CN115768871A - 组合物、结合抑制剂、医疗器械和covid-19的预防方法 - Google Patents

组合物、结合抑制剂、医疗器械和covid-19的预防方法 Download PDF

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Abstract

一种组合物，其是包含来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清的组合物，组合物含有血管紧张肽转化酶2(ACE2)，用途是对健康人或健康动物给药，以预防以ACE2为受体的病毒对健康人或健康动物的感染，该组合物通过对健康人或健康动物进行给药，可用作COVID‑19等以ACE2为受体的病毒感染症的预防药等。

Description

组合物、结合抑制剂、医疗器械和COVID-19的预防方法
技术领域
本发明涉及组合物、结合抑制剂、医疗器械和COVID-19的预防方法。
背景技术
亦称为新型冠状病毒的SARS-CoV-2(2019-nCoV)引起了新的冠状病毒感染症(COVID-19)的发生。针对于此，人们正在研究COVID-19的治疗方法或预防方法。其中，已知使用间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell；MSC)的方法作为COVID-19肺炎的治疗方法有效(参照非专利文献1～3)。
非专利文献1中记载了：基于间充质干细胞的免疫调节治疗被作为COVID-19的适当治疗方法而提出。特别是，在非专利文献1中记载了：在MSC的静脉内移植后，有相当数量的细胞群在肺中蓄积，在起到免疫调节效果的同时保护肺泡上皮细胞，恢复肺微小环境，预防肺纤维化，可治愈肺功能障碍。在非专利文献1的第431页记载了：在该非专利文献1中引用的文献[25]中，使用ACE2阴性的MSC细胞为宜。
非专利文献2中记载了：利用脐带间充质干细胞(Umbilical Cord MesenchymalStem Cell)的抗炎作用和免疫调节作用治愈组织，由此可促进从COVID-19的恢复。非专利文献2中还记载了：SARS-CoV-2和SARS-CoV同样与具有血管紧张肽转化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2；ACE2)的细胞(肺泡II型细胞或毛细血管内皮细胞等)结合(还参照J.Biol.Chem.,2005Aug 26,280(34),第30113-30119页)，因此要求开发与ACE2结合的药物。
非专利文献3中记载了：ACE2-的(不包括ACE2)间充质干细胞的静脉内移植对COVID-19肺炎患者、特别是非常严重的患者的治疗安全且有效。
非专利文献4中虽然记载了使用MSC的治疗COVID-19的临床试验计划，但并未明确记载作为治疗药是否有效。非专利文献4的FIGURE 1的MSCs为ACE2阴性，可列举在第7页的左列第4行对使用ACE2阴性的来自骨髓的间充质干细胞MSCs为宜进行了记载的文献[26](非专利文献4中的文献[26]是与非专利文献1中的文献[25]相同的文献)。另外，在非专利文献4中记载了ACE2在其他来源中的表达是未知的。
非专利文献5中虽然也同样记载了使用MSC的治疗COVID-19的临床试验计划，但并未明确记载作为治疗药是否有效。需要说明的是，在非专利文献5中没有关于ACE2的记载。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Stem Cell Rev Rep.,2020Apr 13,第16卷,第427-433页；非专利文献2：Pain Physician,2020Mar 23,23(2),E71-E83；
非专利文献3：Aging and Disease,2020Apr,11(2),第216-228页；
非专利文献4：Frontiers in Immunology,2020July 03,第11卷,1563,第1-10页；
非专利文献5：Expert Opinion on Biological Therapy,2020April 29,20(7),第711-716页。
发明内容
发明所要解决的课题
然而，在非专利文献1～5中，无法充分确定间充质干细胞的有效成分或COVID-19的治疗机制。另外，在非专利文献1～5中，着眼于将间充质干细胞用于对临床阶段、即患上COVID-19而住院的患者的治疗方法，完全没有着眼于对健康人给药。因此，在非专利文献1～5中，关于使用了间充质干细胞的COVID-19的预防方法并未阐明。
本发明所要解决的课题在于：提供一种组合物，该组合物通过对健康人或健康动物给药，可用作COVID-19等以ACE2为受体的病毒感染症的预防药等。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题进行了深入研究的结果，本发明人发现了：通过使用特定的间充质干细胞的培养上清，经实验确认到抑制以ACE2为受体的病毒与ACE2的结合，可解决上述课题。特别优选的是，发现来源于特定的间充质干细胞的培养上清的外来体表达并含有ACE2，通过使用该外来体，抑制或阻断了SARS-CoV-2在生物细胞上的吸附，可解决上述课题。
非专利文献1和4中记载了在COVID-19的治疗中使用ACE2阴性的MSC为宜，相反，由非专利文献1和4无法读取使用ACE2阳性的组合物或外来体等可预防健康人的COVID-19。即使参照最初记载有治疗病毒感染症的临床试验计划的文献，也未经任何实验确认，无法读取作为对健康人的病毒感染症的预防药的有效性。
具体而言，本发明和本发明的优选构成如下。
[1]组合物，其是包含来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清的组合物，
组合物含有血管紧张肽转化酶2(ACE2)，
组合物的用途是对健康人或健康动物给药。
[1-1]组合物，其是包含来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清的组合物，
组合物含有血管紧张肽转化酶2(ACE2)，
组合物的用途是对健康人或健康动物给药，以预防以ACE2为受体的病毒对上述健康人或上述健康动物的感染。
[2]组合物，其是包含来源于来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清的微小颗粒的组合物，
微小颗粒含有ACE2，
组合物的用途是对健康人或健康动物给药。
[2-1]组合物，其是包含来源于来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清的微小颗粒的组合物，
微小颗粒含有ACE2，
组合物的用途是对健康人或健康动物给药，以预防以ACE2为受体的病毒对上述健康人或上述健康动物的感染。
[3][2]或[2-1]所述的组合物，其中，微小颗粒为来源于来自牙髓的干细胞的培养上清的微小颗粒。
[4][2]～[3]中任一项(也包括[2-1]。下同)所述的组合物，其中，微小颗粒为外来体。
[5][2]～[4]中任一项所述的组合物，其中，微小颗粒是由培养上清纯化的微小颗粒。
