MX2010009540A - Composiciones y metodos para usar celulas estromaticas para mejorar el tratamiento de lesiones del sistema nervioso central. - Google Patents

Abstract

La presente invención provee nuevos métodos y composiciones para el tratamiento de lesiones al sistema nervioso central de mamífero. Estos métodos implican administrar células estromáticas en combinación con un agente permeabilizante de barrera hemato-cerebral a fin de mejorar la neurorrestauración, recuperación neurológica funcional, injerto de células estromáticas y tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.

Description

POSICIONES Y METODOS PARA USAR CELULAS ES ROMATI EJORAR EL TRATAMIENTO DE LESIONES DEL SISTEMA NER CENTRAL Campo de la Invención El campo de la presente invención está gene cionado con el tratamiento de un sistema nervios onado. De manera más específica, la presente dirigida al tratamiento de un sistema nervioso onado al administrar células estromáticas y u eabilizante de barrera hemato-cerebral.

Antecedentes de la Invención La mayoría de las lesiones del sistema ral (SNC) son causadas por accidente vascular on cerebral traumática, lesión de médula cipales contribuyentes a incapacidad en adultos roximadamente 40 millones de personas a nivel mu raleza de alteraciones en estructuras cerebrov contribuyen a accidente vascular cerebral ulos sanguíneos que se forman en los vasos sangu bro (trombo) , coágulos sanguíneos o piezas osclerótica u otro material que viaja al cereb lugar (émbolos) , y hemorragia de vasos sanguín anto, el accidente vascular cerebral puede ser flujo sanguíneo reducido como resultado de una h águlo cerebrovascular, lo que resulta en sumin re deficiente, isquemia, y/o infarto del onado .

El accidente vascular cerebral hemorrág ién se conoce como hemorragia intracerebral (HIC a 15% de accidentes vasculares cerebrales, con ionalmente independientes en 6 meses después de l sell C, Boonyakamkul S, Dennis M, Sandercock P, erebrovasc Dis.1995; 5:26-3) .

El sangrado en curso sustancial ocurre en HIC, particularmente' durante las primeras 3 a ués del inicio, que está ligado a deterioro neu stos pacientes. Más aún, un estudio demostró entes con accidente vascular cerebral con frecu en siquiera atención médica sino hasta 3-6 horas accidente vascular cerebral (Evenson et al oepidemiology, 20(2) : 65-76) . Normalment amientos de accidente vascular cerebral agudo nistrar dentro de las primeras horas después de que sean efectivos, y no proveen ningún orrestaurador en el tejido del SNC lesionado. o, si la ventana de tiempo para tratamiento de a rvaciones, actualmente hay una urgente neces ar enfoques celulares y terapéuticos farmac dosos que puedan ser efectivos más allá de raguda de isquemia. La ampliación de las ro ínsecas del cerebro para neuroplasticidad y sub eración neurologica se vuelve critica en tratami eración post-accidente vascular cerebral diseña rar la reorganización estructural y funcional (e ticidad) del cerebro dañado.

El trasplante intracerebral de células m dor de tejido embrionario se ha mostrado rencian en células neurales (Snyder et al. , ol. 72:121-32) . Se han usado injeretos astriatales para reconstruir circuitos de ies dañados y para mitigar déficits de comportam odelo de isquemia de mamífero (Goto et al., 4 :555-7) .

Las células madre neurales son ca éuticos de células importantes para el tratam ente vascular cerebral y otras enfermedades o a su capacidad para diferenciarse in vitro e euronas, astrocitos y oligodendrocitos . El p ipotencial poderoso de las células madre, en hacer posible tratar de manera efectiva enferm nes con alteraciones complicadas en el circuito S como accidente vascular cerebral, en donde má ción de células es afectada. De hecho, entes, se ha enfocado mucha atención en la capa células madre pluripotenciales indiferenciad rar las afecciones neurológicas experiméntal yen accidente vascular cerebral isquémico, ral y lesión de médula espinal (Chopp et al., Otra avenida potencial para terapia a ías es células de sangre de cordón umbilica ?) , que tienen un porcentaje relativamente, ias madre hematopoyéticas , y se han usado par ente vascular cerebral isquémico en modelos a os grupos han demostrado que las célul evivieron y migraron hacia el SNC de animales no rmos y se ha mostrado que promueven la recu ional en modelos animales de accidente vascular émico, lesión de médula espinal y he acerebral (Chen et al., 2001 Stroke, 32(11) : 26 2002 Cell Transplant, 11(3) : 275-81; Saporta J. Hematotherapy & Stem Cell Research, 12: 2 e las células SCUH se han usado para tratar a ular cerebral isquémico, lesión de médula e rragia intracerebral, aún quedan dudas en cuan ejidos no hematológicos . Las CEMOs de uso potenc rar y remodelar tejidos de cerebro lesionado rtado mediante el uso de diferentes modelos a ón (Chopp et al., 2000; Mahmood et al., 2003; Li ; Kopen et al., 1999; Li et al., 2002; y Li ) . La terapia de CEMO induce cambios neurorrest l. cerebro, que son reflectivos de varios mecan ón.

En modelos previos de lesión neurológica rado que las CEMOs pasan a través de la barrera bral a sitios objetivo de lesiones del cerebr 2001; Mahmood et al., 2003; y Zhang et al.,; 2 n neonatal, las CEMOs migran ampliamente a tr bro en desarrollo y han mostrado la capaci renciarse en neuronas y astrocitos (Kopen et al.

CEMOs infundidas sistémicamente en icipar en el proceso restorador. Sin emba Cidad de las CEMOs para localizar a una región d cerebro e incrementar las concentraciones lo ores de crecimiento tales como factor de crecim io, factor de crecimiento de nervio derivado de ies, factor de crecimiento de nervio derivado de ctor de crecimiento endotelial vascular también p rimordial importancia (Villars et al, 2000; Li ; y Lu et al, 2004). Estos factores de cre rtan y amplifican angiogénesis, neurogénesis , oñal, y plasticidad sináptica (Carmeliet et al. et al, 2002) . Por lo tanto, las CEMOs parecen co pequeñas fábricas bioquímicas y molecu lizadores, lo que produce e induce dentro de las parénquima muchas citocinas y factores tróf ementan la angiogénesis y estabilización vascul ificativo en recuperación animal, mientras ones de CEMOhs inyectadas por vía intraarterial unción neurológica (Chen et al., 2003 y Li et al rabajo previo en un modelo de lesión cerebral t rimental (LCT) mediante el uso de terapia de aarteriales proveyó una vía de administración dio por resultado isquemia cerebral incrementad ombosis cerebrovascular de vasos pequeños por las péuticas mismas (Lu et al, 2001) .

La aplicación de CMMs para tratar HIC expe a estudiado de manera menos extensiva para el tra ccidente vascular cerebral isquémico y LCT. Cuat dos millones de células madre mesenqu nistradas a través de la arteria carótida para tr cida por colagenasa mejoraron la función motora a et al, 1998) . En otro modelo de lesión de HIC, tivos con menos CEMOs se desean en la técni nistrar administraciones múltiples y/o grandes n culos de CEMOs el riesgo severo de causar o brovascular adicionales en la microvasculatura d esionada.

Aunque la administración de CEMOs de por ras neurológicas funcionales en un SNC dañad ras son sólo parciales, lo que deja espacio sign incrementos en la eficacia de usar CEMOs amiento de HIC y lesiones del SNC de mamífero. o, existe la necesidad presionante en la té dos y composiciones para mejorar las terapias a ias usadas para tratar lesiones del SNC, a ementar la neurorrestauración, recuperación ne ional, e injerto de células terapéuticas. lesión del sistema nervioso central (SNC) , que c istrar parenteralmente a un mamífero una tiva de células estrom ticas y un agente permeab arrera hemato-cerebral (BHC) al mamífero. En mo cionadas las células estromáticas se selecci que consiste de: células estromáticas de medu las estromáticas derivadas de tejido adiposo, máticas de hígado, y células estromáticas de gel ton. En ciertas modalidades, las células estromát las estromáticas de medula ósea.

En modalidades relacionadas, el eabilizante de BHC se selecciona del grupo que alquilgliceroles, RMP-7 y manitol. En mo iculares el agente permeabilizante de BHC es mani En modalidades relacionadas adiciónal las estromáticas y el agente permeabilizante d nistran después de una lesión del sistema ral . En modalidades particulares, las omáticas y el agente permeabilizante de nistran más de 1, 2, 4, 8 y 12 horas después ón del sistema nerv *ioso central. En mo cionadas adicionales las células estromáticas y e eabilizante de BHC se administran de aproximada S a aproximadamente un mes después de una le ema nervioso central. En ciertas modalidades, las omáticas y el agente permeabilizante de nistran de aproximadamente 12 horas a aproximada na después de la lesión del sistema nervioso cen lidades relacionadas, las células estromática te permeabilizante de BHC se administ imadamente 12 horas a aproximadamente 48 horas a lesión del sistema nervioso central. ionales, la lesión del sistema nervioso central a enfermedad, trastorno o afección del sistema ¡ ral seleccionado del grupo que consiste de: enfe ¡ Sachs, enfermedad de Sandhoff, síndrome de rmedad de Krabbe, enfermedad de Parkinson, enfer eimer, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) , e Huntington, epilepsia, esclerosis múltiple, ular espinal (AME) , ataxia de Frederich, Sín , síndrome de Wemicke-Korsakoff , y enferm tzfeldt-Jakob .

