KR20140070735A - 두충 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 간보호 및 간 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 두충 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 간보호 및 간 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 간 조직 내의 중성지방, 콜레스테롤의 축적을 억제하여 간 보호 및 간 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

두충 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 간보호 및 간 질환의 예방 및 치료용 조성물 {A composition comprising the compounds isolated from an extract of Eucommia ulmoides OLIV having hepatoprotective activity and for treating or preventing fatty liver}

본 발명은 두충 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 간보호 및 간 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] Laura E.Nagy:Molecular aspects of alchol metabolism: Trasncription factors involved in early ethanol-induced liver injury, Annu.Rev.Nutr 24:55-78, 2004

[문헌 2] 정보섭외 향약대사전, 영림사, p605-606, 1998년

[문헌 3] The promoting effects of geniposidic acid and aucubin in Eucommia ulmoides Oliver leaves on collagen synthesis./ Li Y, Sato T, Metori K, Koike K,Che QM, Takahashi S /Biological & Pharmaceutical Bulletin [1998, 21(12):1306-1310]

[문헌 4] Chih-Li Lin, Hsiu-Chen Huang, and Jen-Kun Lin, Theaflavins attenuate hepatic lipid accumulation through activating AMPK in human HepG2 cells. Journal of Lipid Research. 2007. 48: 2334343

[문헌 5] Brown MS, Goldstein JL: The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell. 1997, 89: 331-340

[문헌 6] Angulo P, Nonalcoholic fatty liver disease. N Engl J Med 2002, 346(16):1221231, Clark JM, Diehl AM, Nonalcoholic fatty liver disease: an underrecognized cause of cryptogenic cirrhosis. JAMA. 2003: 289(22): 3000004

[문헌 7] Zheng Li, Michael Berk1, Thomas M. McIntyre1, Gregory J. Gores, and Ariel E.Feldstein, Lysosomal-Mitochondrial Axis in Free Fatty Acidnduced Hepatic LipotoxicityHepatology. 2008, 47(5): 1495503

[문헌 8] Bax inhibition protects against free fatty acid-induced lysosomal permeabilization,/ Ariel E. Feldstein1, Nathan W. Werneburg2, ZhengZheng Li1, Steven F. Bronk2, and Gregory J. Gores2 / Am , J. Physiol Gastrointest Liver Physiol 290: G1339 - G1346 , 2006. First published 16 February 2006 / doi: 10.1152/ajpgi.00509.2005)

[문헌 9] Cox B. E., Griffin E. E., Ullery J. C., Jerome W. G.(2007) J. Lipid Res. 48, 10121021

[문헌 10] Trivedi N. S., Wang H. W., Nieminen A. L., Oleinick N. L., Izatt J. A.(2000) Photochem. Photobiol. 71, 634639)

[문헌 11] Movement of Bax from the Cytosolto Mitochondria during Apoptosis/Keith G. Wolter,* Yi-Te Hsu,* Carolyn L. Smith,‡Amotz Nechushtan,* Xu-Guang Xi,*and Richard J. Youle*/The Journal of Cell Biology, Volume 139, Number 5, December 1, 1997 1281292

[문헌 12] Saturated fatty acid induction of endoplasmic reticulum stress and apoptosis in human liver cells via the PERK/ATF4/CHOP signaling pathway/ Jie Cao, Dong-Ling Dai, Long Yao, Hui-Hong Yu, Bo Ning, Qin Zhang, Juan Chen, Wen-Hui Cheng, Wei Shen, Zhao-Xia Yang / Molecular and Cellular Biochemistry May 2012, Volume 364, Issue 1-2, pp 115-129

[문헌 13] Palmitic and linoleic acids induce ER stress and apoptosis in hepatoma cells/Yong Zhang1, Rongliang Xue1*, Zhenni Zhang1, Xia Yang2 and Hongyang Shi2 /Lipids in Health and Disease 2012, 11:1

[문헌 14] Lysosomal membrane permeabilization during apoptosis--involvement of Bax/ KK, Johansson AC, Johansson U, Heimlich G, Roberg K, Wang NS, JJM, Ollinger K./ Int J Exp Pathol. 2005 Oct;86(5):309-21.

[문헌 15] Lysosomal membrane permeabilization in cell death./P Boya, G Kroemer /Oncogene. 2008 Nov 13;27 (50):6434-51

[문헌 16] Enhanced lysosomal activity is involved in Bax inhibitor-1-induced regulation of the endoplasmic reticulum (ER) stress response and cell death against ER stress: involvement of vacuolar H+-ATPase (V-ATPase)./Lee GH, Kim DS, Kim HT, Lee JW, Chung CH, Ahn T, Lim JM, Kim IK, Chae HJ, Kim HR./J Biol Chem. 2011 Jul 15;286(28):24743-53. Epub 2011 May 17.

[문헌 16] BD Bioscience (2009). Techniques for Immune Function Analysis (2 ed.). Becton, Dickinson and Company.

[문헌 17] Direct measurement of cathepsin B activity in the cytosol of apoptotic cells by an activity-based probe./ Pratt MR, Sekedat MD, Chiang KP, Muir TW./ Chem Biol. 2009 Sep 25;16(9):1001-12.

[문헌 18] CHANGES IN PANCREATIC LYSOSOMAL ENZYMES ACTIVITY AS THE POTENTIAL FACTORS LEADING TO DIABETIC ENTEROPATHY/ R. MACIEJEWSKI1, K. BURSKI1, J. BAJ1, B. MADEJ1, F. BURDAN/JOURNAL OF PHYSIOLOGY AND PHARMACOLOGY 2001, 52, 4, 823-834.

우리나라 간질환 사망률은 인구 십만명 당 23.5명(남자 37.8명, 여자 9.0명)으로 매우 높으며, 40대 사망원인 1위(41.1명/10만명), 50대 사망원인 2위(72.4명/10만명), 30대 사망원인 3위(10명/10만명)를 차지하는 등 간질환은 한국 중년층 인구의 주요 사망원인이다. 특히 알콜성 간질환은 만성과다 음주자의 대부분에서 나타날 수 있는 질환이다.

상기 알콜성 간질환으로는 지방간, 급성간염, 만성간염, 간경변증과 간암이 있는데 이중 지방간은 가장 가벼운 증상을 보이는 동시에 가장 높은 발생빈도를 나타낸다.

알콜성 지방간이란, 간세포 속에 지방이 축적된 상태인데, 지방자체는 간세포에 큰 독성이 없어 심하지 않은 경우에는 증상이 없는 경우가 많고 간기능 검사를 해 보아도 간기능이 정상이거나 조금 저하되는 경우가 대부분이다. 그러나, 지방간이 심하거나 간염 또는 간경변증에 지방간이 겹치면 간기능이 심히 저하되어 치명적인 상태가 되기도 한다.

구체적으로, 지방간이 악화되어 간세포 속의 지방 덩어리가 커지면 핵을 포함한 세포의 중요한 구성성분이 한쪽으로 밀려 간세포의 기능이 저하되며, 세포내에 축적된 지방으로 인하여 팽창된 간세포들이 간세포 사이에 있는 미세혈관과 임파선을 압박하여 간내의 혈액과 임파액의 순환에 장애가 생기게 된다. 이렇게 되면 간세포는 산소와 영양공급을 적절히 받을 수 없어 간기능이 저하되는 것이다.

상기 지방간은 만성적인 음주벽, 과식에 의한 비만증과 당뇨병이 주요 원인으로 꼽히며, 그밖에 독성이 강한 약제의 복용, 임신중에 항생제를 잘못 복용하였을 경우, 어린아이에게서의 발열성 감염질환이 있을 경우에 해열목적으로 아스피린을 함부로 남용하였을 경우에도 지방간은 생길 수 있다.

이러한 지방간은 면역상태 등의 신체적 여건이 좋으면 간세포의 재생으로 쉽게 회복되지만 그렇지 못할 경우에는 간경변증까지 진행될 수가 있다.

지방간 환자가 10년 내 간경변증으로 이행할 가능성은 30%, 알콜성 간염환자가 계속 음주할 경우 7년 생존율은 50%, 알콜성 간경변 환자가 계속 음주할 경우 5년 생존율은 40% 이하로 알콜에 의한 만성간질환은 우리나라 전체 간질환 사망률의 중요한 부분을 차지한다. 더구나 우리나라는 B형 간염의 만연 지역으로서 만성 간질환 및 간암에 의한 사망률이 총 사망원인의 10%를 차지할 정도로 국민 건강에 심각한 문제가 되고 있다.

따라서 우리나라의 독특한 음주문화를 고려할 때 간질환 사망률을 줄이기 위해서는 초기에 알콜성 간질환을 적절히 치료해야 하지만 아직 우리나라에는 알콜성 간질환 치료제가 개발되어있지 않은 실정이다.

비알코올성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease, 이하 NAFLD)은 음주와 관계없이 간 내에 중성지방이 축적되는 질환을 의미하고, 여기에는 단순지방간(steatosis)과 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)을 포함한다. 단순 지방간은 임상적으로 예후가 양호한 양성 질환으로 생각되고 있으나, 지방간과 함께 염증 혹은 섬유화를 동반하는 NASH는 진행성 간질환으로 간경변 또는 간암을 유발하는 전구 질환으로 인지되고 있다.