[6][2]～[5]中任一项所述的组合物，该组合物包含0.01×108个/ml以上的微小颗粒。
[7][1]～[6]中任一项(也包括[1-1]和[2-1]。下同)所述的组合物，该组合物包含100ng/ml以上的ACE2。
[8][1]～[7]中任一项所述的组合物，该组合物使用未经基因修饰的来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞或来自脐带的干细胞的培养上清。
[9][1]～[8]中任一项所述的组合物，其用途是抑制以ACE2为受体的病毒与人或人以外的动物的ACE2的结合。
[10][1]～[9]中任一项所述的组合物，其中，以ACE2为受体的病毒的Spike蛋白与人或人以外的动物的ACE2的结合的抑制率为40％以上。
[11][9]或[10]所述的组合物，其用途是抑制SARS-CoV-2对具有ACE2的细胞的细胞侵入或细胞融合。
[12][1]～[11]中任一项所述的组合物，该组合物是针对健康人或健康动物的COVID-19的预防药。
[13]权利要求[1]～[12]中任一项所述的组合物，其中，来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞或来自脐带的干细胞是来自人牙髓的干细胞、来自人脂肪的干细胞或来自人脐带的干细胞。
[14]结合抑制剂，其是包含来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清的结合抑制剂，
结合抑制剂含有血管紧张肽转化酶2(ACE2)，
结合抑制剂的用途是对健康人或健康动物给药，
抑制以ACE2为受体的病毒与人或人以外的动物的ACE2的结合。
[15]结合抑制剂，其包含来源于来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清的微小颗粒，
微小颗粒含有ACE2，
结合抑制剂的用途是对健康人或健康动物给药，
抑制以ACE2为受体的病毒与人或人以外的动物的ACE2的结合。
[16]医疗器械，其包含[1]～[13]中任一项所述的组合物、以及[14]或[15]所述的结合抑制剂中的至少一种。
[17]COVID-19的预防方法，其包括以下工序：对人或人以外的动物给予[1]～[13]中任一项所述的组合物、以及[14]或[15]所述的结合抑制剂中的至少一种的工序；或者，将[16]所述的医疗器械安装于人或人以外的动物的工序。
发明效果
根据本发明，可提供一种组合物，该组合物通过对健康人或健康动物给药，可用作COVID-19等以ACE2为受体的病毒感染症的预防药等。
附图说明
[图1]图1是显示各实施例的组合物(培养上清)的Spike-ACE2结合的抑制率的图。
[图2]图2是显示实施例11的组合物(外来体)的Spike-ACE2结合的抑制率的图。
[图3]图3是显示在以用作阳性对照的PNT2 EVs的表达水平为100的情况下，各实施例和参考例的组合物中所含的外来体的ACE2表达水平的相对值的图。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。以下记载的构成要件的说明有时是基于代表性的实施方式或具体例子而进行的说明，但本发明并不限定于这样的实施方式。需要说明的是，本说明书中，用“～”表示的数值范围意思是指包括“～”前后所记载的数值作为下限值和上限值的范围。
[组合物]
本发明的组合物的第1方案为：包含来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞或它们的永生化干细胞(以下，也称为来自牙髓的干细胞等)的培养上清的组合物，组合物含有血管紧张肽转化酶2(ACE2)，用途是对健康人或健康动物给药。
本发明的组合物的第2方案为：包含来源于来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞或它们的永生化干细胞(以下，也称为来自牙髓的干细胞等)的培养上清的微小颗粒的组合物，微小颗粒含有血管紧张肽转化酶2(ACE2)，用途是对健康人或健康动物给药。
本发明的组合物的用途优选为对健康人或健康动物给药以预防(COVID-19等的)以ACE2为受体的病毒对上述健康人或上述健康动物的感染。
本发明的组合物通过对健康人或健康动物给药，可用作COVID-19等以ACE2为受体的病毒感染症的预防药等。
以下，说明本发明的组合物的优选方案。
＜微小颗粒＞
在本发明中，使用来源于来自牙髓的干细胞等的培养上清的微小颗粒。微小颗粒例如通过从来自牙髓的干细胞等的分泌、出芽或分散等，由来自牙髓的干细胞等中导出，并浸出、释放或脱落到细胞培养的培养基中。因此，微小颗粒包含在来自牙髓的干细胞等的培养上清中。
本发明的组合物可将来源于来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清的微小颗粒以包含在它们的培养上清中的状态使用、或者也可以以由培养上清纯化的状态使用。即，可使用来自牙髓的干细胞等的培养上清作为本发明的组合物，也可使用包含由它们的培养上清纯化的微小颗粒的任意组合物作为本发明的组合物。
本发明中，从Spike-ACE2结合抑制率高的观点来看，与使用由培养上清纯化的微小颗粒作为本发明的组合物相比，优选使用来自牙髓的干细胞等的培养上清作为本发明的组合物。
在本发明的组合物的第1方案中，优选组合物含有血管紧张肽转化酶2(ACE2)、且微小颗粒含有ACE2。在本发明的组合物的第2方案中，微小颗粒表达并含有ACE2。ACE2是ACE家族的锌金属蛋白酶，是肾素-血管紧张肽系的重要调节因子。ACE2与ACE相比组织分布更受限，主要存在于心脏、肾脏、睾丸、气管/肺和肠道的上皮细胞(粘膜细胞)、肺泡II型细胞、毛细血管内皮细胞等中。
由于预测含有ACE2的主要成分是微小颗粒，所以通常预测如下：在总蛋白量相等的情况下，与来自牙髓的干细胞等的培养上清相比，纯化的微小颗粒的Spike-ACE2结合抑制率更高。然而，在本发明中，还意外地在结合抑制实验中实际确认并发现了：与纯化的微小颗粒相比，来自牙髓的干细胞等的培养上清(特别是来自牙髓的干细胞的培养上清)的Spike-ACE2结合抑制率高。
(微小颗粒的特性)
微小颗粒优选为选自外来体(exosome)、微小泡、膜颗粒、膜小泡、核外颗粒体(Ectosome)和外囊泡(exovesicle)或微囊泡(microvesicle)的至少1种，更优选为外来体。
微小颗粒的直径优选为10～1000nm、更优选为30～500nm、特别优选为50～150nm。
从容易与以ACE2为受体的病毒结合的观点来看，优选微小颗粒在其表面表达、配置ACE2。
另外，希望在微小颗粒的表面存在CD9、CD63、CD81等称为四旋蛋白(tetraspanin)的分子，其可以是单独的CD9、单独的CD63、单独的CD81，或者可以是它们中的2种或3种的任意组合。
以下，有时会说明使用外来体作为微小颗粒的情况下的优选方案，但本发明的微小颗粒并不限定于外来体。
外来体优选为在多胞体与原形质膜融合时由细胞释放的细胞外小泡。
外来体的表面优选包含来源于来自牙髓的干细胞等的细胞膜的脂质和蛋白。
在外来体的内部优选包含核酸(微小RNA、信使RNA、DNA等)和蛋白等来自牙髓的干细胞等的细胞内物质。
