KR100760385B1 - 독활 추출물을 포함하는 관절 연골 손상 및 관절염의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 독활 (Aralia cordata THUNB.) 추출물을 함유하는 관절 연골 손상 또는 관절염의 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 독활 추출물은 시험관 내 실험에서 연골 구성물질의 분해 억제 및 발현 촉진, 콜라겐 분해효소의 활성 및 발현 억제, 세포 고사 억제 활성을 나타내며, 관절염 동물 모델을 이용한 생체 내 실험에서 연골 조직 회복에 의한 연골 보호 및 염증 유발 물질 억제 활성을 나타내고, 염증 및 통증 유발 동물에서 소염 및 진통 활성이 탁월하므로, 관절 연골 손상 또는 관절염의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품에 이용될 수 있다.

독활, 관절 연골 손상, 관절염, 연골 보호, 진통, 소염, 약학조성물, 건강기능식품

Description

독활 추출물을 포함하는 관절 연골 손상 및 관절염의 예방 및 치료용 조성물 {Composition comprising the extract of Aralia cordata THUNB. for preventing and treating articular cartilage injury and arthritis}

도 1은 인터루킨-1 (IL-1)으로 염증을 유발한 사람 (a) 및 토끼 (b)의 관절 연골 조직 배양 시 본 발명의 독활 추출물을 처리한 후 배양액 내 GAG (Glycosaminoglycan) 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이고,

도 2는 인터루킨-1 (IL-1)으로 염증을 유발한 사람 (a) 및 토끼 (b)의 관절 연골 조직 배양 시 본 발명의 독활 추출물을 처리한 후 배양액 내 2형 콜라겐 (type Ⅱ Collagen)의 농도를 측정한 결과를 나타낸 도이고,

도 3은 인터루킨-1 (IL-1)으로 염증을 유발한 토끼의 관절 연골 세포 배양 시 본 발명의 독활 추출물을 처리한 후 추출한 RNA를 사용하여 PG 및 ColⅡ 유전자의 발현 정도를 확인한 도이며,

도 4는 인터루킨-1 (IL-1)으로 염증을 유발한 사람 (a) 및 토끼 (b)의 관절 연골 조직 배양 시 본 발명의 독활 추출물을 처리한 후 배양액 내 MMP-3 및 MMP-13의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이고,

도 5는 인터루킨-1 (IL-1)으로 염증을 유발한 토끼의 관절 연골 세포 배양 시 본 발명의 독활 추출물을 처리한 후 추출한 RNA를 사용하여 콜라겐 분해효소 (MMP-1, MMP-3 및 MMP-13) 유전자의 발현 정도를 확인한 도이며,

도 6은 인터루킨-1 (IL-1)으로 염증을 유발한 토끼의 연골 세포 배양 시 본 발명의 독활 추출물 처리에 따른 세포독성을 확인한 도이고,

도 7은 관절염 (CIA; collagenase-induced arthritis) 동물모델의 관절 연골 조직 중 정상연골 (a,d), 0.5% CMC 처리군 (b,e) 및 독활 추출물 처리군 (c,f)의 대퇴과 (Femur chondyle, a-c) 및 경골고원부 (Tibia plateau, d-f)를 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하여 본 발명의 독활 추출물의 연골조직 회복활성을 확인한 도이고,

도 8은 CIA 동물모델의 관절 연골조직 중 정상연골 (a,d), 0.5% CMC 처리군 (b,e) 및 독활 추출물 처리군 (c,f)의 대퇴과 (Femur chondyle, a-c) 및 경골고원부 (Tibia plateau, d-f)를 사프라닌 O로 염색하여 본 발명의 독활 추출물의 연골 조직 회복활성을 확인한 도이고,

도 9는 CIA 동물모델의 관절 연골 조직 중 정상연골 (a,d), 0.5% CMC 처리군 (b,e) 및 독활 추출물 처리군 (c,f)의 대퇴과 (Femur chondyle, a-c) 및 경골고원부 (Tibia plateau, d-f)를 트리크롬으로 염색하여 본 발명의 독활 추출물의 연골 조직 회복활성을 나타낸 도이고,

도 10은 CIA 동물모델의 관절 연골 조직 중 0.5% CMC 처리군 (a,c) 및 독활 추출물 처리군 (b,d)의 대퇴과 (Femur chondyle, a & c) 및 경골고원부 (Tibia plateau, b & d)의 시클로옥시게나제-2 (COX-2)의 발현 정도를 면역염색을 통해 확 인한 도이고,

도 11은 CIA 동물모델에 본 발명의 독활 추출물을 처리하였을 때 혈청 내 존재하는 COX-2의 선택적 억제 활성이 있음을 나타낸 그래프이고,

도 12는 CIA 동물모델에 본 발명의 독활 추출물을 처리하였을 때 혈청 내 존재하는 프로스타글란딘 E2 (prostagladin E2) 억제 활성이 있음을 나타낸 그래프이며,

도 13은 인터루킨-1 (IL-1)으로 염증을 유발한 관절 연골 세포 배양 시 본 발명의 독활 추출물을 처리한 후 유세포분석을 통한 세포주기 분석 결과를 나타낸 도이고,

도 14는 인터루킨-1 (IL-1)으로 염증을 유발한 관절 연골 세포 배양 시 본 발명의 독활 추출물을 처리한 후 아넥신 V (Annexin V) 염색을 통한 유세포분석 결과를 나타낸 도이고,

도 15는 인터루킨-1 (IL-1)으로 염증을 유발한 관절 연골 세포 배양 시 본 발명의 독활 추출물 처리가 카스파제-3 (caspase-3) 억제 활성에 의한 세포고사억제 효과를 나타냄을 확인한 도이고,

도 16은 CIA 동물모델의 관절 연골조직 중 0.5% CMC 처리군 (a,c) 및 독활 추출물 처리군 (b,d)의 대퇴과 (Femur chondyle, a & c) 및 경골고원부 (Tibia plateau, b & d)의 카스파제-3 (cleaved caspase-3)의 발현 정도를 면역염색을 통해 확인한 도이다.

본 발명은 연골 보호 효과, 항염, 소염 및 진통 효과를 갖는 독활 추출물을 함유하는 관절 연골 손상 또는 관절염의 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.

한의학에서는 관절염을 비증 (痺症)으로 본다. 비증 (痺症)의 증세는 주로 통증이며, 그 통증은 기혈(氣血) 순환의 문제로 야기될 수 있다. 주된 외적 요인은 풍(風), 한(寒), 습(濕), 열(熱) 등으로 이러한 원인들에 의해 관절, 근육 등의 기혈 순환 장애가 초래되어 통증이 나타나며, 심하면 관절의 운동범위의 제한이 나타난다. 내부적으로는 장부(臟腑) 중 간(肝)과 신(腎)에 주된 원인이 있는데, 근(筋)은 간(肝)에 속하며 간이 혈을 관장하여(肝藏血) 근골 관절을 자양(滋養)함으로써 어혈(瘀血) 등의 병리적 산물을 예방할 수 있다. 또한 신(腎)은 뼈를 관장하고(腎主骨) 인체의 정기(精氣)를 조절하며, 이 정(精)은 골수에 영양을 공급하고 골격을 자윤(滋潤)하는 기능을 한다. 따라서 관절의 이상은 간과 신의 기능과 밀접한 관련이 있어, 한의학에서 골관절염의 예방 및 치료는 이러한 원리를 바탕으로 하여 보다 근본적인 치료를 목표로 하고 있다.

