park et al., Planta Med. 72, pp661664, 2006).

간 조직 중에는 영양물질 흡수 및 대사, 저장, 혈장단백질 합성 등과 같은 간의 주요기능을 수행하는 간세포(hepatocyte) 외에 간 내 대식세포(macrophage)인 쿠퍼세포(Kupffer cell), 간 손상 시 결합조직을 과다 합성함으로써 간섬유화를 초래하는 간성상 세포(hepatic stellate cell; HSC) 및 내피 세포(Endothelial cell), 오목 세포(Pit cell) 등이 존재한다. 이중 간세포는 간 조직을 구성하는 전체 세포의 약 90% 이상을 차지하며, 간의 주요기능을 수행하는 실질 세포(parenchymal cell)로써 간질환시 간 기능 저하는 바로 이 간세포 손상으로 인해 초래되는 것이고 간세포 손상이 지속될 경우 간섬유화/경화가 초래된다. 그러므로 간세포 손상 억제 및 예방은 간 질환 예방 및 치료에 있어서 가장 중요한 부분이라 할 수 있겠다.

오록실린 A의 효능으로는 항암작용(Hu Y et al., Biochem Biophys Res Commun. 351(2), pp521-7, 2006), 항산화 및 항염증 작용(Huang WH et al., Biosci Biotechnol Biochem. 70(10), pp2371-8, 2006), CYP2C9 억제작용(Kim JY et al., J Toxicol Environ Health A. 65(5-6), pp373-81, 2002), 항균작용(Suresh Babu K et al., Bioorg Med Chem Lett. 15(17), pp3953-6, 2005), 항-건망증 작용(Kim DH et al., Neurobiol Learn Mem. 87(4), pp536-46, 2007) 등이 보고되고 있다.

이에, 본 발명자들은 간세포 손상을 효과적으로 보호 및 예방할 수 있는 효능의 물질을 찾고자 연구를 거듭한 결과, 황금(Scutellaria baicalensis Georgi)으로부터 분리된 플라보노이드계에 속하는 성분으로 5,7-디하이드록시-6-메톡시플라본(5,7-dihydroxy-6-methoxyflavone)의 화학명을 갖는 오록실린 A(Oroxylin A)가 담즙산염에 의한 간세포의 자가사멸을 방지하여 간질환의 치료 및 예방에 이용될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 구조식 (1)로 표기되는 오록실린 A를 유효성분으로 함유하는 간질환의 치료 및 예방용 약학조성물을 제공한다.

(1)

상기 오록실린 A는 담즙울체에 의한 간세포 손상을 억제하는 작용을 가짐을 특징으로 하는 간질환의 치료 및 예방용 약학조성물을 제공한다.

상기 간질환은 자가면역성 간질환, 약물유인성 간질환, 알코올성 간질환, 감염성 간질환, 선천성대사성 간질환, 담즙정체에 의한 간질환, 급성간염, 만성간염, 간경변증, 지방간, 간암, 바람직하게는 알코올성 간질환, 담즙정체에 의한 간질환, 급성간염, 만성간염 또는 간경변증을 포함한다.

본 발명에 따른 오록실린 A는 당업계에 잘 알려진 방법으로 추출법 또는 화학적 합성법에 의해 제조, 또한 시판 중인 것을 적의 선택하여 사용할 수 있으며, 그 방법 또는 물질은 특별히 한정되지 않는다.

이하, 본 발명의 화합물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 오록실린 A는 건조된 황금을 세절하여 건조 중량의 약 1 내지 30배, 바람직하게는 약 10 내지 20배의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물로 1 내지 12시간, 바람직하게는 2 내지 5시간 동안 가열 환 류 추출, 냉침추출, 초음파 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 가열 환류 추출을 이용하여 수득한 추출액을 여과 감압 농축하여 조추출물을 얻는 제 1단계; 상기 조추출물을 부탄올, 클로로포름, 메탄올의 용매에 가용하여, 바람직하게는 클로로포름에 가용하는 제 2단계; 상기 제 2단계에서 수득한 클로로포름 추출물을 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 3개의 분획으로 나누는 제 3단계; 상기 제 3단계의 분획 중 첫 번째 분획을 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 오록실린 A를 분리하는 제 4단계의 제조공정을 통해 본 발명의 오록실린 A를 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 오록실린 A를 유효성분으로 함유하는 간질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 간 보호 및 간 손상 치료 및 예방을 위한 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물을 함유하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 함유하는 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 화합물은 1일 1 내지 2,000 ㎎/kg 체중의 농도로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 오록실린 A를 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 건강기능식품은 분말, 과립, 정제 캡슐 또는 음료 형태로 제조가능하다.