已知外来体被用于通过从某个细胞向另一个细胞运输遗传信息而进行的细胞与细胞的通信。外来体可容易地追踪，且可靶向至特异性区域。
(微小颗粒的含量)
本发明的组合物对微小颗粒的含量没有特别限定。从提高Spike-ACE2结合的抑制率的观点来看，本发明的组合物优选包含0.5×108个以上的微小颗粒，更优选包含1.0×108个以上，特别优选包含2.0×108个以上。
本发明的组合物对以总蛋白量计的微小颗粒的含量没有特别限定。从提高Spike-ACE2结合的抑制率的观点来看，本发明的组合物以总蛋白量计优选包含0.5ng以上的微小颗粒，更优选包含1ng以上，特别优选包含2ng以上。而且，如果本发明的组合物以总蛋白量计包含超过2ng的微小颗粒，则可进一步提高Spike-ACE2结合的抑制率。
另外，本发明的组合物对微小颗粒的含有浓度没有特别限定。从提高Spike-ACE2结合的抑制率的观点来看，本发明的组合物优选包含0.01×108个/mL以上的微小颗粒，更优选包含0.05×108个/mL以上，特别优选包含0.1×108个/mL以上。
难以调制微小颗粒的含量多或含有浓度高的组合物。在本发明的组合物中，通过使用按照后述的方法制造的来自牙髓的干细胞等的培养上清、或者由其培养上清纯化微小颗粒进行使用，可增加微小颗粒的含量、或提高含有浓度。
(来自牙髓的干细胞等的培养上清)
对来自牙髓的干细胞等的培养上清没有特别限定。
来自牙髓的干细胞等的培养上清优选实质上不含血清。例如，来自牙髓的干细胞等的培养上清优选血清含量为1质量％以下、更优选为0.1质量％以下、特别优选为0.01质量％以下。
-来自牙髓的干细胞等-
来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞可来源于人、也可来源于人以外的动物。作为人以外的动物，可列举：与后述的给予本发明的组合物的对象动物(生物种)同样的动物，优选哺乳动物。
对用于培养上清的来自牙髓的干细胞没有特别限定。可使用脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from exfoliated deciduous teeth)或通过其他方法获取的乳牙牙髓干细胞或恒齿牙髓干细胞(dental pulp stem cells；DPSC)。除人乳牙牙髓干细胞或人恒齿牙髓干细胞以外，还可使用猪乳牙牙髓干细胞等来源于人以外的动物的来自牙髓的干细胞。
来自牙髓的干细胞(后述的来自脂肪的干细胞或来自脐带的干细胞也同样)除了可产生外来体还可产生血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)-1和-3、TGF-a、KGF、HBEGF、SPARC、其他生长因子、趋化因子等各种细胞因子。另外，还可产生其他的多种生理活性物质。
本发明中，来自牙髓的干细胞的培养上清中使用的来自牙髓的干细胞特别优选为包含多种蛋白的来自牙髓的干细胞，优选使用乳牙牙髓干细胞。即，本发明中，优选使用乳牙牙髓干细胞的培养上清。
对培养上清中使用的来自脂肪的干细胞没有特别限定。作为来自脂肪的干细胞，可使用任意的脂肪组织中所含的体干细胞。除来自人脂肪的干细胞以外，还可使用猪脂肪干细胞等来源于人以外的动物的来自脂肪的干细胞。作为来自脂肪的干细胞，例如可使用按照国际公开WO2018/038180号的[0023]～[0041]中记载的方法调制的来自脂肪的干细胞，该公报的内容作为参照纳入到本说明书中。
对培养上清中使用的来自脐带的干细胞没有特别限定。除来自人脐带的干细胞以外，还可使用猪脐带干细胞等来源于人以外的动物的来自脐带的干细胞。作为来自脐带的干细胞，例如可使用按照日本特开2017-119646号的[0023]～[0033]中记载的方法调制的来自脂肪的干细胞，该公报的内容作为参照纳入到本说明书中。
用于本发明的来自牙髓的干细胞等只要可实现目标处置即可，可以是天然干细胞，也可以是经基因修饰的干细胞。
特别是，在本发明中，可使用来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞的永生化干细胞。通过使用实质上可无限增殖的永生化干细胞，可使干细胞的培养上清中所含的生物因子的量和组成长期稳定。对来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞的永生化干细胞没有特别限定。永生化干细胞优选为未癌化的永生化干细胞。来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞的永生化干细胞可通过在来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞中单独或组合添加以下的低分子化合物(抑制剂)进行培养来调制。
作为TGFβ受体抑制剂，只要是具有抑制转化生长因子(TGF)β受体功能的作用的物质即可，没有特别限定，例如可列举：2-(5-苯并[1,3]二氧杂环戊烯-4-基-2-叔丁基-1H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶、3-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(4-喹啉基)-1-苯硫基氨基甲酰基-1H-吡唑(A-83-01)、2-(5-氯-2-氟苯基)蝶啶-4-基)吡啶-4-基胺(SD-208)、3-(吡啶-2-基)-4-(4-醌基)]-1H-吡唑、2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(以上，Merck公司)、SB431542(Sigma-Aldrich公司)等。可优选列举A-83-01。
作为ROCK抑制剂，只要是具有抑制Rho结合激酶的功能的作用的物质即可，没有特别限定。作为ROCK抑制剂，例如可列举：GSK269962A(Axonmedchem公司)、Fasudilhydrochloride(Tocris Bioscience公司)、Y-27632、H-1152(以上，富士胶片和光纯药株式会社)等。可优选列举：Y-27632。
作为GSK3抑制剂，只要是抑制GSK-3(Glycogen Synthase Kinase 3(糖原合酶激酶3)、糖原合成酶3)的物质即可，没有特别限定，可列举：A 1070722、BIO、BIO-丙酮肟(以上，TOCRIS公司)等。
作为MEK抑制剂，只要是具有抑制MEK(MAP激酶-ERK激酶)的功能的作用的物质即可，没有特别限定，例如可列举：AZD6244、CI-1040(PD184352)、PD0325901、RDEA119(BAY86-9766)、SL327、U0126-EtOH(以上，Selleck公司)、PD98059、U0124、U0125(以上，Cosmo Bio株式会社)等。
在将本发明的组合物用于再生医疗的情况下，从再生医疗等安全性确保法的要求出发，包含来源于来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞或它们的永生化干细胞(来自牙髓的干细胞等)的培养上清的微小颗粒的组合物为不含除来自牙髓的干细胞等以外的其他体干细胞的方案。本发明的组合物可含有除来自牙髓的干细胞等以外的间充质干细胞或其他体干细胞，但优选不含。