대표적 골관절 질환 중 하나인 퇴행성관절염은 만성 관절염이다. 난치성 질환으로서 현재 임상에서 사용되고 있는 항염증제 위주의 약물로는 완치가 어렵다. 또한 소화장애, 위장관 장애 및 신장기능 감소 등과 같은 전신적인 부작용을 유발하며, 환자의 연령이 증가할수록 부작용 발생의 빈도가 높아지므로, 노년층에서 발 병율이 높은 골관절 질환의 치료시 장기간에 걸친 약물의 전신투여는 많은 문제점을 야기할 수 있다. 따라서 인구의 노령화에 비례하여 증가하는 퇴행성관절염에 대해 항염증작용 등의 대증요법 (symptomatic treatment)적 접근보다는 좀더 적극적인 증상의 호전 및 예방을 위한 항염, 연골의 보호 및 재생효과를 목표로 한 신약의 개발이 그 어느 때보다 절실하다. 해외에서도 최근에는 항염증작용의 약물개발에서 한걸음 더 나아가 관절 연골보호, 연골분해방지 및 재생촉진에 관심을 두고 관절조직분해효소 저해제, 자유라디칼 소거제 (SOD 등 활성산소류 제거효소), 관절조직구성성분인 콘드로이친 (chondroitin) 또는 글루코사민 (glucosamine) 등의 장기 복용에 의한 보호 요법 (conservation therapy) 관련 연구 등이 활발히 진행되고 있다 (Badger AM et al., J. Pharmacol . Exp . Ther ., 290, pp587-593, 1999; Choi JH et al., Osteoarthritis Cartilage, 10(6), pp471-478, 2002).

생체 내 관절염의 발생원인으로서는 다양한 생화학적인 체제 (mechanism)가 관여하며, 특히 산화질소 (nitric oxide; NO)를 발생시키는 효소인 산화질소 합성효소 (nitric oxide synthase; NOS)와 프로스타글란딘 (prostaglandin, PG)의 생합성과 관련된 효소들이 염증 반응을 매개하여 관절염 발생에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 L-아르기닌 (L-Arginine)으로부터 NO를 생성시키는 효소인 NOS나, 아라키돈산 (Arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘류를 합성하는데 관련된 효소인 시클로옥시게나제 (cycloxygenase; COX)는 염증을 차단하는데 있어서 주된 목표가 되고 있다.

최근 연구 결과에 따르면, NOS는 몇 가지 종류가 존재하는데 뇌에 존재하는 bNOS (brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS (neuronal NOS), 혈관계에 존재하는 eNOS (endothelial NOS) 등은 체내에 항상 일정수준으로 발현되고 있으며, 이들에 의해 소량 생성되는 NO는 신경전달이나 혈관확장을 유도하는 등 정상적인 신체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는데 반하여, 각종 사이토카인 (cytokine)이나 외부 자극물질에 의해 유도되는 iNOS (induced NOS)에 의해 급격히 과량 발생되는 NO는 세포독성이나 각종 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 만성 염증은 iNOS 활성의 증가와 관련이 있다는 연구보고가 있다 (Chan PS et al., Osteoarthritis cartilage, 13(5), pp387-394, 2005; Appleton I et al., Adv . Pharmacol., 35, pp27-28, 1996).

또한, 시클로옥시게나제도 2종류의 이소타입 (isotype)이 존재하는데, 시클로옥시게나제-1 (cyclooxygenase-1, COX-1)은 세포 내에 항상 존재하여 세포보호작용에 필요한 PG을 합성하는 작용을 나타내는 것에 반하여, 시클로옥시게나제-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)는 염증반응시 세포 내에서 급격히 증가 되어 염증 반응을 일으키는 데 있어서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다 (Weisz A et al., Biochem . J., 316(Pt1), pp209-215, 1996). NO와 PG의 정도를 향상시키는 iNOS 및 COX-2를 포함하는 전사 염증 인자는 관절염을 포함하는 만성 질환의 병인에 관련한다.

독활 (獨活, Aralia cordata THUNB.)은 두릅나무과 (Araliaceae)에 속하는 다년생초본으로 높이는 1.2 m에 달하며 줄기 곳곳에 짧은 털이 나 있다. 잎은 3~ 5장의 잔잎으로 된 겹잎으로 어긋나며, 잔잎 가장자리에는 톱니가 있다. 꽃은 연한 초록색으로, 암꽃과 수꽃이 따로 한 그루에 피는데, 7~ 8월에 가지 끝에 산형(傘形) 꽃차례로 핀다. 열매는 장과 (漿果)로 10월에 검은색으로 익는다. 흔히 약으로 쓰기 위해 심기도 하는데, 한방에서 쓰는 독활은 봄과 가을에 뿌리줄기 및 뿌리를 캐서 겉껍질을 벗겨 햇볕에 말린 것으로 편두통 치료에 쓰인다. 뿌리를 캐자마자 바로 햇볕에 말리면 향기가 없어지므로 바람이 잘 통하는 그늘에서 어느 정도 말린 다음 햇볕에 말리는 것이 좋다. 맛은 맵고 성질은 따뜻하며 무독하며, 해열작용, 진통작용, 진경작용, 소염작용, 혈액응고 촉진작용, 강심작용, 강압작용 등의 효능이 있다. 민간에서는 전초를 해열제, 이뇨제 및 진통제로 사용한다. 약으로는 뿌리를 사용하는데 거풍제습, 통비지통의 효능이 있어 비증, 신경통, 두통, 중풍 후유증 등의 처방에 사용한다. 뿌리에는 정유 (essential oil)가 함유되어 있고, 정유 중에는 리모넨 (limonen), 사비넨 (sabnene), 알파-피넨 (α-pinene), 감마-테르피넨 (γ-terpinene), 미르센 (myrcene), 휴물렌 (humulene, α-caryophyllene), 알파-코페인 (α-copaene), 테르피넨-4-올 (terpinene-4-ol)이 함유되어 있다 (정보섭 및 신민교저, 도해향약 대사전, 영림사, p435, 1998).

독활의 연골 조직 회복 활성, 연골 구성 물질의 발현 및 분해 억제 활성에 의한 연골 보호 효과와 이로 인한 관절 연골 손상 또는 관절염에 대한 치료 효과는 교시되거나 개시된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 본 발명의 독활 추출물이 탁월한 연골 조직 회복 활성, 세포 고사 억제 활성, 연골 구성 물질의 발현 촉진 및 분해 억제 활성에 의한 관절 연골 보호 효과, 항염, 소염 및 진통 효과를 가짐을 확인함으로써, 본 발명을 완성 하였다.

본 발명은 탁월한 연골 조직 회복 활성, 세포 고사 억제 활성, 연골 구성 물질의 발현 촉진 및 분해 억제 활성에 의한 연골 보호 효과, 소염 및 진통 효과를 갖는 독활 추출물을 함유한 관절 연골 손상 또는 관절염의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 독활 (Aralia cordata THUNB.) 추출물을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 관절 연골 손상 또는 관절염의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 추출물은 연골 조직 회복 활성, 세포고사 억제 활성, 연골 구성 물질의 발현 촉진 및 분해 억제 활성에 의한 연골 보호 효과, 항염, 소염 및 진통 효과를 나타냄을 특징으로 한다.

상기 관절염은 퇴행성관절염 또는 류마티스성 관절염을 포함한다.

상기 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 에탄올의 혼합용매, 보다 바람직하게는 20~ 60 % 물 및 에탄올의 혼합용매에 가용한 추출물을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 독활 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 독활을 세절하여 준비한 시료 중량의 약 1 내지 20배, 바람직하게는 약 5 내지 15배 분량의 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 약 1:0.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:0.2 내지 1:5의 혼합비(v/v)를 갖는 물과 에탄올의 혼합용매로, 실온에서 약 0.5 내지 48시간, 바람직하게는 1 내지 15시간 동안 교반 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 상온 추출, 가온 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 교반 추출, 환류 추출 및 가온 추출한 후 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 본 발명의 독활 추출물을 수득할 수 있다.