비만과 인슐린저항성은 대표적인 비알콜성 지방간질환의 위험인자이다. 간섬유증 진행의 위험인자로는 가령, 비만(BMI>30), 혈중 간기능지표 비율(AST/ALT>1) 및 당뇨를 들 수 있으며, 특히 C형 간염 보균자가 비알콜지방간일 경우 간암까지 진행될 수 있어 예방 및 치료의 필요성이 대두되고 있다. 비알콜성 지방간환자의 69-100%는 비만환자이고, 비만환자의 20-40%는 비알콜성 지방간을 동반하며 특히, 남성 비만환자의 간질환 유병율이 여성비만자에 비해 더 높게 나타난다. 서구사회에서는 비만환자뿐만 아니라 정상체중 성인의 3-30%가 비알콜성 지방간병변을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 우리와 식생활이 유사한 일본의 비알콜성 지방간 유병율은 약 20%로 추정되며, 이중 1%가 NASH로 추정된다. 비알콜성 지방간은 성인 뿐 아니라 비만아동에서도 문제가 된다. 비만아동(유럽, 미국 및 아시아 거주)의 10-77%가 비알콜성 지방간 병변을 보이는데, 이는 비알콜성 간질환의 가장 중요한 위험인자가 비만이기 때문이다.

알코올성 간질환의 원인은 다양하고 아직 정확히 밝혀지지 않았지만 알코올에 의해 다양한 전사인자들의 전사활성이 영향을 받는데 이는 지방산대사 이상을 일으킨다고 보고되어 있다. 구체적으로 지방의 합성과 산화에 관여하는 수많은 유전자들은 특정된 전사인자들의 조절을 받는데 여기에는 지방의 산화에 관여하는 PPAR-α 및 지방의 생합성에 관여하는 SREBP-1 등이 포함된다[Laura E.Nagy:Molecular aspects of alchol metabolism: Trasncription factors involved in early ethanol-induced liver injury, Annu.Rev.Nutr 24:55-78, 2004].

두충나무(Eucommia ulmoides OLIV)는 두충과(Eucommiaceae)에 속하는 중국원산의 낙엽교목으로서, 건조한 근피(根皮)를 두충(杜)이라 지칭하여 혈압강하작용, 이뇨작용 등이 알려져 잇으며, 알려진 성분으로는 굽타-퍼르카(gutta-percha), 알칼로이드(alkaloid), 펙틴(pectin), 진방, 수지 등의 성분을 함유한 것으로 알려져 있으며,(정보섭외 향약대사전, 영림사, p605-606, 1998년) 또한, 우쿠빈(aucubin) 및 게니포시드(geniposide) 등의 성분을 함유한 것으로 알려져 있다(The promoting effects of geniposidic acid and aucubin in Eucommia ulmoides Oliver leaves on collagen synthesis./ Li Y, Sato T, Metori K, Koike K,Che QM, Takahashi S /Biological & Pharmaceutical Bulletin [1998, 21(12):1306-1310] )

그러나, 상기 문헌의 어디에도 두충 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물들의 간질환에 대한 치료효과에 대한 어떠한 언급 또는 교시 내용도 없다.

이에 본 발명자들은 섭취가 용이하고 인체에 안전하며 지방간을 치료할 수 있는 물질을 찾고자 연구 노력한 결과, 두충 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물이 상기에서 수득된 두충 추출물 및 이로부터 분리된 화합물들은 (1) 간세포 내 중성지방 축적 및 라이소좀 활성 억제를 보호하여 간 세포 내 지방의 축적을 방지하고, (2) 소포체 스트레스 관련 단백질인 P-PERK, p-eIF2α, CHOP 등의 발현을 감소시키고 (3) 지방 합성관련 항체인 SREBP-1, FAS, PARP 항체의 발현을 억제하고, (4) 간세포 내 지방의 축적을 억제하고, 세포 내 apo B의 합성을 감소시키고, (5) 팔미트산으로 인한 중성지방과 콜레스테롤의 축적을 억제하여 세포를 보호할 뿐만 아니라, (6) 간세포의 세포사를 억제하여 생존능을 증대시키고 (7) DNA fragmentation 억제 효과, Active Caspse-3 및 caspase-9의 발현 에 대한 억제효과, (8) BAX의 리소솜(lysosome)으로의 국소화(localization)에 대한 억제 효과, (9) BAX의 리소솜(lysosome)으로의 침투(Permeabilization)에 대한 억제 효과, (10) lysosomal enzyme 활성 저하에 대한 보호 효과 등 각종 실험을 통하여 간세포 보호효과 및 지방간 억제효과와 같은 간질환 치료 및 예방효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 두충 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 간보호 및 간 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 두충 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 간보호 및 간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물, 바람직하게는 물 및 메탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 30 내지 100%(v/v) 물 및 메탄올 혼합용매에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 두충 추출물로부터 분리된 화합물은 시중에서 구입하거나 두충 추출물로부터 분리가능한 아우쿠빈(aucubin), 게니포시드(geniposide)을 포함한다.

본원에서 정의되는 간 질환은 급성간염, 만성간염, 지방간증, 간경화증, 간섬유화증, 및 간암, 바람직하게는 지방간증, 알콜성 지방간 질환, 비알콜성 지방간 질환, 영양성 지방간 질환, 기아성 지방간 질환, 비만성 지방간 질환, 당뇨병성 지방간 질환, 지방간염, 약물에 의한 간염 등과 같은 지방간 질환을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동일한 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아 세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산 및 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비 용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 하이드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포 네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조 방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 추출물 및 화합물들은 하기와 같은 제조방법으로 수득될 수 있다.

예를 들어, 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 두충 추출물은 하기와 같이 제조될 수 있다. 건조된 두충를 세척 및 세절 후 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 메탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 60~100% 메탄올을 수회 섞은 다음에 30℃ 내지 150℃, 바람직하게는 50℃ 내지 100℃의 온도에서 30분 내지 48시간, 바람직하게는 1시간 내지 12시간 동안 초음파 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법 또는 환류추출법, 바람직하게는 초음파 추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 얻은 추출액을 여과, 감압 농축, 및 건조하여 본 발명의 두충 추출물을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 두충 추출물로부터 분리가능한 아우쿠빈(aucubin), 게니포시드(geniposide) 화합물은 시중에서 구입하거나 상기한 두충 추출물을 당업계에 잘 알려진 통상적인 분획과정을 수행하여 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 등의 비극성 용매에 가용한 비극성 용매 가용 추출 분획물; 및 부탄올, 물 등의 극성용매에 가용한 극성용매 가용 추출 분획물을 수득한 후에, 이 정제물을 대상으로 하여 플래쉬 컬럼크로마토그래피, RP C18 컬럼크로마토그래피 또는 실리카겔 오픈 컬럼크로마토그래피 등의 크로마토그래피를 이용한 정제방법을 선택적으로 수회 반복 수행함으로서, 본 발명의 화합물들 즉, 아우쿠빈(aucubin), 게니포시드(geniposide) 화합물을 각각 정제 및 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법 및 상기 제조공정으로 얻어진 두충 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 간보호 및 간 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물 및 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 두충 추출물 및 이로부터 분리된 화합물들은 (1) 간세포 내 중성지방 축적 및 라이소좀 활성 억제를 보호하여 간 세포 내 지방의 축적을 방지하고, (2) 소포체 스트레스 관련 단백질인 P-PERK, p-eIF2α, CHOP 등의 발현을 감소시키고 (3) 지방 합성관련 항체인 SREBP-1, FAS, PARP 항체의 발현을 억제하고, (4) 간세포 내 지방의 축적을 억제하고, 세포 내 apo B의 합성을 감소시키고, (5) 팔미트산으로 인한 중성지방과 콜레스테롤의 축적을 억제하여 세포를 보호할 뿐만 아니라, (6) 간세포의 세포사를 억제하여 생존능을 증대시키고 (7) DNA fragmentation 억제 효과, Active Caspse-3 및 caspase-9의 발현 에 대한 억제효과, (8) BAX의 리소솜(lysosome)으로의 국소화(localization)에 대한 억제 효과, (9) BAX의 리소솜(lysosome)으로의 침투(Permeabilization)에 대한 억제 효과, (10) lysosomal enzyme 활성 저하에 대한 보호 효과 등 각종 실험을 통하여 간세포 보호효과 및 지방간 억제효과와 같은 간질환 치료 및 예방효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.01 내지 80 중량%, 바람직하게는 10 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1~50 중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태, 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명에 따른 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 간 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 두충 추출물로부터 분리된 화합물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

또한 본 발명은 두충 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 간보호 및 간 질환의 개선 및 예방을 위한 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 건강기능식품은 비만증의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물 또는 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 침출차, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

따라서 또한, 본 발명은 간보호 및 간 질환의 예방 및 개선 효과를 갖는 두충 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 식품 또는 식품첨가제를 제공한다.

본 발명의 화합물을 첨가 가능한 식품 형태는 캔디류의 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 또는 건강보조 식품류인 식품 등을 포함한다.