作为除来自牙髓的干细胞等以外的间充质干细胞，包括来自骨髓的干细胞等，但并不限定于这些。
作为除间充质干细胞以外的其他体干细胞的例子，包括来自真皮系、消化系、骨髓系、神经系等的干细胞，但并不限定于这些。作为真皮系体干细胞的例子，包括上皮干细胞、毛囊干细胞等。作为消化系体干细胞的例子，包括胰腺(整体的)干细胞、肝干细胞等。作为(除间充质干细胞以外的)骨髓系体干细胞的例子，包括造血干细胞等。作为神经系体干细胞的例子，包括神经干细胞、视网膜干细胞等。
本发明的组合物可含有体干细胞以外的干细胞，但优选不含。作为体干细胞以外的干细胞，包括胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)、胚胎癌细胞(EC细胞)。
-来自牙髓的干细胞等的培养上清的调制方法-
对来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清的调制方法没有特别限定，可采用现有的方法。
来自牙髓的干细胞等的培养上清是培养来自牙髓的干细胞等而得到的培养液，不包含细胞本身。例如通过在来自牙髓的干细胞等的培养后分离去除细胞成分，可得到可用于本发明的培养上清。可使用适当施行了各种处理(例如，离心处理、浓缩、溶剂的置换、透析、冷冻、干燥、冷冻干燥、稀释、脱盐、保存等)的培养上清。
用于得到来自牙髓的干细胞等的培养上清的来自牙髓的干细胞等可通过常规方法筛选，可根据细胞的大小或形态、或作为粘附性细胞来筛选。在来自牙髓的干细胞的情况下，可从由脱落的乳牙或恒齿采集的牙髓细胞中作为粘附性细胞或其传代细胞来筛选。在来自脂肪的干细胞的情况下，可从由脂肪组织采集的脂肪细胞中作为粘附性细胞或其传代细胞来筛选。在来自脐带的干细胞的情况下，可从由脐带采集的细胞中作为粘附性细胞或其传代细胞来筛选。在来自牙髓的干细胞等的培养上清中，可使用培养所筛选的干细胞而得到的培养上清。
需要说明的是，“来自牙髓的干细胞等的培养上清”优选为培养来自牙髓的干细胞等而得到的、不包含其细胞本身的培养液。本发明中使用的来自牙髓的干细胞等的培养上清优选在其一个方案中即使作为整体也不包含细胞(无论细胞的种类如何)。该方案的组合物通过该特征自然地使来自牙髓的干细胞等自身与包含来自牙髓的干细胞等的各种组合物明确地区别开来。该方案的典型例子是：不含来自牙髓的干细胞等、而仅由来自牙髓的干细胞等的培养上清构成的组合物。
本发明中使用的来自牙髓的干细胞的培养上清可包含来自乳牙牙髓的干细胞和来自成人牙髓的干细胞两者的培养上清。本发明中使用的来自牙髓的干细胞的培养上清优选包含来自乳牙牙髓的干细胞的培养上清作为有效成分，更优选包含50质量％以上、优选包含90质量％以上。本发明中使用的来自牙髓的干细胞的培养上清更特别优选为仅由来自乳牙牙髓的干细胞的培养上清构成的组合物。
在用于得到培养上清的来自牙髓的干细胞等的培养液中，可使用基础培养基、或在基础培养基中添加了血清等的培养基等。需要说明的是，作为基础培养基，除Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)以外，还可使用Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)(GIBCO公司等)、Ham F12培养基(HamF12)(SIGMA公司、GIBCO公司等)、RPMI1640培养基等。另外，作为可添加在培养基中的成分的例子，可列举：血清(胎牛血清、人血清、羊血清等)、血清替代品(Knockout血清替代品(KSR)等)、牛血清白蛋白(BSA)、抗生素、各种维生素、各种矿物质。
然而，为了调制不含血清的“来自牙髓的干细胞等的培养上清”，可在整个过程中或最后或从最后起的数次传代培养中使用无血清培养基。例如，通过用不含血清的培养基(无血清培养基)培养来自牙髓的干细胞等，可调制不含血清的来自牙髓的干细胞等的培养上清。进行1次或多次的传代培养，通过将最后或从最后起的多次传代培养用无血清培养基进行培养，也可得到不含血清的来自牙髓的干细胞等的培养上清。另一方面，通过利用透析或基于柱的溶剂置换等从回收的培养上清中去除血清，也可得到不含血清的来自牙髓的干细胞等的培养上清。
在用于得到培养上清的来自牙髓的干细胞等的培养中，可直接适用通常所采用的条件。关于来自牙髓的干细胞等的培养上清的调制方法，除了根据干细胞的种类适当调整干细胞的分离和筛选工序以外，可与后述的细胞培养方法同样进行。根据来自牙髓的干细胞等的种类进行的来自牙髓的干细胞等的分离和筛选可由本领域技术人员适当进行。
另外，在来自牙髓的干细胞等的培养中，为了大量生产有助于ACE2表达和/或ACE2的浓度(活性能)的特定的外来体，可适用特别条件。作为特别条件，例如可列举：低温条件、低氧条件、微重力条件等与任何刺激物进行共培养的条件等。
-来自牙髓的干细胞等的培养上清中所含的其他成分-
本发明中用于调制外来体的来自牙髓的干细胞等的培养上清除包含来自牙髓的干细胞等的培养上清以外，还可包含其他成分，但优选实质上不含其他成分。
然而，也可将用于调制外来体的各种添加剂添加至来自牙髓的干细胞等的培养上清中，然后进行保存。
(微小颗粒的纯化)
可由来自牙髓的干细胞等的培养上清纯化微小颗粒。
微小颗粒的纯化优选为由来自牙髓的干细胞等的培养上清分离包含微小颗粒的组分，更优选为分离微小颗粒。
微小颗粒可通过根据微小颗粒的特性从非缔合成分中分离而分离出来。例如，微小颗粒可根据分子量、大小、形态、组成或生物学活性进行分离。
本发明中，通过分取对来自牙髓的干细胞等的培养上清进行离心处理而得到的、含有大量微小颗粒的特定组分(例如沉淀物)，可纯化微小颗粒。可去除除规定组分以外的组分的不需要的成分(不溶成分)。从本发明的组合物中去除溶剂和分散介质、以及不需要的成分可以不是完全去除。可示例离心处理的条件如下：100～20000g、1～30分钟。
本发明中，通过对来自牙髓的干细胞等的培养上清或其离心处理物进行过滤处理，可纯化微小颗粒。可通过过滤处理去除不需要的成分。另外，如果使用适当孔径的滤膜，则可同时进行不需要的成分的去除和灭菌处理。对用于过滤处理的滤膜的材质、孔径等没有特别限定。可按照已知方法用适当的分子量或尺寸截留的滤膜进行过滤。从容易分取外来体的观点来看，滤膜的孔径优选为10～1000nm、更优选为30～500nm、特别优选为50～150nm。
本发明中，可采用柱色谱等进一步的分离方法分离来自牙髓的干细胞等的培养上清或其离心处理物或者它们的过滤处理物。例如，可采用使用了各种柱的高效液相色谱(HPLC)。柱可使用尺寸排阻柱或结合柱。
在各处理阶段的各组分中，为了追踪微小颗粒(或其活性)，可利用微小颗粒的1种以上的特性或生物学活性。例如，为了追踪微小颗粒，可采用光散射、折射率、动态光散射或UV-可见光检测器。或者，为了追踪各组分中的活性，可利用ACE2的表达水平或ACE2活性或ACE2浓度等。
作为微小颗粒的纯化方法，可采用日本特表2019-524824号公报的[0034]～[0064]中记载的方法，该公报的内容作为参照纳入到本说明书中。
＜ACE2的浓度＞
从提高Spike-ACE2结合的抑制率的观点来看，本发明的组合物优选ACE2的浓度(活性能)为100ng/ml以上、更优选为150ng/ml以上、特别优选为200ng/ml以上。