En ciertas modalidades, después nistración de las células estromáticas y el eabilizante de BHC el tejido de sistema nervioso onado ha incrementado la expresión de sinaptofi lina de clase III neuronal (TUJ1) , y doblecortin omparación con un tejido de sistema nervioso fero. En modalidades relacionadas, después nistración de las células estromaticas y el eabilizante de BHC, la recuperación neurologica f tiva y/o motora es mayor comparada con la rec lógica funcional cognitiva y/o motora de un ticamente lesionado al que no se han administ ias estromaticas ni el agente permeabilizante de En modalidades relacionadas adicionales las tnáticas se seleccionan de un grupo que cons omáticas de medula ósea, células estromaticas, ejido adiposo, células estromaticas de hígado, y omaticas de gelatina de Wharton En otras modalidades, relacionadas, el eabilizante de BHC se selecciona del grupo que alquilgliceroles, RMP-7 y manitol.

I En ciertas modalidades relacionadas las gente permeabilizante de BHC se administran m S después de una lesión del sistema nervioso cen tas modalidades, las células estromáticas y e eabilizante de BHC se administran de aproximada S a aproximadamente un mes después de una le ema nervioso central. En modalidades partícul las estromáticas y el agente permeabilizante d nistran de aproximadamente una 12 horas a aproxi semana después de la lesión del sistema nervioso odalidades mas particulares las células estromáti te permeabilizante de BHC se administ imadamente 12 horas a aproximadamente 48 horas a lesión del sistema nervioso central.

En modalidades relacionadas, la lesión del ioso central se selecciona del grupo que cons dente vascular cerebral, lesión cerebral trau eabilizante de BHC al mamífero. En mo cionadas, el número de células estromáticas inje ejido de sistema nervioso central lesionado desp nistráción de las células estromáticas y el eabilizante de BHC es mayor comparado con el n ias estromáticas injertadas en un tejido del ioso central idénticamente lesionado de un mam no se han administrado células estromáticas y u eabilizante de BHC.

En ciertas modalidades relacionadas las omáticas se seleccionan del grupo que consi omáticas de medula ósea, células estromáticas ejido adiposo, células estromáticas de hígado, y omáticas de gelatina de Wharton En modalidades relacionadas, el eabilizante de BHC se selecciona del grupo que imadamente al mismo tiempo que la administració las estromáticas . En modalidades particular ias estromáticas y el agente permeabilizante d nistran mas de 12 horas después de una lesión del ioso central. En modalidades relacionadas, las máticas y el agente permeabilizante de nistran de aproximadamente 12 horas a aproximada después de una lesión del sistema nervioso cen lidades relacionadas adicionales, las omáticas y el agente permeabilizante de nistran de aproximadamente 12 horas a aproximada na después de la lesión del sistema nervioso cen lidades relacionadas adicionales, las om ticas y el agente permeabilizante de nistran de aproximadamente 12 horas a aproximada s después de la lesión del sistema nervioso centr ioso central lesionado de un mamífero que t n del sistema nervioso central, que c istrar parenteralmente una cantidad efectiva de máticas y un agente permeabilizante de barrera ral .

En ciertas modalidades, las células estr sido genéticamente modificadas. En mo clonadas, las células estromáticas han sido geríét ficadas para incrementar la expresión de un f imiento seleccionado del grupo que consiste de: f imiento de nervio, factor neurotrófico deri las gliales, factor neurotrófico ciliar, fa imiento derivado de cerebro, factor de cre ado de plaquetas, factor de crecimiento de fib ctor de crecimiento endotelial vascular. En mo iculares, las células estromáticas se selecci nistran por vía intravascular En modalidades relacionadas particulares, e eabilizante de barrera hemato- cerebral se a S de o aproximadamente al mismo tiempo nistración de las células estromáticas . En mo cionadas, las células estromáticas y el eabilizante de BHC se administran más de 12 horas na lesión del sistema- nervioso central. En mo cionadas adicionales, las células estromática te permeabilizante de BHC se administ imadamente 12 horas a aproximadamente un mes de lesión del sistema nervioso central. En otras mo cionadas, las células estromáticas y el eabilizante de BHC se administran de aproximada S a aproximadamente una semana después de la le ema nervioso central. En otras modalidades rela étnico o hemorrágico . En otras modalidades relac lesión del sistema nervioso central resulta rmedad, trastorno o afección del sistema nervioso ccionado del grupo que consiste de: enfermedad S, enfermedad de Sandhoff, síndrome de Hurler, e rabbe, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Al erosis lateral amiotrófica (ELA) , enferme ington, epilepsia, esclerosis múltiple, atrofia nal (AME) , ataxia de Frederich, síndrome d rome de. Wemicke-Korsakoff , y enfermedad de Cre b.

En otra modalidad, los métodos de la ción proveen una composición que comprende una tiva de células estromáticas y ,un agente permeab BHC . En modalidades relacionadas, las omáticas han sido genéticamente modifica Breve Descripción de las Figuras Las figuras 1A-1B proveen los resultados de lógicas funcionales. Resultados de gráficas d itativas de puntuación de severidad neurologí ra 1A) y prueba de vuelta de esquina (PVE) (Fi uatro grupos (control, fibroblastos primarios ; manitol (MT) , células estromáticas de medu a (CEMOh) ; tratamiento de combinación, CEMOh ntan.

La figura 2 provee gráficas de ba ntajes de pérdida de tejido estriado cuantitativ n de ICH en relación con la región normal contr cuatro grupos (control, fibroblastos p os(FB); manitol (MT) , células estromáticas d humana (CEMOh) ; tratamiento de combinación, CEM0 tran. El nivel de significancia estadística es *P onada del grupo de combinación se presenta en l rior. Las flechas indican células positivamente para BrdU como TUJ1.

Descripción Detallada de la Invención A. Métodos de Tratamiento y Prevención d lógica La presente invención se basa, en pa istrar composiciones terapéuticas a un sistema al (SNC) de mamífero lesionado. Como se usa aquí, iderar que el término "sistema nervioso central" ye el cerebro y médula espinal de un mamífero. El ién incluye los nervios craneales olfatorio y ópt os del SNC incluyen, pero no se limitan a te ro, médula espinal, nervio óptico, regiones indi os tejidos antes mencionados, y las. células neur nción provee métodos y composiciones que re go de oclusiones cerebrovasculares asocia nistro intraarterial de agentes terapéuticos a las al administrar un agente que permeabiliza la to-cerebral en combinación con el agente terap de células.

De conformidad con la presente invención l a seguridad y eficacia de terapias a base de cé istema nervioso central lesionado es determinada da por la capacidad de los agentes terapéuticos a las para penetrar la barrera hemato-cerebral y tejidos del SNC lesionados. Estudios anteriores el número de CEMOhs reclutadas a un sitio del ioso central lesionado alcanzan una meseta de sión intravenosa de 3 a 8 millones de CEMOhs, ere que la barrera hemato-cerebral puede ser un e ser alterado por un incremento en permeabili ciones fisiológicas como hipertensión o por dañ as membranas endoteliales que ocurren con af lógicas tales como trauma, isquemia, tum rmedades alérgicas o inflamatorias. Además, un i ermeabilidad de la barrera hemato-cerebral p ado por una liberación de mediadores químicos ta iquininas, serotonina, histaminas, ácido araq otrienos, y radicales libres.

El uso de mediadores químicos que increm eabilidad de BHC puede ser ventajoso cuando se incrementar suministro de fármaco en el parénq ro. En aplicaciones experimentales y clini éptido sintético y análogo de bradiquinina, amente referido como RMP-7, se encontró que i ctivamente el suministro de fármaco hacia nsibilización de estimulación de receptor ß2.

Otro compuesto que puede mejorar la perme la barrera hemato-cerebral y que podría ofr Ída potencial de mejora en terapias a base de cé ón neurológica es manitol . Por ejemplo, el manit hol de azúcar y un osmolito que se ha usado para ratar afecciones médicas que son causadas emento en fluidos corporales/agua (Winkler y Mu ) . Como un tratamiento adjunto, el manitol se uentemente para disminuir edema o presión int lesiones de cerebro masivas (Schwarz et al., aw y Howard, 1983) . El manitol también se ha us r la barrera hemato-cerebral al encoger temporal las endoteliales apretadamente acopladas que co barrera, lo que permite que los fármac nistrados directamente al cerebro (Kroll y e es algo controversial, se han reportado dosis tol para tratar lesión cerebral traumática cir la presión intracraneal elevada (Cruz et al m-Jensen et al, 1981) .

