JP2022513336A - 血液脳関門の透過性を高めるための複数用量でのｖｅｇｆの使用 - Google Patents

Abstract

低用量の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）ポリペプチドを使用することを含む、対象の血液脳関門（ＢＢＢ）を越えた薬剤送達を促進する方法。いくつかの実施形態では、薬剤の投与の前後にＶＥＧＦポリペプチドの複数用量が対象に投与され得る。

Description

関連出願の相互参照
本出願は２０１８年１０月３日に出願された米国特許仮出願第６２／７４０，８４０号の出願日の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に取り込まれる。

多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、平均余命が診断後２年未満である脳の高悪性度の原発がんである。Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ．，６１，２１２－２３６（２０１１）ａｎｄ Ｂｌｅｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．，１０８（１），１１－２７（２０１２）。ＧＢＭなどの脳疾患の治療用治療薬の開発に大きな進展があったが、このような治療薬を脳内の疾患部位まで効果的に送達することは血液脳関門（ＢＢＢ）のために依然として困難である。

ＢＢＢは脳実質から体循環を分離する非常に選択的な双方向障壁系である。ＢＢＢは、イオンと神経伝達物質の区画化を維持すること、並びにペプチド、代謝物、細胞、及びサイトカインの輸送を制御することにより脳の恒常性を保護する。結果としてＢＢＢは、治療薬、例えばナノ粒子又はリポソームなどの大きい物質が、静脈内投与後又は経口投与後に脳内に進入することを妨げる。Ａｚａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｆｏｃｕｓ，３８（７）（２０１５）。

ＢＢＢを完全に迂回するために脳への治療薬の直接注入が用いられた。Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１０７，４４－６０（２０１６）；Ｂａｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，９０，１１６－１２５（２０１６）；Ｆｏｕｒｎｉｏｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，２１０，９５－１０４（２０１５）；Ｃｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｈｅａｌｔｈｃ．Ｍａｔｅｒ．，６ （２），１６００７６６（２０１７）；Ｗａｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏ．Ｏｎｃｏｌ．，１７（ｓｕｐｐｌ ２），ｉｉ９－ｉｉ２３（２０１５）；Ｂａｌｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｍａｔｅｒ．Ｍｅｄ．，２１（４），１３９３－１４０２（２０１０）；ａｎｄ Ｄｅｂｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒ，９（１０），１５１９－１５２７（２０１３）。しかしながら、これらの方法は侵襲的であり、感染、出血、又は健康な脳組織の損傷などの危険性を有する。Ａｚａｄ ｅｔ ａｌ．，２０１５及びＤｅｂｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３。

したがって、脳疾患、例えばＧＢＭの治療及び／又は診断のために、ＢＢＢを越えた治療薬及び診断薬の送達を促進する新しいアプローチを開発する必要性がある。

本開示は、（ｉ）ＶＥＧＦ１６５Ａにより（例えばＶＥＧＦポリペプチドの全身投与の４５分後～４時間後に）一過性の開口（ｗｉｎｄｏｗ）が生じ、この間は血液脳関門（ＢＢＢ）が高い透過性を有し、治療薬の脳内への進入が可能になるという予期せぬ発見、及び（ｉｉ）複数回の低用量のＶＥＧＦにより治療薬、特に大型分子及び／又は水溶性分子の脳への送達を促進する効果の増大が示されたという予期せぬ発見に少なくとも部分的に基づいている。驚くべきことに、（リポソーム又はナノ粒子に被包されていてもよい）治療薬の送達の前後にＶＥＧＦを投与することによって、脳腫瘍に対する治療薬の効力がさらに強化された。

したがって、本開示のある態様は、（ｉ）投与を必要とする対象に血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）ポリペプチドの１回目の用量を全身投与すること、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の１５分～３時間後に前記対象に有効量の治療薬を全身投与すること、及び（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の２～２４時間後に前記対象に前記ＶＥＧＦポリペプチドの２回目の用量を全身投与することを含む、対象の脳に治療薬を送達する方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）のＶＥＧＦポリペプチドの２回目の用量は、ステップ（ｉｉ）の治療薬の投与の２～８時間後に投与される。例えば、ステップ（ｉｉｉ）のＶＥＧＦポリペプチドの２回目の用量は、ステップ（ｉｉ）の治療薬の投与の３～５時間後に投与され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）のＶＥＧＦポリペプチドの２回目の用量の投与の２～２４時間後にＶＥＧＦポリペプチドの３回目の用量を投与することをさらに含んでよい。いくつかの例では、ＶＥＧＦポリペプチドの３回目の用量は、ステップ（ｉｉｉ）のＶＥＧＦポリペプチドの２回目の用量の投与の２～１２時間後に投与され得る。いくつかの例では、ＶＥＧＦポリペプチドの３回目の用量は、ステップ（ｉｉｉ）のＶＥＧＦポリペプチドの２回目の用量の投与の３～５時間後に投与され得る。

いくつかの実施形態では、治療薬は、ステップ（ｉ）のＶＥＧＦポリペプチドの１回目の用量の投与の約４５分後に対象に投与され得る。代わりに、又は加えて、ステップ（ｉｉｉ）のＶＥＧＦポリペプチドの２回目の用量は、ステップ（ｉｉ）の治療薬の投与の約３時間後に対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｖ）のＶＥＧＦポリペプチドの３回目の用量は、ステップ（ｉｉｉ）のＶＥＧＦポリペプチドの２回目の用量の投与の約３時間後に対象に投与され得る。

本明細書に開示される方法のいずれにおいても、ＶＥＧＦポリペプチドの１回目の用量、２回目の用量、及び／又は３回目の用量は約５０～２００ｎｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦポリペプチドの１回目の用量、２回目の用量、及び／又は３回目の用量は約１００～１５０ｎｇ／ｋｇである。

本明細書において使用される「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定されるような特定の値に対する許容可能な誤差範囲内にあることを意味し、その誤差範囲は、その値が測定又は決定される方法、すなわち測定系の限界に、部分的に依存することになる。例えば、「約」は当技術分野内での実施に関して許容可能な標準偏差内にあることを意味し得る。あるいは、「約」は所与の値の±２０％まで、好ましくは±１０％まで、より好ましくは±５％まで、さらにより好ましくは±１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的系又は生物学的過程に関し、この用語はある値と同じ桁内、好ましくは２倍の範囲内にあることを意味し得る。別段の定めが無い限り、本出願書及び特許請求の範囲において特定の値が記載される場合、「約」という用語は、その特定の値の許容可能な誤差範囲内にあることを暗に示し、且つ、その文脈でこれを意味する。

別の態様では、本開示は、低用量のＶＥＧＦを使用するＢＢＢを越えた脳への治療薬の送達を促進する方法を提供する。このような方法は、（ｉ）投与を必要とする対象に約５０～２００ｎｇ／ｋｇ（例えば、約１００～１５０ｎｇ／ｋｇ）の用量で血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）ポリペプチドを全身投与すること、及び（ｉｉ）ステップ（ｉ）の１５分～３時間後に前記対象に治療薬を投与することを含んでいてもよい。いくつかの例では、治療薬はステップ（ｉ）の約４５分後に前記対象に投与される。

本明細書に開示される方法のいずれかにおいて使用されるＶＥＧＦポリペプチドは、ＶＥＧＦ－Ａポリペプチドであってもよい。いくつかの例では、ＶＥＧＦ－ＡポリペプチドはヒトＶＥＧＦ１６５Ａであってもよい。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦポリペプチドは、動脈又は静脈を介して対象に投与されてもよい。

本明細書に開示される方法のいずれかによって送達される治療薬は、小分子、タンパク質、又は核酸であってもよい。いくつかの例では、治療薬は水溶性であり、及び／又は５００ダルトンを超える分子量を有する。ある例では、治療薬はドキソルビシンである。

いくつかの例では、治療薬は、リポソーム若しくはナノ粒子に被包されているか、又はリポソーム若しくはナノ粒子に結合していてもよい。いくつかの例では、リポソーム又はナノ粒子はＰＥＧ化されていてもよい。本明細書に開示されるリポソーム又はナノ粒子は、約２０～５００ｎｍ、例えば約２０～３００ｎｍ又は約２０～２００ｎｍのソリッドコア直径を有していてもよい。ソリッドコア直径は、日常的方法、例えば透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって決定されてもよい。以下の実施例も参照されたい。

いくつかの例では、治療薬は医薬組成物として製剤されてよく、薬学的に許容可能な担体が医薬組成物にさらに含まれている。あるいは、治療薬は遊離型であってもよい。

本明細書に開示される方法のいずれかによって治療される対象は、脳疾患を有することが疑われているヒト患者、脳疾患のリスクがあるヒト患者、又は脳疾患のヒト患者であってよい。例示的な脳疾患としては、脳腫瘍（例えばＧＢＭ）、脳卒中、精神神経障害、及び神経変性疾患が挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書は、（ｉ）低用量及び／又は複数用量のＶＥＧＦポリペプチドによって脳への治療薬の送達が促進される、本明細書に開示されるＶＥＧＦポリペプチド及び本明細書に記載される治療薬を含む、脳疾患の治療に使用される組合せ剤、及び（ｉｉ）脳障害の治療のための、又は脳障害の治療に使用される医薬品の製造のための前記組合せ剤の使用を提供する。

本発明の１又は複数の実施形態の詳細を以下の記載に説明する。本発明の他の特徴又は利点は、以下の図面及びいくつかの実施形態の詳細な説明、並びに添付されている特許請求の範囲からも明らかになるだろう。