본 발명의 화합물은 간보호 및 간 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물 또는 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물의 혼합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에 따른 두충 추출물 및 이로부터 분리된 화합물들은 간세포 내 지방의 축적을 억제하고, 중성지방과 콜레스테롤의 축적을 억제하여 세포를 보호할 뿐만 아니라, 간세포의 세포사를 억제하여 생존능을 증대시키고 리소소멀(lysosomal) 효소 활성 저하에 대한 보호 효과 등 각종 실험을 통하여 간세포 보호효과 및 지방간 억제효과와 같은 간질환 치료 및 예방효과를 나타냄을 확인함으로써, 간 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 팔미트산으로 인한 소포체 스트레스와 두충의 보호 효과를 나타낸 도이며 (도 1A는 팔미트산 500 μg/mL와 300 μg/mL를 시간 의존적으로 처리 후 세포 생존도를 측정한 결과이며, 도1B는 두충을 25 μg/mL, 50 μg/mL과 100 μg/mL를 농도 별로 처리한 결과이며, 도 1C는 팔미트산(300 μg/mL) 단독 처리시와 두충 25 μg/mL, 50 μg/mL과 100 μg/mL 농도별로 처리 세포 생존도를 측정한 결과이며, 도 1D는 팔미트산(300 μg/mL)와 두충 25 μg/mL, 50 μg/mL과 100 μg/mL 농도별로 소포체 스트레스 관련 단백질의 발현(GRP78, PERK, p-PERK, eIF2α, p-eIF2α, ATF6α, IRE1α, sXBP-1, CHOP)을 확인한 결과임);
도 2는 두충 처리 시 팔미트산으로 인한 지방합성 인자 억제 효과를 나타낸 도이며 (팔미트산(300 μg/mL)을 시간의존적으로 처리한 것과 팔미트산과 두충을 동시 처리한 후 지방 합성관련 항체의 발현(SREBP-1, FAS, PARP )을 확인한 결과임);
도 3은 두충 처리 시 팔미트산으로 인한 중성지방과 콜레스테롤 축적 억제효과를 나타낸 도이며, (도 3A은 oil red stain을 통해 팔미트산 (300 μg/mL) 단독처리시 간 세포 내 지방축적과 팔미트산과 두충을 동시 처리시 세포내 지방축척을 확인한 결과이며, 3B는 세포내 와 배지에서 아포 A와 아포 B의 분비를 확인한 결과이며, 도 3C는 팔미트산과 두충 동시 처리시 중성지방과 콜레스테롤 분비를 확인한 결과임);
도 4는 두충의 유효성분을 통한 세포 생존도 측정 및 소포체 스트레스 억제 효과를 나타낸 도이며, (도 4A는 팔미트산 (300μg/mL) 단독 처리시와 두충의 유효성분인 아우쿠빈 과, 게니포시드를 2.5μg/mL, 5.0μg/mL과 10μg/mL 팔미트산과 동시 처리 시 세포 생존도를 측정한 결과이며, 도 4B는 팔미트산 단독 처리시보다 유효성분을 동시 처리시 소포체 스트레스 관련 단백질의 발현(GRP78, PERK, p-PERK, eIF2α, p-eIF2α, ATF6α, IRE1α, sXBP-1, CHOP)을 확인한 결과임);
도 5는 두충의 유효성분 처리 시 팔미트산으로 인한 지방합성 인자 억제 효과를 나타낸 도이며, (팔미트산 (300μg/mL)을 시간의존적으로 처리한 것과 팔미트산과 두충의 유효성분인 아우쿠빈 (10μg/mL)과, 게니포시드 (10μg/mL)을 동시 처리한 후 시간의존적으로 지방 합성관련 항체의 발현(SREBP-1, FAS, PARP )을 확인한 결과임);
도 6은 두충의 유효성분 처리 시 팔미트산으로 인한 중성지방과 콜레스테롤의 축적과 분비억제효과를 나타낸 도이며, (도 6A는 oil red stain을 통해 두충의 유효성분인 아쿠빈과 게니포시드가 팔미트산 (300μg/mL)으로 인한 간 세포 내 지방축적을 억제함을 확인하였고 아쿠빈과 게니포시드를 팔미트산과 동시에 처리하게 되면 세포 내 지방의 축적을 억제하였고 세포 내로 apo B가팔미트산보다 배지 내로 더 많이 분비됨을 확인한 결과이며, 도 6B는 아쿠빈과 게니포시드가 팔미트산으로 인한 중성지방과 콜레스테롤의 축적을 억제하는 효과를 나타낸 결과임);
도 7은 두충으로 인한 라이소좀 활성을 나타낸 도이며, (도 7A는 Lysotracker형광(Olympus FV1000 confocal microscope)을 이용하여 세포 내 라이소좀의 활성을 확인한 결과이며, 도 7B는 팔미트산 단독 처리시, 두충과 두충의 유효성분이 아쿠빈과 게니포시드를 동시 처리한 후 Lysotracker의 형광의 활성도를 측정한 결과이고 도 7C는 팔미트산 단독 처리시, 두충과 두충의 유효성분이 아쿠빈과 게니포시드를 동시 처리한 후 라이소좀의 효소(β-Galactosidase, β-Glucuronidase, α-Mannosidase)의 활성도를 측정한 결과임);
도 8은 Bax (세포고사 유발 단백질)에 의한 간세포의 세포고사 및 두충의 세포고사 보호 효과를 나타낸 도이며, (도 8A는 Bax 발현 transfection 하여 세포 생존율 실험 결과이며, 도 8B는 Bax의 Lysosome과 Mitochondria로 이동을 확인한 결과이며 도 8C는 cytosol, lysosome과 mitochonria에서 Bax의 발현율을 확인한 결과임);
도 9은 Palmitate에 의한 간세포의 세포고사를 나타낸 도이며, (도 9A는 Palimitate 250, 500, 1000μM 농도에 따른 세포 생존율 실험 결과이며, 도 9B는 Palimitate 250, 500, 1000μM농도에 따른 Caspase-3 activity 결과임);
도 10은 팔미테이트(palmitate; 중성지방)로 인한 간세포 세포고사에 대한 두충의 보호 효과실험이며, (도 10A는 Palmitate를 처리하여 Oil Red O stain을 한 결과이며, 도 10B는 Palmitate(500μM)와 함께 두충을 농도별 25, 50, 100μg/ml로 처리시 두충의 생존능 실험 결과이며, 도 10C은 Palimtate(500μM)과 두충(100μg/ml)을 처리시 시간대 별 생존능을 확인한 결과이며; 도 10D는 Hochest stain을 통한 DNA fragmentation과 Caspse-3 activity를 확인한 결과이며, 도 10E는 Active caspase-3와 Actice caspasee-9의 발현율을 확인한 결과임);
도 11은 palmitate(중성지방)로 인한 BAX의 리소솜(lysosome)으로의 국소화(localization) 억제 효과실험이며, (도 11A는 Palmitate(500μM)과 두충(100μg/ml)을 처리하여 Bax, tBid의 발현을 Total lysate와 Lysosome에서 확인한 결과이며, 도 11B는 Palmitate(500μM)와 두충(100μg/ml)을 처리하여 lysosome과 Bax의 overlay를 확인한 결과임);
도 12은 palmitate(중성지방)로 인한 리소솜(lysosome)으로의 침투(Permeabilization) 억제 효과실험이며, (도 12A는 Palmitate(500μM)과 두충(100μg/ml)을 처리하여 Cathepsin B의 lysosome과 cytosol에서 발현율을 확인한 결과이며 도 12B는 배지에서 Cathepsin B의 활성을 측정한 결과이며 도 12C는 cathepsin B의 분포와 형태를 본 결과이며 도 12D는 LAMP-1과 Cathepsin B의 overlay를 확인한 결과임);
도 13은 palmitate(중성지방)로 인한 lysosomal enzyme 활성 저하에 대한 보호 효과실험이며, (도 13A는 Palmitate(500μM)과 두충(100μg/ml)을 처리하여 V-ATPase의 활성 측정 결과이며 도 13B는 Lysotracker를 이용하여 Lysosome의 양을 확인한 실험 결과이며도 13C는 Acridine Orange 염색을 통한 lysosome 내 pH 결과이며 도 13D는 lysosomal enzyme(α-Galactosidase, α-Mannosidase, Acid Phophatase) 활성 측정 결과임);
도 14은 간세포에서 농도 의존적인 두충 유효 성분(Geniposide & Aucubin)의 Palmitate(중성지방)로 인한 세포고사 억제 효과실험이며 (도 14A는 Palmitate(500μM)과 두충 유효성분(Geniposide & Aucubin)을 농도별 2.5 5, 10μg 처리시 세포 생존율 결과이며 도 14B는 Caspase-3 활성 측정 결과임);
도 15은 간세포에서 시간 의존적인 두충 유효 성분(Geniposide & Aucubin)의 세포사 억제 효과실험이며 (도 15A는 Palmitae(500μM)과 두충 유효성분(Geniposide & Aucubin) 처리시 시간대별 세포 생존율 결과이며 도 15B는 Hoechst 염색으로 DNA fragmentation 확인한 결과와 Caspase-3 활성을 측정한 결과이며 도 15C는 Active Caspase-3와 Active Caspase-9의 발현율 확인 결과임);
도 16은 두충 유효 성분(Gemiposide & Aucubin)의 팔미테이트(palmitate; 중성지방)로 인한 BAX의 리소솜(lysosome)으로의 침투(Permeabilization) 에 대한 억제 효과이며, (palmitate(500μM)과 두충 유효성분(Geniposide & Aucubin) 10μg/ml을 처리하여 도 16A는 lysoosme과 cytosol에서 Cathepsin B의 발현율을 확인한 결과이며 도 16B는 배지에서 Cathepsin B의 활성을 측정한 결과이며 도 16C는 LAMP-1과 Cathepsin B의 overlay를 확인한 결과임);
도 17은 간세포에서 두충 유효성분(Geniposide & Aucubin)의 Palmitate(중성지방)로 인한 lysosomal enzyme 활성 저하에 대한 보호 효과실험이다 (palmitate(500μM)과 두충 유효성분(Geniposide & Aucubin) 10μg/ml을 처리하여 도 17A은 V-ATPase의 활성을 측정한 결과이며 도 17B는 lysotracker를 통한 lysosome의 양을 측정한 결과이며 도 17C은 acridin ornage 염색을 통한 lysosome 내의 pH를 측정한 결과이며 도 17D는 lysosomal enzyme(α-Galactosidase, α-Mannosidase, Acid Phophatase)의 활성을 측정한 결과임).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 두충 메탄올 추출물

실험에 사용된 건조상태의 두충 추출물은 한국생명공학연구원 한국 식물추출물은행(한국식물추출물은행 http://extract.pdre.re.k, 대전)으로부터 구입하였다. 분쇄시료 30~40g을 HPLC 메탄올 용액 200mL으로 50℃에서 초음파분쇄기 (BRAONSON Ultrasonication corporation, ultrasonic cleaner, BRANSON)를 이용하여 추출하였고 이 추출액을 무형광 솜을 사용하여 여과시킨 후, 농축시켰다. 상기 시료를 동결건조시킨 후 건조물 21.18g을 수득하여 (이하, "E.olive"라 함) 하기 실험에 두충 추출물 21.18 mg/mL의 원액을 만든 후에 300μg/mL농도로 실험에 사용하였다.