Por lo tanto, existe la posibilidad de tol pueda mejorar la tolerancia del tejido a estr és de lesión y que el manitol pueda salvar más les en la vecindad del sitio de lesión (Lizasoai ) . De esta manera, el manitol puede atenuar el ch dente vascular cerebral y por lo tanto prol ana de tiempo de supervivencia de tejidos le n, et al 2008) . Sin embargo, el uso de agentes ta tol ha sido poco estudiado como un tratamiento p mo una modalidad adjunta a agentes terapéuticos a las para tejidos del SNC lesionados.

Por lo tanto, en varias modalidades, la En modalidades particulares, las omáticas se seleccionan del grupo que consiste d ias estromáticas derivadas de tejido adiposo las estromáticas de hígado (CEHs) ; y células est elatina de Wharton.

En varias modalidades, el agente permeabili era hemato-cerebral se selecciona del grupo que anitol, RMP-7 , y otros alquilgliceroles adecuados En modalidades particulares, eL eabilizante de barrera hemato-cerebral se nistrar aproximadamente al mismo tiempo o ante las estromáticas en una composición separada o osición. En modalidades particulares, las comp a presente invención, se administran a un i ués de una lesión al SNC. En modalidades parti composiciones de la presente invención se admin te permeabilizante de barrera hemato-cere nistran entre aproximadamente 1 semana y 1 me imadamente 12 horas y 1 mes, entre aproximada S y 2 semanas, entre aproximadamente 12 horas y 1 e aproximadamente 12 horas y 72 horas, imadamente 12 horas y 48 horas, o entre aproxi oras y 24 horas después del inicio sobre la le Los métodos de la presente invención c nistración parenteral (es decir, intrave aarterial así como otras vías parenterales apr atecal, intraventricular, intraparenquimal (que médula espinal, tallo cerebral o corteza acisternal, intracraneal, intrastriatal , o intra las estromáticas en combinación con un eabilizante de barrera hemato-cerebral . aarterial de una cantidad efectiva de tnáticas a un individuo con un SNC lesionado. lidades, un agente permeabilizante de barrera bral se administra intraarterialmente y urrentemente con, o después de la admini aarterial de células estromáticas a un individu lesionado. En otras modalidades relacionadas, u eabilizante de barrera hemato-cerebral se admini intravenosa y antes, concurrentemente con, o de dministración intravenosa de células estromáti viduo con un SNC lesionado. En otras mo ionales, un agente permeabilizante de barrera bral se administra intraarterialmente y urrentemente con, o después de la admini avenosa de células estromáticas a un individuo co onado . era hemato-cerebral es menor que 1 x 1012 células menor que 1 x 1011 células por 100 kg, menor que las por 100 kg, menor que 1 x 109 células por r que 1 x 108 células por 100 kg, menor que las por 100 kg, menor que 5 x 106 células por r que 4 x 106 células por 100 kg, menor que las por 100 kg, menor que 2 x 106 células por r que 1 x 106 células por 100 kg, menor que las por 100 kg, menor que 4 x 105 células pór r que 3 x 105 células por 100 kg, menor que las por 100 kg, menor que 1 x 105 células por r que 5 x 104 células por 100 kg, o menor que las por 100 kg.

En varias modalidades, los métodos y comp a presente invención mejoran la neurorrestauraci o tejido de SNC de mamífero lesionado. Como se ?., 2000 y Goldman et al., 1996) . Por ejemplo, de dente vascular cerebral y otras lesiones del ioso central, el tejido cerebral se revierte a rana de desarrollo, y por lo tanto, responde alt stimulación por citocinas, factores tróficos, y recimiento .

En ciertas modalidades, la neurorrest rada se logra por métodos de la presente inven e, al inducir la expresión de . factores de cree s como factor de crecimiento de nervio der ro (FCN) , factor de crecimiento derivado de ies (FCDG) , factor neurotrofico ciliar (FNTC) , f imiento derivado del cerebro (FCDC) , fa imiento derivado de plaquetas (FCDP) , fa imiento de fibroblastos (FCF) , y factor de cre telial vascular (FCEV) , y otras citocinas dentr con un SNC no lesionado o lesionado no trata rol .

En modalidades particulares, la neurorrest rada en un tejido de sistema nervioso central, l n mamífero es demostrado por expresión increme ptofisina, ß-tubulina de clase III neuronal ( ecortina (DCX1) , comparada con un tejido de ioso central lesionado idéntico en un individuo a an administrado las células estromáticas y e eabilizante de barrera hemato-cerebral . El exper ica entendería que indicadores de neurorrest yen expresión incrementada de genes tal tofisina, ß-tubulina de clase III neuronal ( ecortina (DCX) , entre otros. La exprés tofisina es indicativa de sinaptogénesis ; esa en neuronas inmaduras y células precursoras ican 4) , pentraxin II neuronal, PAS 1 neuronal, sociada a crecimiento neuronal, proteína de exte imiento de neuritas, vimentina, Hu, intemexi eína básica de mielina y pleiotrofina, entre otro o, un experto en la técnica es capaz de reconocer os otros "marcadores" que se usan comúnmen ctar formación de sinapsis, neurogénesis y m oñal, cada una de las cuales es capaz de usar rminación de neurorrestauracion.

La neurorrestauracion es una respuesta endó almente tiene lugar en el SNC en respuesta a les lo, después de accidente vascular cerebral en el to, una población de neuroblastos marcada por e UJ1 incrementada es mayormente expandida en entricular (SVZ) , y estas células son reclutadas delimitan el infarto, en donde se pueden difere el microambiente local y por lo tanto prom rrestauración y recuperación neurológica funcion En otras varias modalidades, los método ente invención proveen el incremento de la rec lógica funcional cognitiva y/o motora de un mamí e un SNC lesionado. Las lesiones al sistema ral se espera que impacten negativamente asp vidad locomotora y/o capacidad cognitiva s raleza de la lesión. Por ejemplo, en un m sión de arteria cerebral media en ratas, los tividad locomotora, función neurológica y re itivo se observaron grupos experimental versus lognan et al., 1998; Roof et al., 2001).

Tanto la recuperación neurológica f itiva como la motora se pueden probar mediante e variedad de métodos comúnmente practicados conoc ridad neurológica (PSN) , prueba de actividad lo campo abierto, prueba de barra giratoria, p stencia de agarre, análisis de modo de andar co a de viga de equilibrio, y la prueba de malla i anera similar, un experto en la técnica usa ológicas funcionales comúnmente practicadas en determinar el nivel de recuperación ne ional cognitiva y motora en humanos .

Algunas otras modalidades de la presente i een métodos para mejorar el 1 injerto de éuticos a base de células v.gr., células estro SNC de mamífero lesionado. Como se usa aquí, ,el erto" o "injertar" significa la supervivenci te terapéutico a base de células en el SNC o t lesionado, en donde el agente terapéutico a las permanece presente en el SNC lesionado por eso neurorregenerativo después de una lesión al anto, aunque no se puede excluir formalmente ias injertadas se diferencian y reemplazan a las SNC lesionadas, un experto en la técnica reconoce les neuroregenerativas incrementadas comunicadas ias endógenas del sistema nervioso central son el injerto incrementado de la terapéutica celu itado benéfico importante de los métodos terap osiciones de la presente invención.

B. Enfermedades, Trastornos y Afecció ema Nervioso Central Los métodos de la presente invención se pue mejorar la neurorrestauración, recuperación ne ional e injerto de agente terapéutico a base de amiferos que poseen uno o más de un número de di Las composiciones terapéuticas de la nción se pueden administrar a adultos, y neonatos tiene una lesión del SNC, que incluyen, por rmedad de Tay-Sachs y la enfermedad de cionada, síndrome de Hurler y y mucopolisac cionada y enfermedad de Krabbe . Con res rmedades del SNC en adultos, los métodos y compo a presente invención son útiles para neurorrest eración funcional y tratamiento de una var rmedades neurológicas , que incluyen pero no se li rmedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, es ral amiotrófica, enfermedad de Huntington, epi lares. El tratamiento de esclerosis múltiple ta empla.

Otras enfermedades neurodegenerativas y cionadas del SNC que se pueden tratar de conform S como aquellos inducidos por fármacos que ptores de dopamina del SNC; trastornos de m cinético, tales como enfermedad, de Parkinson; ucturales de supra-nucleoparálisis progresiva; ucturales del cerebelo; degeneraciones espinocer s como ataxia espinal, ataxia de Fri neraciones .corticales cerebelares, degeneraci emas múltiples (Mencel, Dejerine Thomas, Shi-ado-Joseph) , trastornos sistémicos, tales como e Rufsum, abetalipoprotemia, ataxia, telangiect torno de multi-sistema mitocondrial ; trastornos ielinizante , tales como esclerosis múltiple, sversal aguda; y trastornos de la unidad motora, fias musculares neurogénicas (degeneración de cél no anterior, tales como esclerosis lateral ami fia muscular espinal infanti y atrofia muscular rencia en su totalidad.