상기 방법으로 수득한 독활 추출물을 처리한 사람 및 토끼의 관절 연골 조직 배양액을 이용한 시험관 내 (in vitro) 실험에서, 연골구성물질인 프로테오글리칸 (PG; proteoglycan) 및 2형 콜라겐 (ColⅡ; type Ⅱ collagen)의 분해가 억제되었으며, 콜라겐 분해효소인 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 활성 및 발현을 억제하였다. 또한, 본 발명에 따른 독활 추출물을 처리한 사람 및 토끼의 관절 연골 세포를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 수행한 결과 연골구성물질인 PG 및 ColⅡ 유전자 발현을 촉진하였으며, 세포 독성 또한 나타내지 않았다. 또한, 본 발명의 독활 추출물을 처리한 콜라겐 유도 골관절염 (CIA) 동물 모델의 관절 연골을 헤마톡실린 & 에오신 (Hematoxylin & Eosin), 사프라닌 O (Safranin O) 및 트리크 롬 (Masson's Trichrome)을 이용하여 면역조직화학염색 (immunihistochemistry)을 수행한 결과 연골조직 회복 효과를 나타내었으며, 본 발명의 독활 추출물을 처리한 콜라겐 유도 골관절염 (CIA) 동물 모델의 혈청을 이용한 효소면역방법 (EIA; Enzyme immunoassay)을 수행한 결과 염증 유도 인자인 시클로옥시게나제-2 (COX-2)의 발현 및 활성을 선택적으로 억제하였으며, 프로스타글란딘 E2 (PGE2)의 활성을 억제하였다. 또한, 본 발명의 독활 추출물을 처리한 사람 및 토끼의 관절 연골세포를 이용한 유세포분석 (flowcytometry) 수행 결과 세포 고사 지표 인자인 아넥신 V (annexin Ⅴ)의 발현 및 카스파제-3 (caspase-3)의 활성을 억제하여 세포고사 (apoptosis) 억제 활성을 나타내었다. 또한, 각종 염증 및 통증 유발 동물 모델에 본 발명의 독활 추출물을 처리한 결과 통용되고 있는 비스테로이드계 소염진통제인 셀레콕시브 (Celecoxib)와 비교하여 유사 또는 탁월한 소염진통 활성을 가져 관절염의 예방 및 치료효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 독활 추출물을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 관절 연골 손상 또는 관절염의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 독활 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 관절 연골 손상 또는 관절염 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 독활 추출물을 0.1 ~ 50 중량% 포함한다.

본 발명의 독활 추출물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통 상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 독활 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 독활 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 독활 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 연골 조직 회복 활성, 세포고사 억제 활성, 연골 구성 물질의 발현 촉진 및 분해 억제 활성에 의한 연골 보호 효과, 항염, 소염 및 진통 효과를 나타내는 독활 (Aralia cordata THUNB.) 추출물을 유효성분으로 함유하는 관절 연골 손상 또는 관절염의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등이 있다.

또한, 관절 연골 손상 또는 관절염의 예방 및 치료 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 독활 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 독활 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합 성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 독활 추출물 제조

경희의료원 한방병원에서 구입하여 약 1.0 cm 정도의 크기로 세절한 독활 250 g에 2 ℓ의 50 %(v/v) 에탄올을 가해 고루 섞은 후, 6시간 환류추출 하였다. 여액을 취하여 모으고 잔사에 1.5 ℓ의 30 %(v/v) 에탄올을 가하여 3시간 재가온 추출 후 여액을 모두 합하여 1 ℓ로 농축, 동결건조하여 분말상태의 독활 추출물 63.5 g을 얻어 하기 실험의 시료로 사용하였다 (이하 ACE라 명명함).

참고예 1. 연골 세포 및 연골 조직 준비

사람의 관절연골은 인공관절 수술을 받는 환자의 샘플을 제공받아 사용하였으며 (경희의료원 정형외과 수술실), 토끼의 관절연골은 5주령 토끼 (Newzealand White Rabbit, 샘타코코리아, 대한민국)의 관절에서 채취하였으며, 연골세포는 2주령 토끼 (Newzeland White Rabbit, 샘타코코리아, 대한민국)의 관절에서 분리하였다.

1-1. 연골조직 배양

멸균상태에서 수술을 통하여 관절 표면을 드러낸 후, 대략 200-220 mg의 관절 표면 조직을 취하여 수득한 상기 사람 및 토끼의 관절 연골을 열처리로 비활성화된 5 % 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS, GIBCO BRL, USA)과 페니실린-스트렙토마이신 100 unit/㎖이 함유된 기본배지 (DMEM; Dulbeco's modified eagle's medium, GIBCO BRL, USA)에 담가 놓았다. 관절 조직을 상기 배지로 수차례 씻어낸 다음 37 ℃의 습한 5 % CO₂ 배양기에서 배양하였다. 1~ 2일 후 상기 배지를 열처리로 비활성화된 5 % 우태아혈청과 10 mM HEPES, 페니실린-스트렙토마이신 100 unit/㎖이 함유된 기본 배지로 교체하였고, 30 mg의 관절 조직을 48-웰 플레이트에 옮겼다. 1시간 동안 배양 후, 인터루킨-1α (IL-1α, R&D system, USA) 5 ng/㎕을 배지에 넣어 염증을 유발시키고, 본 발명의 ACE 0.01, 0.02, 0.1, 0.2 ㎎/㎖ 및 디클로페낙 (diclofenac, Sigma, USA) 50 μM을 처리 후 37 ℃에서 배양하였다. 3일간 배양 후 상등액을 수거하였고, 본 발명의 ACE 0.01, 0.02, 0.1, 0.2 ㎎/㎖ 및 디클로 페낙 50 μM이 함유된 배지로 교환하여 25일간 배양하면서 3, 7, 14, 28일이 되는 때에 각각 배양액을 수집하였으며, 이를 -20 ℃에 보관하면서 하기 실험의 시료로 사용하였다.

1-2. 연골세포의 배양

멸균상태에서 관절조직을 인산완충용액 (PBS)이 담긴 배양접시에 담그고, 관절조직에서 필요 없는 살을 가위로 제거한 후 뼈가 서로 맞닿는 부위를 칼로 잘라 뼈를 분리하였다. 약 0.5 mm 두께로 평균 2× 2 mm 넓이로 준비한 연골조직편을 PBS로 3회 이상 세척한 후, 0.2 % 콜라게나아제-2 (collagenase, Sigma, USA)를 첨가하고 CO₂ 배양기에서 약 6시간 반응시키면서 30분 간격으로 흔들어 주었다. 1200 rpm에서 5분간 원심분리 후 상층액을 새 튜브에 모으고, 이 과정을 3회 반복하여 단일 분리된 세포만을 수집하였다. 배양플라스크 (T75 cm², Falcon, USA)에 5.0 × 10⁵ 세포수/㎖의 농도로 연골세포를 분주 후 컨플루언트 (confluent) 상태가 되면 계대해 주었다. 5세대가 되면 6-웰 (well) 및 96-웰 플레이트에 1.0 × 10⁵ 세포수/㎖의 농도로 연골세포를 분주한 후, 인터루킨-1α (IL-1α, R&D system, USA)를 5 ng/㎖ 넣어 염증을 유발시키고, 각각의 웰에 ACE을 1, 10, 20, 50 ㎍/㎖ 및 0.01, 0.1, 0.2 ㎎/㎖의 농도로 첨가한 후 72시간 배양하였다. 상등액을 수거하고, 세포는 상기 시료를 첨가한 신선한 배지로 옮겼으며, 25일간 더 배양하였다. ACE 시료 를 1, 10, 20, 50 ㎍/㎖ 및 0.01, 0.1, 0.2 ㎎/㎖ 농도로 첨가한 후 3, 7, 14, 28일이 되는 때에 배양배지 상등액을 수집하였으며, 이를 -20 ℃에 보관하였다.