低用量のＶＥＧＦによりＢＢＢ透過性の一過性上昇が誘導されたことを示す図を含む。例示的実験計画を示す模式図である。 低用量のＶＥＧＦによりＢＢＢ透過性の一過性上昇が誘導されたことを示す図を含む。マウス（ｎ＝５匹）における静脈内投与後のＶＥＧＦ循環半減期を示す図である。 低用量のＶＥＧＦによりＢＢＢ透過性の一過性上昇が誘導されたことを示す図を含む。ＶＥＧＦの投与又は対照の投与の４５分後又は４時間後のマウスの脳の代表的な造影前後のＴ１強調ガドリニウム（Ｇｄ）ＭＲＩ像を示す写真である。皮質（青色）、静脈洞（黄色）、及びノイズ（赤色）の関心領域（ＲＯＩ）が示されている。 低用量のＶＥＧＦによりＢＢＢ透過性の一過性上昇が誘導されたことを示す図を含む。選択された領域のシグナルノイズ比の定量化を示すグラフである。テューキーのＨＳＤを用いたＡＮＯＶＡにより統計学的分析を行った。左パネル：皮質。右パネル：静脈洞。 低用量のＶＥＧＦによりＢＢＢ透過性の一過性上昇が誘導されたことを示す図を含む。ＶＥＧＦ前処理の４５分後又は４時間後のエバンスブルーの生体内分布を示すグラフである。テューキーのＨＳＤを用いたＡＮＯＶＡにより統計学的分析を行った。 低用量のＶＥＧＦによりＢＢＢ透過性の一過性上昇が誘導されたことを示す図を含む。大脳皮質におけるイソレクチン（緑色）及びエバンスブルー（赤色）を示す代表的画像を示す写真である。上方左側：対照＋エバンスブルー（Ｅｂ）。上方右側：ＶＥＧＦ前処理＋４５分後にＥｂ処理。下方左側：凍結損傷。下方右側：ブランク対照。細胞核をＤＡＰＩ（青色）で染色した。凍結損傷を陽性対照として使用した。スケールバー：１００μｍ。 低用量のＶＥＧＦによりＢＢＢ透過性の一過性上昇が誘導されたことを示す図を含む。対照前処理後又はＶＥＧＦ前処理後の脳における、異なる粒径の蛍光ＰＥＧ修飾ポリスチレンナノ粒子の定量化を示すグラフである。各粒径の対照対ＶＥＧＦの統計学的分析をｔ検定により行った。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。挿入されている数字は動物の数を表している。^＊：対照に対してｐ＜０．０５、^＊＊：対照に対してｐ＜０．０１、^＊＊＊：対照に対してｐ＜０．００１。^＃＃＃：４時間に対してｐ＜０．００１。ｎｓは有意でないことを表している。 選択された抗がん剤の脳への送達がＶＥＧＦにより増加したことを示す図を含む。対照（対照＋ＴＭＺ）、ＶＥＧＦ（Ｖ＋ＴＭＺ）、又は１０倍高用量のＶＥＧＦ（１０×Ｖ＋ＴＭＺ）による前処理後のマウスの脳における、テモゾロミド（ＴＭＺ）の定量化を示すグラフである。ＴＭＺを５ｍｇ／ｋｇ又は２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、１時間循環させた。対照＋ＴＭＺに対するｔ検定により統計学的分析を行った。 選択された抗がん剤の脳への送達がＶＥＧＦにより増加したことを示す図を含む。対照前処理又はＶＥＧＦ前処理から４５分後のドキソルビシン（ｄｏｘ）の生体内分布を示すグラフである。Ｄｏｘを２時間循環させた後で試料を採取した。テューキーのＨＳＤを用いたＡＮＯＶＡにより統計学的分析を行った。 選択された抗がん剤の脳への送達がＶＥＧＦにより増加したことを示す図を含む。対照による前処理（対照＋ＬＤ）又はＶＥＧＦによる前処理（Ｖ＋４５ｍＬＤ）の４５分後に投与されたＬｉｐｏＤｏｘの生体内分布率を示すグラフである。ＬｉｐｏＤｏｘを４時間循環させた後に試料を採取した。テューキーのＨＳＤを用いたＡＮＯＶＡにより統計学的分析を行った。 選択された抗がん剤の脳への送達がＶＥＧＦにより増加したことを示す図を含む。マウス当たりの血漿中濃度に対して正規化されたＬｉｐｏＤｏｘの臓器別濃度を示すグラフである。テューキーのＨＳＤを用いたＡＮＯＶＡにより統計学的分析を行った。 選択された抗がん剤の脳への送達がＶＥＧＦにより増加したことを示す図を含む。ＭＴＴアッセイにより測定されたＤＢＴＲＧ－０５ＭＧヒト神経膠芽腫細胞の生存率に対するＬｉｐｏＤｏｘ（ＬＤ）及びＴＭＺの効果を示すグラフである。ｎ＝４。 選択された抗がん剤の脳への送達がＶＥＧＦにより増加したことを示す図を含む。５ｍｇ／ｋｇの用量の尾静脈内注射後のＬｉｐｏＤｏｘ循環半減期を示すグラフである。ｎ＝５匹。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。挿入されている数字は試験した動物の数を表す。^＊：ｐ＜０．０５。 大型動物モデルにおいて、脳への薬剤の送達がＶＥＧＦにより増加したことを示す図を含む。ブタにおけるＭＲＩ試験の例示的実験計画を示す模式図である。上方パネル：本試験の例示的実験計画。下方パネル：分析される脳の領域。ＴＳＥは高速スピンエコー法を指す。 大型動物モデルにおいて、脳への薬剤の送達がＶＥＧＦにより増加したことを示す図を含む。関心領域を示すブタ脳スライスを示す写真である。ＣＴＸ：大脳皮質、Ｇ：灰白質、Ｗ：白質、ＨＰＦ：海馬体、ＴＨ：視床、ＳＴＲ：線条体（大脳核領域）、ＨＹ：視床下部、ＰＩＲ：梨状野。対照で前処理されたブタ及びＶＥＧＦで前処理されたブタにおける造影前後の代表的Ｔ１強調ＭＲＩ像、及び０～１００のスケールで表された正規化されたシグナル強度の差のヒートマップを示す造影後と造影前の差分画像。選択された脳領域における強調されたＳＮ比の定量化。テューキーのＨＳＤを用いたＡＮＯＶＡにより結果を比較した。 大型動物モデルにおいて、脳への薬剤の送達がＶＥＧＦにより増加したことを示す図を含む。全ての脳領域におけるＳＮ比の平均増加を示すグラフである。左パネル：造影前に対する造影後のＭＲＩのＳＮ比。右パネル：ＭＲＩのＳＮ比。独立ｔ検定により結果を比較した。 大型動物モデルにおいて、脳への薬剤の送達がＶＥＧＦにより増加したことを示す図を含む。ＶＥＧＦにより前処理されたブタにおける薬剤の生体内分布を試験するための例示的実験計画を示す模式図である。 大型動物モデルにおいて、脳への薬剤の送達がＶＥＧＦにより増加したことを示す図を含む。ナノ粒子の蛍光及びブタ脳における蓄積を示すＩＶＩＳ像を示す写真である。 大型動物モデルにおいて、脳への薬剤の送達がＶＥＧＦにより増加したことを示す図を含む。ナノ粒子の生体内全身分布のＨＰＬＣに基づく定量化を示すグラフである。 大型動物モデルにおいて、脳への薬剤の送達がＶＥＧＦにより増加したことを示す図を含む。脳の領域におけるナノ粒子の分布を示すグラフである。テューキーのＨＳＤを用いたＡＮＯＶＡによりデータを分析した。 大型動物モデルにおいて、脳への薬剤の送達がＶＥＧＦにより増加したことを示す図を含む。ナノ粒子の平均脳内保持を示すグラフである。独立ｔ検定によりデータを分析した。 大型動物モデルにおいて、脳への薬剤の送達がＶＥＧＦにより増加したことを示す図を含む。ＬｉｐｏＤｏｘの生体内全身分布を示すグラフである。テューキーのＨＳＤを用いたＡＮＯＶＡによりデータを分析した。 大型動物モデルにおいて、脳への薬剤の送達がＶＥＧＦにより増加したことを示す図を含む。ＬｉｐｏＤｏｘの生体内脳分布を示すグラフである。テューキーのＨＳＤを用いたＡＮＯＶＡによりデータを分析した。 大型動物モデルにおいて、脳への薬剤の送達がＶＥＧＦにより増加したことを示す図を含む。ＬｉｐｏＤｏｘの平均脳内保持を示すグラフである。独立２標本ｔ検定によりデータを分析した。 大型動物モデルにおいて、脳への薬剤の送達がＶＥＧＦにより増加したことを示す図を含む。ＣＳＦ中のＬｉｐｏＤｏｘ濃度を示すグラフである。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。挿入されている数字は動物の数を表す。^＊：は対照に対してｐ＜０．０５、^＊＊：対照に対してｐ＜０．０１。ｎｓは有意でないことを表す。 ＶＥＧＦがＢＢＢ透過性の複数の特徴に影響を与えたことを示す図を含む。ＶＥＧＦ投与の４５分後及び４時間後の重要なＢＢＢ遺伝子についての定量的リアルタイムＰＣＲを示すグラフである。ｎ＝４。左パネル：生化学的関門。中央パネル：解剖学的関門。右パネル：その他。テューキーのＨＳＤにより、ＶＥＧＦ前処理動物の結果を対照動物の結果と比較した。 ＶＥＧＦがＢＢＢ透過性の複数の特徴に影響を与えたことを示す図を含む。ＶＥＧＦ投与後の脳血管のＴＥＭイメージングを示す写真である。パネルの左から右：対照、１５分でのＴＥＭイメージング、４５分でのＴＥＭイメージング、及び４時間でのＴＥＭイメージング。ＥＣ：内皮細胞、Ｌ：管腔、Ｅｒ：赤血球、Ｐ：周皮細胞。埋め込まれているスケールバー：１μｍ。 ＶＥＧＦがＢＢＢ透過性の複数の特徴に影響を与えたことを示す図を含む。健康な脳及びＧＢＭ異種移植片における周皮細胞マーカーＰＤＧＦＲβ（赤色）及び内皮細胞マーカーＣＤ３１（緑色）の染色を示す写真である。パネルの左から右：対照、１５分でのイメージング、４５分でのイメージング、４時間でのイメージング、腫瘍対照、及びＶＥＧＦ処理された腫瘍。各画像の上右隅に平均周皮細胞被覆度が示されている。スケールバー：１００μｍ。 ＶＥＧＦがＢＢＢ透過性の複数の特徴に影響を与えたことを示す図を含む。健康な脳及びＧＢＭ異種移植片における星状細胞マーカーＧＦＡＰ（赤色）及び内皮細胞マーカーＣＤ３１（緑色）の染色を示す写真である。パネルの左から右：対照、１５分でのイメージング、４５分でのイメージング、４時間でのイメージング、腫瘍対照、及びＶＥＧＦ処理された腫瘍。スケールバー：１００μｍ。 ＶＥＧＦがＢＢＢ透過性の複数の特徴に影響を与えたことを示す図を含む。健康な脳及びＧＢＭ異種移植片におけるタイトジャンクションタンパク質クローディン５（赤色、中央段）及び内皮細胞マーカーＣＤ３１（緑色、最上段）の免疫蛍光像を示す写真である。別々のチャンネル、及び重ね合わせ画像が示されている。最上段と中央段の重ね合わせ画像が最下段に示されている。各画像の右上に共局在係数が示されている。スケールバー：４０μｍ。 ＶＥＧＦがＢＢＢ透過性の複数の特徴に影響を与えたことを示す図を含む。周皮細胞の平均被覆率を示すグラフである。 ＶＥＧＦがＢＢＢ透過性の複数の特徴に影響を与えたことを示す図を含む。クローディン５の平均共局在度を示すグラフである。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。挿入されている数は動物の数を表す。^＊：対照に対してｐ＜０．０５、^＊＊：対照に対してｐ＜０．０１、^＊＊＊：対照に対してｐ＜０．００１、^＊＊＊＊：対照に対してｐ＜０．０００１。ｎｓは有意でないことを表す。 神経膠芽腫のマウスモデルにおける動物生存期間がＶＥＧＦ前処理と組み合わせられたＬｉｐｏＤｏｘによって延長したことを示す図を含む。ＶＥＧＦ処理過程（Ｖ）及び複数ＶＥＧＦ処理過程（ＭＶ）の時間的経過及び説明を示す例示的実験計画の模式図である。 神経膠芽腫のマウスモデルにおける動物生存期間がＶＥＧＦ前処理と組み合わせられたＬｉｐｏＤｏｘによって延長したことを示す図を含む。腫瘍担持マウスにおける腫瘍内ＬｉｐｏＤｏｘ濃度の定量化を示すグラフである。ＧＢＭ異種移植片及び同じ動物の対側領域を分析した。ｔ検定を用いて統計学的分析を行った。 神経膠芽腫のマウスモデルにおける動物生存期間がＶＥＧＦ前処理と組み合わせられたＬｉｐｏＤｏｘによって延長したことを示す図を含む。カプラン・マイヤー生存曲線を示すグラフである。ログランク（マンテル・コックス）検定により複数の曲線を対で比較した。 神経膠芽腫のマウスモデルにおける動物生存期間がＶＥＧＦ前処理と組み合わせられたＬｉｐｏＤｏｘによって延長したことを示す図を含む。各処理群の腫瘍の輝度の週毎のまとめを示す写真及び対応するグラフである。各時点での動物の数が挿入されており、代表的なＩＶＩＳ像が示されている。テューキーのＨＳＤを用いたＡＮＯＶＡによりデータを分析した。 神経膠芽腫のマウスモデルにおける動物生存期間がＶＥＧＦ前処理と組み合わせられたＬｉｐｏＤｏｘによって延長したことを示す図を含む。４５日目にＭＲＩによって測定された腫瘍容積分析を示す図である。左パネル：腫瘍容積を示すグラフ。右パネル：腫瘍のイメージングを示す写真。代表的な１ｍｍ厚のスライス（１２枚目、１３枚目、及び１４枚目のスライス）が示されており、腫瘍領域が白色の境界線で印が付けられている。独立ｔ検定によりデータを分析した。 神経膠芽腫のマウスモデルにおける動物生存期間がＶＥＧＦ前処理と組み合わせられたＬｉｐｏＤｏｘによって延長したことを示す図を含む。６０日目～７０日目の間に死んだマウスからの腫瘍切片のＫｉ６７分析を示す図である。代表的な画像はＫｉ６７（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）を示す。スケールバー：１００μｍ。テューキーのＨＳＤを用いたＡＮＯＶＡによりデータを分析した。 神経膠芽腫のマウスモデルにおける動物生存期間がＶＥＧＦ前処理と組み合わせられたＬｉｐｏＤｏｘによって延長したことを示す図を含む。ＤＡＰＩ染色により決定された腫瘍内細胞密度を示すグラフである。テューキーのＨＳＤを用いたＡＮＯＶＡにより結果を分析した。 神経膠芽腫のマウスモデルにおける動物生存期間がＶＥＧＦ前処理と組み合わせられたＬｉｐｏＤｏｘによって延長したことを示す図を含む。イソレクチン染色により決定された４００倍の倍率の視野当たりの腫瘍血管密度を示すグラフである。シャムマウスについては注入領域をイメージングした。テューキーのＨＳＤを用いたＡＮＯＶＡによりデータを分析した。 神経膠芽腫のマウスモデルにおける動物生存期間がＶＥＧＦ前処理と組み合わせられたＬｉｐｏＤｏｘによって延長したことを示す図を含む。脳腫瘍におけるＩｂａ１陽性細胞数の定量化を示すグラフである。テューキーのＨＳＤを用いたＡＮＯＶＡによりデータを分析した。 神経膠芽腫のマウスモデルにおける動物生存期間がＶＥＧＦ前処理と組み合わせられたＬｉｐｏＤｏｘによって延長したことを示す図を含む。ＨＥ染色により決定された腫瘍内浮腫の定量化を示すグラフである。シャムについては正常な脳の同じ大きさの領域を分析した。テューキーのＨＳＤを用いたＡＮＯＶＡによりデータを分析した。 神経膠芽腫のマウスモデルにおける動物生存期間がＶＥＧＦ前処理と組み合わせられたＬｉｐｏＤｏｘによって延長したことを示す図を含む。ＨＥ染色により決定された腫瘍内出血の定量化を示すグラフである。シャムについては正常な脳の同じ大きさの領域を分析した。テューキーのＨＳＤを用いたＡＮＯＶＡによりデータを分析した。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。挿入されている数字は分析された動物の数を表す。^＊：ｐ＜０．０５、^＊＊：ｐ＜０．０１、^＊＊＊：ｐ＜０．００１。ｎｓは有意でないことを表す。 ＶＥＧＦの低用量静脈内投与は安全性の問題を引き起こさなかったことを示す図を含む。マウスにおける血漿中Ｓ１００β濃度を示すグラフである。ＢＢＢ破綻を誘導するリポ多糖（ＬＰＳ）を陽性対照として使用した。脳溶解物を第２の陽性対照として使用した。対応２標本ｔ検定により前後の試料を分析した。一群当たり、ｎ：４以上。 ＶＥＧＦの低用量静脈内投与は安全性の問題を引き起こさなかったことを示す図を含む。ＶＥＧＦ又は１０倍用量の投与後に４時間にわたって３０分毎に測定されたマウスの収縮期血圧及び拡張期血圧を示すグラフである。ＶＥＧＦ投与の直前に最初（０分）のサンプリングを行った。 ＶＥＧＦの低用量静脈内投与は安全性の問題を引き起こさなかったことを示す図を含む。ＶＥＧＦ投与後のブタの収縮期血圧と拡張期血圧の変化を示すグラフである。対応ｔ検定によりデータを分析した。 ＶＥＧＦの低用量静脈内投与は安全性の問題を引き起こさなかったことを示す図を含む。ＶＥＧＦ投与の４５分後及び４時間後の重要な神経炎症マーカーの遺伝子発現を示すグラフである。ｎ：５以上。上段左から右：ＴＮＦ、ＩＬ１ｂ、及びＩＬ６。下段左から右：ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ２、及びＧＦＡＰ。神経炎症を誘導するために凍結損傷（Ｃｒｙｏ）及びＬＰＳを使用した。各試料をＧａｐｄｈに対して正規化した。テューキーのＨＳＤを用いた二元配置ＡＮＯＶＡにより各群の結果をＰＢＳ群の結果に対して分析し、且つ、４時間の結果を２４時間の結果に対して分析した。ＰＢＳ群の平均閾値サイクル数（Ｃ_Ｔ）がリファレンスとして示されている。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。挿入されている数字は動物の数を表す。^＊：対照に対してｐ＜０．０５、^＊＊：対照に対してｐ＜０．０１、^＊＊＊：対照に対してｐ＜０．００１、^＊＊＊＊：対照に対してｐ＜０．０００１。^＃：４時間に対してｐ＜０．０５、^＃＃：４時間に対してｐ＜０．０１、^＃＃＃：４時間に対してｐ＜０．００１。ｎｓは有意でないことを表す。 脳内へのＩｇＧ抗体の浸透及び脳組織内への抗ｎｒＣＡＭ ＩｇＧ一次抗体の浸透を示す図である。対照又はＶＥＧＦの４５分後に一次抗体（Ａｂ）を静脈内注入し、その後、動物を灌流固定し、脳の凍結切片を作製し、蛍光二次抗体で染色した。Ｉ．Ｃ．Ａｂ試料については抗ｎｒＣＡＭを直接的に頭蓋内に注入した。従来法による染色切片は、参考に示されている。 ＨＰＬＣにより測定されたエバンスブルーの検量線を示すグラフを含む。エバンスブルーの検量線を示す図である。 ＨＰＬＣにより測定されたテモゾロミド（ＴＭＺ）の検量線を示すグラフを含む。ＴＭＺの検量線を示す図である。 ＨＰＬＣにより測定されたドキソルビシンの検量線を示すグラフを含む。ドキソルビシンの検量線（ＨＰＬＣ）を示す図である。 ＬｉｐｏＤｏｘのＨＰＬＣ定量の結果を示すグラフを含む。低濃度（１．０μｇ／ｍｌ未満）のＬｉｐｏＤｏｘの検量線を示す図である。 ＬｉｐｏＤｏｘのＨＰＬＣ定量の結果を示すグラフを含む。高濃度（３００．０μｇ／ｍｌ未満）のＬｉｐｏＤｏｘの検量線を示す図である。 ＬｉｐｏＤｏｘのＨＰＬＣ定量の結果を示すグラフを含む。脳組織からのＬｉｐｏＤｏｘ回収率を示す図である。点線は９０％と１１０％の境界線を表す。 ナノ粒子のＨＰＬＣ定量の結果を示すグラフを含む。ＬｉｐｏＤｏｘ（ＬＤ）が存在する場合と存在しない場合のＨＰＬＣに基づくナノ粒子定量の検量線を示す図である。左パネル：示されている様々な薬剤濃度下でのピーク面積。右パネル：ＬｉｐｏＤｏｘの存在がナノ粒子色素保持時間に影響しないことを示す保持時間のグラフ。 ＤＢＴＲＧ細胞の生存度に対するＶＥＧＦの効果を示すグラフである。最大で１００ｎｇ／ｍｌまでの濃度のＶＥＧＦと共にＤＢＴＲＧ細胞を培養した。 ＶＥＧＦ処理に応答したクローディン５及びＰ－糖タンパク質の発現を示す図を含む。ＶＥＧＦ処理後のマウス全脳クローディン５のウエスタンブロット分析の結果を示す図である。左パネル：クローディン５の相対発現率を定量化するグラフ。右パネル：表示されている様々な時点におけるクローディン５の発現を示す写真。 ＶＥＧＦ処理に応答したクローディン５及びＰ－糖タンパク質の発現を示す図を含む。示されている様々な時点におけるＶＥＧＦ処理後のＰ－糖タンパク質の染色を示す写真である。スケールバー：１００μｍ。 ＶＥＧＦ処理後のドキソルビシンの生体内分布を示すグラフを含む。マウスにおけるＶＥＧＦ前処理後のドキソルビシンの生体内分布を示すグラフである。 ＶＥＧＦ処理後のＬｉｐｏＤｏｘの生体内分布を示すグラフを含む。マウスにおける複数用量のＶＥＧＦ処理後のＬｉｐｏＤｏｘの生体内分布を示すグラフである。 本試験において使用されるＧＢＭマウスモデルの様々な特徴を示す図を含む。遺伝子組換えＤＢＴＲＧ－０５ＭＧヒト神経膠芽腫細胞株におけるルシフェラーゼ発現を示す図である。左パネル：ＤＢＴＲＧ細胞におけるルシフェラーゼ発現レベルを示すグラフ。右パネル：ＤＢＴＲＧ細胞におけるルシフェラーゼシグナルを示す写真。 本試験において使用されるＧＢＭマウスモデルの様々な特徴を示す図を含む。頭蓋内注入を受けている例示的ＢＡＬＢ／ｃ ＮＵマウスを示す写真である。 本試験において使用されるＧＢＭマウスモデルの様々な特徴を示す図を含む。６５日後の右半球内の典型的な腫瘍形態を示す写真である。 薬剤保持に対するシャム注射の効果を示す図を含む。ＶＥＧＦ（Ｖ）＋リポソームドキソルビシン（ＬＤ）処理後の腫瘍内ＬｉｐｏＤｏｘ。マウスにおけるシャム注射部位又は対側部位におけるＬｉｐｏＤｏｘ濃度を示すグラフである。 薬剤保持に対するシャム注射の効果を示す図を含む。ＶＥＧＦ（Ｖ）＋リポソームドキソルビシン（ＬＤ）処理後の腫瘍内ＬｉｐｏＤｏｘ。単回用量のＶＥＧＦ及びその後のＬｉｐｏＤｏｘの投与後の腫瘍内ＬｉｐｏＤｏｘ濃度を示すグラフである。 脳腫瘍を有し、且つ、ＬＤ単独での処置又はＶＥＧＦ前処理と共に処理されたマウスの特徴を示す図を含む。ＩＶＩＳにより測定された腫瘍輝度とＭＲＩによる確定された腫瘍の大きさとの相関を示すグラフである。 脳腫瘍を有し、且つ、ＬＤ単独での処置又はＶＥＧＦ前処理と共に処理されたマウスの特徴を示す図を含む。生存実験期間中のマウスの体重を示すグラフである。 脳腫瘍を有し、且つ、ＬＤ単独での処置又はＶＥＧＦ前処理と共に処理されたマウスの特徴を示す図を含む。処理群のマウスの腫瘍のＩｂａ１染色を示す写真である。シャムマウスにおいて対応する正常な脳領域をイメージングした。スケールバー：１００μｍ。 脳腫瘍を有し、且つ、ＬＤ単独での処置又はＶＥＧＦ前処理と共に処理されたマウスの特徴を示す図を含む。浮腫領域及び出血領域を有する腫瘍を例示的ＨＥ像を示す写真である。 脳腫瘍を有し、且つ、ＬＤ単独での処置又はＶＥＧＦ前処理と共に処理されたマウスの特徴を示す図を含む。ＭＲＩにより測定された腫瘍容積に対するＩＶＩＳに基づく発光測定値の相関を示すグラフである。 ＰＤＡＣモデルの特徴を示す図を含む。ＡｓＰＣ１細胞のルシフェラーゼ発現を確認するＩＶＩＳを示すグラフ（左側）及び写真（右側）である。 ＰＤＡＣモデルの特徴を示す図を含む。マウスにおける膵臓腫瘍成立を示すＩＶＩＳを示す写真である。 ＰＤＡＣモデルの特徴を示す図を含む。正常な膵臓及びＰＤＡＣ異種移植膵臓を示す例示的写真を含む図である。 ＰＤＡＣモデルの特徴を示す図を含む。ＰＤＡＣ腫瘍又はシャム手術を受けた膵臓におけるＬｉｐｏＤｏｘの定量化を示すグラフである。 皮下ＧＢＭマウスモデルの特徴を示す図を含む。皮下腫瘍増殖の代表的なＩＶＩＳ像を示す写真である。 皮下ＧＢＭマウスモデルの特徴を示す図を含む。６０日後の代表的な腫瘍を示す写真である。 皮下ＧＢＭマウスモデルの特徴を示す図を含む。対照前処理又はＶＥＧＦ前処理後の腫瘍内ＬｉｐｏＤｏｘ濃度を示すグラフである。 ４５分、４時間、及び２４時間での補助的な炎症遺伝子の発現を示すグラフを含む。下に示す処理群のＦｎ１発現（左側）及びＩｌ１ａ発現（右側）を示すグラフである。陽性対照として、凍結損傷（Ｃｒｙｏ）及びリポ多糖（ＬＰＳ）を神経炎症の誘導に使用した。 ４５分、４時間、及び２４時間での補助的な炎症遺伝子の発現を示すグラフを含む。ＶＥＧＦ投与の４５分後の遺伝子発現を示すグラフである。上段左から右：４５分でのＩＬ１ｂ、４５分でのＴＮＦａ、及び４５分でのＩＬ６。下段左から右：４５分でのＣＣＬ２、４５分でのＣＸＣＬ１、及び４５分でのＧＦＡＰ。 マウス血清血液化学を示すグラフである。上段左から右：ＡＬＴ／ＧＰＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、ＣＰＫ（クレアチニンキナーゼ）、及びＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）。下段左から右：ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）、ＢＵＮ（血中尿素窒素）、及びＣＫ－ＭＢ（クレアチニンキナーゼＭＢ）。