C. Células de la Presente Invención Los métodos y composiciones de la; nción proveen la administración de una cantidad n agente terapéutico a base de células, v.gr., máticas, a fin de tratar un SNC lesionado o t lesionado. Como se usa aquí, el término " tiva" incluye aquellas cantidades de un éutico a base de células necesarias para · l ión pretendida, v.gr., mejora de la neurorresta eración neurológica funcional, o injerto ribe en otra parte de la presente. La cantidad nderá de un número de factores, que incluyen él te terapéutico a base de células usadas, éd oral, sexo, salud general, severidad de la afec amiento en ausencia del agente permeabilizante de to-cerebral .

En varias modalidades, cualquier tipo de c e usar de conformidad con la presente inven tas modalidades, las células de cualquier dérmico, endodérmico o ectodérmico se puede ad combinación con un agente permeabilizante de to- cerebral a un paciente que tiene un sistema ral lesionado.

En ciertas modalidades de la presente inven te terapéutico.-a base de células preferido es omáticas. En modalidades particulares de la nción, las células estromáticas son células est édula ósea, células estromáticas derivadas d oso ( CETAs ) ; células estromáticas de hígado ( las estromáticas de gelatina de Wharton. Las En una modalidad, las células estromát la ósea (CEMOs) se usan como el agente terapeutic células. Como se usa aquí, los términos, omáticas de médula ósea" , "CEMOs", "células est édula" , "células madre mesenquimatosas", o "CMMs" rcambiablemente y se refieren a la pequeña fra las en médula ósea que pueden servir como pre lares a células madre para osteocitos, con itos, adipocitos y células neuronal y no neur ema nervioso central. Las CEMOs se han estudiado nsiva (Castro-Malaspina et al., 1980, Blood 56:28 sma et al, 1985, Exp. Hematol 13:237-243; Simmon , Blood 78:55-62; Beresford et al., 1992, J. Ce 341-351; Liesveld et al., 1989, Blood 73:17 veld et al., Exp. Hematol 19:63-70; Bennett et al Cell. Sci. 99:131-139) . Las CEMOs se pueden Las fuentes de CE Os y métodos para o ivar CEMOs de esas fuentes se han descrito en la r. , Friedenstein et al., ISIS Exp. Hematol. 4,: denstein et al., 1987, Cell Tissue Kinetics 20: ro-Malaspina et al., 1980, Blood 56: 289-301; 1981, Mech. Aging Develop. 16: 81-89; Piersma , Exp. Hematol. 13: 237-243; Owen et al., 1988, cular Biology of Vertébrate Hard Tissues, Ciba Fo osium/ Chichester, U.K., 42-60; Caplan, 1 oped. Res. 9: 641-650; Prockop, 1997, Science 276 sford et al., 1992, J. Cell Sci. 102: 341-351; 1994, Endocrinology 134: 277-286; Rickard et al lop. Bipl. 161: 218-228; Clark et al., 1995, A/i . Sci. 770: 70-78) . Las CEMOs se pueden ancialmente de cualquier médula ósea que incl plo, médula ósea obtenida por aspiración de l eratura corporal humana normal (es decir, aproxi ) , pero puede ser cualquier temperatura a la ias estromáticas pueden proliferar (v.gr,, 30 células estomáticas pueden crecer en una atmó , o una atmósfera de aire complementada con 5% ejemplo. El medio de crecimiento puede ser c o líquido que contiene nutrientes y factores suf suportar la proliferación de células estromáti o contiene, por ejemplo, una fuente de carbono osa) y nutrientes esenciales mínimos, y preferi ienen uno o más de un suero de mamífero (v.gr., era fetal), un antibiótico (v.gr., penic eptomicina) , y L-glutamina (es decir, mej nistro de aminoácidos para biosíntesis de proteín El suero de mamífero se puede usar entración de 1 % a 20%, en volumen, del imiento endotelial) . El medio de crecimiento pu ejemplo, medio esencial mínimo-alf xirribonucleótidos o ribonucleótidos , complemen o de ternera fetal, antibióticos, y L-glutamin cial mínimo de Dulbecco; y otros bien conocidos rto en la técnica. El medio de crecimi eriblemente reemplazado una o más veces (v.gr., as) durante el cultivo de las células estromática Un experto en la técnica apreciará, por las CEMOs pueden ser expandidas y simult enen un estado pluripotencial (es decir, la diferenciarse en uno o más numerosos tipos de S como osteoblastos , adipocitos y células del plo) . Más aún, los métodos para diferenciar OS tipos de células in vi tro se ha descrito en l r., O 96/30031, WO 99/43286, y patente de E. ués de no más de aproximadamente 14 días, 10 .

Las células estomáticas pueden ser expan rar las células sobre una superficie de crecim encía de un medio de crecimiento, y después co'se ías después de, v.gr., 10 días). Alternativam nsión de células estromáticas se puede llevar a e, lo que significa que las células se expande vez. Por ejemplo, después de una primera expansi primera superficie de crecimiento, las máticas son cosechadas y después expandidas en recimiento sobre una segunda superficie de cree e luego, las células estromáticas dos veces e en ser cosechadas y sometidas a una o más r sión adicionales, mediante el uso del mismo mé límite teórico al número de rondas de expansión Además, un experto en la técnica reconoc métodos para aislar los diferentes tipos de omáticas descritos aquí se conocen en la técnica s, Rodbell (1964) J Biol Chem 239:375 y Hanue 9) J Clin Invest 84:1663-1670; CEHs, public citud de patente de E.U.A. No. 2006/0057125; y omáticas de gelatina de Wharton, McElreavey et al hem. Soc. Trans. 636th Meeting Dublin 19.-29S y pu olicitud de patente de E.U.A. No. 2004/0136967) .

En algunas modalidades, las células est han de ser introducidas en un mamífero se pueden n donador diferente (alogeneicos) o pueden ser omáticas obtenidas del individuo que ha de ser ólogo) . Además, las células estromáticas que ha oducidas en el individuo se pueden obtener de una letamente diferente (xenogéneico) . rcialmente disponible de Alkermes Inc. (Cambrid tras modalidades particulares, el agente permea barrera hemato-cerebral se selecciona del g iste de RMP-7, manitol, otros alquilgliceroles a osfo-derivados de moléculas lipofílicas de ficada (que incluyen aquellas descritas en, por nte de E.U.A. No, 7,186,703, que se incorpora rencia en su totalidad), entre otros. En mo iculares, el agente permeabilizante de barrera bral es manitol.

En modalidades relacionadas, el eabilizante de barrera hemato-cerebral se admi concentración suficiente para incremen eabilidad de la barrera hemato-cerebral. En mo iculares, por ejemplo, en donde el agente permea barrera hemato-cerebral es manitol, el , mayor que 1.75 g/kg, or mayor que 2.00 g/kg o m En otras modalidades relacionadas, por eje e el agente permeabilizante de barrera hemato-ce port, el agente permeabilizante de barrera bral se administra a una concentración de aproxi pg/kg a 1 mg /kg, aproximadamente 0.1 pg/kg a 10 roximadamente 1 pg/kg a 10 pg/kg o cualquier i oncentración entre éstos. Por ejemplo, en mo culares, Cereport se administra a aproximad g, aproximadamente 2 pg/kg, aproximadamente ximadamente 4 pg/kg, aproximadamente 5 imadamente 6 pg/kg, aproximadamente 7 imadamente 8 pg/kg, aproximadamente 9 p imadamente 10 pg/kg.

En modalidades particulares, Cereport se a a concentración mayor que .005 pg/kg, mayor sólo ejemplos y no deben considerarse como limi respecto.

En modalidades particulares, el eabilizante de barrera hemato-cerebral ind eabilización transitoria de la barrera hemato-c odalidades relacionadas, la duración de permeabi ntre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente imadamente 2 minutos y 45 minutos, aproximad tos y 30 minutos, aproximadamente 10 minuto tos, o aproximadamente 15 minutos y 25 minutos.

En modalidades relacionadas, la perme sitoria de la barrera hemato-cerebral se mantiene imadamente 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos, 10 inutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, 35 inutos, 45 minutos, 50 minutos, 55 minutos o 60 m -\ quier duración de minutos entre éstos. ; y Mahmood et al., 2003) . Sin embargo, la to- cerebral regula la entrada de muchas sustanci re al cerebro, y puede excluir la entrada de ncialmente terapéuticos al cerebro. De manera imp a mostrado que las CEMOs pasan a través de la to-cerebral a sitios objetivo de lesiones cerebra iciones experimentales (Prockop et al., 1997; Li ; y Zhang et al., 2002). Las CEMOs han mos cidad para diferenciarse en neuronas y astr en la capacidad para migrar preferencialment eza dañada (Kopen et al., 1999) . De pa rtancia es la capacidad de las CEMOs para se mular la secreción de factores de crecimiento q ambiente local que conduce a neurorregener orrestauración (Chopp y Li, 2002) .