참고예 2. 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT- PCR )

참고예 1-2의 방법으로 배양된 연골세포에 트리졸 시약 (TRIzol reagent, Invitrogen Corporation, CA, USA)을 처리하여 RNA를 분리하고, 1 ㎍의 총 RNA에 대한 역전사 (reverse transcriptio)는 oligo(dT)₁₂ 프라이머, dNTP (10 mM), 0.1M 디티오트레이톨 (DTT, dithiotreitol), 역전사효소 (Promega, USA), RNase 저해제가 포함된 완충액을 첨가하여 42 ℃에서 60분간 수행하였다. 상기에서 합성된 각각의 cDNA로 하기 표 1 및 서열번호 1 내지 12에 기재된 프라이머들을 이용한 중합효소 연쇄반응 (PCR; Polymerase Chain Reaction)은 각각의 cDNA 1 ㎍, 2.5 unit의 Taq 중합효소 (TaKaRa TaqTM, Takara, Japan), 1.5 mM dNTP, 1× 완충액 (10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KC1 Triton X-100), 각 프라이머쌍 20 pmol씩을 섞고 증류수로 총부피를 10 ㎕로 맞춘 다음 기계 (Thermal cycler, Bio-Rad, USA)를 이용하여 하기의 과정으로 PCR을 실시하였다. 94 ℃에서 5분간의 열변성 (denaturation) 후 94 ℃에서 60초, 55 ℃에서 60초, 72 ℃에서 90초를 1회로 하여 30회 반응시켰고, 최종 증폭 (last extension)은 72 ℃에서 5분간 수행하였다. PCR에 의하여 생성된 산물은 1.8 % 아가로스 겔에서 전기영동 (5 V/㎝)을 실시하고 EtBr (ethidium bromide) 2 ㎍/㎖로 5분간 염색하고 증류수로 10분간 세척한 다음, 자외선 (260 nm)하에서 특정 밴드 (band)를 확인하였다.

유전자		프라이머의 서열
Col Ⅱ	정방향	AAC ACT GCC AAC GTC CAG AT
	역방향	CTG CAG CAC GGT ATA GGT GA
PG	정방향	GAG GTC GTG GTG AAA GGT GT
	역방향	GTG TGG ATG GGG TAC CTG AC
MMP-1	정방향	AAA GGG AAT AAG TAC TGG G
	역방향	GTT TTT CCA GTG TTT TCC TCA G
MMP-3	정방향	TGC GTG GCA GTT TGC TCA GCC
	역방향	GAA TGT GAG TGG AGT CAC CTC
MMP-13	정방향	GAT AAA GAC TAT CCG AGA C
	역방향	CGA ACA ATA CGG TTA CTC
GAPDH	정방향	GCT CTC CAG AAC ATC ATC CCT GCC
	역방향	CGT TGT CAT ACC AGG AAA TGA GCT

참고예 3. 콜라게나아제 유도 골관절염 동물 모델 (CIA model; Collagenase -induced osteoarthritis model)

토끼 (Newzeland White Rabbit, 샘타코, 대한민국)는 1주 동안 순화시켜 사용하였다. 토끼의 우측 무릎 활액 (synovia) 내에 4 ㎎/㎖ 콜라게나아제 (collagenase, Sigma, USA)를 0.25 ㎖ 투여하였다. 약물을 투여하기 전의 체중을 재고, 투여 후 1주일 간격으로 다시 체중을 쟀으며, 걷는 모습 등의 임상증상을 관찰하였다. 4주 동안 음성대조군 (n=8)에는 0.5 % 카르복시메틸셀룰로스 (carboxymethyl cellulose; CMC)를 20 ㎖/day, 실험군에는 ACE를 20 ㎖/day (150 mg/kg) 먹였고, 4주 후 각 토끼로부터 혈청을 분리하였으며, 우측 무릎을 잘라내어 10 % 포르말린 용액으로 고정하였다.

실험예 1. ACE의 연골 보호 효과 측정

연골 구성 요소인 프로테오글리칸이나 콜라겐을 빨리 생산하지 못하여 연골의 쿠션기능이 없어지면, 연골이 상하고 관절염이 유발된다. 관절 연골은 윤활과 성장을 위한 물 (70~ 80 %), 콜라겐 (10~ 15 %), 프로테오글리칸 (5~ 10 %) 및 연골세포 (chondrocyte)로 구성되어있으며, 프로테오글리칸 (PG)은 한 줄의 중심단백 (core protein)에 여러 개의 글리코사미노글리칸 (GAG; glycosaminoglycan)이 붙어있는 구조를 가지고 있다.

본 발명의 ACE의 프로테오글리칸 및 콜라겐 분해 억제 효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.

1-1. 글리코사미노글리칸 (GAG) 분해 정도 측정

본 발명의 ACE의 사람 및 토끼의 관절 연골 조직 보호효과를 측정하기 위해 1,9-디메틸메틸렌블루 (1,9-dimethylmethylene blue; DMB) 어세이법을 사용하여 PG을 구성하는 GAG의 분해 정도를 알아보는 하기와 같은 실험을 실시하였다 (French MM et al., Ann. Biomed . Eng ., 32(1), pp50-56, 2004).

상기 참고예 1-1의 방법으로 수득한 관절 연골 조직의 배양 배지 중 GAG의 농도는 염료 용액 (Blyscan dye solution)과 반응하여 생성된 음이온성 (polyanionic) 물질의 양에 의해 측정하였으며, 표준물질로는 황산콘드로이친 (chondroitin sulfate)을 사용하였다. ACE 0.01, 0.02, 0.1, 0.2 mg/㎖ 처리군의 배양액 및 양성대조군인 디클로페낙 (diclofenac; Df, Sigma, USA) 처리군의 배양액 각 50 ㎕를 염료 용액 (Blyscan dye solution) 500 ㎕과 섞고, 실온에서 30분 반응시킨 후 12,000 rpm에서 10분 원심분리 하였다. 침전물을 염료 해리 용액 (Blyscan dye-dissociation solution)에 녹인 후 540 nm에서 분광학적 GAG량을 측정하였고, 인터루킨-1α (IL-1α)로 유도된 GAG 분해량을 기준으로 억제율을 계산하여 나타내었다.

실험결과 하기 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 ACE은 배지 중으로의 GAG 분해를 탁월히 억제하여, IL-1α로 유도된 연골 세포 분해를 농도 의존적으로 유의하게 억제함을 확인할 수 있었고, 양성대조군으로 사용한 디클로페낙과 비교시, ACE의 GAG 분해 억제 효과는 사람 관절 연골 조직에서 더욱 탁월하였다.

1-2. 배지 중 2형 콜라겐 농도 측정

본 발명의 ACE의 관절 연골 세포 보호효과를 측정하기 위해 관절 연골의 구성 성분인 콜라겐의 분해 정도를 알아보는 하기와 같은 실험을 실시하였다.

배지 중 2형 콜라겐 (type Ⅱ collagen, ColⅡ)의 수치는 Sircol 콜라겐 어세이 (Liu XD et al., J. Lab. Clin . Med . 137(3), pp208-219, 2001)법을 사용하여 측정하였다. 시료를 술폰산 (sulfonic acid)이 함유된 염료 (Sirius red dye)와 실온에서 30분 동안 반응시킨 후, 540 nm에서 반응액의 광학 밀도 (optical density)를 측정하였다. 연골조직에서 IL-1α로 유도된 ColⅡ 분해량을 기준으로 본 발명의 ACE의 ColⅡ 분해 억제율 (%)을 계산하여 나타내었다.