또한, 간질환의 예방 및 개선 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 화합물들은 천연 과일 쥬스, 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지는 않지만 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 오록실린 A는 100 μM GCDC에 의해 유도된 DNA 절편화 및 PARP 분할 및 카스파제의 활성형 발현을 억제하며, 또한 간세포 자가사멸의 주요역할을 하는 것으로 알려진 JNK 인산화를 억제함으로써 자가사 멸로부터 간세포 보호 활성을 가지고 있음을 확인하였다. 또한 상기의 오록실린 A는 소수성 담즙에 의한 간세포 자가사멸을 억제하는 효능이 있어 간질환의 치료 및 예방용 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예, 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 오록실린 A의 분리 및 구조동정

1-1. 황금 조추출물의 제조

건조한 황금 600 g을 경동시장에서 구입하여 분말화한 후, 6 L의 물을 가하여 3시간 동안 가열 환류 추출하고, 진공 여과하여 상층액을 회수하였다. 이 과정을 3회 반복하여 상층액을 모은 후, 감압 농축(EYELA사, N-1000, 일본)하여 황금 수추출물 1 L를 수득하였다.

1-2. 황금 비극성용매가용추출물의 제조

상기 실시예 1-1 단계에서 얻은 황금 조추출물 1 L는 노말 부탄올 800 ml씩 사용하여 3회 분배한 다음 용매 분획을 감압 농축하여 노말 부탄올 가용부 21.1 g를 수득하였다. 상기 얻어진 노말 부탄올 가용부는 60% 메탄올 1 L에 용해시켜 클로로포름 800 ml씩 3 회 분배한 다음 감압 농축하여 클로로포름 가용부 11.5 g과 60% 메탄올 가용부 9.1 g을 얻었다.

1-3. 황금 추출물로부터 오록실린 A의 분리

상기 실시예 1-2 단계에서 얻은 클로로포름 가용부 11.5 g은 실리카겔(900 g) 컬럼에 걸은 다음 디클로로메탄과 메탄올(30:1 - 20:1 - 10:1)의 혼합용매로 용출하여 혼합비율에 따라 3개의 분획(A, B, C)으로 나누었다. 상기 분획 A(5.4 g)를 이동상으로 클로로포름과 메탄올(40:1)을 사용하여 실리카겔(200-300 매쉬, 500 g) 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 오록실린 A(120 mg)을 수득하였고, 기기분석결과 하기 물성치를 갖는 황색의 판상 결정물의 오록실린 A임을 확인하였다(Tomimori T, Miyaichi Y, Kizu H., Yakugaku Zasshi. 102(4), pp388-91, 1982).

융점: 218-219℃;

¹H-NMR 스펙트럼(DMSO-d ₆ , 400 MHz): 3.75ppm (3H, s, OCH₃), 6.63ppm (1H, s, H-3), 6.97ppm (1H, s, H-8), 8.10-7.52ppm (5H, m, H-2'~6'), 12.95ppm (1H, s, 5-OH);

¹³C-NMR 스펙트럼(DMSO-d ₆ , 62.5 MHz): 182.5 (C-4), 163.4 (C-2), 157.9 (C-7), 153.0 (C-9), 152.8 (C-5), 132.2 (C-4'), 131.7 (C-1'), 130.9 (C-6), 129.4 (C-3', C-5'), 126.6 (C-2', C-6'), 104.9 (C-3), 104.5 (C-10), 94.6 (C-8), 60.2 (OCH₃).

참고예 1. 흰쥐로부터 간세포 분리 및 배양

흰쥐로부터 간세포를 분리하기 위하여 새글랜 등의 방법(Seglen et al., Exp. Cell. Res. 82, pp391-398, 1973)에 따라 하기와 같이 실험을 수행하였다.