具体而言，优选来自牙髓的干细胞等的培养上清中的ACE2的浓度为上述范围。或者，优选含有来源于来自牙髓的干细胞等的培养上清的微小颗粒的组合物中的ACE2浓度为上述范围。
难以调制ACE2的浓度高的组合物。在间充质干细胞的培养上清中，来自牙髓的干细胞的培养上清的ACE2浓度也非常高，故优选使用。同样，由来自牙髓的干细胞的培养上清纯化等而调制的、含有来源于来自牙髓的干细胞的培养上清的微小颗粒的组合物的ACE2浓度也非常高，故优选使用。
可使用经基因修饰的来自牙髓的干细胞以提高ACE2的浓度。然而，即使是未经基因修饰的来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞或来自脐带的干细胞的培养上清，ACE2浓度也充分高，故可使用。在间充质干细胞的培养上清中，来自牙髓的干细胞的培养上清的ACE2浓度也非常高，因此可优选使用含有未经基因修饰的来自牙髓的干细胞的培养上清或来源于其的微小颗粒的组合物。因此，在将本发明的组合物给予至人或动物时，即使在出于安全上或伦理上的理由要求不进行基因修饰的情况下，也可使用本发明的组合物(特别是含有来自牙髓的干细胞的培养上清或来源于其的微小颗粒的组合物)。
另外，通过使用按照后述方法制造的来自牙髓的干细胞等的培养上清、或者使用来源于其培养上清的微小颗粒，可提高ACE2的浓度。
＜其他成分＞
本发明的组合物除了含有微小颗粒，还可根据给药的对象动物的种类或目的，在不损及本发明效果的范围内含有其他成分。作为其他成分，可列举：营养成分、抗生素、细胞因子、保护剂、载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、无痛化剂、稳定剂、保存剂、防腐剂等。
作为营养成分，例如可列举：脂肪酸等、维生素等。
作为抗生素，例如可列举：青霉素、链霉素、庆大霉素等。
作为载体，可列举：作为药学上可接受的载体而已知的材料。
本发明的组合物可以是微小颗粒本身，也可以是进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂等的药物组合物。药物组合物的目的在于促进对给药对象的动物给予微小颗粒。
药学上可接受的载体优选为不会对给药对象的动物引起显著的刺激性、不会抑制所给予的化合物的生物学活性和特性的载体(包含稀释剂)。载体的例子为：丙二醇；(生理)盐水；乳液；缓冲液；培养基、例如DMEM或RPMI等；含有去除自由基的成分的低温保存培养基。
另一方面，本发明的组合物优选不含规定的物质。
例如，本发明的组合物优选不含来自牙髓的干细胞等。
另外，本发明的组合物优选不含MCP-1。然而，可包含MCP-1以外的细胞因子。作为其他细胞因子，可列举：日本特开2018-023343号公报的[0014]～[0020]中记载的细胞因子等。
另外，本发明的组合物优选不含Siglec-9。然而，可包含除Siglec-9以外的其他唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素。
需要说明的是，本发明的组合物优选实质上不含血清(胎牛血清、人血清、羊血清等)。另外，本发明的组合物优选实质上不含Knockout血清替代品(KSR)等现有的血清替代品。
本发明的组合物优选上述的其他成分的含量(固体成分量)均为1质量％以下、更优选为0.1质量％以下、特别优选为0.01质量％以下。
＜组合物的制造方法＞
对本发明的组合物的制造方法没有特别限定。
可使用通过上述方法调制的来自牙髓的干细胞等的培养上清、或商业购入而获取的来自牙髓的干细胞等的培养上清作为本发明的组合物。
另外，可利用上述方法调制来自牙髓的干细胞等的培养上清，然后由来自牙髓的干细胞等的培养上清纯化微小颗粒，调制本发明的组合物。或者，可由商业购入而获取的来自牙髓的干细胞等的培养上清纯化微小颗粒，调制本发明的组合物。也可接受包含废弃处理的来自牙髓的干细胞等的培养上清的组合物(或适当纯化其组合物)，从中纯化微小颗粒，调制本发明的组合物。
对本发明的组合物的最终形态没有特别限定。例如，本发明的组合物可列举：将微小颗粒与溶剂或分散介质一同填充至容器中而形成的形态；将微小颗粒与凝胶一同凝胶化且填充至容器中而形成的形态；将微小颗粒冷冻和/或干燥进行固态化制成制剂或填充至容器中而形成的形态等。作为容器，例如可列举：适于冷冻保存的管、离心管、袋等。冷冻温度例如可设为-20℃～-196℃。
＜组合物的用途＞
本发明的组合物的用途是对健康人或健康动物给药。健康人或健康动物意思是指没有发生以ACE2为受体的病毒感染症的、无症状的人或动物。健康人或健康动物还包括无症状感染的人或动物，无论其对以ACE2为受体的病毒感染症是否呈阴性。需要说明的是，本发明的组合物的用途优选为对以ACE2为受体的病毒感染症呈阴性的人或动物给药。然而，从有效预防的观点来看，无需进行预诊断以确定阴性的人或动物，而是优选对阴性和/或无症状感染的人或动物给药。
本发明的组合物可用作以ACE2为受体的病毒感染症的预防药。特别是，本发明的组合物可用作COVID-19的预防药。然而，本发明的组合物可在除COVID-19的预防药以外的用途中使用。在任何情况下本发明的组合物均优选为药物组合物。
以下，说明本发明的组合物的用途。
本发明的组合物充分地含有ACE2。
这里，在以ACE2为受体的病毒(SARS-CoV等一部分冠状病毒等)感染人或人以外的动物的情况下，其存在于细胞表面，与作为病毒受体蛋白的ACE2结合后，发生病毒外膜与细胞膜的融合。例如，在冠状病毒的情况下，Spike蛋白(S蛋白)与人(或人以外的动物)的细胞的细胞膜的ACE2结合后，被蛋白分解酶切断，S蛋白被激活，病毒外膜与细胞膜融合。本发明的组合物中所含的微小颗粒表面的ACE2首先与冠状病毒结合，阻碍或抑制之后的冠状病毒与具有ACE2的细胞的结合、侵入或融合，成为感染冠状病毒感染症的防御。因此，与以ACE2为受体的病毒结合的成分可用作这些冠状病毒感染症的预防药。即，本发明的组合物优选抑制冠状病毒与人或人以外的动物的ACE2的结合，更优选为冠状病毒对具有ACE2的细胞的细胞侵入抑制剂或细胞融合抑制剂。另外，由于微小颗粒对病毒起着诱饵(诱惑物)的作用，所以本发明的组合物优选为针对冠状病毒的诱饵。
本发明的组合物对以ACE2为受体的病毒的Spike蛋白与ACE2的结合(Spike-ACE2结合)的抑制率只要是10％以上即可，优选为40％以上、更优选为50％以上、特别优选为60％以上。
另外，作为引起COVID-19的病毒的SARS-CoV-2也和以往已知的SARS-CoV同样与具有ACE2的细胞结合。因此，本发明的组合物更优选为SARS-CoV-2对具有ACE2的细胞的细胞侵入抑制剂或细胞融合抑制剂。而且，与以ACE2为受体的病毒结合、并抑制病毒与人或人以外的动物的ACE2结合(形成竞争关系；作为诱饵起作用)的本发明的组合物可用作COVID-19的预防药。因此，在本申请的申请时，即使没有显示作为COVID-19的预防药的药理试验结果，也可以说本发明的组合物可用作COVID-19的预防药(存在使用的可能性)。
成为COVID-19(新型冠状病毒感染症)是指人或人以外的动物的生物体具有感染了SARS-CoV-2的细胞。感染症特别是可通过由呼吸系统样品进行检测或病毒滴定的方法、或检测血液循环SARS-CoV-2特异性抗体的方法等来确认，此时采用利用了PCR的已知方法。