실험결과 하기 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 ACE은 배지중의 ColⅡ의 농도를 탁월히 억제하여, 손상된 관절 연골 조직 중 콜라겐의 생성을 회복시킴을 확인할 수 있었고, 양성대조군으로 사용한 디클로페낙 (Df) 처리군과 비교시 ACE은 0.2 ㎎/㎖의 낮은 농도에서 IL-1α로 유도된 콜라겐 분해를 더 효과적으로 억제하여 탁월한 연골보호효과를 확인할 수 있었다.

1-3. 연골구성물질의 유전자 발현 정도 측정

상기 참고예 1-2에서 수득한 토끼 관절 연골 세포의 프로테오글리칸 및 ColⅡ 유전자의 발현 정도를 상기 참고예 2의 RT-PCR을 실시하여 알아보았다.

실험결과 하기 도 3에 나타낸 바와 같이 본 발명의 ACE은 토끼 관절 연골 조직 및 관절 연골 세포에서 IL-1α의 처리로 인해 발현이 저해된 프로테오글리칸 및 ColⅡ 유전자의 발현을 농도 의존적으로 증가시켜 연골보호 효과를 나타내었다.

1-4. MMP -1 및 MMP -13 농도 측정

콜라겐 분해효소 (MMP; Matrix metalloproteinase)는 연골조직의 단백질을 파괴하는 단백질 분해효소의 일종으로 류마티스 관절염은 물론 골관절에서 연골조직을 파괴하여 관절염을 악화시키는 역할을 하므로 이들의 생산을 억제하는 것은 관절의 연골보호 측면에서 특히 중요하다 (Nagase H and Woessner JF Jr., J. Biol. Chem ., 274(31), pp21491-21494, 1999).

상기 참고예 1-1의 관절 연골 조직 배양액을 이용하여 MMP 생성 억제효과를 ELISA 키트 (MMP-3 kit, MMP-13 kit, Biomol Research Lab., Inc., PA, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 하기와 같이 측정하였으며, MMP-3 (stromalysin-1) 및 MMP-13 (collagenase-3)에 의해 잘려지는 표색기질 (colorimetric substrate)로서, 티오펩토라이드 (thiopeptolide; Ac - Pro - Leu - Gly - [2 - mercapto - 4 - methyl - pentanoly ] - Leu - Gly - OC₂H₅,)를 측정하였다. 단백질 분해 활성 (proteolytic activity)을 측정하기 위해 각 배양액를 25 ㎕씩 96-웰 플레이트에 기질 50 ㎕와 함께 분주하였으며, 37 ℃에서 1시간 동안 배양한 후 450 nm에서 ELISA reader (Molecular devices, USA)로 측정하였다. 각 시료의 MMP-3 및 MMP-13 활성은 각 웰의 배양액 내 MMP %를 측정하여 하기 도 4에 나타내었으며, 본 발명의 ACE은 IL-1α로 유도된 콜라겐 분해효소 MMP-3 및 MMP-13의 활성을 농도의존적으로 유의하게 억제시켰다. 또한 양성대조군으로 사용한 디클로페낙 (Df) 처리군 및 BB94 (MMP 저해제) 처리군과 비교시 0.2 ㎎/㎖의 농도에서 본 발명의 ACE이 MMP-3 및 MMP-13의 활성을 더 효과적으로 억제시킴을 확인할 수 있었다.

1-5. MMP -1, MMP -3, 및 MMP -13 유전자 발현 억제 측정

상기 참고예 1-2의 토끼 관절 연골 세포를 이용하여 ACE의 처리에 의한 콜라겐 분해효소들 (MMPs; Matrix metalloproteinases)의 발현 억제 효과를 알아보기 위해 참고예 2의 RT-PCR을 실시하였다.

상기 실험결과 하기 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 ACE은 토끼 연골세포에서 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 유전자 발현을 억제함을 확인할 수 있었다.

1-6. 세포독성 측정

본 발명의 ACE이 연골 세포 (chondrocyte)의 생존능력에 미치는 영향을 알아보기 위하여 상기 참고예 1-2에서 수득한 토끼의 관절 연골 세포를 이용하여 하기의 방법으로 실험을 실시하였다.

세포의 생존능력의 지표로써 젖산탈수소효소 (LDH; cytoplasmic enzyme lactate dehydrogenase, LDH kit, Promega Corp., Madison, WI, USA)의 활성을 측정하였다 (Hussain SM et al., Toxicol . In Vitro, 19(7), pp975-983, 2005).

무처리군, 농도별 (0.01, 0.1, 0.2 ㎎/㎖) 및 시간별 (3, 7, 14 days) ACE 처리군의 배양액을 사용하였다. TBT (Tris-buffered Tetrazolium) 용액 (INT-chloride)으로 기질 혼합 파우더 (diaphorase, lactate, NAD)를 녹인 후, 배양액 50 ㎕과 기질 혼합액 50 ㎕를 섞어준 후 30분간 실온에서 반응시켰다. 정지액을 50 ㎕ 넣은 후 배양 배지의 흡광도를 490 nm에서 측정하여 LDH 활성을 정량하였다.

실험결과 하기 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 ACE은 연골세포에서 농도별로 처리 후 3일, 7일, 14일간 배양 후에도 연골세포의 생존에 영향을 미치지 않아 ACE이 안전한 조성물임을 확인할 수 있었다.

실험예 2. CIA 동물 모델에서의 연골보호 및 진통 효과

2-1. 면역조직화학적 염색 ( immunohistochemical staining)에 의한 연골 조직 회복 측정

조직화학적 염색을 위해 상기 참고예 3에서 수득한 CIA 동물 모델의 무릎 관절을 10 % 포르말린 고정액으로 고정하고, 칼슘을 제거한 후, 파라핀으로 포매하였다. 파라핀 블록을 5 ㎛ 두께로 절편화하여 라이신이 코팅된 슬라이드 (poly-L-lysine-coated glass slide, Sigma, USA)에 접착시켰다. 절편은 탈파라핀과정 후 함수과정을 거쳐 헤마톡실린 및 에오신 (Hematoxylin & Eosin)으로 염색하였다.

상기 실험결과 하기 도 7에 나타낸 바와 같이, CIA 동물모델인 토끼의 대퇴과 (Femur chondyle, 도 7b) 및 경골고원부 (Tibia plateau, 도 7e)의 경우 연골층이 매우 얇아져 있었으나, ACE을 투여한 CIA 동물 모델인 토끼의 관절은 대퇴과 (Femur chondyle, 도 7c)와 경골고원부 (Tibia plateau, 도 7f)의 손상된 연골층이 정상군 (도 7a 및 도 7d)과 비슷하게 회복되었다.

상기 실험결과를 키쿠치 등(Kikuchi et al., Osteoarthritis, 4, pp99-110, 1996)의 방법을 이용하여 각각을 점수로 환산, 등급화하여 하기 표 2 에 나타내었다. 실험결과, ACE 투여군의 경우, 0.5 % CMC를 투여한 대조군에 비하여 연골표면의 손상, 연골함몰, 쪼개짐, 연골세포의 분포 등의 점수 총 합계가 경골 고원부 (Tibial plateau) 및 대퇴과 (Femur chondyle) 각각 약 1.8배, 2배 낮게 나타났으며, 이는 연골조직 및 연골세포의 회복을 나타내는 결과이다.