흰쥐를 마취하여 복부를 절개한 후, 간문맥에 삽관하여 5% CO₂ 및 95% O₂의 혼합기체를 불어넣은 37℃의 Ca^{2 +}, Mg^{2 +}-없는 행크의 균형염 용액(Ca^{2 +}, Mg^{2 +}-free Hank's balanced salt solution)을 관에 흘려보내 간 내 혈액을 제거하였다. 그런 다음, 0.05% Ⅳ형 콜라겐나아제(collagenase type IV) 및 1 mM CaCl₂ 용액을 흘려보냈다. 간 조직을 몸체로부터 떼어낸 다음 간세포 현탁액을 만들어 50×g에서 2분간 원심분리하고 침전된 간세포를 취해 Ca^{2 +}, Mg^{2 +}-없는 행크의 균형염 용액으로 2회 세척한 다음 1형 콜라겐으로 코팅된 배양용기에 10% (v/v) 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS, 깁코BRL, 미국), 10^-8 M 인슐린, 50 U/㎖의 페니실린 및 50 U/㎖의 스트렙토마이신(시그마, 미국)이 첨가된 윌리암스 배지 E(Williams’Medium E; WME, 깁코BRL, 미국)를 배양액으로 하여 세포수가 1×10⁶ 세포수/㎖ 되도록 한 후, 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다. 2시간 배양 후 세포를 행크의 균형염 용액으로 세척하여 붙지 않은 간세포는 제거하고 새 배양액으로 교체한 다음 5% CO₂, 37℃의 조건에서 16 시간 동안 배양시킨 다음 하기 실험에 사용하였다.

참고예 2. 1차배양 간세포에서 간세포 자가사멸( apoptosis ) 유도 및 오록실린 A 처리

참고예 1에서와 같이 분리 배양한 간세포에 담즙울체와 같은 조건을 형성하여 자가사멸을 유발하기 위하여, 담즙울체시 간독성을 나타내는 소수성 담즙산염인 글리코케노디옥시콜레이트(glycochenodeoxycholate; GCDC)를 간세포에 처리한다. 간세포에 오록실린 A를 10분 전처리하고 GCDC 100 μM을 가하여 4 시간 동안 배양하였다. 오록실린 A는 디메틸설프옥시드(dimethylsulfoxide; DMSO)에 용해하여 사용하였고, GCDC는 행크의 균형염 용액(Hank's balanced salt solution; HBSS)에 용해한 다음 0.22 ㎛ 필터로 여과한 다음 배양액에 가했다. 실험군은 하기 표 1과 같이 설정하였다.

1군	DMSO 함유 배양액 처리
2군	100 μM GCDC와 DMSO 함유 배양액 처리
3군	100 μM GCDC와 오록실린 A(40 μM) 함유 배양액 처리

실험예 1. DNA 단편화에 미치는 오록실린 A의 보호효과 측정

간세포내 DNA 단편화에 미치는 오록실린 A의 보호 효과를 상기 참고예 2에서와 같이 처리한 간세포 실험군에서 다음과 같이 실시하였다.

간세포 내 DNA를 시판되는 위저드 지노믹 DNA 퓨리피케이션 키트(프로메가, 미국)를 이용하여 추출 및 정량한 다음 30 ㎍의 DNA를 2% 아가로스 겔에서 50 mV, 40 분간 전기영동하여 자외선하 DNA 단편화를 확인하였으며 그 결과를 도 1에 나타내었다.

실험 결과로부터, 100 μM GCDC 처리시 간세포의 DNA 단편화가 유도되었으나 오록실린 A와 100 μM GCDC를 같이 처리한 간세포의 경우 DNA 단편화 유도가 억제되었음을 확인할 수 있었다(도 1참조).

실험예 2. 캐스파제-3 및 캐스파제-8 활성에 미치는 오록실린 A의 억제효과 측정

상기 실시예 1에서 수득한 오록실린 A의 캐스파제-3(caspase-3) 및 캐스파제-8(caspase-8)의 활성 억제 효과를 알아보기 위해 리안 등의 방법(Lian et al., Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 96, pp495-502, 2005)을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

캐스파제의 활성은 시판되는 캐스파제-3 및 캐스파제-8 활성 색도계 어세이 키트(caspase-3 and caspase-8 activity colorimetric assay kit, R&D system Inc., 미국)를 이용하여 참고예 1에서와 같이 배양한 간세포에 GCDC와 함께 오록실린 A를 40 μM로 4 시간 동안 처리한 실험군을 대상으로 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

군 번호	캐스파제-3 활성 (%)	캐스파제-8 활성(%)
1	100.0±6.7	100.0±12.4
2	447.8±53.2a	180.3±25.2a
3	132.8±11.8a,b	107.7±21.6b
[주] aP< 0.05, 1군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임 bP< 0.05, 2군에 비해 통계학상 유의적인 차이를 보임