COVID-19的预防意思是指阻止由SARS-CoV-2引起的人或人以外的动物的生物体内的感染、或者至少减少其发生的可能性。通过给予本发明的组合物，人或动物的细胞感染SARS-CoV-2的可能性降低。
本发明的组合物可与COVID-19的治疗药并用。COVID-19的治疗意思是指在人或人以外的动物的生物体内减少、减弱与病毒感染有关的症状(呼吸系统综合征、发热等)、或缩短其症状的恢复期间。优选通过给予本发明的组合物使人或动物的生物体的病毒感染率(感染效价)减少，更优选病毒从生物体完全消灭。
本发明的组合物可用作后述的本发明的医疗器械的材料或医疗器械的交换构件。
与现有的可用作COVID-19的预防药的组合物相比，本发明的组合物具有以下优点：容易大量生产，可有效利用以往作为产业废弃物等废弃的干细胞的培养液，降低干细胞的培养液的废弃成本等。特别是在来自牙髓的干细胞等的培养上清为来自人牙髓的干细胞、来自人脂肪的干细胞或来自人脐带的干细胞的培养上清的情况下，在对人适用本发明的组合物的情况下也具有以下优点：在免疫学等观点上的安全性高、伦理性的问题也少。在来自牙髓的干细胞等的培养上清为来源于各种疾病患者(不孕症等)的来自牙髓的干细胞等的培养上清的情况下，在对其患者适用本发明的组合物时，安全性更高，伦理性的问题也会减少
本发明的组合物来源于来自牙髓的干细胞等的培养上清，因此也可用于修复医疗的用途。特别是包含来自牙髓的干细胞等的培养上清的液体优选用于修复医疗的用途。这里，在以干细胞移植为前提的再生医疗中，已知干细胞不是再生的主角，而是干细胞产生的体液成分与自身的干细胞一起修复脏器。以往的干细胞移植所伴随的癌化、标准化、给药方法、保存性、培养方法等困难的问题得到解决，利用使用了来自牙髓的干细胞等的培养上清的组合物可进行修复医疗。与干细胞移植相比，在使用了本发明的组合物的修复中没有移植细胞，故不易发生肿瘤化等，可谓更加安全。另外，来自牙髓的干细胞等的培养上清或本发明的组合物具有可使用恒定标准化的品质的产品的优点。由于可选择大量生产或有效的给药方法，因此能够以低成本利用。
[结合抑制剂]
本发明的结合抑制剂的第1方案为：包含来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清的结合抑制剂，结合抑制剂含有血管紧张肽转化酶2(ACE2)，结合抑制剂的用途是对健康人或健康动物给药，抑制以ACE2为受体的病毒与人或人以外的动物的ACE2的结合。
本发明的结合抑制剂的第2方案为结合抑制剂，其包含来源于来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清的微小颗粒，微小颗粒含有ACE2，结合抑制剂的用途是对健康人或健康动物给药，抑制以ACE2为受体的病毒与人或人以外的动物的ACE2的结合。
本发明的结合抑制剂与其说是治疗与COVID-19等以ACE2为受体的病毒感染症相关的多种症状或疾病，不如说是在为了预防以ACE2为受体的病毒感染症的感染而对健康人或健康动物给药的用途中使用。
另一方面，以ACE2为受体的病毒感染症的治疗药并不能预防以ACE2为受体的病毒感染症的感染。
因此，本发明的结合抑制剂明确地与以ACE2为受体的病毒感染症的治疗药相区别，根据作用机制的不同，在对健康人或健康动物给药方面预防对象组和/或对象疾病不同。关于本发明的组合物，这一点也同样。
对给予本发明的结合抑制剂的对象的人等(人或人以外的动物)的年龄没有特别限定。本发明的结合抑制剂可对年轻人等给药，也可对老年人等给药。在感染时老年人等的重症化风险高、而年轻人等为轻症或无症状的病毒感染症(例如COVID-19)的情况下，从有效预防的观点来看，优选将成为给药对象的预防对象组限定为老年人等。
另外，在某种程度上判明重症化的风险高的组的病毒感染症(例如COVID-19)的情况下，从有效预防的观点来看，优选将成为给药对象的预防对象组限定为重症化风险高的组。作为重症化的风险，可列举：上述的高龄、有基础疾病的人或动物、孕妇、吸烟史等。作为基础疾病，可列举：慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性肾病、糖尿病、高血压、心血管疾病、肥胖等。
[医疗器械]
本发明的医疗器械包含本发明的组合物。
作为医疗器械，可列举：面罩、面罩用过滤器、表面密封件、空间病毒去除装置等。
作为包含本发明的组合物的面罩，可列举：具有至少1片具有本发明的组合物的面罩用过滤器(病毒结合过滤器)的面罩。具有本发明的组合物的面罩用过滤器可通过涂布法、浸渍法等已知的方法对已知的过滤器赋予本发明的组合物来制造。面罩可自由地取出具有本发明的组合物的面罩用过滤器，可任意交换面罩用过滤器。包含本发明的组合物的面罩可含有ACE2，因此可吸附SARS-CoV-2等病毒，抑制其透过。
作为包含本发明的组合物的表面密封件，可通过涂布法、浸渍法等已知的方法对已知的表面密封件赋予本发明的组合物来制造。或者，可对作为表面密封件的材料的树脂片材(丙烯酸类片材等)等赋予本发明的组合物后制造表面密封件。包含本发明的组合物的表面密封件含有ACE2，因此可抑制SARS-CoV-2等病毒的吸附、透过。
作为包含本发明的组合物的空间病毒去除装置，可列举：在空间病毒去除装置内填充本发明的组合物使其可连续或间断地射出的装置。对连续或间断地射出本发明的组合物的方法没有特别限定，可使用电等动力，也可通过生物体的热或化学反应等缓释，还可手动操作喷雾装置等。空间病毒去除装置的形状可以是具备可安装于生物体的细带的垂饰型，也可以是具有可固定于某个空间的固定构件的形状，还可以是以喷雾的方式自由移动的形状。空间病毒去除装置可自由填充本发明的组合物，使可任意交换本发明的组合物。包含本发明的组合物的空间病毒去除装置可连续或间断地射出含有ACE2的组合物或微小颗粒，因此可吸附SARS-CoV-2等病毒，可抑制病毒侵入人等生物体的内部。
[COVID-19的预防方法]
本发明的COVID-19的预防方法包括以下工序：对人或人以外的动物给予本发明的组合物的工序；或者，将本发明的医疗器械安装于人或人以外的动物的工序。
对人或人以外的动物给予本发明的组合物的工序没有特别限定。
给药方法可列举：向口腔、鼻腔或气管喷雾或吸引、点滴、局部给药、滴鼻剂等，优选侵袭少。作为局部给药的方法，优选注射。另外，还优选电穿孔，其是通过对皮肤表面施加电压(电脉冲)使细胞膜短暂地产生微细的孔，使有效成分渗透至真皮层，这在常规护理中是无法达到的。
给予至动物的本发明的组合物可在动物的体内循环，并与具有ACE2的组织(细胞或干细胞)结合。
对给药次数和给药间隔没有特别限定。给药次数可设为1～2次以上，优选为1～5次，更优选为1次或2次、特别优选为2次。给药间隔优选为1～24小时、更优选为12小时以内。然而，可根据给药对象的愿望适当调整。
给药时期和给药期间只要是想要预防病毒感染的时期或其之前即可，没有特别限定。在想要预防病毒感染的时期可每天连续给药，也可设定适当间隔进行给药。也可像面罩或表面密封件那样，在外出时或与他人接触时等仅根据给药对象的愿望进行给药。