En numerosos reportes, los animales trat ación neuronal (Seyfried et al. 2006). Sin emb nción del suministro terapéutico máximo de la ante el uso de la concentración de inyección más preocupación clínicamente importante. A fin de áximo el potencial terapéutico de una cantidad m s, la presente invención provee la administraci te permeabilizante hemato-cerebral en combinación ias estromáticas .

Varias modalidades de la presente inven gidas a mejorar la neurorrestauración en un fero lesionado mediante la amplificación uestas endógenas a lesión del sistema nervioso odalidades particulares, esto se logra al adminis inación de una cantidad efectiva de células est agente permeabilizante de barrera hemato-cereb tanto la mejora de sinaptogénesis , neurogé orrestauración en un tejido de SNC lesionad fero se logra mediante la administración de una tiva de células estromáticas y un agente permea arrera hemato-cerebral . Como se usa aquí, los meabilizante de barrera hemato-cerebral" y eabilizante de barrera hemato-cerebral" signi ancia que es capaz de alterar la integridad de la to-cerebral . Los métodos de la presente i emplan la alteración de la barrera hemato-cere e , para facilitar un número incrementado de omáticas y niveles más altos de factores de cre otróficos para entrar al cerebro, y por lo tanto, eurorrestauración en un SNC lesionado de un mamí lidades particulares, el mamífero se selecciona d consiste de un humano, ratón, rata, conejo, perro a, cerdo y caballo. En otras modalidades, el mam iculares, la cantidad de células est nistradas a un mamífero que tiene un SNC lesion ar eficacia terapéutica es menor que, aproximada a, o mayor que la cantidad de células estromát n ser administradas a un mamífero que tiene ticamente lesionado a fin de lograr un efecto te método que no incluye el paso de administrar u eabilizante de barrera hemato-cerebral Por ejet r número de células se puede administrar, ya te permeabilizante de barrera hemato-cerebral pe células alcancen el SNC lesionado. En lidades, un mayor número de células se puede inación con un agente permeabilizante de barrera bral sin efectos colaterales negativos (v.gr., brovascular) .

En modalidades particulares, el número omáticas administradas en combinación con un eabilizante de barrera hemato-cerebral es aproxi ismo a aproximadamente 5 veces, aproximadamente 2 ces, o aproximadamente 2.5 veces a 3.5 veces meno ro de células estromáticas administradas en un mé ce de la administración de un agente permeabili era hemato-cerebral a un mamífero que tiene ticamente lesionado. En modalidades partícul ro de una cantidad efectiva de células estr istradas en combinación con un agente permeabili era hemato-cerebral es menor que 99%, menor r que 90%, menor que 80%, menor que 70%, menor r que 50%, menor que 40%, menor que 30%, menor qu r que 10% del número de células estr nistradas en un método que carece de la administr gente permeabilizante de barrera hemato-cerebr kg. En algunas modalidades, el número de una tiva de células estromáticas administradas e imadamente 1 x 109 y aproximadamente 5 x 1011 cél kg. En algunas modalidades, el número de una tiva de células estromáticas administra imadamente 5 x 1010 células por 100 kg. En lidades, el número de una cantidad efectiva de máticas administradas es 1 x 1010 células por 100 En modalidades particulares, el número idad efectiva de" células estromáticas administ inación con un agente permeabil izante de barrera bral es menor que 1 x 1012 células por 100 kg, me ?1 células por 100 kg, menor que 1 x 1010 células menor que 1 x 109 células por 100 kg, menor que ias por 100 kg, menor que 1 x 107 células por r que 5 x 106 células por 100 kg, menor que s correcta de una cantidad efectiva de omáticas para métodos de la presente invención .

En ciertas modalidades, es ventajoso ad cantidad efectiva que comprende menos omáticas en combinación con un agente permeabili era hemato-cerebral en comparación con un métod uye co-administración de un agente permeabili era hemato-cerebral, a fin de reducir el r siones cerebrovasculares en terapia a base de cél rto en la técnica entendería que las oclusione diciales para la neurorrestauración y rec ológica funcional en un SNC lesionado .

Los métodos de la presente invención so mejorar la neurorrestauración y recuperación ne ional bien después del inicio de la lesión camente, el manejo agudo de accidente vascular En una modalidad, un método para mej prrestauración en un SNC de mamífero lesionado ante la administración de una cantidad efec ias estromáticas y un agente permeabilizante de to-cerebral, en donde tanto las células estromáti agente permeabilizante de barrera hemato-cere istran más que después del inicio de la lesión otras modalidades relacionadas, tanto las máticas como el agente permeabilizante de to-cerebral se administran a un individuo con nado por lo menos 12 horas después de una le En otras modalidades relacionadas, tanto las máticas como el agente permeabilizante de to-cerebral se administran a un individuo con onado aproximadamente por lo menos 1 hora, por lo S , por lo menos 3 horas, por lo menos 4 horas, mes, entre aproximadamente 12 horas y 1 me imadamente 12 horas and 2 semanas, entre aproxim oras y 1 semana, entre aproximadamente 12 hor s, entre aproximadamente 12 horas y 48 horas, imadamente 12 horas y 24 horas después del inic esión del SNC. Un experto en la técnica apreci métodos y composiciones ¦ de la presente inve n poner en práctica en cualquier tiempo despué n del SNC, que incluye por lo menos 12 horas de lesión del SNC y hasta producir los efectos desea Se contempla que debido al tiempo istración de una cantidad efectiva de m ticas y agente permeabilizante de barrera ral, en ciertas modalidades, es después de la estrategias de tratamiento agudas de muchas lesi que muchos más pacientes serán candidat to- cerebral no necesitan tener lugar exactamente ??. En modalidades particulares, el eabilizante de barrera hemato- cerebral se a s, concurrentemente con o después de la administr ias estromáticas a un individuo con un SNC lesio lidades particulares, el agente permeabiliz era hemato- cerebral se administra inmediatamente imadamente 30 minutos, 20 minutos, 10 mi tos, 2 minutos, 1 minuto, o 30 segundos ante nistración de células estromáticas a un SNC lesio tas modalidades, el agente permeabilizante , de to- cerebral se administra inmediatamente a imadamente 30 minutos antes de la administr ias estromáticas a un SNC lesionado, o c rvalo de tiempo entre aproximadamente 0 y 30 S de la administración de células estromáti inistrar" se usa a lo largo de la especificac ribir el proceso por el cual las células estrom gente permeabilizante de barrera hemato-cerebr ente invención son suministrados a un individu lesionado para propósitos terapéuticos.

La administración de- las composiciones ente invención se puede lograr en un número de incluyen, pero no se limitan a, parenteral (el té ere a intravenosa e intraarterial así como ot nterales apropiadas) intratecal, intravent aparenquimatosa (que incluyen en la médula espina ral o corteza motora) , intracisternal , intra aestriatal, e intranigral, entre otras, que pe células estromáticas usadas en los métodos de la nción migrar finalmente al sitio objetivo necesar En modalidades particulares, la admini tado. Desde el punto de vista clínico, aarterial es atractiva ya que se usa extensivam s terapias, que incluyen quimioterapia, embo res y malformaciones arteriovenosas , y tr ascular de estenosis arterial intracraneal u otica aguda.

En modalidades particulares, los método ente invención contemplan la administración de u tivamente alta de un agente permeabilizante de to-cerebral , tal como manitol, suministrado rvalos descritos en otra parte, en la prese en influir benéficamente la migración de omáticas al sitio de lesión del SNC, así como licaciones asociadas con administración intravas células estromáticas , y por lo tanto, mej orrestauración y recuperación neurológica funcion diferente que el agente permeabilizante de to-cerebral . Un experto en la técnica entender de diferentes vías de administración para omáticas y un agente permeabilizante de barrera ral no altera el tiempo de administración de u eabilizante de barrera hemato-cerebral en relació o de administración de las células estromáticas .

Por ejemplo, en ciertos métodos de la ción, un agente permeabilizante de barrera ral se administra por vía intravenosa y rrentemente con o después de la admini aarterial de . una cantidad efectiva de máticas a un individuo con un SNC lesionado. lidades, un agente permeabilizante de barrera ral se administra intraarterialmente y urrentemente con o después de la admini venosa de células estromáticas a un individuo co nado .

Un experto en la técnica apreciará que las máticas, agentes permeabilizantes de barrera ral, cantidades efectivas de células estro o y vías de administración de células estrom te permeabilizante de barrera hemato-cerebral , s para células y agentes descritos en la prese rar la neurorrestauración en un SNC lesionad fero son apropiados para usarse con mé siciones de la presente invención que son gene idos a mejorar la recuperación neurológica f itiva y motora, y mejorar el injerto de máticas en un SNC lesionado de un mamífero.