실시예 2. 두충 추출물 분리 화합물 준비

두충의 유효활성 성분인 아우쿠빈(aucubin; 55561, sigma), 게니포시드(geniposide; SML0153, sigma)을 각각 구입하여 DMSO(D2650,sigma)에 원액 20 mg/mL를 만든 후 이 원액을 희석하여 10μg/mL농도로 실험에 사용하였다.

실험예 1. HepG2 세포에서의 지방간 억제 효능 측정

실시예의 시료의 HepG2 세포에서 지방간 억제 효능을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다. (Chih-Li Lin, Hsiu-Chen Huang, and Jen-Kun Lin, Theaflavins attenuate hepatic lipid accumulation through activating AMPK in human HepG2 cells. Journal of Lipid Research. 2007. 48: 2334343)

1.1 시약

팔미트산 (P0500, sigma), BSA (A7030,fatty acid free, sigma), oil red O stain (O9755 ,sigma), lysosome isolation kit (LYSISO1,sigma), RPMI Medium 1640 배지 (31800-022, gibco life technology)으로 각각 제공받았다.

1.2. 세포 배양

사람 간암 세포주 (HepG2 cell, human hepatoma cell line)인 HepG2 세포는 RPMI Medium 1640 (gibco life technology) 배지에 항생제 (15140, gibco)와 10% fetal bovine serum (10437028, gibco)을 첨가하여 배양하였다. 세포는 일정한 습도를 유지하는 37℃ 항온기에서 공기(95%)와 CO2 (5%)의 혼합기체를 공급하면서 배양하고, 2~3일 마다 계대 배양하였다. HepG2 세포는 팔미트산 처리하기 전 10% FBS가 첨가된 RPMI Medium 1640 (gibco life technologie) 배지에서 24시간 동안 배양하여 세포들을 안정화시킨 후 팔미트산(300μg/mL)을 12시간 처리하였고, 두충에 의한 소포체 스트레스 및 지방 합성 및 축적 억제를 확인하기 위해 팔미트산 300μg/mL에 두충추출물 25, 50, 100 μg/mL을 시 12시간 처리하였다. 또한 두충의 유효성분인 아쿠아빈 (aucubin), 게니포시드 (geniposide)을 2.5, 5, 10 ng/mL을 농도별로 처리하여 소포체 스트레스 및 지방 합성 및 축적억제를 확인하였고 0, 3, 6, 9, 12,18, 24 시간 의존적으로 처리하여 같은 실험을 진행하였다.

1.3.웨스턴 블롯(Western Blot) 분석

비알콜성 지방간 질환의 발병 시작은 중성지방 합성의 증가로 인해 세포 내 중성지방이 증가하는 특징을 가지는데 중성지방으로 인한 간의 지방산 합성은 지방상 생합성 경로에 중요한 효소인 fatty acid synthesis(FAS) 유전자의 전사활성이 증가하여 일어나며 이 과정에서 sterol regulation element protein(SREBPs)는 지방산과 콜레스테롤의 생합성 경로에 관련되는 효소를 활성화하여 간에서 지방산과 콜레스테롤 합성을 조절하는 중요한 전사인자이다. (Brown MS, Goldstein JL: The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell. 1997, 89: 331-340)

HepG2 세포에 RIPA Buffer 완충액 (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM Na₂EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na₃VO₄)에 단백질 분해효소 억제제(Protease Inhibitor Cocktail (100X), 5871, cell signaling)를 처리하여 단백질을 추출하였다. 각 시료를 완충액과 섞어 5분간 끓인 후에 SDS-PAGE (Bio Rad, Hercules, CA) 에서 전기 영동하여 단백질은 크기 별로 분리한 후에 차단 완충액(5 % skim milk, REF232100, BD)으로 차단하고 소포체 스트레스 관련 항체인 rabbit p-PERK(Thr 981), rabbit apoA1(FL-267), rabbit perk(H-300), mouse apoB(C1.4) mouse anti-eIF2α(D-3), mouse anti-GADD153/C/EBP homologous protein (CHOP, R-20), mouse anti-GRP78(76-E6), β-actin (C4) 모두 Santa Cruz로부터 구입하였고, rabbit anti-phospho-eIF2α, rabbit anti-phospho-IRE1α(S724)는 cell signalling에서 구입하여 1:1000의 비율로 희석하여 사용하였다. 지방합성 관련 항체인 SREBP-1(A-4), FAS(A-5), PARP(D-1), Histone H3(C-16)는 santa cruz로 구입하여 1:1000로 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응 시킨 후에, 이차 항체인 anti-rabbit(sc-2004), anti-mouse(sc-2005), anti-rat(sc-2006)는 santa cruz로 구입하여 상온에서 1시간 반응시켰다. ECL 용액 (ECL250-2, 대명사이언스)를 사용하여 단백질 발현을 확인하였다. 멤브레인(Membrane)을 액틴(actin) 항체와 다시 반응시켜 일정한 양의 단백질을 사용하였는지 확인하였다.

1.4.세포 내 중성지방 측정( Oil red stain )

간세포에서 지방의 저류는 세포활성을 약화시키며 결국 죽음에 이르게 하기 때문에 과다한 지방은 밖으로 분비되거나 분해되어 간세포에서 없어져야 간세포는 기능에 충실할 수 있다. (Angulo P, Nonalcoholic fatty liver disease. N Engl J Med 2002, 346(16):1221231, Clark JM, Diehl AM, Nonalcoholic fatty liver disease: an underrecognized cause of cryptogenic cirrhosis. JAMA. 2003: 289(22): 3000004)

간세포 내 중성지방 축적을 확인하기 위해 포르말린으로 20분간 고정시킨 후 oil red staining 용액으로 30분간 염색을 한 후에 현미경(OLYMPUS CKX31)으로 세포 내 중성지방 축적을 관찰하였다

1.5. 중성지방과 콜레스테롤 측정

세포와 배지를 시간대별로 모은 후 아산세트 중성지방 측정용 시약(AM-157S-K, 아산제약주식회사)과 콜레스테롤 측정용 시약(AM 202-K, 아산제약주식회사)을 사용하여 측정하였다

세포와 배지를 중성지방 및 콜레스테롤 측정용 시약에 넣고 37℃에 넣고 반응시킨 후 각 시료를 정량하여 94 well 판에 옮겨 ELISA 기기를 이용하여 측정하였다.

1.6. 라이소좀 활성 측정

간세포에 팔미트산을 처리하게 되면 소포체 스트레스로 인한 지방합성이 증가되고 세포 내 중성지방과 콜레스테롤의 축적으로 인해 라이소좀의 활성이 억제 되어 간세포가 죽게 된다. 하지만 두충이 팔미트산으로 인한 라이소좀의 활성의 억제를 보호하여 간 세포 내 지방의 축적이 일어나지 않게 함을 알아보기 위해 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 간 세포 내 라이소좀의 활성을 확인하였다.(Zheng Li, Michael Berk1, Thomas M. McIntyre1, Gregory J. Gores, and Ariel E.Feldstein, Lysosomal-Mitochondrial Axis in Free Fatty Acidnduced Hepatic LipotoxicityHepatology. 2008, 47(5): 1495503)

라이소좀을 분리시키기 위해 3X10⁸ 세포를 모은 후 1.5mL의 추출 용액을 넣은 후 세포를 부풀게 한다. Dounce glass(Wheaton Dounce Glass Tissue Grinder Homogenizer w/PTFE Pestle)를 이용하여 세포소기관을 터뜨려 분리시켰다. 그 후 1,000g에서 10분 동안 원심 분리 후에 상층액을 모아 다시 20,000g에서 20분 동안 원심 분리하였다. 그 후 라이소좀 분리를 위해 sucrose gradient 용액(OptiPrep Density Gradient Medium 60% (w/v) solution of iodixanol in water, D1556, Sucrose Solution, 2.3 M, S4189, sigma)을 사용하여 150,000g에서 4시간 동안 시료를 원심분리 한 후에 중간에 분리된 라이소좀을 파이펫을 사용하여 잘 분리시켰다. 라이소좀 효소 (β-Galactosidase, M1633, β-Glucuronidase, M9130, α-Mannosidase, M3657, sigma) 75 μL에 시료 25 μL를 넣고 37℃ 에서 30분 동안 배양 후에 여기(excitation) 파장 360nm와 방출(emission) 파장 410nm을 설정 후 형광분석기기(auto analyzer Alcyon 300Plus Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다.

1.7.실험 결과

본 실험 결과, 도 1A에서 나타낸 바와 같이, 팔미트산 500 μg/mL와 300 μg/mL를 시간 의존적으로 처리 후 세포 생존도를 측정한 결과, 24시간에서 팔미트산 500 μg/mL에서보다 300 μg/mL에서 세포가 더 많이 생존하는 것을 확인하였고 1B에서는 두충을 농도 별로 처리시 아무런 영향이 없음을 확인하였다. 1C에서 보듯이 팔미트산 단독 처리시 보다 두충을 동시 처리하게 되면 간세포가 더 많이 생존함을 확인하였다. 도 1D에서는 팔미트산 단독 처리시와 팔미트산과 두충 동시 처리시 소포체 스트레스 관련 단백질의 발현을 확인한 결과 팔미트산 단독 처리시 P-PERK, p-eIF2α, CHOP의 발현이 증가하지만 두충을 농도 의존적으로 처리하게 되면 이들 단백질의 발현이 감소하는 것을 확인하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 팔미트산(300 μg/mL)을 시간 의존적으로 처리한 것과 팔미트산과 두충을 동시 처리한 후 지방 합성관련 항체의 발현을 확인한 결과 팔미트산 단독 처리시 SREBP-1, FAS, PARP 항체가 시간 의존적으로 증가하지만 두충을 동시에 처리하게 되면 이들의 발현이 일정함을 확인하였다. 팔미트산으로 인한 지방 합성이 두충이 보호하는 것을 확인하였다.