在有义务对规定人员(密切接触者、来自海外的归国人员或旅行者、到海外的出国人员等)在一定期间连续给药的情况下，可在规定期间每天连续给药。另外，在对与病毒感染者的接触机会多的医生或护士等医疗相关人员给药的情况下，可仅在有与病毒感染者接触的机会的情况下(每个工作期间等)给药。在这些情况下，优选像避孕药那样以为了适当的连续给药或间隔给药而设置的、每1天的给药量的药物试剂盒或药物包装的形式制造本发明的组合物。可适当地配合间隔适当地配置假药。或者，像疫苗那样，在想要通过1次给药进行1周以上等长期预防的情况下，可将大量的给药量汇总一起进行1次给药。
对给予本发明的组合物的对象动物(生物种)没有特别限定。给予本发明的组合物的对象动物优选为哺乳动物、鸟类(鸡、鹌鹑、鸭等)、鱼类(鲑鱼、鳟鱼、金枪鱼、鲣鱼等)。作为哺乳动物，可以是人，也可以是非人哺乳动物，但特别优选为人。作为非人哺乳动物，更优选为牛、猪、马、山羊、绵羊、猴、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠。
对将本发明的医疗器械安装于人或人以外的动物的工序没有特别限定。可根据本发明的医疗器械的形态将本发明的医疗器械安装于人或人以外的动物。对安装本发明的组合物的对象动物没有特别限定，优选范围与给予本发明的组合物的对象动物同样。
实施例
以下，列举实施例和比较例或参考例以进一步具体地说明本发明的特征。以下的实施例中所示的材料、使用量、比例、处理内容、处理步骤等只要不脱离本发明的宗旨则可适当变更。因此，本发明的范围不应由以下所示的具体例子限定性地解释。
[实施例1]
＜来自牙髓的干细胞的培养上清的调制＞
使用DMEM培养基代替DMEM/Ham F12混合培养基，其他则依据日本专利第6296622号的实施例6中记载的方法，调制了乳牙牙髓干细胞的培养上清。在原代培养中，添加胎牛血清(FBS)进行培养，在传代培养中分取使用原代培养液进行培养的传代培养液的上清使不含FBS，调制了乳牙牙髓干细胞的培养上清。需要说明的是，DMEM是Dulbecco改良Eagle培养基，F12是Ham F12培养基。
将所得到的乳牙牙髓干细胞的培养上清作为实施例1的组合物。
[实施例2]
除了使用来自脂肪的干细胞以外，与实施例1同样地操作，调制了来自脂肪的干细胞的培养上清。将所得到的来自脂肪的干细胞的培养上清作为实施例2的组合物。
[培养上清的Spike-ACE2结合抑制的评价]
使用COVID-19Spike-ACE2结合测定试剂盒(品号：CoV-SACE2；RayBiotech公司制造)，按照以下的方法评价实施例1和2的组合物的Spike-ACE2结合抑制。需要说明的是，在各孔中事先固定有SARS-CoV-2Spike RBD重组蛋白。
＜试剂的调制＞
(1)将5×测定稀释剂(Item E2)用蒸馏水稀释5倍，调制了所需量的1×测定稀释剂。
(2)将20×测定稀释剂(Item B)用蒸馏水稀释5倍，调制了所需量的1×洗涤缓冲液。
(3)在ACE2蛋白(Item F)中添加50μl上述(1)中得到的1×测定稀释剂，调制了ACE2蛋白浓缩液。
(4)在1000×检测抗体(Item C)的1个小瓶中加入100μl上述(1)中得到的1×测定稀释剂。
(5)将上述(4)中得到的溶液用上述(1)中得到的1×测定稀释剂稀释至55倍，调制了所需量的ACE2检测抗体溶液。
(6)将HRP缀合抗山羊IgG用上述(1)中得到的1×测定稀释剂稀释至1000倍，调制了1×HRP缀合的抗山羊IgG溶液。
＜试验样品的准备＞
在实施例1和2的50μl组合物中混合0.7μl ACE2蛋白浓缩液，将其用1×测定稀释剂稀释，使总量为100μl。
＜测定协议＞
将各试剂恢复至室温。
在实施例1和2的50μl组合物中混合0.7μl ACE2蛋白浓缩液，将其用1×测定稀释剂稀释后的总量100μl加入到附带的微孔板的各孔中。在微孔板上盖上盖子，在室温下边振荡边培养2.5小时。
舍弃各孔中的溶液后，在各孔中加入300μl 1×洗涤缓冲液，进行4次洗涤。加入100μl ACE2检测抗体溶液(山羊抗ACE2抗体)，在室温下边振荡边培养1小时。
舍弃各孔中的溶液后，加入300μl 1×洗涤缓冲液，进行4次洗涤。加入100μl 1×HRP-缀合抗山羊IgG溶液，在室温下边振荡边培养1小时。
舍弃各孔中的溶液后，加入300μl 1×洗涤缓冲液，进行4次洗涤。加入100μl TMB(四甲基联苯胺)一步法底物试剂，在室温下边避光振荡边培养10分钟。
在各孔中加入50μl终止液(反应终止液)。
测定了450nm的吸光度。边观察显色的状态边进行测定。
所得结果见图1。
由图1可知：实施例1和2的组合物、即来自牙髓的干细胞的培养上清和来自脂肪的干细胞的培养上清可抑制Spike-ACE2结合。特别是可知：与来自脂肪的干细胞的培养上清(实施例2)相比，来自牙髓的干细胞的培养上清(实施例1)的结合抑制率高。
[实施例11]
＜由来自牙髓的干细胞的培养上清调制外来体＞
为了确定主要有助于抑制Spike-ACE2结合的成分，按照以下的方法由实施例1中得到的乳牙牙髓干细胞的培养上清纯化了来自牙髓的干细胞的外来体。
用孔径为0.22微米的过滤器过滤乳牙牙髓干细胞的培养上清(100mL)，之后将其溶液在4℃下以100000×g离心分离60分钟。倾析上清，将外来体浓缩颗粒重新悬浮于磷酸缓冲盐水(PBS)中。将重新悬浮的样品以100000×g离心分离60分钟。再次将颗粒作为浓缩样品从离心管的底部回收(约100μl)。蛋白浓度通过微小BSA蛋白测定试剂盒(Pierce、Rockford、IL)来确定。包含外来体的组合物(浓缩溶液)在-80℃下保管。
将所得到的包含外来体的组合物作为实施例11的组合物。
＜Spike-ACE2结合抑制的评价＞
除了使用以总蛋白量计为2μg的来自牙髓的干细胞EVs(实施例11的组合物)代替50μl来自牙髓的干细胞的培养上清(实施例1的组合物)以外，与实施例1同样地操作，对Spike-ACE2结合抑制进行评价。
所得结果见图2。
由图2可知：来自牙髓的干细胞EVs(实施例11的组合物)可抑制Spike-ACE2结合。来自牙髓的干细胞EVs的结合抑制率为40.8％。
进一步可知：在使来自牙髓的干细胞EVs(实施例11的组合物)以总蛋白量计从2μg开始增加并进行同样的评价时，结合抑制率进一步提高。
由图1和图2的结果可知：在来自牙髓的干细胞等的培养上清中主要有助于Spike-ACE2结合抑制的成分是外来体。
[实施例12]
与实施例11同样地操作，由实施例2中得到的来自脂肪的干细胞的培养上清调制了包含外来体的组合物。将所得到的包含外来体的组合物作为实施例12的组合物。
[实施例13]
除了使用来自脐带的干细胞以外，与实施例1同样地操作，调制了来自脐带的干细胞的培养上清。与实施例11同样地操作，由所得到的来自脐带的干细胞的培养上清调制了包含外来体的组合物。将所得到的包含外来体的组合物作为实施例13的组合物。
[参考例1]
除了使用来自骨髓的干细胞以外，与实施例1同样地操作，调制了来自骨髓的干细胞的培养上清。与实施例11同样地操作，由所得到的来自骨髓的干细胞的培养上清调制了包含外来体的组合物。将所得到的包含外来体的组合物作为参考例1的组合物。
[评价]
＜外来体的特性＞
实施例1、2、11～13的组合物中所含的微小颗粒的平均粒径均为50～150nm。
实施例11～13的组合物是1.0×109个/μL的高浓度外来体溶液。