G. Mejora de Recuperación Neurológica Func ra" significa mejorar, como resultado de utilizar mposiciones de la presente invención, las ha Ítivas o motoras y/o actividades locomotoras fero que tiene un SNC lesionado. La mejora se pue la diferencia en cualquier tarea neurológica f antes y después del tratamiento. Por lo tanto, l a recuperación neurológica funcional cognitiva n mamífero que tiene un SNC lesionado sign emento en el rendimiento de una tarea neu ional dada, en donde una cantidad efectiva de máticas y un agente permeabilizante de barrera ral se ha administrado al mamífero en relació imiento de la tarea en un mamífero que tiene ticamente lesionado pero al que no se han admi las estromáticas y un agente permeabilizante de to-'cerebral (es decir, células estromáticas sol tora se incrementa aproximadamente 1%, 2%, 5%, 1 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 7 85%, 90%, 95% o 100% o cualquier porcen peración entre éstos.

H. Mejora de Injerto de Células Estromátic Lesionado Algunas otras modalidades de la presente i efieren a métodos para mejorar el injerto de omáticas en un tejido de SNC lesionado de un ante la administración parenteral de las omáticas y un agente permeabilizante de barrera bral, tal como manitol. Como se usa aquí, el erto" significa la presencia de células estr nistradas en un SNC de mamífero lesionado aproxi semanas a aproximadamente un año después de amiento con células estromáticas en ausencia de u eabilizante de barrera hemato-cerebral .

La presente invención contempla, en parte, emento del número de células estromáticas injer ejido de SNC lesionado de un mamífero facili oregeneración por las células endógenas del tejid onado, y por lo tanto, beneficia al mamí ementar la tasa y/o magnitud de neurorresta eración neurológica funcional, y neuroregeneraci lesionado .

Las células estromáticas injertadas pue ctadas mediante el uso de un número de técnicas c un experto en la técnica. Las proteínas para ras gración, diferenciación, y migración de omáticas genéticamente modificadas en el tej ema nervioso central lesionado de un mamífer fero no está limitado al uso de moléculas dét esadas de un vector o virus. La migración, integ renciación de células estromáticas se pueden de ante el uso de una serie de sondas que permit lización de células estromáticas de médu lantadas. Esas sondas incluyen aquellas p cífica de humanos, que es un elemento tra dante presente en aproximadamente 1 en cada 5000 s, por lo que permite al experto rastrear el' pro élula trasplantada. El rastreo de células trasp ás se. puede lograr mediante el uso de antic as de ácido nucleico para marcadores específ las detallados en otra parte en la presente, tal sin limitarse a, NeuN, MAP2, proteí ofilamentos y similares.

También un experto en la técnica aprec un agente permeabilizante de barrera hemato-ementa el injerto de las . células est imadamente 1.1 veces a 10 veces, aproximadam s a 5 veces, aproximadamente 1.25 veces a 2.5 imadamente 1.25 veces a 2 veces en relación idad de injerto observado cuando las células estr dministran sin un agente permeabilizante de to-cerebral . En ciertas modalidades, el injert ias estromáticas se incrementa por lo menos en 1. veces, 1.3 veces, 1.4 veces, 1.5 veces, 2 ve S, 5 veces, 10 veces o mayor. En mo iculares, el injerto ocurre en un tejido de SNG l acente a un tejido de SNC lesionado.

I. Células Estromáticas Genéticamente Mod s en los Métodos de la Presente Invención métodos para la introducción de ADN exógeno as estromáticas con expresión concomitante no en las células estromáticas tales como itas para células en general, por ejemplo, en 1. (2001 , Molecular Cloning: A Laboratory Manu g Harbor Laboratory, New York) , y en Ausubel , Current Protocols in Molecular Biology, John , New York) .

Los medios para introducir transgénes en ien conocidos. Una variedad de métodos para surti resar un ácido nucleico dentro de una célula de conocidos por los expertos en la técnica. Esos yen, por ejemplo, vectores virales, suministro de liposoma (WO 93/24640; Mannino Gould-F chniques, vol . 6 (7) :682-691 (1988); patente d 5,279,833; WO 91/06309; Feigner, et al., Pro Los vectores retrovirales ampliamente yen aquellos a base de virus de leucemia d ) , virus de leucemia de gibón (GaLV) , v odeficiencia de simios (SIV) , virus de inmunodef a (VIH), y combinaciones de los mismos. Véase scher, et al, J. Virol., vol . 66 (5) : 2731-2739 n, et al., J. Virol,, vol. 66(5) : 1635-1640 rfelt, et al, Virol., vol. 176:58-59 (1990); wi J. Virol., vol. 63:2374-2378 (1989); Miller, et ]., vol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94 /05700 , y R uci, en Fundamental Immunology, tercera edici 1993) ) .

Los vectores a base de AAV también se u sducir células con ácidos nucleicos objetivos, v roducción in vitro de ácidos nucleicos y polipép dimientos de terapia génica in vivo y ex viv ); Hermonat y Muzyczka, Proc. Nati. Acad. Sci, 66-6470 (1984); y Samulski, et al, J. Viro 3822-3828 (1989) .

La terapia génica que usa células estr ticamente modificadas ofrece varias ventajas únic ransferencia de genes directa en el cuerpo. Pri ion del transgén terapéutico a las células estr lugar fuera del paciente, lo que permite a ÍCO una medida importante de control porqu cionar y trabajar sólo con aquellas células estr contienen el transgén y producir el agente terapé idad suficiente.

Por lo tanto, los métodos de la presente i ién proveen la administración de células estromát o un ácido nucleico aislado es introducido en e proteína codificada por el ácido nucleico de ? nucleico introducido se pueden usar como her nvestigación, diagnóstico y terapéuticas, y un si e los modeles de mamífero son generados los cu es para el desarrollo de nuevas herramie nóstico y terapéuticas para estados de e ccionados en un mamífero.

La administración de una célula estromá esa un ácido nucleico aislado deseado se puede eer el producto del ácido nucleico aislado a otra do o mamífero entero, en donde un nivel más ucto génico es útil para tratar o aliviar una enf torno o afección asociada con la expresión y/o al . Por lo tanto, la invención conte nistración de una célula estromática que expresa eico aislado deseado en donde la expresión, eína y/o actividad incrementados de la proteína te permeabilizante de barrera hemato-cerebral tol y una cantidad efectiva de células est ticamente manipuladas para expresar varios fac imiento del SNC, factores tróficos y ' c ementaría la neurorrestauracion, neuroregener eración neurológica funcional en el mamífero c ara un SNC idénticamente lesionado en un mamífe las . células estromáticas genéticamente modifica te permeabilizante de barrera hemato-cerebral nistran o en donde sólo se administran om ticas .

Además, se contempla que los métodos de la nción que utilizan células estromáticas genét ficadas serán útiles en el tratamiento virtual quier enfermedad, trastorno o afección del ioso central, como se describe en otra part las gliales, factor neurotrófico ciliar, fa imiento derivado del cerebro, factor de cre ado de plaquetas, factor de crecimiento de fibro Ctor de crecimiento endotelial vascular, que son las células que ya están presentes en el SNC.

Por ejemplo, las células estromáticas pu ivadas y genéticamente manipuladas antes ducción en un mamífero que tiene un SNC lesion ias estromáticas genéticamente manipuladas se ad mamífero que tiene un SNC lesionado junto con u eabilizante de barrera hemato-cerebral tal como facilitar injerto incrementado de las CEMOs modi injerto mejorado incrementado de CEMOs genét uladas mejoraría además la neurorresta oregeneración y recuperación neurológica funcion fero cuando se compara un SNC idénticamente lesi máticas, y proveen tratamiento para un sistema ral de mamífero lesionado como se describe a lo resente. Las composiciones de la presente , i renden cantidades efectivas de células estr ticamente modificadas o no modificadas ademá te permeabilizante de barrera hemato-cereb lidades particulares, las células estromáti las estromáticas de médula ósea, células estr adas de tejido adiposo, células estromáticas de lulas estromáticas de gelatina de Wharton. En mod ionadas, el agente permeabilizante de barrera ral es un alqulglicerol , RMP-7, o manitol. Un ex écnica inmediatamente apreciaría que los inter entración para células estromáticas y eabilizante de barrera hemato-cerebrales desc parte e la presente son adecuados para composic arrera hemato- cerebral adem s pueden comprender na estéril, solución de Ringer, solución ceada de Hanks (HBSS) , o Isolito S, pH 7.4. Cu as composiciones de la presente invención opcio comprender media celular libre de suero.

La presente invención se describirá ahorá completa mediante los siguientes ejemplos. Esta i sin embargo, puede ser modalizada en mucha rentes y no debe considerarse como limitada lidades expuestas en la presente; más bien lidades se proveen de modo que esta descrip ia y completa, y transmita el alcance de la inv expertos en la técnica.

EJEMPLOS Ejemplo 1 ecuentemente , los inventores de la presente desc la co-administración de un agente permeabili era hematocerebral , en este caso, manitol, y CEM0 ás la eficiencia de suministro de MSC intravasc r, menos células inyectadas fueron requeridas par iisma eficacia terapéutica de 3 a 8 millones nistradas en ausencia de manitol) después de H resultado una producción neurológica funcional do se comparó con tratamientos de control .