ＢＢＢを越えた薬剤送達に関連する困難を克服するために、ＢＢＢの破綻、ＢＢＢの浸透化、ＢＢＢの迂回、又はこれらの組合せを含む多数のアプローチが試みられてきた。浸透処理はこの関門を破綻させることができ、薬剤の取込み及び送達のために内在性運搬体タンパク質を利用する多くの試みが行われてきた。薬剤の脳脊髄液中への直接注入又は脳内への直接注入により、ＢＢＢが完全に回避される場合もある。しかしながら、これらの方法にはイオン不均衡、神経伝達物質の漏出、及び循環中へのケモカインの放出などのこれらの方法に独特な問題がある。Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １９（１２）：１５８４－１５９６；２０１３。

本明細書は、治療薬の投与前に低用量の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を全身投与、又は治療薬の投与前後に複数回の低用量ＶＥＧＦを全身投与してＢＢＢの透過性を高めることによって治療薬の脳内への取込みを改善することを含む有利な方法を提供する。この有利な方法は、ＢＢＢ透過性に対するＶＥＧＦの効果を示す、本明細書に報告される予期せぬ発見に基づいている。以下にいくつかの例を示す。

本研究は、低用量のＶＥＧＦの静脈内注射により一過性（約４５分～４時間）の開口が生じ、この間にＢＢＢの透過性が高まり、この開口の後にＢＢＢは完全性を回復することを示す。さらに、本研究は、複数用量のＶＥＧＦの投与、例えば治療薬投与前の１用量および治療薬投与後の１用量又は複数用量の投与が、ナノ粒子に基づく薬剤又はリポソームに基づく薬剤などの治療薬のＢＢＢ透過を容易にし、それによりヒト神経膠芽腫のマウスモデルの生存期間の大幅な延長などの意図される治療有効性を高めるうえでより有効であることを示す。

さらに、小型動物モデル（マウスモデル）及び大型動物モデル（ブタモデル）の両者において類似の結果が観察され、このことからこれらの選択された用量のＶＥＧＦであればヒトの治療において有効であると予期された。特に、本明細書に報告される結果は、ＶＥＧＦ前処理によって、治療薬（例えばＬｉｐｏＤｏｘ等）の脳腫瘍領域への進入が、マウスモデルにおいて観察されるような治療薬の正常な脳領域への進入よりもずっと高いレベルに増加したことを示す。

また、予期せぬことに、低用量のＶＥＧＦは、腫瘍脈管形成の増加、低血圧の誘発、又は任意の明確な有害作用を引き起こすことは認められなかった。１０倍高用量のＶＥＧＦは脳の区画化を破綻させることも著しい低血圧を引き起こすこともなかった。

ＶＥＧＦシグナル伝達の阻害はがん治療における重要な治療標的である。Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２（６４２３），８４１－８４４（１９９３）。したがって、がん患者への外来性ＶＥＧＦの投与は驚くべきことであり、直感と相いれないように思える。ＶＥＧＦは炎症の強力な誘導因子であることが以前に示されており、且つ、高血圧の原因になり得る。驚くべきことに、ＶＥＧＦによって非常に軽度の炎症しか誘導されないことが本研究の結果から示された。ＶＥＧＦ投与後の３時間以内では低血圧は観察されなかった。ＶＥＧＦは神経炎症を引き起こすことが分かっているため、複数回の低用量ＶＥＧＦが治療効力を高め、且つ、副作用を最小限にし得ると予期される。

ＢＢＢを越えた治療薬／診断薬の送達の促進のためのＶＥＧＦの使用
本開示の１つの態様は、低用量及び／又は複数用量のＶＥＧＦポリペプチドと薬剤（例えば診断薬又は治療薬）の併用を含む脳疾患の治療方法を特徴とする。ＶＥＧＦポリペプチドは低用量での治療を必要とする対象に対して全身投与可能であり、続いてＶＥＧＦポリペプチドの投与後の適切な時間枠内に薬剤が投与される。場合によっては、ＶＥＧＦポリペプチドは薬剤の投与後の適切な時間枠内に対象に対して１回又は複数回投与されてもよい。

（ｉ）ＶＥＧＦ
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、脈管形成及び血管形成を刺激する細胞によって産生されるシグナルタンパク質であり、血小板由来増殖因子サブファミリーに属する増殖因子である。ＶＥＧＦの通常機能は胚発生時の新血管形成、傷害後の新血管形成、運動後の筋肉形成、及び閉塞した血管を迂回するための新血管（側副循環）の形成である。血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、正常な新血管形成、並びに細胞の増殖及び生存の促進の原因となる可溶性ホモ二量体タンパク質である。

ヒトでは５種類のＶＥＧＦの型が見られ、正常な細胞及び組織で見られる優勢な型はＶＥＧＦ１６５Ａである。Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，９（６），６６９－６７６（２００３）。ＶＥＧＦは内皮細胞上に存在するＶＥＧＦＲ－１受容体又はＶＥＧＦＲ－２受容体への結合を介して作用し、血管透過性に影響することが長らく知られている。Ｓｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９（４５８７），９８３－９８５（１９８３）；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ Ｆａｃｔｏｒ． Ｉｎ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ：Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ；Ｃａｔｒａｖａｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｃａｌｌｏｗ，Ａ．Ｄ．，Ｇｉｌｌｉｓ，Ｃ．Ｎ．，Ｒｙａｎ，Ｕ．Ｓ．，Ｅｄｓ．；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ＵＳ：Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，１９９１；ｐｐ ６９－７６；ａｎｄ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，８（５５），１５３－１７０（２０１１）。血管形成におけるＶＥＧＦの役割を考慮して、ＶＥＧＦは虚血性疾患での使用についてヒトで治験されており、良好な耐用性を示すが特に有効ではないことがわかった。Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０７（１０），１３５９－１３６５（２００３）。

ＶＥＧＦは病態生理学的血管形成に役割を果たすことも知られており、遊離循環ＶＥＧＦの減少に重点を置いた治療法（ベバシズマブ）又はＶＥＧＦＲ活性を妨害することに重点を置いた治療法（セディラニブ）を利用して、栄養送達の減少及び細胞生存経路の妨害による腫瘍進行の遅延化に成功している。Ｋｈａｓｒａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗｓ；２０１４；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｗｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３７（７０５８），４９７－５０４（２００５）；及びＬｕ－Ｅｍｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，３３（１０）（２０１５）。これらの薬剤は腫瘍血管系を正常化する場合もあり、その結果として薬剤がより効果的に腫瘍まで送達されるようになる。Ｊａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０７：５８－６２（２００５）。

本明細書に言及される５種類のファミリーのうちのいずれのＶＥＧＦも本明細書に開示される方法に使用することができる。ＶＥＧＦは適切な起源、例えばヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、イヌ、及びネコに由来するものであってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法において使用されるＶＥＧＦ分子はＶＥＧＦ－Ａ分子、例えばＶＥＧＦ－Ａ_１６５アイソフォームである。ヒトＶＥＧＦ－Ａ_１６５のアミノ酸配列は、ＡＰＭＡＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲＱＥＮＰＣＧＰＣＳＥＲＲＫＨＬＦＶＱＤＰＱＴＣＫＣＳＣＫＮＴＤＳＲＣＫＡＲＱＬＥＬＮＥＲＴＣＲＣＤＫＰＲＲ（配列番号１）である。

いくつかの例では本明細書に記載される方法において使用されるＶＥＧＦ分子は野生型ＶＥＧＦである。他の例ではこの分子は改変型変異体であってよく、この変異体は野生型と同等又は類似の生物活性を保持している。

このような改変型変異体は、野生型と比較して少なくとも８５％（例えば９０％、９５％、９７％、９９％、又はそれ以上）の配列同一性を有していてもよい。２つのアミノ酸配列の「同一性パーセント」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７，１９９３のように改変されている、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８，１９９０のアルゴリズムを用いて決定される。このようなアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれている。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いてＢＬＡＳＴプロテインサーチを実施して目的のタンパク質分子に対して相同なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列の間にギャップが存在する場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２，１９９７に記載されるようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴプログラム及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）の初期パラメーターを使用することができる。

いくつかの実施形態では、改変型変異体は、野生型と比較して１又は複数の保存的アミノ酸残基置換から構成される。当業者は機能的に同等の変異体を提供するためにＶＥＧＦ分子に保存的アミノ酸置換が行われてもよいこと、すなわち、変異体が特定のＶＥＧＦの機能を保持することを理解するであろう。本明細書において使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換されたタンパク質の相対的電荷特性又はサイズ特性を変化させることがないアミノ酸置換のことを指す。変異体は、当業者に知られているポリペプチド配列改変方法をまとめている参照文献、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見られるような方法に従って調製可能である。アミノ酸の保存的置換には、（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ、（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ、（ｄ）Ａ、Ｇ、（ｅ）Ｓ、Ｔ、（ｆ）Ｑ、Ｎ、及び（ｇ）Ｅ、Ｄの群内のアミノ酸間で行われる置換が含まれる。

機能的に同等の変異体を作製するためのＶＥＧＦのアミノ酸配列中での保存的アミノ酸置換は、通常、この変異体をコードする核酸の変更によって行われる。このような置換は当業者に知られている様々な方法によって行われ得る。例えば、ＰＣＲによる変異、Ｋｕｎｋｅｌ（Ｋｕｎｋｅｌ，ＰＮＡＳ ８２：４８８－４９２，１９８５）の方法に従う部位特異的変異導入、又はＶＥＧＦ変異体をコードする核酸分子の化学合成によってアミノ酸置換が行われる場合がある。

本明細書に記載される方法において使用されるＶＥＧＦ分子はいずれも従来法によって調製されてもよい。例えば、日常的なタンパク質精製法に従って適切な天然起源から分子を単離することができる。あるいは、従来の組換え技術によって適切な宿主細胞内で分子を産生することができる。

ＶＥＧＦの他に、ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩなどの他の増殖因子も本明細書に記載される方法で使用されてもよい。

（ｉｉ）治療薬及び診断薬
本明細書に開示される方法は、ＢＢＢを越えた脳への薬剤の送達を促進することを目的としており、それにより薬剤は意図されている活性を及ぼすことができる。いくつかの例では、薬剤は脳障害、例えば脳腫瘍を治療するための治療薬であってもよい。他の例では、薬剤は脳の状態を診断するための診断薬、例えばイメージング剤であってもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される治療薬又は診断薬は、少なくとも１時間、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６、時間、少なくとも４８、時間、少なくとも７２時間、少なくとも２５時間、少なくとも３０時間、少なくとも３５時間、少なくとも４０時間、少なくとも４５時間、少なくとも５０時間、少なくとも５５時間、少なくとも６０時間、少なくとも６５時間、少なくとも７０時間、少なくとも７５時間、少なくとも８０時間、少なくとも８５時間、少なくとも９０時間、少なくとも９５時間、又は少なくとも１００時間の半減期を有していてもよい。例えば、治療薬は、少なくとも４０時間の半減期を有していてもよい。いくつかの例では、長期の半減期は、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３５時間、少なくとも３６時間、少なくとも４０時間、少なくとも４４時間、少なくとも４５時間、少なくとも５０時間、５０時間、少なくとも５５時間、少なくとも６０時間、少なくとも６５時間、少なくとも７０時間、少なくとも７５時間、少なくとも８０時間、少なくとも８５時間、少なくとも９０時間、少なくとも９５時間、少なくとも１００時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも５か月、又は少なくとも１年間の半減期であってもよい。

本明細書に開示される治療薬は、１又は複数の治療効果を有する任意の分子であってもよい。このような分子は、小分子、タンパク質（例えば抗体）、核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、又は干渉ＲＮＡ）、脂質、又は糖であってもよい。いくつかの例では、治療薬は水溶性化合物であってもよい。代わりに、又は加えて、治療薬は、（例えば５０００ダルトンを未満の分子量を有する）小分子であってもよく、比較的に大きいサイズを有していてもよく、例えば５００ダルトンを超える分子量、例えば１ｋＤａを超える分子量、２ｋＤａを超える分子量、３ｋＤａを超える分子量、又は４ｋＤａを超える分子量を有する。

いくつかの実施形態では、治療薬は遊離型であってよい。あるいは、治療薬は共有結合又は非共有結合により担体に結合されていてもよい。いくつかの実施形態では、治療薬はリポソーム若しくはナノ粒子に埋め込まれていてもよく、被包されていてもよく、結合していてもよい。

いくつかの例では、薬剤（例えば治療薬又は診断薬、場合によってはＶＥＧＦポリペプチド）はリポソームに埋め込まれているか、被包されていてもよく、結合していてもよい。例えば、リポソームは活性薬剤をリポソームの内部に有していてもよく、又は活性薬剤がリポソームの表面上に埋め込まれていてもよい。例として、本開示の治療薬はリポソームによって被包されていてもよく、リポソームの中に埋め込まれていてもよい。非限定的な例として、治療薬はリポソームドキソルビシン（ＬｉｐｏＤｏｘ）であってよい。例えば、米国特許第５，２１３，８０４号明細書を参照されたい。活性薬剤（例えばＶＥＧＦポリペプチド、診断薬、治療薬、又はそれらの任意の組合せ）を含むリポソームは、当技術分野において知られている方法、例えばＥｐｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０（１９８０）並びに米国特許第４，４８５，０４５号明細書及び同第４，５４４，５４５号明細書に記載される方法によって調製可能である。循環期間が増加したリポソームが米国特許第５，０１３，５５６号明細書中に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物を使用する逆相蒸発法により生成され得る。所定の孔径を有するフィルターからリポソームを押し出して所望の直径を有するリポソームが得られる。

リポソームは中性に帯電していてもよい。リポソームの電荷はゼータ電位測定法を用いて決定され得る。例えば、Ｃｌｏｇｓｔｏｎ ａｎｄ Ｐａｔｒｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１；６９７：６３－７０を参照されたい。例えば、中性に帯電したリポソームは－１０ｍＶ～＋１０ｍＶ（例えば－５ｍＶ～０ｍＶ、－３ｍＶ～０ｍＶ、－２ｍＶ～０ｍＶ、０～５ｍＶ、－２ｍＶ～２ｍＶ、又は－１０ｍＶ～－５ｍＶ、５ｍＶ～１０ｍＶ）のゼータ電位を有する場合がある。

あるいは、活性薬剤（例えば治療薬、診断薬、又は場合によってはＶＥＧＦポリペプチド）は、マイクロカプセル中に埋め込まれてナノ粒子を形成する場合もある。このようなナノ粒子は、例えばコロイド型薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）において、又はマクロエマルジョンにおいて、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルなど、例えばコアセルベーション技術又は界面重合によって調製され得る。このような技術は当技術分野において知られている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）を参照されたい。

本明細書に開示されるリポソーム又はナノ粒子はいずれも適切な大きさ、例えば適切なソリッドコア直径又は適切な流体力学的径を有していてもよく、それらの径はそれぞれ透過電子顕微鏡法及びＭａｌｖｅｒｎ ＺｅｔａＳｉｚｅｒなどの従来法によって決定され得る。ある特定の例では、それらのリポソーム又はナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む場合がある。

いくつかの例では、本明細書に開示されるリポソーム及びナノ粒子の適切なソリッドコア直径は、約２０～５００ｎｍの範囲、例えば約２０～４００ｎｍ、約２０～３００ｎｍ、約２０～２５０ｎｍ、約２０～２００ｎｍ、約２０～１５０ｎｍ、約２０～１００ｎｍ、約５０～３００ｎｍ、約５０～２００ｎｍ、又は約１００～３００ｎｍの範囲であってよい。代わりに、又は加えて、本明細書に開示されるリポソーム及びナノ粒子の適切な流体力学的径は、３０～５５０ｎｍの範囲、例えば約３０～５００ｎｍ、約３０～４５０ｎｍ、約３０～３５０ｎｍ、約３０～３００ｎｍ、約３０～２５０ｎｍ、約５０～２５０ｎｍ、又は約１５０～３５０ｎｍの範囲であってよい。いくつかの実施形態では、リポソームの流体力学的径は、１００ｎｍ未満（例えば１０ｎｍ～１００ｎｍ、２０ｎｍ～１００ｎｍ、３０ｎｍ～１００ｎｍ、４０ｎｍ～１００ｎｍ、５０ｎｍ～１００ｎｍ、６０ｎｍ～１００ｎｍ、７０ｎｍ～１００ｎｍ、８０ｎｍと１００ｎｍ、９０～１００ｎｍ、９１ｎｍ～１００ｎｍ、９０～９５ｎｍ、９５～１００ｎｍ、９２ｎｍと１００ｎｍ、９３ｎｍ～１００ｎｍ、９４ｎｍ～１００ｎｍ、９６～１００ｎｍ、９７ｎｍ～１００ｎｍ、９８ｎｍ～１００ｎｍ、又は９９ｎｍ～１００ｎｍ）であってよい。リポソームの流体力学的径は、動的光散乱法を含む任意の適切な技法を用いて測定することができる。例えば、Ｋａｓｚｕｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｎｏｐａｒｔ Ｒｅｓ（２００８）１０：８２３及び以下の例を参照されたい。