	0.5 % CMC 처리군	150 ㎎/㎏ ACE 처리군
경골 고원부 (Tibial plateau)
loss of superficial layer	4.7 ± 0.9	3.4 ± 0.6
erosin of cartilage	4.9 ± 1.2	2.7 ± 1.1
fibrillation and/or fissures	3.8 ± 0.7	2.9 ± 1.9
disorganization of chondrocytes	4.1 ± 1.1	1.9 ± 0.8
loss of chondrocytes	3.5 ± 0.8	1.4 ± 0.9
cluster formation	3.7 ± 1.4	1.7 ± 1.5
Sumscore	24.7 ± 6.1	14 ± 7.5
대퇴과 (Femur condyle )
loss of superficial layer	3.7 ± 2.1	2.3 ± 1.3
erosin of cartilage	3.1 ± 1.7	1.7 ± 0.5
fibrillation and/or fissures	3.3 ± 0.7	1.9 ± 0.8
disorganization of chondrocytes	3.9 ± 0.6	2.1 ± 1.1
loss of chondrocytes	2.8 ± 0.8	1.1 ± 0.9
cluster formation	2.5 ± 1.4	1.2 ± 0.4
Sumscore	19.3 ± 7.3	10.3 ± 5.3
Each data represents the mean±S.D. (n=5) *P<0.01 compared to 0.5 % CMC treated group.

2-2. 사프라닌 O ( Safranin O) 및 트리크롬 ( Masson's Trichrome ) 염색에 의한 연골 조직 회복 측정

관절 연골 조직에서의 프로테오글리칸과 콜라겐을 각각 염색하기 위하여 사프라닌 O (Safranin O, Sigma, USA) 및 트리크롬 (Masson's Trichrome, Sigma, USA) 염색을 실시하였다 (Muir HM et al., Histology, Churchill Livingstone, Edinburgh, pp177-198, 1986). 시료에 대한 사전 정보가 전혀 없는 병리학자가 염색된 슬라이드를 판독하였으며, 200× 배율의 렌즈로 측정 후 사진촬영 하여 그 결과를 하기 도 8 및 도 9에 나타내었다.

상기 실험결과 하기 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, CIA 동물 모델의 대퇴과 (Femur chondyle, 도 8b 및 도 9b) 및 경골고원부 (Tibia plateau, 도 8e 및 도 9e)의 연골조직은 프로테오글리칸과 콜라겐의 손실이 유도되어 염색시 발색정도가 흐려졌으며, 연골의 두께가 얇아졌다. 그러나 본 발명의 ACE 처리군 (도 8c 및 도 8f)은 CIA 동물 모델의 연골조직 손실을 회복시켜, 사프라닌 O 에 의해 염색된 프로테오글리칸의 농도가 높아졌으며, 연골의 형태도 다시 정상 토끼 (도 8a 및 도 8d)의 연골형태와 같이 회복됨을 확인하였다 .

2-3. 시클로옥시게나제 -2 ( Cyclooxygenase -2, COX-2)의 면역조직화학적 염색

면역조직화학적 염색을 위해 제작된 상기 실험예 2-1의 파라핀 절편을 사용하여 COX-2 항체 (Cayman, USA)를 사용하여 면역조직화학 염색을 실시하였다.

면역조직화학적염색은 우선 조직 절편의 파라핀을 제거하고 여러 농도의 에탄올로 수화시킨 다음, 3 % 과산화수소수 (H₂O₂)로 10분간 반응시켜 내인성 퍼록시다제 활성 (endogenous peroxidase activity)를 저해시킨 후 단백질분해효소 K (proteinase K, Zymed Laboratories Inc., san francisco, CA)를 37 ℃에서 10분간 처리하였다. 트리스완충액(TBS; Tris-buffered saline, pH7.4)으로 세척하고 protein block serum-free solution (DakoCytomation, Denmark)으로 20분간 반응시킨 다음 희석제 (antibody diuent, Dakocytomation, Denmark)를 사용하여 1: 200으로 희석한 COX-2 항체와 4 ℃에서 하룻밤 (overnight) 반응시켰다. 그 후 조직 절편을 Dakocytomation LSAB system을 사용하여 스트렙타비딘-비오틴-퍼록시다제 복합체 (streptavidin-biotin- peroxidase complex)를 만들고 디아미노벤지딘 (DAB; diaminobenzidine, Dakocytomation, Denmark) 용액으로 발색한 후 헤마톡실린으로 대조염색 (counterstaining) 하였으며, 연골은 대퇴과 (Femur chondyle) 및 경골 고원부 (Tibia plateau)로 나누어 관찰하였고 (Axiovert 200, ZEISS, Germany) 200배율로 촬영 하였으며, COX-2 발현 정도를 하기 표 3 및 도 10에 나타내었다.

상기 실험결과, CIA 동물 모델에 0.5 % 카르복시메틸셀룰로스 (carboxymethylcellulose; CMC)용액을 먹인 음성대조군에 비하여 ACE을 먹인 실험군에서 COX-2의 발현이 연골 부위인 대퇴과 (Femur chondyle) 및 경골 고원부 (Tibia plateau) 모두에서 현저히 감소함을 확인하였다.

	0.5% CMC 처리군	150 mg/kg ACE 처리군
대퇴과 (Femur chondyle)	138.7± 15.3	8.3± 1.4**
경골 고원부 (Tibia plateau)	119.6± 22.4	6.9± 0.8**
Each data represents the mean ± S.D. (n=5) **P<0.01 compared to 0.5% CMC treated group.

2-4. 시클로옥시게나제 ( cyclooxygenase ) 활성 측정

상기 참고예 3의 CIA 동물 모델에서 4주째에 분리한 혈청을 효소면역측정키트 (EIA kit; Enzyme immunoassay kit, #760151, Cayman chemical, Ann Arbor, Michigan, USA)에 적용하여 시클로옥시게나제 활성을 측정하였다 (Seaver B and smith JR, J. Herb Pharmacother ., 4, pp11-18, 2004). 혈청을 인산완충용액을 사용하여 1: 50으로 희석하여 50 ㎕씩 분주하고 COX-2 억제제인 DuP-697 (Cayman chemical, Ann Arbor, Michigan, USA) 또는 COX-1 억제제인 SC-560 (Cayman chemical, Ann Arbor, Michigan, USA)을 50 ㎕씩 첨가하여 반응시켜, 혈청 내에 존재하는 COX-1 또는 COX-2의 활성을 억제시킴으로써 이에 상응하는 COX-1 또는 COX-2의 활성을 발색법으로 측정하여 하기 도 11에 나타내었다.

상기 실험결과, 본 발명의 ACE은 COX-1의 활성은 억제하지 않았고 COX-2 활성만을 선택적으로 억제하였다. 이 결과로 ACE이 위점막, 장에 존재하는 내적인 COX-1의 활성은 억제하지 않음으로써 안정성의 효능을 입증하였고, COX-2에 의한 염증 및 통증 등을 선택적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.

2-5. 프로스타글란딘 E2 (Prostaglandin E2 ; PGE2 ) 활성 측정

상기 참고예 3의 CIA 동물 모델에서 혈청 내의 PGE2의 양을 PGE2 효소면역측정 키트 (PGE2 EIA kit, Cayman chemical, Ann Arbor, Michigan, USA)를 이용하여 측정하였다 (Dovedi SJ et al., J. Urol ., 174(1), pp332-337, 2005). 혈청을 인산완충용액을 사용하여 1: 50으로 희석하여 50 ㎕씩 분주하고, 염소 항-마우스 PGE2 단클론 IgG 항체 (goat anti-mouse prostaglandin E2 monoclonal IgG)가 미리 코팅된 플레이트(pre-coated plate)를 사용하여 발색시켰고, 합성된 PGE2 (synthesized PGE2)의 양은 표준 (standard) PGE2를 순차적 희석 (serial dilution)하여 측정 후 정량화 하여 하기 도 12에 나타내었다.