도 3A에서는 oil red stain을 통해 팔미트산 (300 μg/mL)으로 인한 간 세포 내 지방축적 확인하였다. 두충을 팔미트산과 동시에 처리하게 되면 세포 내 지방의 축적을 억제하였고 세포 내 apo B가 배지 내로 분비됨을 확인하였다. 두충이 팔미트산으로 인한 중성지방과 콜레스테롤의 축적을 억제하여 세포를 보호함을 확인하였다.

도 4A에서 보듯이 팔미트산 (300 μg/mL) 단독 처리시와 두충의 유효성분인 아쿠빈(aucubin, 10 μg/mL) 및 게니포시드 (geniposide, 10 μg/mL) 를 팔미트산과 동시에 처리 후에 세포 생존도를 측정한 결과, 팔미트산 단독 처리시보다 유효성분을 동시 처리시 세포가 더 많이 생존함을 확인하였다. 도 4B에서는 팔미트산 단독 처리시와 유효성분 동시 처리시에 소포체 스트레스 관련 단백질의 발현을 확인한 결과, 팔미트산 단독 처리시 소포체 스트레스 관련 단백질인 p-PERK, p-eIF2α, CHOP의 발현이 증가하지만 두충의 유효성분인 아쿠아빈 (aucubin)과 게니포시드 (geniposide)를 팔미트산과 동시에 처리하게 되면 p-PERK, p-eIF2α, CHOP의 발현이 증가하지 않음을 확인하였다. 결국, 두충이 소포체 스트레스를 억제함을 확인하였다.

도 5에서 보듯이 팔미트산 (300 μg/mL)을 시간의존적으로 처리한 것과 팔미트산과 두충의 유효성분인 aucubin (10 μg/mL)과 geniposide (10 μg/mL)을 동시 처리한 후 지방 합성관련 항체의 발현을 확인한 결과 팔미트산 단독 처리시 SREBP-1, FAS, PARP 항체가 증가하지만 유효성분을 동시에 처리하게 되면 지방 합성 관련 항체의 발현이 증가하지 않음을 확인하였다.

도 6에서 나타난 바와 같이, 팔미트산(300 μg/mL)을 시간의존적으로 처리한 것과 팔미트산과 두충의 유효성분인 아우쿠빈(aucubin), 게니포시드(geniposide)을 동시 처리한 후 지방 합성관련 항체의 발현을 확인한 결과 팔미트산 단독 처리시 SREBP-1, FAS, PARP 항체가 시간의존적으로 증가하지만 아우쿠빈, 게니포시드을 동시에 처리하게 되면 이들의 발현이 일정함을 확인하였다. 팔미트산으로 인한 지방 합성이 두충의 유효성분 또한 보호하는 것을 확인하였다.

도 7A에서 나타낸 바와 같이, Lysotracker (DND-99; Molecular Probes, Eugene, OR)를 염색하여 현미경(Olympus FV1000 confocal microscope) 이용하여 세포 내 라이소좀의 활성을 확인한 결과, 팔미트산을 처리한 세포에서는 Lysotracker의 형광이 약한 반면 두충과 그의 유효성분을 처리한 세포에서는 Lysotracker의 형광이 증가함을 확인하였다. 또한 라이소좀 효소의 활성을 형광분석기기로 측정한 결과, β-Galactosidase, β-Glucuronidase, α-Mannosidase 모두 팔미트산을 처리하게 되면 감소하지만 두충 단독 처리시, 팔미트산과 두충 동시 처리하게 되면 라이소좀 효소의 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 두충의 유효성분인 아우쿠빈(aucubin, 10 μg/mL) 및 게니포시드 (geniposide, 10 μg/mL) 역시 라이소좀 효소의 활성이 팔미트산 단독 처리시보다 증가한 것을 확인하였다. 이로써 두충이 라이소좀의 활성을 증가시켜 지방의 합성 및 축적을 억제시킴을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 간세포 보호 효능 측정

실시예의 시료의 간세포 보호 효능을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다 (Bax inhibition protects against free fatty acid-induced lysosomal permeabilization,/ Ariel E. Feldstein1, Nathan W. Werneburg2, ZhengZheng Li1, Steven F. Bronk2, and Gregory J. Gores2 / Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 290: G1339 - G1346 , 2006. First published 16 February 2006 / doi: 10.1152/ajpgi.00509.2005)

시약

팔미트산 (P0500, sigma), BSA (A7030,fatty acid free, Sigma), Lipofectamine(11667-019, Invitrogen), oil red O stain (O9755 ,Sigma), lysosome isolation kit (LYSISO1,Sigma), RPMI Medium 1640 배지 (31800-022, GIBCO life technology)으로 각각 제공받았다.

세포배양 및 Transfection

사람 간암 세포 유래 hepatocyte cell line인 HepG2 cell은 American Type Culture Collection (St. Louis, MO,USA)에서 구입하였으며, RPMI에 10% FBS, 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2의 환경이 유지되는 incubator(Sanyo, Japan)에서 배양하였다. 실험과정의 모든 세포는80~90%의 confluence에서 실험하였고, 20 passages를 넘 기지 않은 세포만 사용하였다. HepG2세포를 0.5-2g의 GFP-BAX DNA를 공급자의 제시 방법(Invitrogen)에 따라 Lipofectamine(11667-019, Invitrogen)을 이용하여 transfection시켰다. Confocal microscopy는 inverted Zeiss laser-scanning confocal microscope(Zeiss LSM 510; Carl Zeiss)를 이용하여 수행하였다.

LysoTracker 염색과 MitoTracker 염색 및 형광면역염색.

HepG2 세포에 LysoTracker Red (DND-99; Molecular Probes, Eugene, OR) 그리고 MitoTracker Red (CMXRos; Molecular Probes, Eugene, OR)를 최종 농도가 50mM이 되도록 배지에 함유하여 30분동안 37℃에서 배양한다. Cell 이미지는 inverted Zeiss laser-scanning confocal microscope(Zeiss LSM 510; Carl Zeiss)를 이용하여 수행하였다.

리소솜 ( Lysosome ) 분리

라이소좀을 분리시키기 위해 3X10⁸ 세포를 모은 후 1.5mL의 추출 용액을 넣은 후 세포를 부풀게 한다. Dounce glass(Wheaton Dounce Glass Tissue Grinder Homogenizer w/PTFE Pestle)를 이용하여 세포소기관을 터뜨려 분리시켰다. 그 후 1,000g에서 10분 동안 원심 분리 후에 상층액을 모아 다시 20,000g에서 20분 동안 원심 분리하였다. 그 후 라이소좀 분리를 위해 lysosome isolation kit(LYSISO1,Sigma)에 포함되어 있는 sucrose gradient 용액(OptiPrep Density Gradient Medium 60% (w/v) solution of iodixanol in water, D1556, Sucrose Solution, 2.3 M, S4189, sigma)을 사용하여 150,000g에서 4시간 동안 시료를 원심분리 한 후에 중간에 분리된 라이소좀을 파이펫을 사용하여 잘 분리시켰다.

Hemocytometer 를 이용한 세포생존율의 측정

HepG2 cell을 24 well plate에 1×10⁵ cells/well로 분주하여 FBS가 10% 함유된 RPMI 배지로 24 h 동안 배양하고, 두충의 효능을 최대한으로 관찰하기 위해 FBS가 고갈된 배지로 12 h 동안 더 배양하였다. Palmitate는 0, 250, 500,1000μM 농도로 24hr 처리하였다. 두충은 0, 25, 50, 100μg/ml 농도로 24hr 처리하였다. 배지를 제거하고 0.05% trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 부유시켜서 phosphate buffered saline(PBS)를 각 well당 적정량을 첨가하여 세포를 모은 다음 2,000rpm으로 5분5간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 세포만 남긴 다음 다시 PBS를 1ml 첨가하여 잘 섞은 후 세포 부유액과 0.5% trypan blue(Gibco BRL)를 동량으로 섞은 후 2분간 처리한 후 도립현미경(Carl Zeiss,Germany)을 이용하여 살아있는 세포를 계수하였다. 세포의 생존율은 control cell에 대한백분율로 나타내었다. [i.e. cell viability (%control) = 100×(absorbance of treated sample)/(absorbance of control)].

Oil Red O 염색

간세포 내 중성지방 축적을 확인하기 위해 포르말린으로 20분간 고정시킨 후 PBS로 두 번 세척 후에 oil red O stain(O9755 ,Sigma) 용액으로 30분간 염색을 한 후에 도립현미경(Carl Zeiss, Germany)으로 세포 내 중성지방 축적을 관찰하였다

Caspase -3 Activity 분석

Apoptosis pathway에 관여하는 Caspase-3 activity를 측정하기 위하여 Caspase-3 activity assay Kit(APT165, KOMABIOTECH)를 이용하여 제조사가 제시하는 방법에 따라 수행하였다. 세포를 PBS로 세척 후 lysis buffer (10 mm Tris-HCl, 10 mm NaH₂PO₄/NaHPO₄, pH 7.5, 130 mm NaCl, 1% Triton X-100, and 10 mm sodium pyrophosphate)에 30분간 4℃에서 lysis 후 BCA방법으로 단백질을 정량한다. 30μg의 단백질을 20mm Ac-DEVD-AMC이 포함된 1ml Protease assay Buffer (20 mm HEPES, pH 7.5, 10% glycerol, 2 mm dithiothreitol)에 37℃에서 1시간 동안 반응시킨다. Ac-DEVD-pNA 기질이 Caspase-3에 의해 분해되어 pNA를 방출하는데 이를 Spectrofluorometry(Hitachi F-2500)으로 405nm 파장에서 측정하였다.