治療薬は抗がん剤、例えば神経膠芽腫などの脳腫瘍を治療するための薬剤であってもよい。抗がん剤の非限定的な例としては、トポイソメラーゼ阻害剤（例えばカンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、ドキソルビシン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン、及びアクラルビシン）、代謝拮抗剤（例えばフルオロピリミジン、デオキシヌクレオシド類似体、チオプリン、メトトレキサート、及びペメトレキセド）、アルキル化剤（例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブチル、イホスファミド、ブスルファン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチルウレア（ＭＮＵ）、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、フォテムスチン、ストレプトゾトシン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド、チオテパ、マイトマイシン、及びジアジコン）、細胞傷害性抗生剤（例えばアクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、アクラルビシン、及びミトキサントロン）、又は生物製剤（例えばベバシズマブ、セツキシマブ、ペムツモマブ、オレゴボマブ、ミンレツモマブ、エタラシズマブ、ボロシキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ－Ａ１２、ＭＫ－０６４６、Ｒ１５０７、ＣＰ７５１８７１、マパツムマブ、ＫＢ００４、又はＩＩＩＡ４などの治療抗体）が挙げられる。

ある特定の例では、治療薬（例えば抗がん剤）は、リポソームによって被包されているか、又はリポソーム中に埋め込まれている。リポソームによって被包されている治療薬の非限定的な例は、リポソームドキソルビシンである。ドキソルビシンはＤＮＡにインターカレートする化合物であり、トポイソメラーゼＩＩの阻害に関係するとされている。非限定的な例として、ドキソルビシンは、以下に示す式Ｉを含み得る。

ドキソルビシン誘導体及び薬学的に許容可能なそれらの塩も本開示によって包含されることを理解されたい。例えば、ドキソルビシンは塩酸ドキソルビシンであってよい。

いくつかの例では式Ｉ中の１又は複数の位置が（例えば官能基の置換又は付加により）改変されている場合がある。官能基の非限定的な例としては、炭化水素鎖（例えば置換又は非置換のアルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基）、ベンゼン環、アミン基、アルコール、エーテル、ハロゲン化アルキルド、チオール、アルデヒド、ケトン、エステル、カルボン酸、及びアミドが挙げられる。したがって、本明細書において使用される「ドキソルビシン」という用語は、式Ｉのこれらの改変型変異体のうちのいずれも包含する。

化学元素はＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，７５ｔｈ Ｅｄ．の内表紙、ＣＡＳバージョンの元素周期表に従って特定され、特定の官能基は一般的にそのハンドブックの中に記載されるように定義される。また、有機化学の全般的な原則、並びに特定の機能性部分及び反応性は、Ｔｈｏｍａｓ Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ，１９９９；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｍａｒｃｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１；Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；及びＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｓｏｍｅ Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９８７に記載されている。

本明細書に記載される化合物は１又は複数の不斉中心を含むことができ、したがって様々な異性体型、例えばエナンチオマー及び／又はジアステレオマーとして存在し得る。例えば、本明細書に記載される化合物は、個別のエナンチオマー、ジアステレオマー、又は幾何異性体の形で存在し得るか、又は（ラセミ混合物、及び１又は複数の立体異性体が濃縮された混合物を含む）立体異性体の混合物の形で存在し得る。キラル高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）並びにキラル塩の形成及び結晶化を含む当業者に知られている方法によって混合物から異性体を単離することができ、又は不斉合成によって好ましい異性体を調製することができる。例えば、Ｊａｃｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１）；Ｗｉｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３３：２７２５（１９７７）；Ｅｌｉｅｌ，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，ＮＹ，１９６２）；及びＷｉｌｅｎ，Ｔａｂｌｅｓ ｏｆ Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｐ．２６８（Ｅ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ，Ｅｄ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｎｏｔｒｅ Ｄａｍｅ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｔｒｅ Ｄａｍｅ，ＩＮ １９７２）を参照されたい。本発明は、本明細書に記載される化合物を他の異性体を実質的に含まない個々の異性体として、又は様々な異性体の混合物としてさらに包含する。

（ｉｉｉ）医薬組成物
本明細書に記載される方法において使用される活性薬剤（例えばＶＥＧＦ、診断薬、及び／又は治療薬）はいずれも、本明細書に開示される方法のいずれかにおいて使用される医薬組成物を形成するために、緩衝剤を含む薬学的に許容可能な担体（非薬効成分（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ））と混合され得る。「許容可能な」は、その担体が組成物の有効成分と適合可能でなくてはならず（及び好ましくは有効成分を安定化することができ）、且つ、治療対象に対して有害ではないことを意味する。緩衝剤を含む薬学的に許容可能な非薬効成分（担体）は当技術分野においてよく知られている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．（２０００） Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒを参照されたい。

許容可能な担体、非薬効成分、又は安定化剤は、使用される投与量及び濃度では服用者にとって無毒であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコール、又はベンジルアルコール、メチルパラベン又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質複合体）、及び／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。薬学的に許容可能な非薬効成分は、さらに本明細書に記載される。

ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される医薬組成物は無菌状態でなければならない。これは、例えば無菌濾過膜を通す濾過により容易に実現される。治療組成物は無菌アクセスポートを有する容器の中、例えば静脈内投与用輸液バッグ中、又は皮下注射針によって突き刺すことができるストッパーを有するバイアル瓶中に注入されることが一般的である。

本明細書に記載される医薬組成物は、経口投与、非経口投与、又は直腸投与のため、又は吸入若しくは吹送による投与のために、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、液剤若しくは懸濁剤、又は坐剤などの単位投与剤形であってもよい。

錠剤などの固体組成物の調製のため、主有効成分を医薬用担体、例えばコーンスターチ、ラクトース、ショ糖、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム又はガム類、及び他の医薬用希釈剤、例えば水などの従来の錠剤作製成分と混合して、本発明の化合物又は無毒の薬学的に許容可能なその塩の均一な混合物を含有する固体前製剤組成物を形成することができる。これらの前製剤組成物が均一であると言う場合、組成物を錠剤、丸剤及びカプセル剤などの同等に有効な単位投与剤形に容易に細分できるように、有効成分が組成物中に均等に分散していることを意味する。その後、この固体前製剤組成物は、０．１～約５００ｍｇの本発明の有効成分を含む上記の種類の単位投与剤形に細分される。新規組成物の錠剤又は丸剤は被覆されていてもよく、被覆されていない場合は長期作用の利点をもたらす剤形になるように調合されていてもよい。例えば、錠剤又は丸剤は内側投薬成分と外側投薬成分を含むことができ、外側投薬成分は内側投薬成分上の外被の形態である。それらの２つの成分は、胃の中での崩壊に抵抗し、内側成分が完全なまま十二指腸に入っていくように働くか又は遅れて放出されるように働く腸溶層によって分けられている場合がある。様々な材料をそのような腸溶層又は腸溶被覆に使用でき、そのような材料としては、多くのポリマー酸、並びにポリマー酸とシェラック、セチルアルコール、及びセルロースアセテートのような材料との混合物が挙げられる。

適切な界面活性剤には特に非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレンソルビタン（例えばＴｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０、又は８５）及び他のソルビタン（例えばＳｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０、又は８５）が挙げられる。界面活性剤を含む組成物は０．０５～５％の界面活性剤を都合よく含むことになり、０．１～２．５％であってもよい。必要であれば、他の成分、例えばマンニトール又は他の薬学的に許容可能なベヒクルが添加される場合があることを理解されたい。

適切な乳剤は、市販の脂肪乳剤、例えばＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）、及びＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）を使用してを調製され得る。有効成分は、事前に混合された乳剤組成物の中に溶解されてもよく、あるいは、油（例えば大豆油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、コーン油、又はアーモンド油）及びリン脂質（例えば卵リン脂質、大豆リン脂質、又は大豆レシチン）と水との混合時に形成される乳剤の中に溶解されてもよい。乳剤の浸透圧（ｔｏｎｉｃｉｔｙ）を調節するために、他の成分、例えばグリセロール又はグルコースが添加される場合があることを理解されたい。適切な乳剤は、最大で２０％の油、例えば通常５～２０％の油を含む。脂肪乳剤は０．１～１．０．ｉｍ、特に０．１～０．５．ｉｍの脂肪小滴を含んでいてもよく、且つ、５．５～８．０の範囲内のｐＨを有していてもよい。

乳剤組成物は、ＶＥＧＦ又は治療薬をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）又はその構成成分（大豆油、卵リン脂質、グリセロール、及び水）と混合することにより調製される組成物であってもよい。

吸入又は吹送用の医薬組成物としては、薬学的に許容可能な水性溶媒若しくは有機溶媒、又はそれらの混合物中の液剤及び懸濁剤、並びに粉剤が挙げられる。液体組成物又は固体組成物は上で示したような適切な薬学的に許容可能な非薬効成分を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は局所的効果又は全身的効果のために経口経路又は経鼻呼吸経路によって投与される。

一例では、活性薬剤のうちの１種類又は複数種類が液体医薬組成物に製剤されてもよく、それらの液体医薬製剤は、例えば静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は腹腔内注射によって投与可能な無菌液剤又は懸濁剤である。無菌注射液剤又は懸濁剤の製造に適切な希釈剤又は溶媒としては、１，３－ブタンジオール、マンニトール、水、リンゲル溶液、及び等張食塩水が挙げられるがこれらに限定されない。天然の薬学的に許容可能な油、例えばオリーブ油又はトウゴマ油同様に、脂肪酸、例えばオレイン酸及びそのグリセリド誘導体も注射剤の調製に有用である。これらの油剤又は懸濁剤は、アルコール性希釈剤又はカルボキシメチルセルロース若しくは類似の分散剤を含んでいてもよい。Ｔｗｅｅｎｓ又はＳｐａｎｓなどの他の一般的に使用される界面活性剤、又は薬学的に許容可能な剤形の製造に一般的に使用される他の類似の乳化剤若しくは生物学的利用率向上剤も製剤目的のために使用可能である。

（ｉｖ）治療薬又は診断薬の脳送達の促進
本明細書に開示されるＶＥＧＦポリペプチドはいずれも、例えばＶＥＧＦ１６５ＡなどのＶＥＧＦ－Ａ（及び他の増殖因子）は、ＢＢＢを越えた脳への薬剤の送達を増加させるために、本明細書に同様に開示される任意の薬剤（例えば治療薬又は診断薬）と併用することができる。処理を必要とする対象に対して低用量のＶＥＧＦポリペプチドを最初に投与し、ＶＥＧＦの投与後の適切な時間枠内に適切な用量の薬剤を適切な経路によって対象に投与することができる。いくつかの例では、薬剤の投与後の適切な時間内にＶＥＧＦポリペプチドの１回又は複数回の追加用量が対象に投与される場合がある。ＶＥＧＦの２連続の用量が適切な時間内に、例えば約２～２４時間を空けて、対象に体系的に投与されてもよい。

本明細書に開示される治療薬又は診断薬はいずれも、脳送達促進のためにＶＥＧＦと併用されてもよい。いくつかの例では、治療薬又は診断薬は、リポソーム若しくはナノ粒子中に埋め込まれていてもよく、又はリポソーム若しくはナノ粒子に被包されていてもよい。

本明細書に記載される方法を実施するため、処理を必要とする対象（例えば、本明細書に記載されているような対象）に対して、適切な量のＶＥＧＦポリペプチド（例えばヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５）を含む医薬組成物を適切な経路、例えば静脈内注射、動脈内注射、又は皮下注射によって最初に投与することができる。適切な時間の後に、同じ対象に対して有効量の治療薬又は診断薬を含む医薬組成物を適切な経路によって投与することができる。

「投与された」、「投与する」、又は「投与」という用語は、本発明の薬剤（例えば化合物又は組成物）の静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、動脈内投与、頭蓋内投与、又は皮下投与を含むがこれらに限定されない送達モードを指すために本明細書において互換的に使用される。本開示の１つの実施形態では、増殖因子（例えばＶＥＧＦ）、治療薬、又はイメージング用造影剤などの診断薬が直接静脈内注射又は直接頭蓋内注射によって対象に投与される。全身投与は身体全体が影響を受けるように循環系内に薬剤を投与する投与経路である。投与は腸内投与（胃腸管を介した薬剤の吸収）又は非経口投与（注射、点滴、又は移植）によって行われ得る。

ＶＥＧＦポリペプチド（及び本明細書に開示される別の増殖因子）及び治療薬／診断薬は、ＶＥＧＦ及び／又は治療薬／診断薬を適切な作用部位又は所望の作用部位まで効果的に輸送し得る任意の経路によって、適切な対象（例えばヒトなどの哺乳類動物）に投与され得る。例示的な投与経路としては、経口経路、経鼻経路、経肺経路、経皮経路、例えば受動的送達又はイオン導入送達、又は非経口経路、例えば直腸経路、デポー経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、鼻腔内経路、腹腔内経路、動脈内経路、頭蓋内経路、小脳内経路、皮下経路、点眼液又は軟膏が挙げられるがこれらに限定されない。

いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦポリペプチド（及び他の増殖因子）及び／又は治療薬／診断薬は従来の全身性経路、例えば静脈内注射又は皮下注射によって投与され得る。注射組成物は、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、及びポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）などの様々な担体を含有し得る。静脈内注射のために、ＶＥＧＦ又は治療薬／診断薬などの水溶性薬剤は、薬剤及び生理学的に許容可能な非薬効成分を含む医薬製剤が注入される点滴法によって投与され得る。生理学的に許容可能な非薬効成分としては、例えば５％ブドウ糖、０．９％生理食塩水、リンゲル溶液、又は他の適切な非薬効成分が挙げられ得る。筋肉内製剤、例えば適切な可溶性塩形態の薬剤の無菌製剤は、注射用水、０．９％生理食塩水、又は５％グルコース溶液などの医薬用非薬効成分中に溶解され、投与され得る。

いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦポリペプチドは低用量で対象に投与され得る。例えば、ＶＥＧＦは約１０ｎｇ／ｋｇ～５００ｎｇ／ｋｇの量、例えば約２０～２５０ｎｇ／ｋｇ、約５０～２００ｎｇ／ｋｇ、又は約１００～１５０ｎｇ／ｋｇの量で対象（例えばヒト対象）に投与される。ＶＥＧＦの選択された用量はＢＢＢの透過性を高めるためには十分に高い用量であるべきだが、その後の脳に対する損傷（例えば浮腫）を必然的に引き起こすＢＢＢの一体構造を破綻させるには不十分であるべきである。したがって、ＶＥＧＦは約１０ｎｇ／ｋｇ～５００ｎｇ／ｋｇの量、例えば約２０ｎｇ／ｋｇ、５０ｎｇ／ｋｇ、８０ｎｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ、１２０ｎｇ／ｋｇ、１５０ｎｇ／ｋｇ、１８０ｎｇ／ｋｇ、２００ｎｇ／ｋｇ、又は２５０ｎｇ／ｋｇの量で対象（例えばヒト対象）に投与されることが好ましい。ＶＥＧＦに対する感受性を有する対象に対しては、ＶＥＧＦの用量を、例えば１０ｎｇ／ｋｇ未満（例えば約１～５ｎｇ／ｋｇ又はそれ未満）まで減少させてもよい。あるいは、ＶＥＧＦに対する耐性を有する対象に対しては、ＶＥＧＦの用量を、例えば５００ｎｇ／ｋｇ超（例えば約５００ｎｇ／ｋｇ～５μｇ／ｋｇ、例えば８００ｎｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、４μｇ／ｋｇ、又は５μｇ／ｋｇ）まで増加させてもよい。

有効量の治療薬又は診断薬は、対象中の脳障害を治療又は診断するためにＶＥＧＦポリペプチド（又は別の増殖因子）と併用される。本明細書において使用される「有効量」という用語は、必要な投与回数及び期間で疾患の治療に関して所望の結果を達成するために有効な量を指す。例えば、がんの治療においては、がんの任意の症状を減少させる、防止する、遅延若しくは抑制する、又は停止させる薬剤（すなわち、化合物又は組成物）が有効であり得る。有効量の薬剤は、疾患又は異常を治癒させるために必要とされるのではなく、疾患又は異常の発症が遅延、妨害、又は防止されるように、又は疾患若しくは異常の症状が改善されるように、疾患又は異常に対する治療をもたらすであろう。有効量は、指定期間内に１回、２回、又はそれより多くの回数で投与されるように適切な形で１回用量、２回用量、又はそれより多くの用量に分割されてもよい。

本開示のＶＥＧＦ（又は他の増殖因子）及び／又は治療薬の投与量は、選択された特定の増殖因子又は治療薬、投与経路、及び患者において所望の応答を引き出す増殖因子又は治療薬の能力だけではなく、疾患状態又は緩和される症状の重症度、患者の年齢、性別、患者の体重、患者の健康状態、及び治療される病気の重症度、併用薬物、又は患者が従っている特別食などの因子、及び当業者が理解し得る他の因子によっても患者毎に異なることになり、適切な投与量は最終的には担当医師の自由裁量で決まることを理解されたい。投与計画は所望の応答を引き出すために調節されることがある。好ましくは、本発明の増殖因子がＢＢＢに対する透過性を上昇させるような量及び期間で投与された後、続いて、治療応答の改善を達成するために少なくとも１用量の治療薬が対象に投与される。

いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦポリペプチドは、治療薬又は診断薬の投与の約１５～１８０分前（例えば１５～１２０分前、１５～９０分前、１５～６０分前、３０～１２０分前、３０～９０分前、又は３０～６０分前）に投与され得る。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦポリペプチドは、治療薬又は診断薬の投与の約１５分前、約２０分前、約２５分前、約３０分前、約３５分前、約４０分前、約４５分前、又は約５０分前に投与される。ある例では、ＶＥＧＦは、治療薬の投与の約４５分前に投与される。別の例では、ＶＥＧＦの投与は、治療薬又は診断薬の投与の約３時間前である。