另外，按照已知方法分析了所得到的实施例1、2、11～13的组合物的成分。其结果可知：各实施例的组合物不含来自牙髓的干细胞等的干细胞，不含MCP-1，也不含Siglec-9。因此，可知：与作为间充质干细胞的培养上清的有效成分的MCP-1和Siglec-9以及它们的类似物不同的有效成分是各实施例的组合物的有效成分。
＜ACE2的表达的确认＞
使用作为多克隆抗体的ACE2抗体(品号：21115-1-AP；Cosmo Bio株式会社制造)，按照以下的方法进行了各实施例1、2、11～13或参考例的组合物中的ACE2的表达的确认。
调制报道了ACE2的表达的PNT2细胞的外来体，将包含该外来体的组合物作为PNT2EVs。
通过ELISA法测定了来自牙髓的干细胞的培养上清(实施例1的组合物)、来自脂肪的干细胞的培养上清(实施例2的组合物)、来自牙髓的干细胞EVs(实施例11的组合物)、来自脂肪的干细胞EVs(实施例12的组合物)、来自脐带的干细胞EVs(实施例13的组合物)、来自骨髓的干细胞EVs(参考例1的组合物)和PNT2 EVs的ACE2的表达水平、即ACE2蛋白量。
求出在以用作阳性对照的PNT2 EVs的表达水平为100的情况下的各实施例和参考例的组合物中所含的外来体的ACE2表达水平的相対值(N＝1)。在所得结果中，实施例11～13和参考例1的结果见图3。
由图3可知：在各实施例的组合物所含的外来体中，ACE2表达并被含有。特别是，可知：与来自脐带的干细胞EVs(实施例13)相比，来自牙髓的干细胞EVs(实施例11)和来自脂肪的干细胞EVs(实施例12)的ACE2的表达水平高。由这些结果可知：本发明的组合物可用作COVID-19的预防药。另外，ACE2的表达水平越高，越容易与以ACE2为受体的病毒结合，因此对COVID-19的预防更有利。
另一方面，来自骨髓的干细胞EVs(参考例1)无法检测到ACE2的表达。根据该结果，来源于来自骨髓的干细胞的培养上清的外来体是否可用作COVID-19的预防药还不明确。
＜ACE2的浓度测定＞
使用SensoLyte(注册商标)390ACE2活性测定试剂盒、Fluorimetric(AnaSpec公司制造)测定了来自牙髓的干细胞EVs(实施例11的组合物)、来自脂肪的干细胞EVs(实施例12的组合物)、来自脐带的干细胞EVs(实施例13的组合物)、来自骨髓的干细胞EVs(参考例1的组合物)的ACE2的浓度(活性能)(100测定；N＝2)。
测定时，将各实施例和参考例的组合物的外来体浓度设为1×109个/ml，在实施例和参考例中将组合物的使用量设为等量，从而使外来体量为等量。所得结果见下述表1。
需要说明的是，ACE2的浓度优选为100ng/ml以上、更优选为150ng/ml以上、特别优选为200ng/ml以上。
[表1]
EVs ACE2浓度(ng/ml)
实施例11 来自牙髓的干细胞EVs 225.3
实施例12 来自脂肪的干细胞EVs 124.1
实施例13 来自脐带的干细胞EVs 178.8
参考例1 来自骨髓的干细胞EVs 56.6
由上述表1可知：各实施例的组合物的ACE2浓度高。特别是，可知：与来自脂肪的干细胞EVs(实施例12)和来自脐带的干细胞EVs(实施例13)相比，来自牙髓的干细胞EVs(实施例11)的ACE2浓度高。作为确认与以ACE2为受体的病毒结合的容易度的方法，确认ACE2的浓度比确认ACE2的表达更准确。ACE2的浓度(活性能)越高，越容易与以ACE2为受体的病毒结合，因此作为针对病毒的诱饵更有效，对COVID-19的预防更有利。
另一方面，来自骨髓的干细胞EVs(参考例1)的ACE2浓度低。
需要说明的是，实施例1的组合物(来自牙髓的干细胞的培养上清)的ACE2浓度与来自牙髓的干细胞EVs(实施例11)的ACE2浓度为同等程度。实施例2的组合物(来自脂肪的干细胞的培养上清)的ACE2浓度与来自脂肪的干细胞EVs(实施例12)的ACE2浓度为同等程度。

Claims (17)

1.组合物，其是包含来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清的组合物，
上述组合物含有血管紧张肽转化酶2即ACE2，
组合物的用途是对健康人或健康动物给药，以预防以ACE2为受体的病毒对上述健康人或上述健康动物的感染。
2.组合物，其是包含来源于来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清的微小颗粒的组合物，
上述微小颗粒含有ACE2，
组合物的用途是对健康人或健康动物给药，以预防以ACE2为受体的病毒对上述健康人或上述健康动物的感染。
3.权利要求2所述的组合物，其中，上述微小颗粒是来源于上述来自牙髓的干细胞的培养上清的微小颗粒。
4.权利要求2或3所述的组合物，其中，上述微小颗粒为外来体。
5.权利要求2～4中任一项所述的组合物，其中，上述微小颗粒是由上述培养上清纯化的微小颗粒。
6.权利要求2～5中任一项所述的组合物，该组合物包含0.01×108个/ml以上的上述微小颗粒。
7.权利要求1～6中任一项所述的组合物，该组合物包含100ng/ml以上的ACE2。
8.权利要求1～7中任一项所述的组合物，该组合物使用未经基因修饰的上述来自牙髓的干细胞、上述来自脂肪的干细胞或上述来自脐带的干细胞的培养上清。
9.权利要求1～8中任一项所述的组合物，其用途是抑制以ACE2为受体的病毒与人或人以外的动物的ACE2的结合。
10.权利要求1～9中任一项所述的组合物，其中，以ACE2为受体的病毒的Spike蛋白与人或人以外的动物的ACE2的结合的抑制率为40％以上。
11.权利要求9或10所述的组合物，其用途是抑制SARS-CoV-2对具有ACE2的细胞的细胞侵入或细胞融合。
12.权利要求1～11中任一项所述的组合物，其是针对健康人或健康动物的COVID-19的预防药。
13.权利要求1～12中任一项所述的组合物，其中，上述来自牙髓的干细胞、上述来自脂肪的干细胞或上述来自脐带的干细胞是来自人牙髓的干细胞、来自人脂肪的干细胞或来自人脐带的干细胞。
14.结合抑制剂，其是包含来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清的结合抑制剂，
上述结合抑制剂含有血管紧张肽转化酶2即ACE2，
结合抑制剂的用途是对健康人或健康动物给药，
抑制以ACE2为受体的病毒与人或人以外的动物的ACE2的结合。
15.结合抑制剂，其包含来源于来自牙髓的干细胞、来自脂肪的干细胞、来自脐带的干细胞或它们的永生化干细胞的培养上清的微小颗粒，
上述微小颗粒含有ACE2，
结合抑制剂的用途是对健康人或健康动物给药，
抑制以ACE2为受体的病毒与人或人以外的动物的ACE2的结合。
16.医疗器械，其包含权利要求1～13中任一项所述的组合物、以及权利要求14或15所述的结合抑制剂中的至少一种。
17.COVID-19的预防方法，其包括以下工序：对人或人以外的动物给予权利要求1～13中任一项所述的组合物、以及权利要求14或15所述的结合抑制剂中的至少一种的工序；或者，将权利要求16所述的医疗器械安装于人或人以外的动物的工序。
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