Western Blot

HepG2 세포에 RIPA Buffer 완충액 (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM Na₂EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4)에 단백질 분해효소 억제제(Protease Inhibitor Cocktail (100X), 5871, cell signaling)를 처리하여 단백질을 추출하였다. 각 시료를 완충액과 섞어 5분간 끓인 후에 SDS-PAGE (Bio Rad, Hercules, CA) 에서 전기 영동하여 단백질은 크기 별로 분리한 후에 차단 완충액(5 % skim milk, REF232100, BD)으로 차단하고 pro-apoptotic protein인 Bax(2772, cellsignaling), t-Bid(PC645, Merck Millipore) active caspase-3(9601, cell signaling), active caspase-9(9501, cell signaling), 소포체 표지자 단백질 PDI(2246, cell signaling), 미토콘드리아 표지자 단백질 COXⅡ(4842, cell signaling), 라이소좀 표지자 단백질 LAMP(3243, cell signaling)은 cell signaling에서 구입하였다. β-actin (C4) Santa Cruz, CA로부터 구입하였고, 1:1000의 비율로 희석하여 24시간 4℃에서 반응시켰다. 이차 항체인 anti-rabbit(sc-2004), anti-mouse(sc-2005), anti-rat(sc-2006)는 santa cruz로 구입하여 상온에서 1시간 반응시켰다. ECL 용액 (ECL250-2, 대명사이언스)를 사용하여 단백질 발현을 확인하였다.

Hoechst 염색

Hoechst는 유명한 cell-permeant nuclear counter stain으로 DNA와 결합하여 파란색 현광을 띈다. 세포고사가 일어날 때 핵이 쪼개지는 현상이 보이는데 이를 통해 세포고사를 시각적으로 확인할 수 있다. 세포를 24well plate에 1X10⁵ cells/well 분주하여 palmitate와 두충 추출물을 처리한 후 PBS를 세척 후에 배지에 1ml당 Hoechst(R37605, Molecular Probes) 2 방울씩 떨어뜨려서 25분간 배양 한 후 현미경으로 확인한다.

lysosome 효소 activity 측정

V-ATPase activity를 측정하기 위하여 acridine orange uptake assay를 수행하였다. Acitvation buffer는 6 μm acridine orange, 150 mm KCl, 2 mm MgCl2, and 10 mm Bis-Tris-propane를 포함하고 있다. 안정적인 spectrofluorometric baseline을 잡은 후 V-ATPase를 활성화 시키기 위하여 ATP(최종농도 1.4μm)와 2.5 μm valinomycin (pH 7.0) (membarne poteintial을 발생시키기 위해 lysosome 내와 외의 K+ 이동을 활성화시킴)을 첨가한다. V-ATPase에 의해 수소 이온이 들어가게 되면 acridine orange dye가 들어가게 된다. 이를 fluorescence system (Photon Technology International)를 이용하여 495nm 파장에서 활성화시키고 530nm 파장으로 측정한다.( Cox B. E., Griffin E. E., Ullery J. C., Jerome W. G.(2007) J. Lipid Res. 48, 10121021)

Acridine Orange uptake assay

Acridine Orange는 세포내 pH와 proton pump activity를 측정하는데 쓰인다. formaldehyde로 15분간 고정시킨 후 PBS로 세척하고 나서 Staining solution(Acridine Orange 6 mg/ml ,Citric acid 0.1 M ,Na2HPO4 0.2 M pH 2.6 )로 30-45초 배양한 후 inverted Zeiss laser-scanning confocal microscope(Zeiss LSM 510; Carl Zeiss)를 이용하여 이미지를 얻는다. (Trivedi N. S., Wang H. W., Nieminen A. L., Oleinick N. L., Izatt J. A.(2000) Photochem. Photobiol. 71, 634639)

Lysosomal enzyme activity 측정

간세포에 팔미트산을 처리하게 되면 소포체 스트레스로 인한 지방합성이 증가되고 세포 내 중성지방과 콜레스테롤의 축적으로 인해 라이소좀의 활성이 억제 되어 간세포가 죽게 된다. 하지만 두충이 팔미트산으로 인한 라이소좀의 활성의 억제를 보호하여 간 세포 내 지방의 축적이 일어나지 않게 함을 알아 보기 위해 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 간 세포 내 라이소좀의 활성을 확인하였다.(Zheng Li, Michael Berk1, Thomas M. McIntyre1, Gregory J. Gores, and Ariel E.Feldstein, Lysosomal-Mitochondrial Axis in Free Fatty Acidnduced Hepatic LipotoxicityHepatology. 2008, 47(5): 1495503)

라이소좀 효소 (α-Galactosidase, M1633, acid Phosphatase, M9130, α-Mannosidase, M3657, sigma) 75 μL에 시료 25 μL를 넣고 37℃ 에서 30분 동안 배양 후에 여기(excitation) 파장 360nm와 방출(emission) 파장 410nm을 설정 후 형광분석기기(auto analyzer Alcyon 300Plus Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다.

2.1. Bax (세포고사 유발 단백질)에 의한 간세포의 세포고사 및 두충의 세포고사 보호 효과실험

Bax(세포사 유발 단백질)에 의한 간세포의 세포고사 및 두충의 세포고사 보호효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다(Movement of Bax from the Cytosolto Mitochondria during Apoptosis/Keith G. Wolter,* Yi-Te Hsu,* Carolyn L. Smith,‡Amotz Nechushtan,* Xu-Guang Xi,*and Richard J. Youle*/The Journal of Cell Biology, Volume 139, Number 5, December 1, 1997 1281292)

먼저, 간세포에서 두충으로 인한 세포고사의 보호효과를 보고자 GFP-BAX를 Lipofectamine을 이용하여 형질 주입 한 후 세포 사진은 inverted Zeiss laser-scanning confocal microscope(Zeiss LSM 510; Carl Zeiss)이용하여 수행하였다.

본 실험 결과, 도 8 A에 나타난 바와 같이, GFP-BAX를 형질주입시킴에 따라 세포고사가 유발되었지만 두충을 동시에 처리하였을 때 세포고사를 억제되었으며, 도 8B B에서 GFP-BAX와 lysosome tracker 또는 mitochondria tracker로 염색하여 overlay하여 GFP-BAX의 localization을 확인한 결과, GFP-BAX 처리시 lysosome과 mitochondria로 BAX가 이동한 것을 관찰 할 수 있었으며, 두충을 동시 처리시에는 이동이 적어짐을 확인하였으며, 도 8C의 Western blot을 통해 이를 확인하였다.

2.2. palmitate (중성지방)로 인한 간세포 세포고사실험

팔미테이트(palmitate; 중성지방)로 인한 간세포 세포고사 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다(Saturated fatty acid induction of endoplasmic reticulum stress and apoptosis in human liver cells via the PERK/ATF4/CHOP signaling pathway/ Jie Cao, Dong-Ling Dai, Long Yao, Hui-Hong Yu, Bo Ning, Qin Zhang, Juan Chen, Wen-Hui Cheng, Wei Shen, Zhao-Xia Yang / Molecular and Cellular Biochemistry May 2012, Volume 364, Issue 1-2, pp 115-129 )

먼저, palmitate(중성지방)로 인한 간세포 세포고사를 보고자 palmitate를 농도 별 250, 500, 1000μM로 처리한 후 Trypan Blue 염색을 하여 hemocytometer이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 또한 palmitate를 위와 같이 처리하여 세포에서 Caspase-3 activity assay kit(APT165, KOMABIOTECH)를 이용하여 Caspase-3 activity를 colorimetic하게 측정하였다.

본 실험 결과, 도 9 A에 나타난 바와 같이, Palmitate 농도에 의존적으로 세포 생존능이 감소하였으며, 도 9 B에서 세포사멸사 신호전달 중 하나인 Caspase-3 activity가 Palmitate 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다.

2.3. palmitate (중성지방)로 인한 세포사 억제실험

팔미테이트(palmitate; 중성지방)로 인한 간세포 세포고사에 대한 두충의 억제 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다(Palmitic and linoleic acids induce ER stress and apoptosis in hepatoma cells/Yong Zhang1, Rongliang Xue1*, Zhenni Zhang1, Xia Yang2 and Hongyang Shi2 /Lipids in Health and Disease 2012, 11:1 )

먼저, palmitate(중성지방)로 인한 간세포 세포고사에 대한 억제효과를 확인하고자, palmitate(500μM)과 두충 추출물를 농도 별 25, 50, 100μg/ml로 처리하였다. Oil red O 여색을 통해 Palmitate가 lipid droplet을 형성하여 세포에 작용하는지 확인 한 후, Trypan Blue 염색을 하여 세포 생존율이 측정하였다. palmitate(500μM)와 두충 추출물(100μg/ml)을 처리하여 시간 별로 Trypan Blue 염색과 Hoechst 염색, Caspase-3 Activity를 통해 세포고사를 확인하였다.

본 실험 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 도 10A에서 Palmitate를 처리하여 Oil Red O stain을 한 결과 lipid droplet형성 확인하였고 도 10B에서 Palmitate(500μM)와 함께 두충을 농도별 25, 50, 100μg/ml로 처리한 결과 두충의 농도 의존적으로 생존능이 증가하였고 도 10C에서 Palimtate(500μM)과 두충(100μg/ml)을 처리하여 시간 의존적으로 생존능을 확인한 결과, 두충 동시처리군이 높았으며, 도 10D에서 Hochest stain을 통해 DNA fragmentation 확인 결과, 두충 동시 처리 군에서 DNA fragmentation 억제 효과를 보였으며, Caspase-3 activity를 시간 의존적으로 확인한 결과, 두충 동시 처리군이 지속적으로 활성이 억제되어 있으며, 도 10E에서 Active Caspase-3와 caspase-9을 western blot을 통해 확인한 결과, 시간 의존적으로 두충 동시 처리군이 Active Caspse-3와 caspase-9의 발현율이 억제되어 있음을 알 수 있었다.