ある実施形態では、本明細書に開示される治療方法は、治療薬（例えば抗がん剤）又は診断薬の投与後に１回又は複数回の追加用量のＶＥＧＦポリペプチドを対象に投与することをさらに含む。例えば、治療薬／診断薬の投与から約２～２４時間後（例えば、２～１２時間後、３～８時間後、又は３～５時間後）に対象に対して追加の第１用量のＶＥＧＦを投与することができる。ある例では、１回目の追加用量のＶＥＧＦは治療薬／診断薬の投与から約３時間後に対象に投与される。いくつかの例では、１回目の追加用量のＶＥＧＦの投与後の適切な時間枠内、例えば、１回目の追加用量のＶＥＧＦの投与後２～２４時間（例えば２～１２時間、３～８時間、又は３～５時間）に対象に対して２回目の追加用量のＶＥＧＦを投与することができる。ある例では、２回目の追加用量のＶＥＧＦは１回目の追加用量のＶＥＧＦの投与の約３時間後に対象に投与される場合がある。必要な場合は、治療薬又は診断薬の処理と共に追加用量のＶＥＧＦを対象に対して投与してもよい。

複数用量のＶＥＧＦが使用される場合、各ＶＥＧＦ投与の用量は同じであってよい。あるいは、異なるＶＥＧＦ用量が異なる回に投与されてもよい。いくつかの例では、各回に低用量のＶＥＧＦ（例えば、本明細書に開示される低用量の範囲内の用量）を対象に投与することができ、異なる回で投与されるＶＥＧＦの用量は同じであっても異なっていてもよい。

ＶＥＧＦ処理の経過において、薬剤の日常的手順の後に１回又は複数回の追加用量の治療薬又は診断薬が対象に投与されてもよい。いくつかの例では、治療薬又は診断薬の投与はそれぞれ、最後のＶＥＧＦ投与の後の適切な時間枠内、例えば最後のＶＥＧＦ投与後の３０分～３時間以内、場合によっては最後のＶＥＧＦ投与の約４５分後に行われてもよい。

いくつかの例では、低用量のＶＥＧＦポリペプチド（例えばＶＥＧＦ１６５Ａ）がヒト患者などの対象に投与される。約３０～６０分（例えば４５分）、有効量の治療薬又は診断薬が同じ対象に投与される。対象はその後、１回又は複数回の低用量のＶＥＧＦが追加投与されてもよく、例えば、治療薬／診断薬の投与の２～８時間後に１回目の追加の低用量のＶＥＧＦが投与され、場合によっては１回目の追加用量のＶＥＧＦの２～８時間後に２回目の追加の低用量のＶＥＧＦが投与される場合がある。追加の用量の治療薬又は診断薬は、１回目の追加用量のＶＥＧＦの前及び／又は後に対象に投与されてもよく、場合によっては２回目の追加用量のＶＥＧＦの前及び／又は後に対象に投与されてもよい。

いくつかの例では、治療薬又は診断薬の投与の後に３回以上の用量のＶＥＧＦが対象に投与される。例えば、少なくとも２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、又は１０回の用量（例えば低用量）のＶＥＧＦが治療薬又は診断薬の投与後に対象に投与されてもよい。治療薬の投与後に投与されるＶＥＧＦの用量は、連続的に（例えば治療薬の投与を挟まずに）投与されてもよい。あるいは、治療薬の投与後に投与されるＶＥＧＦの用量は、非連続的に（例えば治療薬の投与を挟んで）投与されてもよい。

いくつかの例では、ＶＥＧＦの（例えば連続的又は非連続的な）投与と投与の間の間隔は最大で４時間（例えば１５分間、３０分間、１時間、１．５時間、２時間、３時間、又は４時間）である。ＶＥＧＦの（例えば連続的又は非連続的な）投与と投与の間の間隔は１～４時間、２～４時間、３～時間、１．５～４時間、２．５～４時間、２～３時間、又は２．５～３．５時間であってよい。いくつかの例では、ＶＥＧＦの（例えば連続的又は非連続的な）投与と投与の間の間隔は３時間である。

いくつかの例では、対象に投与されるＶＥＧＦの用量がそれぞれ同じ量である。いくつかの例では、対象に投与されるＶＥＧＦの少なくとも２回の用量が同じ量である。いくつかの例では、対象に投与されるＶＥＧＦの少なくとも２回の用量が異なる量である。いくつかの例では、対象に投与されるＶＥＧＦの全ての用量が異なる量である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、対象の脳腫瘍などの脳疾患の治療に適用され得る。いくつかの例では、脳腫瘍は神経膠芽腫（例えば多形神経膠芽腫）である。「対象」又は「患者」という用語は、本発明の方法で治療可能なヒト種を含む動物を指す。「対象」又は「患者」という用語は、一方の性が具体的に指示されない限り男性と女性の両方を指すものとされる。したがって、「対象」又は「患者」という用語は本開示の治療方法から利益を得る場合がある任意の哺乳類動物を含む。

「腫瘍」及び「がん」という用語は本明細書において互換的に使用され、無制御の増殖、分化の欠如、及び／又は周囲の組織へ進入及び転移する能力を引き起こす、正常な制御の喪失を独自の特性として有する任意の細胞性悪性病変を意味することを意図している。ヒト脳腫瘍としては、神経膠腫、腫瘍転移、髄膜腫、下垂体腺腫、及び聴神経腫が挙げられるがこれらに限定されない。神経膠腫の例としては、星状細胞腫、毛様細胞性星状細胞腫、低悪性度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形神経膠芽腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、上衣下腫、神経節腫、混合膠腫、乏突起神経膠腫、及び視神経膠腫が挙げられる。いくつかの例では、脳腫瘍は多形神経膠芽腫である。非グリア系腫瘍の例としては、聴神経腫瘍、脊索腫、ＣＮＳリンパ腫、頭蓋咽頭腫、血管芽腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫瘍、下垂体腫瘍、原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、ラブドイド腫瘍、及びシュワン細胞腫が挙げられる。脳神経に影響する腫瘍としては、視神経の神経膠腫、第８脳神経の神経線維腫、第５脳神経の神経線維腫が挙げられる。良性腫瘍としては、くも膜嚢胞、類皮嚢胞、類表皮嚢胞、コロイド嚢胞、及び神経上皮嚢胞、並びに他の任意の進行の遅い腫瘍が挙げられる。原発脳腫瘍は上記の腫瘍のように脳自体の中で発生するが、転移性脳腫瘍（身体の別の部分でのがんとして始まった続発性脳腫瘍）が最も一般的な脳腫瘍である。脳転移は、限定されないが、肺、皮膚（黒色腫）、腎臓、結腸、及び乳房で発生するがんを含む原発がんから転移する場合がある。

本明細書において使用される「治療」という用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果、例えばがんの増殖の遅延化又は抑制、又は器官（例えば脳）に対する虚血傷害の改善を得ることを意味するものとされる。その効果は疾患又はその症状の完全又は部分的な防止という点で予防的であってもよく、及び／又は疾患及び／又は疾患が原因の有害作用の部分的若しくは完全な治癒という点で治療的であってもよい。本明細書において使用される「治療」には、哺乳類動物、特にヒトの疾患の防止的（例えば予防的）治療、治癒的治療、又は緩和的治療が含まれ、その治療には（１）ある疾患にかかりやすい可能性があるがまだその疾患を発症しているとは診断されていない個人における、疾患又は異常の発症の防止的（例えば予防的）治療、治癒的治療、又は緩和的治療、（２）（例えば疾患の進行停止による）疾患の抑制、又は（３）疾患の緩和（例えば疾患に関連する症状の軽減）が含まれる。

本明細書に記載される抗がん剤などの抗がん剤は、本明細書に提供される開示に従ってＶＥＧＦ（及び本明細書に記載されるような別の増殖因子）と併用され得る。低用量のＶＥＧＦは小分子薬剤だけでなくタンパク質薬／ナノ粒子／幹細胞に対してもＢＢＢ透過性を上昇させることがわかった。したがって、小分子抗がん剤及び生物製剤の両方が脳腫瘍の治療有効性を高めるために本明細書に記載されるようなＶＥＧＦと併用され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、限定されないが、脳卒中、精神神経障害、又は神経変性疾患を含む脳障害の治療に適用することができる。このような脳疾患の例は本明細書に示されている。いくつかの例では。ＭＳＣなどの幹細胞が本明細書に提供される開示に従って脳卒中又は神経変性疾患の治療のためにＶＥＧＦ（及び本明細書に記載されるような他の増殖因子）と併用され得る。他の例では、抗凝固剤（例えば本明細書に記載される抗凝固剤）が脳卒中の治療のためにＶＥＧＦと併用されてもよい。さらに、本明細書に記載される任意の抗精神病薬又は抗認知症薬を含む抗精神病薬又は抗認知症薬が精神障害又は認知症の治療のためにＶＥＧＦと併用されてもよい。これらの標的疾患の例も本開示中に示されている。

本明細書において使用される「脳卒中」という用語は、脳の全部又は一部への血液供給を阻止するか減少させる任意の事象を意味するものとされる。脳卒中は、血栓症、塞栓症、又は出血が原因の場合があり、虚血性脳卒中（血栓性脳卒中及び塞栓性脳卒中が含まれ、血栓症、塞栓症、及び全身性血流低下等により生じる）又は出血性卒中（脳内出血、くも膜下出血、硬膜下出血、及び硬膜外出血等により生じる）と呼ばれる場合がある。本明細書において使用される場合、熱中症及び一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）は脳卒中から除外される。熱中症は体温上昇により生じ、脳内の臨床症状は本明細書において規定される脳卒中の臨床症状（すなわち、脳内での低酸素状態と関連した血液供給の中断）とは異なる。ＴＩＡは時に「軽度脳卒中」と呼ばれるが、これらの軽度脳卒中は発症２４時間以内に完全に解消する能力から、本明細書において規定される脳卒中と区別可能である。脳卒中は神経学的検査、血液検査、並びに／又はコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン（例えば造影剤を使用しないもの）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、超音波ドプラー法、及び動脈造影法などの医用画像撮影法によって診断される。

「精神神経障害」という用語は、４種類の精神的能力のうちのどれが影響を受けているかによって通常分類される神経障害を意味するとされる。例えば、第１の群には統合失調症及びせん妄などの思考障害及び認知不全が含まれ、第２の群には情動障害及び不安症などの気分障害が含まれ、第３の群には人格欠損及びパーソナリティ障害などの社会的行動障害が含まれ、第４の群には知的障害及び認知症などの学習障害、記憶障害、及び理解力障害が含まれる。したがって、本開示の精神神経障害は、統合失調症、せん妄、アルツハイマー病（ＡＤ）、うつ、躁病、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、薬物中毒、軽度認知障害、認知症、激越、感情鈍麻、不安症、精神病、外傷後ストレス障害、易刺激性、及び双極性障害を包含する。

本明細書において使用される「神経変性疾患」という用語は、神経系の様々な領域での神経細胞死及びその結果としての罹患対象の機能障害を特徴とする状態を指す。本開示の神経変性疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）、嗜銀顆粒病、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、グアムＡＬＳ／パーキンソン認知症複合、血管性認知症、前頭側頭型認知症、意味認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病、封入体ミオパチー、封入体筋炎、又はパーキンソン病（ＰＤ）を包含する。

他の実施形態では、本明細書に記載される方法は、造影剤などのイメージング剤とのＶＥＧＦ（又は他の増殖因子）の併用による脳イメージングに適用可能である。造影剤は、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）又は単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などのコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて検出可能な任意の薬剤であってもよい。非限定的な例として、イメージング剤はコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）又は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）の造影剤であってよい。

脳障害の治療又は診断に使用されるキット
本開示は、脳疾患の治療又は診断のために本明細書に記載される方法において使用されるキットも提示する。このようなキットは少なくとも２つの容器を含むことができ、ＶＥＧＦを含む第１の製剤を含む容器、及び本明細書に記載されるような治療薬（例えば抗がん剤）又は本明細書に記載されるような診断薬（例えばイメージング剤）を含む第２製剤を含む第２の製剤を含む。いくつかの例では、キットは、ＶＥＧＦを含む第３製剤を含む第３の製剤を含み、第３の製剤は第２の製剤の投与の２～４時間後に処理を必要とする対象に全身投与されるものであってもよい。

いくつかの例では、キットには、第３の製剤の投与の２～４時間後に処理を必要とする対象に全身投与されるものであってよい、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む第４製剤を含む、少なくとも１つの第４の容器（ｉｖ）がさらに含まれる。２つ以上の第４の容器を含む例では、連続的なＶＥＧＦと投与の間隔は２～４時間であってもよい（例えば、その間隔は３時間であってもよい）。

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法のうちのいずれかに準拠する取扱説明書を含んでいてもよい。含まれている取扱説明書は、本明細書に記載されるような標的脳疾患を治療又は診断するためのＶＥＧＦ及び／又は治療薬／診断薬の投与についての説明を含み得る。キットは、個人が標的疾患を有しているか否かを特定することに基づく、治療に適切な個体の選別についての説明をさらに含んでいてもよい。さらに他の実施形態では、取扱説明書は標的疾患のリスクがある個体へのＶＥＧＦ又は治療薬／診断薬の投与についての説明を含んでいてもよい。

ＶＥＧＦ及び／又は治療薬／診断薬の使用に関する取扱説明書には、意図されている治療又は診断のための投与量、投与スケジュール、及び投与経路に関する情報が通常含まれている。容器は単位用量、バルク包装（例えば複数用量包装）、又は小単位用量であってよい。本明細書に記載されるキット中に提供される取扱説明書は、通常、ラベル上又は添付文書（例えば、キット中に含まれる紙シート）上に書かれた取扱説明書であるが、機械可読式の取扱説明書（例えば磁気式記憶ディスク又は光学式記憶ディスク上に保持されている取扱説明書）も許容可能である。

ラベル又は添付文書は、この組成物が本明細書に記載されるような脳疾患又は脳障害の治療／診断、発症遅延、及び／又は改善に使用されることを示す。取扱説明書は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかを実施するために提供されてもよい。

本発明のキットは適切に包装されている。適切な包装としては、バイアル、ボトル、ジャー、及びフレキシブル包装（例えば、密封されたマイラーバッグ又はプラスチックバッグ）等が挙げられるがこれらに限定されない。特定の装置、例えば吸入器、経鼻投与装置（例えば、アトマイザー）、又はミニポンプなどの輸液装置と併用するためのパッケージも考慮される。キットは無菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は静脈内投与用輸液バッグ又は皮下注射針で突き刺し可能なストッパーを有するバイアル瓶であってよい）。容器が無菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は静脈内投与用輸液バッグ又は皮下注射針で突き刺し可能なストッパーを有するバイアル瓶であってよい）。

キットは、任意に、緩衝液及び解釈用情報などの追加の構成要素を提供してもよい。通常、キットは容器、及び容器上の又は容器に添付されたラベル又は添付文書を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、上記キットの内容物を含む製品を提供する。

一般的な手法
本発明の実施には、別段の指示がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来技法が使用されることになり、それらの技法は当技術分野の範囲内である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）。

当業者は、さらに精査せずとも、上記記載に基づいて本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は単なる例示であると解釈されるべきであり、いかなる意味においても以下の開示を限定するものではない。本明細書において引用されている全ての刊行物は、本明細書において参照された目的又は主題について参照により取り込まれる。

実施例：多形神経膠芽腫のリポソーム化薬剤療法の改善のための血液脳関門透過性の一過性上昇の誘導
本研究は、血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性を高めることによる脳への治療薬の送達の促進における低用量のヒト血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）の効果を試験する。本明細書では、低用量の全身投与されたヒトＶＥＧＦポリペプチドにより、マウス及びブタの両方で短時間のＢＢＢ透過性の上昇が誘導されたことが報告された。ＶＥＧＦは、様々な大きさのナノ粒子、小分子、及びリポソーム化学療法薬を含む様々な例示的分子の脳送達を増加させることがわかった。これらの結果はＶＥＧＦによって誘導されるＢＢＢ透過性の時間枠は一過性であることを示しており、正常なＢＢＢ完全性はマウスモデルにおいて観察されたようにＶＥＧＦの投与後４時間以内に回復した。ＶＥＧＦとリポソーム化ドキソルビシンを組み合わせることでヒト神経膠芽腫のマウスモデルの動物生存期間が予想外に延長された。驚くべきことに、ＶＥＧＦがマウスに投与された場合、全身にわたる毒性は認められなかった。

したがって、これらの結果は、ナノ粒子又はリポソーム型薬剤などの治療薬のＢＢＢを越えた送達を促進し、それにより脳障害の治療を促進するためにＶＥＧＦを使用することができることを裏付けている。

材料と方法
（ｉ）動物実験
薬剤生体内分布試験に使用された動物は、体重約２５ｇの８～１０週齢の雄フレンド白血病ウイルスＢ（ＦＶＢ）マウスであった。約２１ｇの６～８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃ ＮＵマウスをヒトＧＢＭ腫瘍異種移植実験に使用した。ＰＤＡＣ腫瘍異種移植のためには体重２５～３０ｇの８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを使用し、機構研究及び安全性試験には約３０ｇの８～１０週齢の雌ＩＣＲマウスを使用した。全てのマウスを台湾のＢｉｏＬａｓｃｏ社から購入した。マウスを自由給水給餌で１２時間毎の昼夜サイクルで飼育した。大型動物試験のために１９～２４ｋｇのＬａｎｙｕミニブタを使用した。全てのマウス実験は台湾中央研究院動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって認可され、ブタは台湾国家実験動物センターの認可済みプロトコルに従って獣医スタッフの監督下で使用された。