상기 결과로부터, GCDC 처리에 의해 캐스파제-3 및 캐스파제-8의 활성이 유의적으로 증대되었으나, GCDC와 오록실린 A를 함께 처리한 경우에는 GCDC 단독 처리군에 비해 유의적으로 캐스파제-3 및 캐스파제-8의 활성이 억제되었음을 확인할 수 있었다. 이로서 오록실린 A는 GCDC에 의해 유도된 간세포 캐스파제-3 및 캐스파제-8의 활성화를 유의성 있게 억제하고 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 면역이적법(Immunoblot)을 이용한 캐스파제 -3 및 캐스파제 -8의 활성형 발현 및 폴리( ADP -리보오스) 폴리머라제 ( PARP ) 분할에 대한 오록실린 A의 억제효과

상기 실시예 1에서 수득한 오록실린 A의 간세포에 대한 자가사멸 억제작용을 면역이적법 어세이(immunoblot assay)로 캐스파제-3 및 캐스파제-8의 활성형 증가억제와 PARP 분열억제를 확인하고자 리안 등의 방법(Lian et al., Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 96, pp495-502, 2005)을 이용하여 하기의 면역이적법실험 (immunoblot assay)을 수행하였다.

상기 참고예 1에서와 같이 분리 배양한 간세포에 GCDC와 오록실린 A를 4시간동안 처리한 실험군을 대상으로 면역이적법을 실시하였다. 약물을 처리한 간세포를 용해 완충용액(lysis buffer, 10 mM Tris(pH 8.0), 120 mM NaCl, 0.5% NP-40, 1 mM EDTA, 0.1 mM 페닐메틸설퍼닐 플루라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride), 1 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol), 1 ㎍/㎖ 아프로티닌(aprotinin))로 용해한 다음 14000 rpm, 4℃에서 20 분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상층의 단백질 농도를 바이오-레드 DC 단백질 검사 키트(Bio-Rad Laboratories, 미국)를 사용하여 측정한 다음 단백질 50 ㎍을 각각 12% (w/v) SDS 겔(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)에서 120 V로 1.5 시간 동안 전기영동시켰다. 전기영동에 의해서 겔 내 단백질은 분자량 크기에 따라 분리되고, 이러한 단백질을 니트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane, 밀리포어, 미국)에 30 mA로 16 시간 동안 트랜스퍼(transfer)시켰다. PARP 분열의 경우 트랜스퍼된 니트로셀룰로오스막을 5% 탈지유(skim milk)로 블로킹한 다음, 100배 희석된 마우스 항-PARP 항체(PARP antibody; Cell Signaling Technology, 비벌리, MA, 미국)를 1차 항체로 사용하여, 16 시간 동안 4℃에서 반응시켰다. 2차 항체로서 서양고추냉이 퍼옥시다아제-결합된 항-마우스 면역글로블린 G(horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-mouse IgG; 산타크루즈, 미국)를 2,000배 희석한 것을 사용하여 1 시간 동안 반응시켰다.

캐스파제-3 활성형의 경우 트랜스퍼된 니트로셀룰로오스막을 5% 탈지유(skim milk)로 블로킹한 다음, 200배 희석된 토끼 캐스파제-3 항체(rabbit anti-caspase-3 polyclonal antibody; Santa cruz)를 1차 항체로 사용하여, 2시간동안 실온에서 반응시켰다. 캐스파제-8 활성형의 경우 트랜스퍼된 니트로셀룰로오스막을 5% 탈지유(skim milk)로 블로킹한 다음, 1000배 희석된 토끼 캐스파제-8 항체(Polyclonal anti-caspase-8; StressGen Biotechnologies, 캐나다)를 1차 항체로 사용하여, 4 시간 동안 실온에서 반응시켰다. 2차 항체로서 서양고추냉이 퍼옥시다아제-결합된 항-토끼 면역글로블린 G(horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-rabit IgG; Santacruz)를 2,000배 희석한 것을 사용하여 1시간 동안 반응시켰다. 발색은 강화된 화학발광 웨스턴 블랏 검출 시스템 키트(Enhanced chemiluminescence(ECL) western blotting detection system kit; 아머샴, 미국)를 이용하여, 사용자 설명서에 따라 X-ray 필름(Agfa, EC)에 노출시켜 확인하였으며 그 결과는 도 2에 나타내었다.