상기 실험 결과, 본 발명의 ACE은 PGE2의 활성을 억제시켰으며, 상기 결과로 ACE의 항염 효과 및 진통 기전을 확인하였다.

실험예 3. 세포고사 ( apoptosis ) 억제 확인

3-1. 유세포분석 ( flowcytometry )을 이용한 연골세포의 세포주기 분석

참고예 1-2의 방법으로 연골세포를 분리한 후 계대배양하여 5세대째의 연골세포를 6-웰 플레이트에 분주하였다. ACE을 10 ㎍/㎖로 처리하고 24시간 배양한 후 세포를 수거하여 인산완충용액으로 세척한 후 차가운 70 % 에탄올로 고정한 후 0.1 % RNA 분해효소 (RNAse)를 첨가하고 30분간 반응시켰다. 50 ㎍/㎖의 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide; PI) 0.5 ㎖을 넣어 염색한 후 유세포분석기 (flowcytometer; FACSCalibur, Becton Dickinson, USA)로 측정하여 하기 도 13에 나타내었다 (Nakamura T et al., Leukemia, 11(suppl13), pp548-551, 1997).

상기 실험 결과, 대조군은 IL-1a에 의해 세포고사가 유도되어 Sub G1단계의 세포가 증가되었고, ACE 처리군은 Sub G1단계의 세포가 감소되어 세포고사가 억제됨을 확인하였다. 양성대조군으로 사용한 MEK (pERK) 억제제 (20 μM; PD98059, Calbiochem, USA)는 세포고사를 촉진하였고, p38 MAPK 억제제 (20 μM; SB203580, Calbiochem, USA)는 세포고사를 억제하였다.

3-2. 유세포분석 ( flowcytometry )을 이용한 연골세포의 아넥신 V ( Annexin V) 염색

참고예 1-2의 방법으로 연골세포를 분리한 후 계대배양 하여 5세대째의 연골세포를 6-웰 플레이트에 분주하였다. ACE을 10 ㎍/㎖로 처리하고 24시간 배양한 후 세포를 수거하여 인산완충용액으로 세척한 후 형광물질이 표지된-아넥신 V 항체 (Annexin V kit, Pharmingen, USA)를 첨가하여 10분간 반응 후, 50 ㎍/㎖의 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide; PI) 0.5 ㎖을 넣어 염색한 후 유세포분석기 (flowcytometer, FACSCalibur, Becton Dickinson, USA)로 측정하여 하기 도 14에 나타내었다 (Sawatzky DA et al., Am. J. Pathol ., 168(1), pp33-41, 2006).

상기 실험결과 도 14에 나타난 바와 같이, 대조군은 IL-1a에 의해 세포고사가 유도되어 아넥신 V 발현 세포가 증가되었으나, ACE 처리군은 아넥신 V 발현 세포의 감소양상을 나타내어 세포고사가 억제됨을 확인하였다.

양성대조군으로 사용한 MEK (pERK) 억제제 (20 μM; PD98059, Calbiochem, USA)는 세포고사를 촉진하였고, p38 MAPK 억제제 (20 μM; SB203580, Calbiochem, USA)는 세포고사를 억제하였으며, 본 발명의 ACE은 p38 MAPK 억제제와 같은 활성으로 세포고사 감소를 유도함을 확인할 수 있었다.

3-3. 카스파제 -3 ( caspase -3) 활성 측정

참고예 1-2의 방법으로 연골세포를 분리한 후 계대배양 하여 5세대째의 연골세포를 6-웰 플레이트에 분주하고, 실험군에는 본 발명의 ACE을 1, 10, 20 ㎍/㎖로 처리하였으며, 양성대조군으로는 FMK (카스파제 활성억제제, R&D system, USA) 50 uM를 사용하였다. 24시간 배양한 후, 세포를 모으고, 파쇄액 (lysis buffer)을 사용하여 파쇄한 후 colorimetric kit (Pharmingen, USA)를 이용하여 정량하였다. 50 μM의 카스파제-3 기질액 Ac-Asp-Glu-Val-Asp-chromophore p-nitroaniline을 세포파쇄 후 수득한 상등액과 혼합하여 37 ℃에서 1시간 반응 후 카스파제-3의 활성을 측정하여 하기 도 15에 나타내었다.

실험결과 하기 도 15에 나타난 바와 같이, 본 발명의 ACE은 IL-1a에 의해 증가된 카스파제-3의 활성을 농도 의존적으로 억제하였으며, 상기 결과로 세포주기 분석, 아넥신 V 염색으로 확인된 본 발명의 ACE에 의한 세포고사억제가 카스파제-3 활성을 억제함으로써 유도된 것임을 확인하였다.

3-4. CIA 동물 모델에서 cleaved caspase -3 면역염색

상기 참고예 3의 CIA 동물 모델에서 본 발명의 ACE의 처리로 세포고사가 억제되는지 확인하기 위하여 cleaved caspase-3 항체 (Cellsignaling, USA)를 이용하여 실험예 2-3과 같이 면역조직화학적 염색을 실시하였으며, cleaved caspase-3의 발현 정도를 하기 표 4 및 도 16에 나타내었다.

실험결과 하기 표 4에 나타난 바와 같이, 0.5 % CMC를 먹인 음성대조군에서는 세포고사가 유도되어 대퇴과 (Femur chondyle)와 경골 고원부 (Tibia plateau)에서 각각 83.5± 8.8, 59.7± 4.2의 갯수로 cleaved caspase-3 양성세포가 관찰되었으나, 본 발명의 ACE에 의하여 대퇴과 (Femur chondyle)는 21.7± 11.4, 경골 고원부 (Tibia plateau)는 27.8 ± 5.3의 갯수로 고사세포의 수가 감소되었다. 또한, 하기 도 16에 나타난 바와 같이 연골세포의 생체 내 (in vivo) 실험에서도 ACE에 의하여 세포고사가 현저히 감소함을 확인하였다.

	0.5% CMC 처리군	150 mg/kg ACE 처리군
대퇴과 (Femur chondyle)	59.7± 4.2	21.7± 11.4*
경골 고원부 (Tibia plateau)	83.5± 8.8	27.8± 5.3**
Each data represents the mean ± S.D. (n=5) *P<0.05 **P<0.01 compared to 0.5% CMC treated group.

실험예 4. 진통 및 소염 활성 측정

4-1. 복사 유도 꼬리 뒤틀림 진통 실험 (Radiation - induced Tail flick analgesia test)

본 발명의 ACE의 통증억제효과를 알아보기 위해 꼬리 뒤틀림 실험 (tail flick test)을 실시하였다 (Shaw FZ et al., Brain Res., 911(2), pp105-115, 2001).

실험동물로는 체중 20~ 25 g의 웅성 ICR 마우스 (중앙실험동물, Japan)를 수일간 순화시킨 후, 각 군당 10마리씩 사용하였다. ACE (500 ㎎/㎏) 및 양성대조군인 COX-2 저해제 셀레콕시브 (500 ㎎/㎏, Celecoxib, Sigma, USA)를 경구투여하고, 1시간 후에 적외선을 꼬리의 정중부에 조사한 후 회피반응을 보이기까지의 시간을 측정하였으며, 음성대조군의 횟수를 기준으로 억제율을 계산하여 하기 표 5에 나타내었다.

구분	농도 (mg/kg)	통증 억제율(%)
ACE	500	21.3
셀레콕시브	100	23.4

상기 표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 ACE은 탁월한 통증억제효과를 나타내었고, ACE가 비스테로이드 소염진통제인 셀레콕시브와 유사한 진통효과를 나타냄을 확인하였다.