（ｉｉ）薬剤投与
マウスでは別段の定めが無い限り３０Ｇのインスリン注射針を使用して尾静脈よりボーラス注射として薬剤を投与した。組換えヒトＶＥＧＦ１６５Ａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、台湾）を０．１％（重量／体積）ウシ血清アルブミン中に懸濁し、別段の定めが無い限り体重１ｇ当たり１．５ｎｇの用量で外側尾静脈から投与した。エバンスブルー（Ｓｉｇｍａ社、Ｅ２１２９）を通常生理食塩水中に４％（重量／体積）の濃度で懸濁し、４ｍｌ／ｋｇの用量で投与した。生理食塩水中に懸濁された塩酸ドキソルビシン（Ｓｉｇｍａ社、Ｄ１５１５）、又はＬｉｐｏＤｏｘ（ＴＴＹ Ｂｉｏ社、台湾）を外側尾静脈により２～８ｍｇ／ｋｇの用量でゆっくりと投与した。テモゾロミド（Ｓｉｇｍａ社、Ｔ２５７７）を５ｍｇ／ｋｇ又は２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。２０ｎｍ、１００ｎｍ、及び５００ｎｍのソリッドコア直径を有する蛍光ＰＥＧ結合黄緑色ポリスチレン微粒子（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を３ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。神経炎症の誘導のために使用したリポ多糖（Ｓｉｇｍａ社、Ｌ４３９１）を、５ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。ブタではｒｈＶＥＧＦ１６５Ａ（０．２μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｍｌ）又はベヒクル対照を右総頸動脈に注入した。５％（重量／体積）ブドウ糖溶液中に０．３５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈されたＬｉｐｏＤｏｘ（ＴＴＹ Ｂｉｏ社、台湾）を約３．０ｍｌ／分の速度のシリンジポンプによる静脈内点滴によって１．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。黄緑色ＰＥＧ結合ポリスチレンナノ粒子（１００ｎｍのコア径）を３ｍｇ／ｋｇの用量でボーラス注入により投与した。

（ｉｉｉ）ナノ粒子のＰＥＧ化
以前に記載されたように、ｍＰＥＧアミン（５ｋＤ、Ｎａｎｏｃｓ社、台湾）及びカルボジイミド（Ｓｉｇｍａ社）を使用して蛍光ナノ粒子をＰＥＧ化し、Ｍａｌｖｅｒｎ ＺｅｔａＳｉｚｅｒ ＺＳを使用してこれらのナノ粒子の特徴を分析した。Ｌｕｎｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，６：２５６１３（２０１６）。

（ｉｖ）造影磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）
マウスについては技術員がＰｈａｒｍａｓｃａｎ ７Ｔ １６ｃｍボア水平システムを操作した。イソフルラン吸入によって麻酔されたＦＶＢマウスにＶＥＧＦ又は同体積のベヒクル対照を注入した。造影前Ｔ１強調スピンエコー画像を撮影した（反復時間（ＴＲ）＝４００ミリ秒、エコー時間（ＴＥ）＝１０．８ミリ秒、視野（ＦＯＶ）＝２×２ｃｍ、励起回数（ＮＥＸ）＝８、スライス厚０．８ｍｍ）。ＶＥＧＦ投与の４５分後又は４時間後に造影剤（Ｇａｄｏｖｉｓｔ、Ｂａｙｅｒ社）をカテーテル挿入された尾静脈に０．２ｍｍｏｌ／ｋｇの割合で投与した。造影剤注入の１分後に造影後Ｔ１強調画像を撮影した。ＲＯＩのシグナル（平均ピクセル強度）をバックグラウンドノイズの標準偏差によって除算することによってＳＮ比を計算した。画像撮影、ＳＮ比測定、及び腫瘍容積測定は全て２人のＭＲＩ操作技術員により実施あれ、これらの技術員には試験群が伏せられた。

ブタについては、ＶＥＧＦ又はベヒクル対照を投与し、Ｐｈｉｌｉｐｓ Ａｃｈｉｅｖａ Ｘ ３．０ ３Ｔ ＭＲＩ装置を使用して２枚の造影前Ｔ１強調ターボスピンエコー画像を撮影した（ＴＲ＝６００ミリ秒、ＴＥ＝１０ミリ秒、ＦＯＶ＝２０×２０ｃｍ、スライス厚＝３ｍｍ）。ＶＥＧＦ投与の４５分後にガドジアミド（Ｏｍｎｉｓｃａｎ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を０．１ｍｍｏｌ／ｋｇの用量（約５ｍｌ）でパワーインジェクターにより静脈内投与した。１分後に、３枚組の造影後画像を同じ設定で撮影した。２枚の造影前画像は平均され、各動物の造影後画像のうちで最も高いＳＮ比を有するものが分析のために選択された。

（ｖ）エバンスブルーの定量
３０分の循環後に腹部大動脈から５０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を灌流した。臓器を取り出し、複数の小片に分割し、リンスし、乾燥し、重量測定し、５００μｌのホルムアミド中でホモジナイズし、６０℃で一晩加熱し、２１，０００ｇで１５分間遠心分離した。上清の吸光度を６２０ｎｍで測定し、７４０ｎｍでバックグラウンド補正を行い、検量線により未知濃度を定量した。エバンスブルー注射を受けなかったマウスの臓器を使用してブランク吸光度読み取り値を確定した。Ｒａｄｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．，Ｎｏ．７３，ｅ５００６２（２０１３）。

同じ臓器の複数の小片に由来する濃度を平均した。この方法の検量線が図８ａに示されている。エバンスブルーの血管外漏出を撮影するため、ｄｅｌ Ｖａｌｌｅらの方法を適用した。ｄｅｌ Ｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１７４（１），４２－４９（２００８）。マウスを５０ｍｌのＰＢＳで心臓内灌流し、続いて５０ｍｌのパラホルムアルデヒド（４％重量／体積）中のエバンスブルー（１％重量／体積）で心臓内灌流した。局所的なＢＢＢ損傷領域を誘発するための凍結損傷を陽性対照として使用した。ＯＣＴ（Ｏｐｔｉｍｕｍ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）コンパウンド中に脳を包埋し、分析用に２０μｍ厚の切凍結片を作製した。

（ｖｉ）蛍光ＰＥＧ結合ポリスチレンナノ粒子の定量
マウスではナノ粒子を３０分間循環させた後、上記のように動物に対して灌流を行った。ＩＶＩＳを使用してナノ粒子の保持量を定量した（励起４８５ｎｍ、蛍光５３０ｎｍ）。ナノ粒子投与を受けなかったマウスの脳を使用してバックグラウンド補正を行った。ブタではＨＰＬＣを使用してナノ粒子の保持量を定量した。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｓｃａｌｅ，７（３８），１５８６３－１５８７２（２０１５）。簡単に説明すると、ナノ粒子の蛍光染料をｏ－キシレン中に抽出し、Ｗａｔｅｒｓ ｅ２６９５分離モジュール及びＸ－ｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ）カラムをメタノール：水（７７：２３）の移動相、流速１ｍｌ／分で使用して定量した。検出には、Ｗａｔｅｒｓ ２４７５ ＦＬＲ検出器を５０５ｎｍの励起及び５１５ｎｍの蛍光で使用した。

（ｖｉｉ）テモゾロミド（ＴＭＺ）のＨＰＬＣ定量
約１００ｍｇの組織を酸性化酢酸アンモニウム（２００μｌ、１０ｍＭ、ｐＨ３．５）、硫酸亜鉛（２００μｌ、１００ｍＭ）、及びメタノール（４００μｌ）中でホモジナイズし、続いて４℃で３０分間、１０，０００ｇで遠心分離した。上清をＨＰＬＣ分析のために採取した。８０：２０の比率の酢酸（０．１％体積／体積）とメタノールを使用して、３５℃で、Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｔ３ ３μｍ ＨＰＬＣカラム内、０．８ｍｌ／分の流速で、Ｗａｔｅｒｓ ｅ２６９５分離モジュールにより分離を実施した。Ｗａｔｅｒｓ ２４８９ ＵＶ／可視光検出器を３１６ｎｍで使用して検出を実施した。テオフィリンを内部標準として使用し、２７５ｎｍでこれを測定して、結果をテオフィリンピークに対するＴＭＺピークの比率として計算した。図８ｂに示されているように、溶解緩衝液中に溶解されたＴＭＺの検量線から未知濃度を計算した。

（ｖｉｉｉ）ドキソルビシン及びリポソームドキソルビシンのＨＰＬＣ定量
臓器を取り出し、乾燥し、重量測定し、複数の小片（約１００ｍｇの組織又は１００μｌの血漿）に分割した後、１ｍｌの溶解緩衝液（０．２５Ｍ ショ糖、５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ６．７）を使用して完全にホモジナイズした。次に、２００μｌのホモジネートを１ｍｌの酸性化アルコール（７０％エタノール、０．３Ｎ ＨＣｌ）と混合し、－２０℃で一晩放置した後、４℃で３０分間、１０，０００ｇで遠心分離した。上清をＨＰＬＣ分析のために採取した。Ｗａｔｅｒｓ ｅ２６９５分離モジュール、４０℃で、Ｘ－Ｂｒｉｄｇｅ ５μｍカラム内、３５％の１０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４と６５％のメタノールの移動相、１ｍｌ／分の流速より分離を行った。検出には、Ｗａｔｅｒｓ ｅ２４７５モジュール（励起４８０、蛍光６００ｎｍ）を使用した。

ＬｉｐｏＤｏｘ抽出のために、３０分間の超音波処理、２回の凍結融解処理、及び溶解緩衝液へのトリトン－Ｘ１００（１％体積／体積）の添加を含むようプロトコルを改変して、以前の刊行物のプロトコルに適合させた。Ｋｏｖａｃｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，１８７，７４－８２（２０１４）；及びＬａｇｉｎｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１１（１９ Ｐｔ １），６９４４－６９４９（２００５）。検量線、ＨＰＬＣピークの例、及び回収率が図９ａ～９ｄに示されている。

（ｉｘ）多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）異種移植モデル
本試験ではＤＢＴＲＧ－０５ＭＧヒト神経膠芽腫細胞を使用した。ルシフェラーゼ発現の証拠が図１３ａに示されている。１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中において３７℃でＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ細胞を日常的に培養した。製造業者のプロトコルに従ってＭＴＴアッセイを実施した。ＧＢＭ腫瘍の作製のため、６μｌの無菌生理食塩水中に懸濁された３００，０００個のＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ生細胞を定位注入により０．５ｍｌ／分で６週齢のＢＡＬＢ／ｃ ＮＵマウスに投与した。注入位置はブレグマの後方２ｍｍ、右大脳半球１．５ｍｍ側方、及び硬膜より２．５ｍｍの深さであり、細胞を視床に送達した。Ｂａｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．，Ｎｏ．６７，３－６（２０１２）。ボーンワックスを頭蓋骨に塗り、縫合糸を用いて皮膚を閉じた。異種移植による腫瘍形成の成功率は約９０％であった。これらの動物が腫瘍進行のために死んだ場合、又はこれらの動物が重篤な悪液質（開始時の体重の２５％超の減少）、摂食不能、及び足指つまみ刺激に対する応答の欠如を含む所定の基準に合致した場合の殺処理時に、動物の死を記録した。Ｇｈｏｌａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｅｕｓ，４，１－１４（２０１３）。腫瘍モデルのその他の特徴解析が図１３Ａ～１３Ｃに示されている。

皮下ＧＢＭ異種移植のために、１×１０^６細胞のＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ細胞をＢＡＬＢ／ｃ ＮＵマウスのそれぞれの脇腹に注入し、５８日間増殖させた。膵臓がん（ＰＤＡＣ）の同所性モデルについては、台湾国立台湾大学医病院のＹｕ－Ｗｅｎ Ｔｉｅｎ博士より贈られたルシフェラーゼ発現性ＡｓＰＣ１ヒト膵臓がん細胞を１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ１６４０中において３７℃で日常的に培養した。Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．，６（１），８９－９８（１９８５）。１０μｌの無菌ＰＢＳ中に懸濁された５×１０^５細胞のＡｓＰＣ１生細胞を膵臓中に投与した。Ｃｈａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２０１３，Ｎｏ．７６，２－６（２０１３）。膵臓を腹腔内に戻した後、腹膜には連続縫合を使用し、皮膚には結節縫合を用いて、切開部分を二層で閉じた。その他の情報が図１６Ａ～１６Ｄに提供される。

（ｘ）腫瘍進行のＩＶＩＳ評価
７５μｇ／ｇのルシフェリン基質（Ｍｏｎｏｌｉｇｈｔ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を腹腔内投与により投与した。イソフルラン吸入によりマウスを麻酔し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍを使用して５分間隔で反復ＩＶＩＳ像を撮影した。最も強い発光シグナルを示す時点を分析に選択した。各フレームに存在するシャムマウス由来のバックグラウンド読み取り値を差し引いた。

（ｘｉ）免疫蛍光染色
６０日目～７０日目の間に死んだマウスの脳腫瘍を免疫蛍光染色に選択した。ＶＥＧＦ＋対照の試料を参照のために含ませたが、これらのマウスは６０日目よりも前に死んだ。使用した一次抗体及び希釈度は、抗Ｋｉ６７抗体（１：５００、ＧｅｎｅＴｅｘ社、ＧＴＸ１６６６７）、イソレクチンＩＢ４－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、抗ＧＦＡＰ抗体（１：５００、ＡｂＣａｍ社、ａｂ６８４２８）、抗Ｉｂａ１抗体（１：１０００、Ｗａｋｏ社、０１９－１９７４１）、抗Ｐ－糖タンパク質抗体（１：１００、ＡｂＣａｍ社、ａｂ１７０９０４）、抗ｐｄｇｆｒβ抗体（１：１００、Ａｂｃａｍ社、ａｂ３２５７０）、抗クローディン５抗体（１：５０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、３４－１６００）、抗ＣＤ３１抗体（１：１００、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、５５０２７４）であった。試料を４％（重量／体積）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（ｐＨ６．８）中で一晩固定し、パラフィン中に包埋し、切片を作製した。スライドに対してキシレンを使用して脱パラフィンを行い、アルコールから水への段階希釈物によって再水和を行い、製造業者の指示に従って抗原賦活化、透過処理、及びブロッキングを行った。イソレクチン以外はブロッキング緩衝液中に希釈した一次抗体を４℃で一晩適用し、イソレクチンについては室温で１時間適用した。スライドをＰＢＳで３回洗浄した後、第２の一次抗体を添加して、４℃で一晩放置した。使用した二次抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ－１１０１１）とヤギ抗ラットＩｇＧ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ－１１００６）であり、室温で１時間適用した。少なくとも３枚の別々の切片を試験し、切片当たり少なくとも３枚の画像を撮影した。凍結切片については試料を灌流固定した後、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に浸漬し、３０％（重量／体積）ショ糖溶液中で凍結保護して、ＯＣＴ中で凍結し、切片作製を行い、ブロッキングから続けて上記のように染色した。ＨＥ染色（Ｍａｙｅｒｓ社）は標準的な実験プロトコルに従った。ＡｘｉｏＳｃｏｐ顕微鏡をＡｘｉｏＦｌｕｏｒ対物レンズ及びＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェアと共に使用して、又はＭｏｄｅｌ－Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００ Ｓｔａｇｅ共焦点顕微鏡を使用して画像撮影を行った。

（ｘｉｉ）透過電子顕微鏡観察
マウスを麻酔し、ＰＢＳで灌流を行い、続いて１００ｍｌの０．１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の４％ＰＦＡで灌流を行った。脳を取り出し、４％ＰＦＡ中で後固定し（一晩、４℃）、ＰＢＳ中で洗浄した。クライオミクロトームを使用して同日に脳の冠状切片（１００μｍ厚）を切り出し、浮遊切片を作製した。切片をＰＢＳ中の４％ＰＦＡ、２．５％グルタルアルデヒド中に浸漬し（一晩、４℃）、ＰＢＳで５分間、３回洗浄した。これらの標本を１％四酸化オスミウム中で４５分間浸漬し、脱水し、そしてスパー低粘性樹脂を使用して包埋した。その後、試料をトリミングし、Ｌｅｉｃａ ＥＭ ＵＣ６ウルトラミクロトームを使用して切片作製を行った。その後、酢酸ウランとクエン酸鉛を使用してこれらの超薄切片を二重染色した。ＪＥＯＬ ＪＥＭ １２００ＥＸ ＴＥＭを８０ＫＶの加速電圧で使用して画像を撮影した。

（ｘｉｉｉ）酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
血漿Ｓ１００βについて、マウス血漿を１，５００ｇで１５分間の遠心分離により分離し、製造業者の指示（Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｅ－ＥＬ－Ｍ１０３３）に従ってＥＬＩＳＡを実施した。生理食塩水中の希釈脳ホモジネートを陽性対照として使用した。血漿中ｒｈＶＥＧＦを測定するため、製造業者のプロトコルに従って抗ヒトＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキット（Ｂｏｓｔｅｒ社、ＥＫ０５３９）を使用した。ＶＥＧＦ投与前の同じマウスからの試料をブランクとして使用した。

（ｘｉｖ）リアルタイム定量的ＰＣＲ
約５０ｍｇの重量のマウス大脳皮質の試料をＴｒｉｚｏｌ中でホモジナイズし、製造業者のプロトコルに従って全ＲＮＡを抽出した後、Ｎａｎｏｄｒｏｐによって定量化を行った。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩリバーストランスクリプターゼキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を使用して試料をｃＤＮＡに逆転写した。ＯｍｉｃｓＧｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｏｍｉｃｓ Ｂｉｏ社、台湾）を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００リアルタイムＰＣＲシステムを用いて増幅をモニターした。ＧＡＰＤＨを内部対照として使用した。使用したプライマーが表１に示されている。