2.4. palmitate (중성지방)로 인한 BAX 의 리소솜(lysosome)으로의 국소화( localization ) 억제 효과실험

팔미테이트(palmitate; 중성지방)로 인한 BAX의 리소솜(lysosome)으로의 국소화(localization)에 대한 억제 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다.(Lysosomal membrane permeabilization during apoptosis--involvement of Bax/ KK, Johansson AC, Johansson U, Heimlich G, Roberg K, Wang NS, JJM, Ollinger K./ Int J Exp Pathol. 2005 Oct;86(5):309-21.)

먼저, 팔미테이트(palmitate; 중성지방)로 인한 BAX의 리소솜(lysosome)으로의 국소화(localization)에 대한 억제 효과를 확인하고자, palmitate(500μM)과 두충 추출물을 100μg/ml로 처리하였다. Palmitate와 두충 추출물을 처리하여 pro-apoptotic 단백질인 Bax와 tBid의 발현을 Cytosol과 Lysosome 분획물에서 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. 또한 Bax의 lysosome으로의 이동을 확인하고자 lysosome 표지 단백질인 LAMP-1과 Bax를 면역현광염색하여 이미지는 inverted Zeiss laser-scanning confocal microscope(Zeiss LSM 510; Carl Zeiss)를 이용하여 얻었다.

본 실험 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 도11A에서 Palmitate와 두충 추출물을 처리하여 pro-apoptotic 단백질인 Bax와 tBid의 발현을 Cell lyste total과 Lysosome 분획물에서 확인하였을 때 Palmitate 단독 처리시 Cell total lysate에서 시간 별로 감소하는 반면에 lysosome 분획물에서 증가하며, palmitate와 두충 추출물 동시 처리군에서는 lysososme에서의 Bax와 tBid의 발현이 Palmitate 단독군에 비해 적다. 11 B에서 Palmitate(500μM)와 두충 추출물을 함께 처리하여 LAMP-1과 Bax protein을 면역현광염색하였을 때, Palmitate 처리시에는 overlay가 높은 반면 두충 추출물 동시 처리시에는 overlay가 단독 처리 군보다 낮았다.

2.5. palmitate (중성지방)로 인한 리소솜(lysosome)으로의 침투( Permeabilization ) 억제 효과실험

팔미테이트(palmitate; 중성지방)로 인한 BAX의 리소솜 (lysosome)으로의 침투(Permeabilization)에 대한 억제 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다. (Lysosomal membrane permeabilization in cell death./P Boya, G Kroemer /Oncogene. 2008 Nov 13;27 (50):6434-51 )

먼저, 팔미테이트(palmitate; 중성지방)로 인한 BAX의 리소솜(lysosome)으로의 침투(Permeabilization)에 대한 억제 효과를 확인하고자, palmitate(500μM)과 두충 추출물을 100μg/ml로 처리하였다. lysosome과 cytosol 분획을 하여 cathepsin B의 western bot을 통해 catehpsin B의 permeabililzaion을 확인하였다. 또한 배지에서 Catehpsin B activity(K140-100, BioVision)를 측정하였다. cathepsni B의 세포 내 분포 형태를 알기위하여 Cathepsin B를 면역형광염색하여 이미지를 얻었다. cathepsin B가 lysosome 내에 존재하는지 확인하기 위하여 lysosome 표적 단백질(LAMP-1)과 cathepsin B를 면역형광염색하여 overlay를 확인하였다.

본 실험 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, lysosomal protein인 Cathpesin B의 localization을 확인하였고, 도 12 A에서 Palmitate와 두충을 처리하여 lysosome과 cytosol을 분리하여 cathepsin B의 발현율을 확인한 결과, Palmitate 처리시, lysosome에 위치하던 cathepsin B가 cytosol에 발현율이 높아지지만 두충을 동시 처리한 결과 lysosome에 지속적으로 위치하고 있음을 확인하였고, 도 12B에서 Palmitate(500μM)와 두충을 처리하여 Medium에서 Cathepsin B의 activity를 확인한 결과, 두충 동시처리 군이 시간 의존적으로 Cathepsin B의 활성이 낮았으며, 도 12C에서 Palmitate(500μM)과 두충(100μg/ml)을 처리하여 Cathepsin B의 발현율을 면역 형과 염색을 통하여 확인한 결과, 대조군에서 cathepsin B가 Dot형태로 있지만 Palmitate 처리시에서 Diffuse되는 결향을 보이고 두충을 동시 처리하면 이런 효과가 억제되었으며, 도 12 D에서 Palmitate와 두충을 처리하여 lysosome marker protein(LAMP-1)과 Cathepsin B를 면역 형광 염색하여 overlay를 확인한 결과 두충 동시 처리군에서 overlay율이 유지되고 있음을 확인하였다.

2.6. 팔미테이트 (중성지방)로 인한 lysosomal enzyme 활성 저하에 대한 보호 효과실험

팔미테이트(palmitate; 중성지방)로 인한 lysosomal enzyme 활성 저하에 대한 보호 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다(Enhanced lysosomal activity is involved in Bax inhibitor-1-induced regulation of the endoplasmic reticulum (ER) stress response and cell death against ER stress: involvement of vacuolar H+-ATPase (V-ATPase)./Lee GH, Kim DS, Kim HT, Lee JW, Chung CH, Ahn T, Lim JM, Kim IK, Chae HJ, Kim HR./J Biol Chem. 2011 Jul 15;286(28):24743-53. Epub 2011 May 17.)

먼저, 팔미테이트(palmitate; 중성지방)로 인한 lysosomal enzyme 활성 저하에 대한 보호 효과 효과를 확인하고자, palmitate(500μM)과 두충 추출물을 100μg/ml로 처리하였다.

본 실험 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 도 13 A에서 Palmitate와 두충을 처리하여 V-ATPase의 활성을 측정한 결과 palimate에 의해 저하된 활성이 두충 동시 처리군에서 증가되었고, 도 13 B에서 Palmitate(500μM)와 두충을 처리하여 Lysosome의 intensity를 확인한 결과, palmitate 처리 군에서 intensity가 저하됨에 반해 두충 동시처리 군에서 대조군과 비슷한 intensity를 유지하고 있으며, 도 13C에서 Palmitate(500μM)과 두충(100μg/ml)을 처리하여 lysosome의 Acidic pH(red)를 Acridine orange stain을 통해 측정한 결과, palmitate 처리 군에서는 pH가 Alkalic(Green)해진 반면 에 두충 동시 처리 군에서는 Acidic pH를 유지하고 있었으며, 13 D에서 Palmitate와 두충을 처리하여 lysosomal enzyme 활성을 측정한 결과, α-Galactosidase, α-Mannosidase 와 Acid phosphatase 활성이 두충 동시처리 군에서 높음을 확인하였다.

2.7.간세포에서 농도 의존적인 두충 유효 성분( Gemiposide & Aucubin )의 Palmitate(중성지방)로 인한 세포고사 억제 효과실험

간세포에서 농도 의존적인 두충 유효 성분(Geniposide & Aucubin)의 Palmitate(중성지방)로 인한 세포고사 억제효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다.(Saturated fatty acid induction of endoplasmic reticulum stress and apoptosis in human liver cells via the PERK/ATF4/CHOP signaling pathway/ Jie Cao, Dong-Ling Dai, Long Yao, Hui-Hong Yu, Bo Ning, Qin Zhang, Juan Chen, Wen-Hui Cheng, Wei Shen, Zhao-Xia Yang / Molecular and Cellular Biochemistry May 2012, Volume 364, Issue 1-2, pp 115-129)

먼저, 간세포에서 농도 의존적인 두충 유효 성분(Gemiposide & Aucubin)의 Palmitate(중성지방)로 인한 세포고사 억제 효과를 확인하고자, palmitate(500μM)과 두충 유효성분(Geniposide & Aucubin)을 농도 별 2.5, 5, 10μg/ml로 24시간 처리한 후 Trypan Blue 염색을 통해 세포 생존율을 측정하고 Caspase-3 Activity를 측정하였다. 또한 western Blot으로 세포고사 신호 전달 단백질인 active caspase-3와 caspase-9의 발현율을 확인하였다.

본 실험 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 도 14 A에서 Palmitate와 유효성분을 농도 의존적(2.5, 5, 10μg/ml)로 처리한 결과 농도 의존적으로 세포 생존능이 증가하였고 도 14 B에서 세포사 신호전달 중 하나인 Casepase-3 활성을 측정하기 위해 Palmitate와 유효성분을 농도 의존적(2.5, 5, 10μg/ml)로 처리한 결과, 농도 의존적으로 Caspase-3의 activity가 감소하였고 도 14 C에서 Active Caspase-3와 caspase-9을 western blot을 통해 발현율을 확인한 결과, 농도 의존적으로 유효성분 동시 처리군이 Active Caspse-3와 caspase-9의 발현율이 억제되어 있음을 확인하였다.

2.8.간세포에서 시간 의존적인 두충 유효 성분( Geniposide & Aucubin )의 세포사 억제 효과실험

간세포에서 시간 의존적인 두충 유효 성분(Geniposide & Aucubin)의 세포사 억제효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다.( BD Bioscience (2009). Techniques for Immune Function Analysis (2 ed.). Becton, Dickinson and Company.)

먼저, 간세포에서 시간 의존적인 두충 유효 성분(Geniposide & Aucubin)의 세포사 억제효과를 확인하고자, palmitate(500μM)과 두충 유효성분(Geniposide & Aucubun)을 10μg/ml 단위로 시간대 별로 처리하여 Trypan Blue 염색을 통해 세포 생존율을 측정하였고 Hoechst 염색을 통해 DNA fragmentation을 보았으며 Caspase-3 Activity를 측정하였다. 또한 세포고사 신호 전달 단백질인 Active Caspase-3와 caspase-9의 발현율을 western blot을 통해 확인하였다.