4-2. 족압 진통 실험 (Paw pressure analgesia test)

본 발명의 ACE의 진통효과를 알아보기 위해 족압 진통 실험 (paw pressure analgesia test)을 실시하였다 (Khasar SG et al., Pain, 116(1-2), pp79-86, 2005).

실험동물로는 체중 200g의 웅성 SD 랫트 (중앙실험동물, Japan)를 수일간 순화시킨 후 사용하였다. ACE (200 ㎎/㎏) 및 양성대조군인 COX-2 저해제 셀레콕시브 (100 ㎎/㎏, Celecoxib, Sigma, USA)를 경구투여하고, 24시간 후 2 % 카라기난 (carrageenan, Sigma, USA)을 좌측 후지에 피하 투여하고 진통계측기 (analgesic meter, Stoelting, USA)를 사용하여 통증에 의한 회피 반응을 보일 때 까지의 무게를 측정하였으며, 음성대조군의 무게를 기준으로 억제율을 계산하여 하기 표 6에 나타내었다.

구분	농도 (mg/kg)	통증 억제율(%)
ACE	200	49.4
셀레콕시브	100	57.4

상기 표 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 ACE은 탁월한 통증억제효과를 나타내었고, ACE가 비스테로이드 소염진통제인 셀레콕시브와 유사한 진통효과를 나타냄을 확인하였다.

4-3. 포르말린 진통 실험 ( Formalin analgesia test)

본 발명의 ACE의 진통효과를 알아보기 위해 포르말린 동물모델 실험을 실시하였다 (Fazli-Tabaei S et al., Behav. Pharmacol., 16, pp613-619, 2005).

실험동물로는 체중 20~ 25 g의 웅성 ICR 마우스 (중앙실험동물, Japan)를 수일간 순화시킨 후, 각 군당 10마리씩 사용하였다. ACE (400 ㎎/㎏) 및 양성대조군인 COX-2 저해제 셀레콕시브 (100 ㎎/㎏, Celecoxib, Sigma, USA)를 경구투여하고, 24시간 후 10 % 포르말린용액 (formalin, Sigma, USA)을 좌측 후지에 피하 투여하고 후지 바닥을 핥는 시간을 측정하여 셀레콕시브의 효력을 100으로 하여 억제율을 환산하여 하기 표 7에 나타내었다.

구분	농도 (mg/kg)	통증 억제율(%)
ACE	400	111.8
셀레콕시브	100	100

상기 표 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 ACE은 탁월한 통증억제효과를 나타내었고, ACE가 비스테로이드계 소염진통제인 셀레콕시브보다 우수한 진통효과를 나타냄을 확인하였다.

4-4. 아라키돈산유발 귀부종 소염 실험 (Test with arachidonic acid - induced ear oedema)

아라키돈산은 혈소판의 응고, 동맥경화, 심장병, 염증 등을 일으키는 프로스타글란딘의 전구체로 염증을 발생시키는 주요한 원인이 되는 물질이다. 본 발명의 ACE의 소염 활성을 평가하기 위해 아라키돈산 (arachidonic acid)으로 부종을 유발한 마우스를 이용하여 하기의 실험을 실시하였다.

실험동물로는 체중 20~ 30 g의 웅성 ICR 마우스 (중앙실험동물, USA)을 각 군당 6마리씩 사용하였다. ACE (400 ㎎/㎏) 및 양성대조군인 COX-2 저해제 셀레콕시브 (100 ㎎/㎏, Celecoxib, Sigam, USA)를 경구투여하고, 1시간 후에 아세톤으로 녹인 50 ㎎/㎖의 아라키돈산을 마우스의 오른쪽 귀 안쪽과 바깥쪽에 골고루 도포하여 귀의 부종을 유발하였다. 1시간 후 왼쪽 귀와 비교하여 귀두께의 증가율을 계산하여 하기 표 8에 나타내었다.

구분	농도 (mg/kg)	부종 억제율(%)
ACE	400	23.5
셀레콕시브	100	23.2

상기 표 8에 나타난 바와 같이, 본 발명의 ACE은 실험쥐에 유발된 귀의 부종에 대한 탁월한 소염효과를 나타내었고, ACE가 비스테로이드계 소염진통제인 셀레콕시브와 유사한 소염효과를 나타냄을 확인하였다.

4-5. 크로톤오일 유발 귀부종 소염 실험 (Test with croton oil - induced ear oedema)

크로톤 오일 (Croton oil)은 피부에 도포하면 도포면에 발적, 종창, 수포가 생기는 염증작용을 일으킨다. 본 발명의 ACE의 소염 활성을 평가하기 위해 크로톤 오일로 부종을 유발한 마우스를 이용하여 하기의 실험을 실시하였다.

실험동물로는 체중 20~ 30 g의 웅성 ICR 마우스 (중앙실험동물, Japan)을 각 군당 6마리씩 사용하였다. ACE (500 ㎎/㎏) 및 양성대조군인 COX-2 저해제 셀레콕시브 (100 ㎎/㎏, Celecoxib, Sigma, USA)를 경구투여하고, 1시간 후에 아세톤으로 녹인 2.5 %의 크로톤 오일을 마우스의 오른쪽 귀 안쪽과 바깥쪽에 골고루 도포하여 귀의 부종을 유발하였다. 4시간 후 왼쪽 귀와 비교하여 귀두께의 증가율을 계산하여 하기 표 9에 나타내었다.

구분	농도 (mg/kg)	부종 억제율(%)
ACE	500	30.3
셀레콕시브	100	31.5

상기 표 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 ACE은 실험쥐에 유발된 귀의 부종에 대한 탁월한 소염효과를 나타내었고, ACE가 비스테로이드계 소염진통제인 셀레콕시브와 유사한 소염효과를 나타내어 우수한 소염활성이 있음을 확인하였다.

실험예 5. 경구투여 독성실험

4주령의 특정병원성부재 (SPF)의 ICR 마우스 (중앙실험동물, Japan)를 사용하여 급성 및 반복독성실험을 하기과 같이 실시하였다.

각 군 (5마리/군)에 본 발명의 ACE을 용해시켜 5g/kg/10㎖의 용량으로 단회 경구 투여하였다. ACE을 투여한 후 동물의 폐사 여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

반복투여 독성실험의 경우, 2g/kg/10㎖의 용량으로 5회 반복 경구 투여하였다. 그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 따라서 본 발명에 따른 ACE은 모든 마우스에서 5,000 mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소 치사량 (LD₅₀)은 5,000 mg/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

하기에 본 발명의 추출물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

ACE 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

ACE 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

ACE 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

ACE 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

ACE 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

ACE 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

ACE 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 독활 추출물은 시험관 내 실험에서 연골구성물질의 분해 억제와 발현 촉진, 콜라겐 분해효소의 활성 및 발현 억제 및 세포 고사 억제 활성을 나타내며, 관절염 동물 모델을 이용한 생체 내 실험에서 연골 조직 회복에 의한 연골 보호 활성 및 염증유발물질 억제 활성을 나타내며, 염증 및 통증 유발 동물에서 소염 및 진통 활성을 가지므로, 관절 연골 손상 또는 관절염의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품에 유용하게 사용될 수 있다.

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Claims (7)

1. 독활 (Aralia cordata THUNB.)의 30 내지 50% 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 관절 연골 손상, 퇴행성 관절염 또는 류마티스성 관절염의 예방 및 치료용 약학조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 연골 조직 회복 활성, 세포고사 억제 활성, 연골 구성 물질의 발현 촉진 및 분해 억제 활성에 의한 연골 보호 효과, 항염, 소염 및 진통 효과를 나타내는 독활 (Aralia cordata THUNB.)의 30 내지 50% 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 관절 연골 손상, 퇴행성 관절염 또는 류마티스성 관절염의 예방 및 개선용 건강기능식품.
7. 삭제

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