（ｘｖ）ソフトウェア及び統計学
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０ｂ（Ｍａｃ）を全ての統計学的分析及びグラフ作成に使用した。事前事後分析には対応ｔ検定を用い、群分析には多重比較の補正のためにテューキーの事後検定と共に一元配置又は二元配置ＡＮＯＶＡ（分散分析）を用いた。腫瘍生存分析のために死亡数を記録及び使用してカプラン・マイヤー生存曲線を作成し、マンテル・コックスログランク検定を用いてこれらの生存曲線を比較した。Ｍａｃ用のＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ４．０ソフトウェアを使用して腫瘍輝度及びナノ粒子蛍光のＩＶＩＳ像の定量化を行った。ＭｉｃｒｏＤｉｃｏｍ（Ｗｉｎｄｏｗｓ）でＭＲＩ ＤＩＣＯＭ像を分類し、ＦＩＪＩ／ＩｍａｇｅＪ（Ｍａｃ）で測定ツールを使用してＳＮ比の計算を実施した。ヒートマップを作成するためにＰｙｔｈｏｎを使用して動物内のボクセルをフレームの隅の６４×６４ボクセル領域の平均に対して比較し、その差を０～１００までのスケールで表した。映像の明瞭さを改善するために免疫蛍光像の輝度とコントラストの調節を行い、この調節をシリーズ内の全ての画像に対して同様に適用した。共局在分析ではＺｅｉｓｓ ＺＥＮソフトウェアで生画像を分析した。ＤＡＰＩチャンネル／ＣＤ３１チャンネルを使用して共局在が無いことに対する閾値を確定し、次にこの閾値をその他のチャンネルに対して適用した。ＩｍａｇｅＪのフリーハンドライン選択ツールを使用して周皮細胞の整列の分析を実施した。Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（Ｍａｃ）で図をまとめた。

（ｘｖｉ）抗体投与方法
ＶＥＧＦの投与又は対照の投与の４５分後に尾静脈を介して３０μｌの抗ＮｒＣＡＭ一次抗体（ａｂＣａｍ社）を注入した。抗体を２時間循環させ、マウスを５０ｍＬの生理食塩水で灌流し、続いて５０ｍＬのパラホルムアルデヒド（４％重量／体積）で灌流した。脳を取り出し、４％ＰＦＡ中に一晩保持した後、凍結切片に処理した。陽性対照として、灌流の前に５μｌの抗体を脳内に直接注入した。次に、Ａｌｅｘａ４８８結合二次抗体を使用して凍結切片を染色した。陰性対照として、未処理動物の脳切片を使用した。第２の陽性対照として、従来の実験技術（室温１時間）を用いて未処理動物の脳切片を抗ｎｒＣＡＭ抗体で染色した。染色された陽性対照以外の全ての画像を固定された露光時間で撮影した。緑色チャンネルの強度をＩｍａｇｅＪで定量した。

結果
（ｉ）低用量ＶＥＧＦはＢＢＢ透過性の一過性上昇を誘導する
例示的実験計画が図１ａに示されている。マウスにＶＥＧＦ又はベヒクル対照を静脈内注入し、４５分後又は４時間後に薬剤を静脈内注入した。図１ｂはマウス血流中でのヒトＶＥＧＦの半減期が約１８．６７分であることを示している。

磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって測定される脳実質内への造影剤の透過は、多くの場合に生きている動物でのＢＢＢの完全性の証明に使用される。Ｂｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．，１１（５），７１１－７２１（２０１４）；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，９（２）（２０１４）；及びＺｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，６６，９－２０．ｅ８６４０７（２０１５）。通常条件下では少量のガドリニウム系薬剤（Ｇｄ）が脳実質に進入するのみであり、コントラストがほとんど強調されないだろうと予期された。図１ｃ及び図１ｄに示されているように、対照が投与された動物は造影前画像と比較してＴ１強調造影後画像では平均してわずかに３．５％の皮質組織のシグナルノイズ比（ＳＮ比）の増加を示した。しかしながら、ＶＥＧＦ投与の４５分後にＧｄが投与された場合、皮質の平均ＳＮ比が有意に増加し（１６％、ｐ＜０．００１）、ＶＥＧＦ前処理によりＧｄの脳組織内への浸透が増加したことが示された。一方、ＶＥＧＦの４時間後にＧｄが投与された場合、ＳＮ比の増加は５％未満のままであり、ＢＢＢの完全性が正常化したことが示された（（対照に対してｐ＝０．６１５０、ＶＥＧＦ処理４５分後に対してｐ＜０．００１）。中央脳静脈洞の周囲の領域（黄色の境界線）の分析により、静脈洞内に存在する造影剤のために大幅なシグナル増強が全ての群において生じ、群間で有意な差が無いことが示された。例となる画像が示されており、ランダムノイズの関心領域（ＲＯＩ；赤色の円、左隅）、中央脳静脈洞（中央の黄色の円）、及び皮質（黄色の円の右側の青色の曲線）が示されている。

エバンスブルー染料は血清アルブミンに迅速に結合可能であり、且つ、完全なＢＢＢを通過しないことが当技術分野において知られていた。Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ，１－７（２０１４）；Ｂｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｅｒ．Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ，２（１），１３（２０１４）；及びＣａｒｄｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，６４（２），３２８－３６３（２０１０）。ＶＥＧＦの４５分後又は４時間後にエバンスブルーを注入し、３０分間循環させた。図１ｅに示されているように、ＶＥＧＦで前処理されたマウスは対照処理動物と比較してエバンスブルーの脳組織内濃度が４．８５倍高かったが（ｐ＝０．００６９）、ＶＥＧＦの４時間後にエバンスブルーが注入された場合、増加は検出されなかった（対照に対してｐ＝０．９４０５）。ＢＢＢ透過性の上昇が一過性のようであることがこのことからも示されている。

腎臓も４５分でのエバンスブルー取込みの増加を示した。エバンスブルー定量の検量線が図８ａに示されている。脳皮質の代表的切片が図１ｆに並んで示されており、イソレクチン染色された血管（緑色）の外側でのエバンスブルー染色（赤色）の増加が示されている。局所的損傷をＢＢＢに対して引き起こす凍結損傷をエバンスブルー注入の前に用いて陽性対照を実施した。この損傷部位は実質において強いエバンスブルーシグナルを示した。

大型のナノ粒子よりも小型のナノ粒子の方が脳内に容易に入ることがよく知られている。Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，４（１４６），１４６ｒａ１０９－１４６ｒａ１０９（２０１２）；Ｋｏｆｆｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１１，１０８（４６），１８８３７－１８８４２（２０１１）；及びＢｅｎ－Ｚｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５０９（７５０１），５０７－５１１（２０１４）。大型のナノ粒子によるＢＢＢの迂回に対するＶＥＧＦの効果を試験するため、ＶＥＧＦ投与の４５分後に尾静脈注射によって蛍光染料含有ＰＥＧ結合ポリスチレンナノ粒子を投与した。これらのナノ粒子は２０ｎｍ、１００ｎｍ、及び５００ｎｍのソリッドコア直径を有し、それぞれ５２ｎｍ、１２０ｎｍ、及び５１２ｎｍの流体力学的径を有し、ゼータ電位は中性であった。ナノ粒子の例示的特性が表２に示されている。

表２では透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によってソリッドコア直径が測定され、Ｍａｌｖｅｒｎ ＺｅｔａＳｉｚｅｒを使用して流体力学的径及びゼータ電位が測定された。数字は平均値±標準偏差を示している。ナノ粒子を３０分間循環させた後、マウスを５０ｍｌの生理食塩水で灌流し、脳ナノ粒子含量をＩＶＩＳにより定量した。予期されたように、通常条件下では２０ｎｍのナノ粒子は１００ｎｍ又は５００ｎｍのナノ粒子よりも多く脳内へ浸透した。ＶＥＧＦ前処理動物では、図１ｇに示されているように、脳による２０ｎｍのナノ粒子の保持の有意な増加（対照に対して３．５倍、ｐ＝０．０００２）が検出された。１００ｎｍのナノ粒子の浸透の有意な増加（対照に対して８倍、ｐ＝０．０１８２）も検出されたが、５００ｎｍのナノ粒子の保持の有意な変化は無かった（対照に対してｐ＝０．９７６２）。また、抗体に基づく化学療法にとって有益であり得る、全身性注入されたＩｇＧ抗体がＶＥＧＦ前処理により脳内へ浸透可能になることを示す予備的な証拠も得られた（図７）。

概して、これらのデータは、低用量の静脈内ＶＥＧＦ注射によりＢＢＢ透過性が上昇して、脳内への小分子又はナノ粒子の浸透が可能になり得ることを示す。この効果は一過性のようであり、ＶＥＧＦ注射から４時間後にはＢＢＢ機能が回復する。

（ｉｉ）ＶＥＧＦは抗がん剤に対する血液脳関門の透過性を高めた
次に、異なる種類の治療化合物を脳組織へ送達するために上記同様のアプローチが使用可能であるかどうかを調べることにした。テモゾロミド（ＴＭＺ）はＧＢＭ治療の第一選択薬剤療法である。図２ａに示されているように、１０倍高い濃度のＶＥＧＦを使用した場合であっても、ＶＥＧＦは脳内のＴＭＺ濃度を有意に上昇させることがない。ＴＭＺ全身投与量を５ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇまで増加させると脳内のＴＭＺ量を増加したが、ＶＥＧＦによる前処理がＴＭＺの脳内濃度をさらに上昇させることはなかった。これは、ＴＭＺは小分子（ＭＷ＝１９４．１５）且つ高脂溶性分子として、それ自体の臨床効果のために脳内に浸透できるという事実に起因する可能性がある。Ｏｓｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１０（１１），３７２８－３７３６（２００４）。ＴＭＺ定量についての検量線及び試料の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ピークが図８ｂに示されている。

次に、例として塩酸ドキソルビシン（ＭＷ＝５７９．９８）を使用して、大型水溶性分子のＢＢＢ透過に対するＶＥＧＦの効果を試験した。ドキソルビシンは全身投与後に脳内にほとんど進入しない。ドキソルビシンの他の固形腫瘍に対する高い有効性から脳腫瘍にドキソルビシンを送達しようと多くの試みが行われてきた。Ａｒｙａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，２０４，６０－６９（２０１５）；Ｋｏｖａｃｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４；及びＷｏｈｌｆａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，１５４（１），１０３－１０７（２０１１）。本試験ではマウスにＶＥＧＦ又は対照を注入し、４５分後にドキソルビシン（８ｍｇ／ｋｇ）を注入した。この薬剤を２時間循環させた後に、この動物を生理食塩水で灌流した。次に、重要臓器からドキソルビシンを抽出し、ＨＰＬＣにより定量した（図８ｃ）。図２ｂに示される生体内分布の結果から、全身のドキソルビシンの０．１％未満が健常対照マウスの脳に進入したことが確認される。ＶＥＧＦの前処理によって、脳内ドキソルビシン濃度が統計学的に有意に上昇したが（対照に対してｐ＝０．０１８０）、それでも脳内のドキソルビシンの分布は他の臓器でのこの化合物の分布よりもずっと少ない（図２ｂ）。

次に、ＰＥＧ結合リポソームドキソルビシン（ＬｉｐｏＤｏｘ）の脳送達の促進における効果についてＶＥＧＦを試験した。これらのリポソームは中性に帯電しており（－１．５３ｍＶ）、９５．５５ｎｍの平均流体力学的径を有することがわかった。下の表３を参照されたい（数値はＭａｌｖｅｒｎ ＺｅｔａＳｉｚｅｒにより測定された平均値±標準偏差を表している）。ＬｉｐｏＤｏｘは本明細書に開示されるＰＥＧ結合ナノ粒子と同様の特性を示し、脳への進入に成功した（図１ｅ）。

図２ｃの結果はＶＥＧＦ投与後のＬｉｐｏＤｏｘの脳内への進入の有意な増加（対照に対して６．４倍、ｐ＝０．００３７）を示しており、ＶＥＧＦ存在下でＬｉｐｏＤｏｘが健全なＢＢＢを通過可能であったことを示している。図２ｄは試料採取時の各マウス個体の血漿ＬｉｐｏＤｏｘ濃度に対して正規化され、結果として薬剤代謝及び排出の個体差について補正されているデータを示している。いずれの末梢器官でもＬｉｐｏＤｏｘ濃度に有意な差が検出されなかった。図９ａ～９ｄはＨＰＬＣ法により測定されたＬｉｐｏＤｏｘ定量の結果を示している。

ＭＴＴアッセイを用いて、ヒト神経膠芽腫細胞株ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧと培養されるとＬｉｐｏＤｏｘはＴＭＺよりも２５倍低いＩＣ_５０を有することがわかった（図２ｅ）。また、５ｍｇ／ｋｇ用量での全身投与後のマウスにおけるＬｉｐｏＤｏｘの循環半減期は４４．７２時間であることがわかった（図２ｆ）。この循環半減期はＴＭＺの半減期（１．８時間）又はドキソルビシンの半減期（１１時間）よりも著しく長い。Ａｇａｒｗａｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，５（２），１４４－１５１（２０００）；及びＪｏｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５（４），２６７－２７０（１９８１）。ＶＥＧＦはいずれの所与の濃度でもＤＢＴＲＧ－０５ＭＧ細胞の生存度に影響しないこともわかった（図１０）。

（ｉｉｉ）ＶＥＧＦは大型動物モデルにおいて脳への薬剤送達を増加させる
本明細書中で報告された結果が臨床的により適切な意義のある薬剤用量までスケールアップ可能であることを確認するために、脳への薬剤送達の促進におけるＶＥＧＦの効果をブタモデルにおいてさらに試験した。

頸動脈を介してＶＥＧＦ（０．２μｇ／ｋｇ）又はベヒクル対照をＬａｎｙｕミニブタ（各群ｎ＝３匹）に投与した。図３ａに示されているように、ＧｄのＳＮ比増加を使用してＭＲＩにより複数の脳領域でのＢＢＢ完全性を判定した。図３ｂに示されているように、ＶＥＧＦ前処理を受けたブタはベヒクル対照前処理を受けたブタと比較するとＳＮ比の有意な増加を示した。さらに、この増加は試験した複数の主要な脳ＲＯＩを通して非常によく一貫していた。中央脳静脈洞のＳＮ比増加には有意な差が存在しなかった。全ての領域のＳＮ比の平均は、対照ベヒクルで前処理されたブタよりもＶＥＧＦで前処理されたブタにおいて４倍高かった（ｐ＝０．００３５）（図３ｃ）。このレベルの増加はマウスで観察された増加レベル（図１ｃ～１ｄ）に類似している。正規化された造影後シグナル強度と正規化された造影前シグナル強度の間の変化を示すヒートマップも図３ｂの右パネルに示されている。

ＰＥＧ結合ポリスチレンナノ粒子（１００ｎｍのコア直径）及びＬｉｐｏＤｏｘを例として使用して、生体内分布試験をブタにおいても実施した（図３ｄ）。ＶＥＧＦで前処理されたブタの脳組織において、全ナノ粒子蓄積量のわずかな増加が観察された（図３ｅ）。ナノ粒子の全身生体内分布のＨＰＬＣに基づく正確な定量化から、これらの粒子の大部分が肺に蓄積されていることが示された（図３ｆ）。特定の脳領域の比較から、ＶＥＧＦ前処理後により多くのナノ粒子が保持される全体的な傾向が示された（図３ｇ、左パネル及び右パネル）。全ての脳領域の平均によって、脳内のナノ粒子保持のわずかではあるが統計学的に有意な増加（２．４倍、ｐ＝０．０２５８）が示された（図３ｈ）。

ＨＰＬＣによる全身性ＬｉｐｏＤｏｘ生体内分布の分析から、大半のＬｉｐｏＤｏｘが循環中に残り、脾臓がＬｉｐｏＤｏｘを保持する主要な臓器であるというマウスにおいて観察されたパターンと同様のパターンが示された。図３ｉを図２ｃと比較して参照されたい。脳における領域特異的なＬｉｐｏＤｏｘ蓄積の試験から、ＶＥＧＦで前処理された動物により多くのＬｉｐｏＤｏｘが蓄積する全体的な傾向が示された（図３ｊ）。全ての脳のデータを平均により、ＬｉｐｏＤｏｘ蓄積のわずかな増加が明らかになった（図３ｋ）。汚染混入の無い脳脊髄液（ＣＳＦ）を３匹のブタから収集した。ＶＥＧＦで前処理された２匹の動物はいずれも対照処理動物よりも高いＣＳＦ中ＬｉｐｏＤｏｘ濃度を示した（図３ｌ）。

概して、これらの結果は、ＶＥＧＦで誘導されたＢＢＢの透過性はスケールアップ可能であり、且つ、大型動物で導入可能であることを実証しており、このことはヒト患者にとってより臨床的に関係する。

（ｉｖ）ＶＥＧＦはＢＢＢ透過性の複数の態様に影響する
ＢＢＢ透過性は、タイトジャンクションタンパク質の発現又は局在の変化、内皮細胞からの周皮細胞の解離、星状細胞の喪失、並びにＢＢＢトランスポーター及び排出ポンプの活性変化を含む多くの変化を特徴とする場合がある。ＶＥＧＦ又は生理食塩水の注入から４５分後又は４時間後にマウスの脳を採取し、ＢＢＢ透過性に対するＶＥＧＦの潜在的な影響について分析した。

最初のスクリーニングとしてＢＢＢ完全性に関わる重要遺伝子の発現を測定した。Ｍａｃｄｏｎａｌｄら著、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ誌、第１７４巻（第２号）、２１９～２２６頁（２００８年）。興味深いことに、これらの結果は、図４ａに示されているように、Ｓｌｃ２ａ１（ＧＬＵＴ－１、グルコーストランスポーター）及びＳｌｃ６ａ８（ＣＲＴ、クレアチニントランスポーター）などのＢＢＢトランスポーターの増加、及びＴｊｐ２（ＺＯ－２）及びＣｌｄｎ５（クローディン５）などのタイトジャンクション構成要素の減少を含む、いくつかの遺伝子の発現が変化することを示している。