본 실험 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 도 15 A 에서 Palmitate와 두충 유효성분(Geniposide & Aucubin)를 처리하여 생존능을 확인한 결과 유효성분 동시 처리군에서 Palmitate 단독 처리 군보다 생존능이 시간 의존적으로 높았으며, 도 15 B 에서 Palmitate(500μM)와 두충 유효 성분을 처리하여 Hoechst stain을 통해 DNA　fragmentation을 확인한 결과, Palmitate 처리 군에서 DNA fagmentation이 관찰 되었지만 유효성분 동시 처리군에서는 DNA fragmentation이 관찰 되지 않았으며, Caspase-3 activity를 시간 의존적으로 확인 결과, 두충 유효성분 동시 처리군이 지속적으로 activity사 억제되어 있었으며, 도 15 C 에서 Active Caspase-3와 caspase-9을 western blot을 통해 발현율을 확인한 결과, 시간 의존적으로 두충 유효성분 동시 처리군이 Active Caspase-3와 caspase-9의 발현율이 억제되어 있음을 확인하였다.

2.9.간세포에서 리소솜(lysosome)으로의 침투( Permeabilization ) 억제 효과실험

팔미테이트(palmitate; 중성지방)로 인한 BAX의 리소솜(lysosome)으로의 침투(Permeabilization) 에 대한 억제 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다 (Direct measurement of cathepsin B activity in the cytosol of apoptotic cells by an activity-based probe./ Pratt MR, Sekedat MD, Chiang KP, Muir TW./ Chem Biol. 2009 Sep 25;16(9):1001-12.)

먼저, 두충 유효 성분(Geniposide & Aucubin)의 팔미테이트(palmitate; 중성지방)로 인한 BAX의 리소솜(lysosome)으로의 침투( Permeabilization ) 에 대한 억제 효과를 확인하고자, palmitate(500μM)과 두충 유효성분(Geniposide & Aucubin) 10μg/ml을 처리하였다. lysosome과 cytosol을 분리하여 시간 별로 Cathpesin B의 발현율을 western blot을 통해 확인하여 Bax의 lysosome으로의 침투로 인한 cathepsin B의 이동을 확인하였고, 배지에서 Cathepsin B의 activity를 측정하였다. Cathepsin B의 이동을 LAMP-1과 Cathepsin B 면역형광염색을 통하여 ovelay시킴으로써 cathepsin B의 세포내 분포와 위치를 확인하였다.

본 실험 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, 도 16A)에서 Palmitate와 두충 유효성분(Geniposide & Aucubin)을 처리하여 lysosome과 cytosol을 분리하여 cathepsin B의 발현율을 Western Blot으로 확인한 결과, Palmiate 처리시, lysosome에 위치하던 cathepsin B가 시간이 지남에 따라 cytosol에 발현율이 높아지지만 두충 유효성분을 동시 처리한 결과 lysosome에 지속적으로 위치하고 있었으며, 도 16 B에서 Palmitate(500μM)와 두충 유효성분을 처리하여 Medium에서 Cathepsin B의 activity를 확인한 결과, 두충 유효성분 동시 처리 군이 시간 의존적으로 Cathepsin B의 활성이 낮았으며, 도 16 C 에서 Palmitate와 두충 유효성분을 처리하여 lysosome marker protein(LAMP-1)과 Cathepsin B를 면역 형광 염색하여 overlay를 확인한 결과, 두충 유효성분 동시 처리군에서 overlay율이 유지되고 있음을 확인하였다.

2.9.간세포에서 두충 유효성분의 Palmitate (중성지방)로 인한 lysosomal enzyme 활성 저하에 대한 보호 효과실험

간세포에서 두충 유효성분의 Palmitate(중성지방)로 인한 lysosomal enzyme 활성 저하에 대한 보호 효과실험를 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험을 수행하였다(CHANGES IN PANCREATIC LYSOSOMAL ENZYMES ACTIVITY AS THE POTENTIAL FACTORS LEADING TO DIABETIC ENTEROPATHY/ R. MACIEJEWSKI1, K. BURSKI1, J. BAJ1, B. MADEJ1, F. BURDAN/JOURNAL OF PHYSIOLOGY AND PHARMACOLOGY 2001, 52, 4, 823-834)

먼저, 간세포에서 두충 유효성분의 Palmitate(중성지방)로 인한 lysosomal enzyme 활성 저하에 대한 보호 효과를 확인하고자, palmitate(500μM)과 두충 유효물질(Geniposide & Aucubin) 10μg/ml을 처리하였다. Acridine Uptake assay를 이용하여 V-ATpase의 활성을 측정하였고 LysoTracker 염색을 통하여 lysosome의 양적 차이를 확인하였다. Acridine Orange 염색을 통해 lysosome 내의 pH를 보았다. 또한 Lysosomal enzyme (α-Galactosidase, α-Mannosidase 와 Acid phosphatase) 활성을 시간대별로 측정하였다.

본 실험 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 도 17A에서 Palmitate와 두충 유효성분을 처리하여 lysosome을 분리하여 V-ATPase의 활성을 측정한 결과 palmitate에 의해 저하된 활성이 두충 유효성분 동시 처리군에서 증가되었으며 도 17B에서 Palmitate(500μM)와 두충 유효성분을 처리하여 Lysosome의 intensity를 확인한 결과, palmitate 처리 군에서 intensity가 저하됨에 반해 두충 유효성분 동시처리 군에서 대조군과 비슷한 intensity를 유지하고 있었으며, 도 17 C에서 Palmitate(500μM)과 두충 유효성분을 처리하여 lysosome의 Acidic pH(red)를 Acridine orange stain을 통해 측정한 결과 palmitate 처리 군에서는 pH가 Alkalic(Green)해진 반면 두충 유효성분 동시 처리 군에서는 Acidic pH를 유지하고 있음. 그림 D에서 Palmitate와 두충 유효성분을 처리하여 lysosomal enzyme 활성을 측정한 결과 α-Galactosidase, α-Mannosidase 와 Acid phosphatase 활성이 두충 유효성분 동시처리 군에서 높음을 확인하였다.

하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

< 제제예 1> 산제의 제조

E.olive --------------------------------------- 20 mg

유당 ------------------------------------------ 100 mg

탈크 ------------------------------------------ 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

<제제예 2> 정제의 제조

E.olive --------------------------------------- 10 mg

옥수수전분 ------------------------------------ 100 mg

유당 ------------------------------------------ 100 mg

스테아린산 마그네슘 --------------------------- 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

< 제제예 3> 캡슐제의 제조

E.olive --------------------------------------- 10 mg

결정성 셀룰로오스 ----------------------------- 3 mg

락토오스 -------------------------------------- 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 ------------------------- 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

< 제제예 4> 주사제의 제조

아우쿠빈 --------------------------------------- 10 mg

만니톨 ----------------------------------------- 180 mg

주사용 멸균 증류수 ----------------------------- 2974 mg

Na₂HPO_{4 ,}12H₂O ------------------------------------ 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

< 제제예 5> 액제의 제조

E.olive --------------------------------------- 20 mg

이성화당 -------------------------------------- 10 g

만니톨 ---------------------------------------- 5 g

정제수 ---------------------------------------- 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

< 제제예 6> 건강 식품의 제조

E.olive --------------------------------------- 1000 ㎎

비타민 혼합물 --------------------------------- 적량

비타민 A 아세테이트 --------------------------- 70 ㎍

비타민 E -------------------------------------- 1.0 ㎎

비타민 B1 ------------------------------------- 0.13 ㎎

비타민 B2 ------------------------------------- 0.15 ㎎

비타민 B6 ------------------------------------- 0.5 ㎎

비타민 B12 ------------------------------------ 0.2 ㎍

비타민 C -------------------------------------- 10 ㎎

비오틴 ---------------------------------------- 10 ㎍

니코틴산아미드 -------------------------------- 1.7 ㎎

엽산 ------------------------------------------ 50 ㎍

판토텐산 칼슘 --------------------------------- 0.5 ㎎

무기질 혼합물 --------------------------------- 적량

황산제1철 ------------------------------------- 1.75 ㎎

산화아연 -------------------------------------- 0.82 ㎎

탄산마그네슘 ---------------------------------- 25.3 ㎎

제1인산칼륨 ----------------------------------- 15 ㎎

제2인산칼슘 ----------------------------------- 55 ㎎

구연산칼륨 ------------------------------------ 90 ㎎

탄산칼슘 -------------------------------------- 100 ㎎

염화마그네슘 ---------------------------------- 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

< 제제예 7> 건강 음료의 제조

게니포시드 --------------------------------------- 1000 ㎎

구연산 ------------------------------------------- 1000 ㎎

올리고당 ----------------------------------------- 100 g

매실농축액 --------------------------------------- 2 g

타우린 ------------------------------------------- 1 g

정제수 ------------------------------------------- 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (7)

1. 두충 추출물로부터 분리된 아우쿠빈 또는 게니포시드 화합물을 유효성분으로 함유하는 간보호 및 간 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물에 가용한 추출물임을 특징으로 하는 약학 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 간 질환은 급성간염, 만성간염, 지방간증, 간경화증, 간섬유화증, 및 간암, 약물에 의한 간염임을 특징으로 하는 약학 조성물.
4. 두충 추출물로부터 분리된 아우쿠빈 또는 게니포시드 화합물을 유효성분으로 함유하는 간보호 및 간 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
5. 제 4항에 있어서, 상기 건강기능식품 형태는 분말, 과립, 정제, 캡슐, 음료, 껌, 비타민 복합제 또는 건강보조식품인 건강기능식품.
6. 간보호 및 간 질환의 예방 및 개선 효과를 갖는 두충 추출물로부터 분리된 아우쿠빈 또는 게니포시드 화합물을 유효성분으로 함유하는 식품.
7. 간보호 및 간 질환의 예방 및 개선 효과를 갖는 두충 추출물로부터 분리된 아우쿠빈 또는 게니포시드 화합물을 유효성분으로 함유하는 식품첨가제.

Images