실험 결과로부터, GCDC를 처리한 간세포군에서는 캐스파제-8의 활성형(44 kD), 캐스파제-3의 활성형(17 kDa) 및 분열된 PARP(85 kDa)이 정상군에 비해 유의적으로 증가하였음을 확인할 수 있었다. 이에 반해 GCDC와 오록실린 A를 같이 처리한 군에서는 활성형 캐스파제-8(44 kD) 및 캐스파제-3(17 kDa)와 분열된 PARP(85 kDa)이 GCDC 단독 처리군에 비해 현저히 감소하였음을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로부터 오록실린 A는 담즙산염에 의한 간세포 자가사멸을 억제하였음을 확인할 수 있었다(도 2참조).

실험예 4. c- jun - NH2 - termial kinase ( JNK ) 인산화 억제 효과

상기 실시예 1에서 수득한 오록실린 A의 JNK 인산화 억제 효과를 알아보기 위해 박 등의 방법(Park et al., Planta Med. 72, pp661-4, 2006)을 이용하여 하기와 같이 면적이적법 실험(immunoblot assay)을 수행하였다.

참고예 1에서와 같이 분리 배양한 간세포 실험군을 사용하여 얻은 간세포 단백질은 실험예 3과 같이 준비하였으며, 수득한 각 실험군의 단백질 100 ㎍을 각각 12% (w/v) SDS 겔에서 200 V로 1시간동안 전기영동 하였다. 전기영동에 의해서 겔 내 단백질은 분자량크기에 따라 분리되었으며, 이 상태로 30 mA로 16 시간 동안 니트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane, 밀리포어, 미국)으로 트랜스퍼(transfer)하였다. 니트로셀룰로오스막을 5% 탈지유(skim milk)로 블로킹하고, 1000배 희석된 인산화-JNK 항체(phospho-JNK polyclonal antibody; Cell Signaling Technology)를 1차 항체로 사용하여, 16시간 동안 4℃에서 반응시켰으며, 2000 배 희석된 양고추냉이 퍼록시다제가 결합된 항-토끼 면역글로블린 G(horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-rabbit IgG; 산타크루즈, 미국)를 2차 항체로 사용하여 1시간 동안 반응시켰다. 강화된 화학발광 웨스턴 블랏 검출 시스템 키트(Enhanced chemiluminescence(ECL) western blotting detection system kit, KPL)를 이용하여 발광반응 하였으며, 발광정도는 사용자 설명서에 따라 X-ray 필름(Agfa, EC)에 노출시켜 확인하였으며 그 결과는 도 3에 나타내었다.

실험 결과로부터, 100 μM GCDC에 의해 간세포 자가사멸에 주요한 작용을 하는 JNK의 인산화가 유도되나 오록실린 A 처리에 의해 JNK 인산화는 현저히 억제되었음을 확인할 수 있었다(도 3참조).

본 발명의 화합물을 함유하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

오록실린 A 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

오록실린 A 10 mg

옥수수 전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

오록실린 A 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

오록실린 A 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

오록실린 A 10 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100 ml 로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강기능식품의 제조

오록실린 A 1000 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 mg

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

오록실린 A 1000 mg

구연산 1000 mg

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수 전체 900 ml

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

도 1은 소수성 담즙산염 처리에 의한 간세포 DNA 단편화가 본 발명에 따른 오록실린 A에 의해 억제됨으로써 오록실린 A의 간세포 자가사멸 억제효과를 나타낸 도이며,

도 2는 소수성 담즙산염 처리에 의한 활성형 캐스파제-8, 활성형 캐스파제-3 및 폴리(ADP-리보오스)폴리머라제 절단형의 발현이 본 발명에 따른 오록실린 A에 의해 억제됨으로써 오록실린 A의 간세포 자가사멸 억제효과를 나타낸 도이고,

도 3은 소수성 담즙산염 처리에 의해 유도되는 간세포내 c-jun-NH2-말단 키나제의 인산화가 본 발명의 오록실린 A에 의해 억제됨을 나타낸 도이다.

Claims (6)

1. 담즙울체에 의한 간세포 손상을 억제하는 작용을 가지는 오록실린 A(Oroxylin A)를 유효성분으로 함유하는 급성간염 또는 만성간염의 치료 및 예방용 약학조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 담즙울체에 의한 간세포 손상을 억제하는 작용을 가지는 오록실린 A(Oroxylin A)를 유효성분으로 함유하는 급성간염 또는 만성간염의 예방 및 개선용 건강기능식품.
6. 삭제

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