La co-administración de manitol con CEMO ificativamente la producción neurológica func S Wistar machos adultas sometidas a HIC experimen eída, a diferencia ya sea del tratamiento admi separado, o de la administración de con oblastos humanos. La HIC fue inducida en 36 rata os por infusión intraestriatal de sangre autólo a de vuelta de esquina. Las figuras 1A-1B mues las ratas que recibieron el tratamiento de com anitol y CEMOh mostraron mejoras significativas as de vuelta de esquina y PSN.

Los resultados de este experimento indicaro ministración de manitol incrementó la eficie administradas intraarterialmente a dosis b ia no dio por resultado mortalidad prematura miento efectivo para HIC experimentalmente i estudio demuestra que la terapia de combin ol y CEMOh fue más efectiva en el increm eración neurológica funcional que cualquier tera o se dio intraarterialmente para tratar HIC.

Materiales y Métodos Animales y Reactivos . Ratas Wistar macho rragia intravenosa, infusión intravenosa de m sión intraarterial de CEMOh. Treinta y seis rata que pesaban de 270 a 320 gramos se usaron para emorragia intracerebral . La estabilización y loca eotáctica se usaron en las ratas bajo anestesia se describió anteriormente (Seyfried et al., 20 inducida al inyectar 100 µ? de sangre autóloga, a vena femoral, en el cuerpo estriado derech cidad de infusión constante de 10 µ? por minuto ( al., 2004) . Veinticuatro horas después de H les se dividieron en cuatro grupos experiment 1 recibió sólo inyección intraarterial (por la tida interna) de 1 millón de fibroblastos p os en solución salina regulada en su pH con ) como control. El grupo 2 recibió inyección int anitol a una dosis de 1.5g/kg en PBS por la ve Pruebas Neurológicas Funcionales . Las proc lógicas funcionales se midieron por la pr ación de severidad neurológica (PSN) (Chen et al prueba de vuelta de esquina (Zhang et al., 200 scribió anteriormente en Seyfried et al.f 2006.

Análisis Estadístico. El análisis estadí aciones funcionales se realizó mediante el uso d dos colas de Student para muestras independien se presentaron como la media + error estándar y <0.05 se consideraron significativos.

Resultados Administración intravenosa de manitol seg ción intraarterial de CEMOh en un modelo anima por resultado producción neurológica f nte entre todos los cuatro grupos tanto por la p omo la de vuelta de esquina. Siete días después imentalmente inducida, la producción neurológica a por PSN empezó a mostrar mejora estadís ficativa para el grupo de terapia de combin ol y CEMOh únicamente (figura 1A, grupo 4) . Al fi da semana después del ictus, el grupo de te nación de manítol y CEMOh mostró producción ne onal significativamente mejorada y valuada po as de esquina (P < 0.05) comparado con el grupo d erapia de fibroblastos humano (figuras 1A-1B, s 1 y 4) . Los grupos de terapia de manitol iduales demostraron una tendencia de mejora aron ninguna mejora neurológica estadis ficativa (figuras 1A-1B, grupos 2 y 3) .

La terapia de combinación de manitol int MO que la anteriormente descrita (Seyfried et al., Aunque las terapias que consistían d arterialmente administradas habían sido efect los de isquemia cerebral, es probable que el bene ol en el modelo de HIC sea más evidente debi aleza diferente de la patofisiología de coágulo S ente. Un hematoma parenquimatoso crea un efecto , comprime los vasos pequeños circundantes y ctos de rompimiento de sangre vasogénicos; el contrarrestar estos efectos mientras táneamente el suministro de las células (Boulard ) . Estos resultados tienen ramificaciones importa ías que dirigen estructuras vasculares comprome ituaciones en donde el edema puede limitar la ef a terapia dada, en donde puede ser ventajoso ad dosis más pequeña de CEMO con manitol ' para obt nistración de manitol y CEMOh daría por resul cción estadísticamente significativa en el g ida de tejido cerebral en un modelo de HIC en rce días después del ictus, secciones de ce fina se prepararon de ratas Wistar machos adulta 1 ejemplo 1. Seis secciones de cada cerebro de ron con hematoxilina y eosina (H y E) y el núme élulas se contó. El porcentaje de pérdida d iado ipsilateral como un porcentaje del he ralateral no tratado se redujo significativamen de tratamiento de combinación de manitol rado con los otros grupos de tratamiento (figura Los resultados de estos experimentos dem la terapia de combinación de manitol y CEMOh eyó producción neurológica funcional mejorada, jo significativamente la pérdida de tejido en u rales se cortaron, se fijaron en formalin aron en secciones de 2 mm de espesor. Las s on embebidas en parafina y cada 40a sección ada a un espesor de 6 i entre la bregma +0.1 mm e cada cerebro de rata para un total de seis se só para tinción con H y E y tinción inmunoquí entaje de la pérdida de tejido estriado comparad o estriado contralateral se calculó mediante e istema de análisis de imagen (Data Translation, M Análisis Estadístico. El análisis estadís de daño de tejido relacionado con HIC se ante el uso de la prueba de t de Student indepe datos se presentaron como la media ± error es res de P <0.05 se consideraron significativos. ntaje de pérdida de tejido en los otros tres gru El porcentaje de pérdida de tejido lateral se calculó con referencia a pérdida de t o estriado en el hemisferio normal. El porcent érdida de tejido de cuerpo estriado en el lad ragia se presenta en la figura 2 como blastos humanos = 32.4 ± 2.8%; 1 millón de CE Oh 3.4% (P>0.05); manitol solo = 25.9 ± 1.75% (P> tol con CEMOh = 21 ± 3.2% (P<0.01). Por lo t ntaje de pérdida de tejido estria ificativamente reducido en el grupo de combinació mparó con los grupos de control. Una tendencia d ién se observó cuando cualquiera de manitol o istró solo, pero esta tendencia no fue estadíst Íficativa.

La terapia de combinación de manitol seg Ejemplo 3 Inmunotincion de Secciones de Cerebro de Rata con lesiónales Indicaron Neurorrestauracion Mejorada de Tratamiento de Combinación de Manitol y CEM Generalidades Experimentales Este experimento probó la hipótesis de qu istración de manitol y CEMOh daría por resul ción estadísticamente significativa en el g ida de tejido cerebral en un modelo de HIC en ce días después del ictus, secciones de ce fina se prepararon de ratas Wistar machos adulta l ejemplo 1. Seis secciones de cada cerebro ? hibridadas a anticuerpos indicativos de resta se describe más adelante.

Los resultados de estos experimentos dem la terapia de combinación de manitol y CEMOh m o de Sigma (St. Louis, O) . Los siguientes ant arios se usaron: anticuerpo monoclonal contra Brd , Carpenteria, CA.); sinaptofisina (1:1,000 mAb, Chemicon. Temecula . CA) ; doblecortina (DCX) (1:5 Biotechnology, Santa Cruz, CA) , ß-tubulina de neuronal (TUJ1) (1:5,000 mAb; Covance, Berkele -Nuclei (1:500; específico para todos los t ias humanas; Chemicon. Temecula. CA) Histología e Inmunohistoquimica. A 14 días la operación, los animales fueron anestes ndidos transcardialmente con 4% de paraformald ción salina regulada en su pH con fosfato. Los rales se cortaron, se fijaron en formalin aron en secciones de 2 mm de espesor. Las s n embebidas en parafina y cada 40a sección ada a un espesor de* 6 pm entre la bregma +0.1 mm marcador específico para los núcleos humanos, Ma 2003) . Todas las inmunotinciones se realizaron o con dos controles negativos de uso de la om cuerpo primario y el usó de suero preinmune rol de calidad del procedimiento de inmunotinci ciones semicuantitativas de sinaptofisina, TUJ1 serie de seis preparaciones a varios niveles d e se usaron. La sinaptofisina se midió en la re o estriado. TUJ1 y DCX. se midieron en entricular. Sinaptofisina, TUJ1 y DCX talizadas bajo un lente de objetivo de 20x (Olymp us Optical Co, Tokyo, Japón) mediante el uso ra de video a color 3-CCD (modelo DXC-970MD; So , Japón) en interfaz con un sistema de aná n MCID (Imaging Research, Inc, St. Cathari á) . Para sinaptofisina, TUJ1 y DCX, los d uras proliferantes y migración neuronal.

Análisis Estadístico. El análisis estadí aciones funcionales, área de daño de tejido rel HIC y resultados histoquímicos se realizaron tod nte el uso de prueba de t de Student independie s se presentaron como la media ± error estándar y <0.05 se consideraron significativos.

Resultados Secciones de cerebro de treinta y seis rata S adultas que fueron el tema de los experimento los 1 y 2, fueron inmunohistoquímicamente teñi , mAb 1281 y expresión de genes: sinaptofisina, Como se muestra en la figura bhistoqulmica que usa mAb 1281 demostró q ficativamente más células de tinción con BrdU a zona de colindanci (P<0.05) alrededor de nado del grupo de tratamiento de combinación de MOh comparado con el grupo de control { figura · 3 mento en el número de células BrdU positivas sug anitol y CEMOh actúan sinergísticamente para pro feración y migración a la región lesiona vación intrigante es que el manitol solo in ficativamente el mareaje de BrdU en la veci de lesión (P<0.05), lo que sugiere que el manit contener la actividad mitogénica para ini cación de ADN.

Tinción inmunohistoquímica del grupo de te nación de manitol y CEMOh reveló inc ficativos en expresión de sinaptofisina, TUJ .05) en las regiones afectadas por HIC comparado reveló una subpoblación de células que expré ador neuronal cuando aún se dividían, lo que sug onas inmaduras estaban formándose nuevamente du a de recuperación el grupo de tratamiento de comb La terapia de combinación de manitol seg intraarterial en este experimento probó que e CEMOh que - alcanzan el área de lesi ificativamente incrementado por infusión de ma ió que hubo suministro mejorado a través vasculatura y/o penetración de barrera hemato . Además, se mostró que el manitol era auxiliar 1 proceso de neurorestauracion después de HIC hay un incremento en la presencia de célul tivas en la región de HIC afectada comparada roles. Aun cuando no se observó mejora estadíst ificativa de producción neurológica funcional c incorporación de 5'-bromo-2' desoxiuridina y el n las inmaduras teñidas con anticuerpos a ma nales . La preadministración de manitol i ificativamente el número de CEMOh localizado n de la HIC, mejoró los parámetros histoquí eración neural y neurorestauración, y red ecuencias anatómicas y neuropatológicas de HI dio además sugirió que terapia de combinación de Oh fue más efectiva que cualquier terapia sola c intraarterialmente para tratar HIC.

Además, este estudio mostró que el tratam nes al sistema nervioso central más allá del al de terapias de manejo agudo convencionales fue las composiciones de la presente invención descr eron muy efectivos en la remodelación de t ema nervioso central dañado. propósitos de ilustración, se pueden hacer ficaciones sin desviarse de la esencia y alcan ción. Por consiguiente, la invención no está to por las reivindicaciones anexas.

Se hace constar que con relación a esta f método conocido por la solicitante para llev ica la citada invención, es el que resulta cia nte descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como ante ma como propiedad lo contenido en las si indicaciones : 1. Un método para mejorar la neurorrestaur tejido de sistema nervioso central lesionado fero que tiene una lesión del sistema nervioso ) , caracterizado porque comprende adn teralmente al mamífero una cantidad efectiva de máticas y un agente permeabilizante de barrera ral (BHC) al mamífero . 2. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque las células estromát cionan del grupo que consiste de: células estr édula ósea, células estromáticas derivadas d 5. El método de conformidad con la reivi aracterizado porque el agente permeabilizante d tol. 6. El método de conformidad con la reivi aracterizado porque las células estromáticas y. e eabilizante de BHC se administran por vía intrava 7. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque las células estromát nistran por vía intraarterial y el agente permeab C se administra por vía intravenosa. .8. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque el agente permeabilizante d nistra antes de o aproximadamente al mismo tiemp nistración de las células estromáticas. 9. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque las células estromáticas y e ras después de la lesión del sistema nervioso ce 12. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque las células estromáticas y e abilizante de BHC se administran desde aproximad a después de la lesión del sistema nervioso cent 13. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque las células estromáticas y e abilizante de BHC se administran de aproximad a a aproximadamente 1 mes después de la le ma nervioso central . 14. El método de conformidad con la reivin racterizado porque el mamífero es un humano. 15. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque la lesión del sistema al se selecciona del grupo que consiste de: a lar cerebral, lesión cerebral traumática, le ma nervioso central seleccionada del grupo que enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Sandhoff, urler, enfermedad de Krabbe, enfermedad de Pa medad de Alzheimer, esclerosis lateral ami ) , enfermedad de Huntington, epilepsia, es iple, atrofia muscular espinal (AME) , at rich, Síndrome de Down, síndrome de Wemicke-Kors medad de Creutzfeldt-Jakob. 18. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque después de la administració ias estromáticas y el agente permeabilizante de o de sistema nervioso central lesionado ha incr expresión de sinaptoficina, ß-tubulina de cí nal, y doblecortina (DCX1) , en comparación con u istema nervioso central lesionado de manera idé mamífero al que no se' han administrado ias estromáticas y el agente permeabilizante de eración neurológica funcional cognitiva y/o mo fero es mayor comparada con la. recuperación neu ional cognitiva y/o motora de un mamífero idént onado al que no se han administrado las máticas ni el agente permeabilizante de BHC. 21. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque las células estromát ccionan del grupo que consiste de: células estr édula ósea, células estromáticas derivadas d so, células estromáticas de hígado, y máticas de gelatina de Wharton. 22. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque el agente permeabilizante d ciona del grupo que consiste de: alquilglicerole itol. istra antes de o aproximadamente al mismo tiemp istración de las células estromáticas. 26. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque las células estromáticas y e eabilizante de BHC se administran después de un istema nervioso central. 27. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque las células estromáticas y e abilizante de BHC se administran de aproximad s después de una lesión del sistema nervioso cent 28. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque las células estromáticas y e eabilizante de BHC se administran desde aproxim ras después de la lesión del sistema nervioso ce 29. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque las células estromáticas y e ral se selecciona del grupo que consiste de: a lar cerebral, lesión cerebral traumática y l la espinal . 32. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque la lesión del sistema al es accidente vascular cerebral isqué r gico. 33. Un método para mejorar el injerto de máticas en un tejido de sistema nervioso nado de un mamífero que tiene una lesión del ioso central caracterizado porque comprende adm teralmente una cantidad efectiva de células estr agente permeabilizante de BHC al mamífero. 34. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque el número de células estr rtadas en el tejido de sistema nervioso central l édula ósea, células estromáticas derivadas d so, células estromáticas de hígado,? y máticas de gelatina de Wharton. 36. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque el agente permeabilizante d ciona del grupo que consiste de: alquilglicerole itol . 37. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque las células estromáticas y e abilizante de BHC se administran por vía intrava 38. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque las células estromát istran intraarterialmente y el agente permeabili e administra por vía intravenosa. 39. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque el agente permeabilizante d s después de una lesión del sistema nervioso cent 42. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque las células estromáticas y e abilizante de BHC se administran desde aproxim ras después de la lesión del sistema nervioso ce 43. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque las células estromáticas y e abilizante de BHC se administran desde aproximad a después de la lesión del sistema nervioso cent 44. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque las células estromáticas y e abilizante de BHC se administran de aproximad a a aproximadamente 1 mes después de la le ma nervioso central . 45. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque la lesión del sistema ema nervioso central lesionado de un mamífero q lesión del sistema nervioso central, caracterizad rende administrar parenteralmente una cantidad células estromáticas y un agente permeabiliz era hemato-cerebral . 48. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque las células estromáticas ticamente modificadas. 49. El método de conformidad con la reiyin caracterizado porque las células estromáticas ticamente modificadas para incrementar la expresi r de crecimiento seleccionado del grupo que cons r de crecimiento de nervio, factor de cre ado de células gliales, factor neurotrófico r de crecimiento derivado del cerebro, fa imiento derivado de plaquetas, factor de crecim 104 ciona del grupo que consiste de: alquilglicerole itol. 52. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque las células estromáticas y e eabilizante de BHC se administran por vía intrava 53. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque el agente permeabilizante de to-cerebral se administra antes de o aproximada tiempo que la administración de las máticas . 54. El método de conformidad con la reivi caracterizado porque las células estromáticas y e eabilizante de BHC se administran después de un sistema nervioso central. 55. El método de conformidad con la reivi caracterizado porque las células estromáticas y e a después de la lesión del sistema nervioso cent 58. El método de conformidad con la reivi caracterizado porque las células estromáticas y e eabilizante de BHC se administran de aproximad a a aproximadamente 1 mes después de la le ma nervioso central . 59. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque la lesión del sistema ral se selecciona del grupo que consiste de: a lar cerebral, lesión cerebral traumática, l ia espinal, hipoxia- isquemia, ataque-, infe enamiento . 60. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque la lesión del sistema ral es accidente vascular cerebral isqu rrágico. rich, síndrome de Down, síndrome de Wemicke-Kors medad de Creutzfeldt-Jakob . 62. Una composición caracterizada porque c cantidad efectiva de células estromáticas y u eabilizante de BHC. 63. La composición de conformidad . ndicación 62, caracterizada porque las m ticas han sido genéticamente modificadas. 64. La composición de conformidad ndicación 63, caracterizada porque las máticas han sido genéticamente modificad ementar la expresión de un factor de cre ccionado del grupo seleccionado de: factor de cre ervio, factor de crecimiento derivado de células r neurotrófico ciliar, factor de crecimiento cerebro, factor de crecimiento derivado de pl