ＶＥＧＦ注入から４５分、９０分、及び４時間で健常マウスから脳を採取した後、凍結し、薄切して、ＢＢＢの完全性についての重要な指標について染色した。透過電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）を用いてＶＥＧＦ処理後の脳血管の形態を試験した。代表的な画像は、対照動物では、通常、基底膜で隔てられて、周皮細胞が内皮細胞に隣接して存在していたことを示している（図４ｂ）。対照的に、ＶＥＧＦ注入から１５分では、多くの血管はわずかに拡張しており、且つ、隣接する周皮細胞を欠いているようであった。４５分では大半の血管はもはや拡張しておらず、ＶＥＧＦ処理後４時間では血管と周皮細胞の両方が正常に見えた（図４ｂ）。

この発見をさらに試験するために、ＧＢＭ担持マウスからの凍結試料をＶＥＧＦ注入から４５分後に採取した。ＢＢＢの完全性を視覚化するために以前に使用された血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲβ）に対する抗体を使用して、周皮細胞を染色した。Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２３（４）（２０１７）。図４ｃに示されているように、抗ＣＤ３１抗体で染色された周皮細胞で覆われた血管の長さを定量した。対照動物ではＰＤＧＦＲβ染色がＣＤ３１^＋血管の外側に観察された（９１．１％の被覆率）。しかしながら、ＴＥＭの観察結果と一致して、周皮細胞被覆率は１５分では低下しており（５７．６％）、４５分後（８６．２％）及び４時間後（８３．０％）では正常に戻った。腫瘍領域では血管は大きさ及び形態について非常に多様であり、周皮細胞による被覆率が低かった（３０．８％）。驚くべきことに、ＶＥＧＦでの前処理は、腫瘍領域内での周皮細胞被覆率（２８．９％）に影響しなかった。

星状細胞のマーカーであるＧＦＡＰについても試験した。図４ｄに示されているように、処理群間で星状細胞の形態の明確な変化はなかった。腫瘍領域には星状細胞がほとんど存在しなかった。内皮細胞タイトジャンクションの構成要素であるクローディン５は、内皮細胞マーカーＣＤ３１と共染色された。Ｂｅｎ－Ｚｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５０９（７５０１），５０７－５１１（２０１４）。図４ｅに示されているように、これらの結果から、対照マウスにおけるクローディン５とＣＤ３１の高い共局在度（９５％超）が示され、この共局在度はＶＥＧＦ投与の４５分後（５５．８％）と４時間後（４２．７％）で低下した。この結果は図４ａに示されているＣｌｄｎ５の下方制御を示した遺伝子発現データに合致している。また、クローディン５のウエスタンブロットから、ＶＥＧＦ投与後にタンパク質発現が低下する傾向が示された（図１１ａ～１１ｂ）。興味深いことに、対照処理マウスでは腫瘍領域にタイトジャンクションが多く存在すること（８０．０％）が示された。ＶＥＧＦ前処理後に、タイトジャンクションの存在は４８．５％まで低下した。図１１ｂに示されているように、ＢＢＢ上の主要な排出ポンプであるＰ－糖タンパク質も全ての時点において血管の膜上に均一に現れた。Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２６（５），１－１７（２０１６）。

（ｖ）ＬｉｐｏＤｏｘと組み合わされたＶＥＧＦは神経膠芽腫のマウスモデルの生存期間を延長する
ＶＥＧＦ前処理と組み合わせてＬｉｐｏＤｏｘを使用して、マウス神経膠芽腫モデルにおいて神経膠芽腫の治療実験を図５ａに略述されているように実施した。ＬｉｐｏＤｏｘの循環半減期が長いこと（４４．７２時間）、及びＶＥＧＦ誘導ＢＢＢ開放が一過性であることを考慮すると、（ＶＥＧＦ前処理に加えて）ＬｉｐｏＤｏｘ投与の後に複数用量のＶＥＧＦ（ＭＶ）を投与することで、複数回のＬｉｐｏＤｏｘの脳送達の機会が得られると予期された。ＭＶマウスには最初にＶＥＧＦを投与し、次にその最初のＶＥＧＦ投与の４５分後にＬｉｐｏＤｏｘを投与した。このＬｉｐｏＤｏｘ投与から３時間後と６時間後に２回用量のＶＥＧＦによってこれらのＭＶマウスをさらに処理した。ＭＶ＋ＶＥＧＦマウスにおけるＬｉｐｏＤｏｘの生体内分布は図１２Ｂに示されている。ＶＥＧＦ又は対照で前処理されたマウスにおけるドキソルビシンの生体内分布を比較として図１２Ａに示した。

ルシフェラーゼを発現するように遺伝子組換えされたヒト神経膠芽腫細胞株ＤＢＴＲＧ－０５ＭＧを使用して、図１３ａ～ｃに示されているようにＢＡＬＢ／ｃ ＮＵマウスの異種移植神経膠芽腫モデルを形成した。図５ａも参照されたい。腫瘍進行を毎週のＩＶＩＳによってモニターし、ＶＥＧＦ＋対照（Ｖ＋対照）、対照＋ＬｉｐｏＤｏｘ（対照＋ＬＤ）、ＶＥＧＦ＋ＬｉｐｏＤｏｘ（Ｖ＋ＬＤ）、又は複数回のＶＥＧＦ＋ＬｉｐｏＤｏｘ（ＭＶ＋ＬＤ）のいずれかの処置を受けるようにマウスをランダムに割り当てた。シャムマウスには腫瘍細胞ではなく生理食塩水が頭蓋内注入され、これらのマウスはＭＶ＋ＬＤ処置過程を受けた。ＬｉｐｏＤｏｘは５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、２１日目、２５日目、及び２８日目に処置が行われた。

ＶＥＧＦ前処理後にＧＢＭ異種移植片へのＬｉｐｏＤｏｘの送達を定量した。驚くべきことに、ＶＥＧＦ前処理後に腫瘍内のＬｉｐｏＤｏｘがその対側部位よりも７．８倍多いことがこれらの結果から示されている（図５ｂ）。この量は対照で前処理されたマウスでの腫瘍内濃度よりも１３．６倍高かった。対照＋ＬＤマウスの腫瘍領域で検出された濃度は、その対側部位で検出された濃度よりもわずかに高い（２．３倍）だけであったことが重要であり、腫瘍自体のＥＰＲ効果が低いことを示唆している。シャム注入はＬｉｐｏＤｏｘ蓄積に影響しないこと（図１４ａ）、及びＶＥＧＦの単回注入（Ｖ＋ＬＤ）でもＭＶ＋ＬＤよりも低い程度であったが腫瘍内のＬｉｐｏＤｏｘが増加すること（図１４ｂ）もわかった。

図５ｃに示されているカプラン・マイヤー生存曲線は対照＋ＬＤを受けたマウスの生存期間の中央値（６０日）と比較して、Ｖ＋ＬＤ群の生存期間の中央値（６７日、ｐ＝０．０２７１）及びＭＶ＋ＬＤ群の生存期間の中央値（７９日、ｐ＝０．００４２）が改善していたを示している。Ｖ＋ＬＤとＭＶ＋ＬＤとの間の差も有意であった（ｐ＝０．０４８３）。この実験の最中に死んだシャム操作マウスはいなかった。

図５ｄに示される毎週の腫瘍輝度試験により、処置開始前（２１日目）には群間に差が無いことが分かる。しかしながら、処置完了から２週間後（４２日目）には、Ｖ＋ＬＤ処置を受けたマウス及びＭＶ＋ＬＤ処置を受けたマウスは、対照＋ＬＤマウスよりも有意に小さい腫瘍を有した（それぞれｐ＝０．０４２５及びｐ＝０．０４１７）。同じ傾向は４９日目及び５６日目でも継続した。６３日目までＭＶ＋ＬＤ処置マウスはその他の群よりも有意に小さい腫瘍を有した（対照＋ＬＤに対してｐ＝０．００２９、Ｖ＋ＬＤに対してｐ＝０．０１２７３）。各群のマウスの代表的ＩＶＩＳ像が対応するグラフの上に示されている。４５日目に対照＋ＬＤ処理群及びＶ＋ＬＤ処理群からそれぞれ５匹のマウスを無作為に選別し、図５ｅに示されているようにＭＲＩにより腫瘍容積を確定した。ＭＲＩ技術員が盲検状態でスライス画像を撮影し、分析した。これらの結果から、Ｖ＋ＬＤ処置マウスの腫瘍は対照＋ＬＤ処置マウスよりも総容積が有意に小さく（ｐ＝０．０３５８）、且つ、より少ないＭＲＩスライスの中にしか存在しなかった（ｐ＝０．０３０３）ことが確認され、このことは腫瘍進行の遅延を示している。腫瘍の輪郭が描かれている代表的スライス画像が示されている。図１５ａはＩＶＩＳ発光とＭＲＩにより確定した腫瘍容積との相関が高い（ｒ^２＝０．７８８４）ことを示している。マウスの体重が図１５ｂに示されている。

６０～７０日目の間に死んだ動物からの試料を染色用に選別した。Ｖ＋対照の試料が参照のために含まれているが、これらの動物は６０日よりも前に死んだものであり、直接的に比較できない。図５ｆは、Ｋｉ６７^＋腫瘍細胞の減少が、対照＋ＬＤ処置マウスと比較してＶ＋ＬＤ（ｐ＝０．００６１）処置マウス及びＭＶ＋ＬＤ処置マウス（ｐ＝０．０００１）で有意であること、及びＭＶ＋ＬＤ処置マウスとＶ＋ＬＤ処置マウスとの間で有意であること（ｐ＝０．０２０８）を示している。ＤＡＰＩ染色により決定された腫瘍の全体的細胞密度（図５ｇ）もＭＶ＋ＬＤ処理群でわずかに低下した（対照＋ＬＤに対してｐ＝０．０４７８）。Ｖ＋対照処置マウスは、おそらく早い時点での試料採取のため、細胞増殖の低下を示している。

ＶＥＧＦが脈管形成の強力な刺激因子であることを考慮して、イソレクチンで切片を染色し、腫瘍内の血管を数えた。実際にはＭＶ＋ＬＤ処理群のマウスの腫瘍は対照＋ＬＤ群のマウスよりも血管が少なかった（ｐ＝０．０２）（図５ｈ）。ミクログリア／マクロファージマーカーであるＩｂａ１の免疫組織化学染色によって、図５ｉに示されているように、様々な処理群の腫瘍中のＩｂａ１^＋細胞数に有意な差が無いことが明らかになった。Ｖ＋対照処置マウスは、これもまたおそらく早い時点での分析のため、免疫浸潤の減少を示した。Ｉｂａ１染色された腫瘍の画像例が図１５ｃに示されている。

さらに、保持されている間質液がＶＥＧＦによって増加する可能性があるので、ＨＥ染色像を使用して腫瘍内の浮腫領域及び出血領域のＩｍａｇｅＪを用いて特定した。ＨＥ染色像の例が図１５ｄに示されている。興味深いことに、Ｖ＋／ＭＶ＋ＬＤ処置動物は対照処置動物よりも浮腫が少ない傾向があった（図５ｊ）。出血に関しては群間で有意な差が無かったが、個々の動物の間で大きなばらつきがあった（図５ｋ）。

ＶＥＧＦが他の悪性腫瘍に対して作用するかどうかを調べるため、膵管腺がん（ＰＤＡＣ）モデルにおいて対照＋／ＭＶ＋ＬＤプロトコルに続いてＬｉｐｏＤｏｘ取込みを定量し（図１６ａ～図１６ｃ）、正常膵臓及び腫瘍異種移植片による取込みを比較した。これらの結果（図１６ｄ）は。ＰＤＡＣ異種移植片がシャム操作膵臓よりも約３倍多いＬｉｐｏＤｏｘを取り込んだことを示している。このことは、ＬｉｐｏＤｏｘの全体的な濃度は依然として低いが、本モデルには何らかのＥＰＲ効果が存在することを示唆している。ＶＥＧＦ前処理の追加は、正常膵臓又はＰＤＡＣ異種移植片のいずれにおいても取込みを変化させなかった。このことは、この用量のＶＥＧＦが末梢器官の血管透過性の変化を引き起こさないことを示す以前のデータに合致する。ＬｉｐｏＤｏｘの蓄積に対するＶＥＧＦ前処理の効果を皮下に移植されたＧＢＭ異種移植片において試験した。図１７ａ～図１７ｃに示されているように、ＭＶ＋ＬＤ処理プロトコル後の腫瘍ではＬｉｐｏＤｏｘの蓄積の有意な変化は見られなかった。対照処理腫瘍におけるＬｉｐｏＤｏｘ濃度は、これらの腫瘍はＢＢＢによって保護されていないため、皮下異種移植片では同所異種移植片と比べて２５．８倍高いことは特筆に値する。

（ｖｉ）低用量ＶＥＧＦ静脈内投与は安全である
ＶＥＧＦの投与は脳の区画化を破綻させ、結果として脳の構成要素が体循環中へ漏出することが示唆された。脳への治療薬の送達を促進するためにＶＥＧＦを使用することの潜在的な副作用が試験される。本研究ではカルシウム結合タンパク質Ｓ１００β（Ｓ１００β）をマーカーとして使用した。血液中のこのタンパク質の存在が脳損傷及びＢＢＢ完全性の喪失の末梢マーカーとしての役割を果たすことが以前に示されている。Ｍａｒｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，３４２（１－２），１－１２（２００４）；及びＰｌｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，３５（２），５１８－５２６（２０１５）。図６ａに示されている結果には、本明細書に開示される低用量又は１０倍高用量のＶＥＧＦでは、ＶＥＧＦの投与から２時間後のマウス血漿中Ｓ１００βに有意な変化が無いことが示されている。ＢＢＢ透過性を上昇させる神経炎症の強力な誘導因子であるリポ多糖（ＬＰＳ）は陽性対照として使用され、投与２時間後に血漿中Ｓ１００βの有意な増加を引き起こした。

ヒトでの治験において、ＶＥＧＦが注入時に一過性の全身性低血圧を引き起こすことがわかった。Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０７（１０），１３５９－１３６５（２００３）；及びＥｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，７２（１），２０－３２（２００２）。この所与のボーラス用量が同じ効果を引き起こし得るか試験するため、マウスにＶＥＧＦを低用量又は１０倍高用量で注入し、ＢＰ－２０００シリーズＩＩ血圧分析システムを使用して３０分毎に血圧を測定した。図６ｂに示される結果には、ＶＥＧＦ投与後の４時間にわたって顕著な血圧の変化が無いことが示されている。同様に、ＶＥＧＦを投与されたブタでは対照と比較して明確な血圧の変化が見られなかったが（図６ｃ）、おそらく麻酔及び手術に起因して、両方の群において血圧低下の全体的な傾向が見られた。興味深いことに、ＶＥＧＦを投与された１匹のブタで急速だが一過性のフラッシング反応が観察されたが、これはヒトにおいても認められている現象である。Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．，１４２（５），８７２－８８０（２００１）。

内在性ＶＥＧＦは脳損傷後の神経炎症を誘導することが知られている。ＡＡｒｇａｗ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１２，１２２（７），２４５４－２４６８（２０１２）。しかしながら、ＶＥＧＦ受容体が脳内皮細胞の脳に面している側である反管腔側上に多数存在することを考慮すると、外因性の静脈内ＶＥＧＦの脳に対する効果は明確ではない。Ｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．，２５（９），１１１１－１１１８（２００５）。したがって、静脈内ＶＥＧＦも神経炎症を誘導する可能性についての見識を得るため、リアルタイム定量的ＰＣＲを用いて神経炎症に関連するいくつかの主要サイトカインの遺伝子発現の変化をスクリーニングした。Ｓｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，８（７），１－２０（２０１３）；及びＭｏｎｎｅｔ－Ｔｓｃｈｕｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，Ｎｏ．ＳＵＰＰＬ．５０，１－２０（２０１１）。本研究で使用されたＶＥＧＦ及びＬｉｐｏＤｏｘ処理群の投与の４時間後又は２４時間後に動物に灌流を行った。凍結損傷及びＬＰＳを陽性対照として使用した。図６ｄに示される結果には、ＶＥＧＦ投与によって多数の神経炎症関連遺伝子の発現が中程度に上昇したことが示されている。Ｔｎｆａ、Ｃｃｌ２、及びＣｘｃｌ１の発現はＶＥＧＦ処理から４時間後では変化がなかったが、処理から２４時間後では中程度に上昇することがわかった。急性炎症マーカーであるＩｌ６の遺伝子発現は複数回のＶＥＧＦを利用した処理群では４時間後に上昇したが、単回ＶＥＧＦを利用した処理群では上昇しなかった。Ｉｌ１ｂ又はＧｆａｐの発現が著しく上昇した処理群は無かったが、これらはいずれも凍結損傷又はＬＰＳによって上昇した。

他の炎症マーカーの遺伝子発現データが図１８ａに示されており、使用した全てのプライマーのリストが上の表１に示されている。ＶＥＧＦ投与の４５分後の測定値は対照と比較してこれらの類似した遺伝子の増加が無いことを示しており、このことは炎症が遅延型応答、おそらくはＢＢＢ透過性の上昇に対する応答になっている可能性があることを示している（図１８ｂ）。また、肝臓機能及び腎臓機能についての血液化学の結果は処理後に有害な変化が無いことを示した（図１９）。これらの結果は所与の用量のＶＥＧＦが安全であると思われることを表している。

考察
ＶＥＧＦは２０ｎｍ～１００ｎｍのナノ粒子及びＬｉｐｏＤｏｘ（直径が約９５ｎｍ）などの分子のＢＢＢ透過の向上において特に効果的であり、全てがＶＥＧＦ前処理後に脳内に容易に進入したことは興味深いことである。ＬｉｐｏＤｏｘは現在では乳房及び卵巣の固形腫瘍の治療に使用されているが、ＧＢＭの治療には認可されていない。ＬｉｐｏＤｏｘは、ＰＥＧ修飾によりこの薬剤分子が排出から保護されて、この薬剤分子が脳組織内をより容易にすることが可能になる場合があるため、Ｐ－糖タンパク質を発現する腫瘍を有する患者ではドキソルビシンよりも効果的な場合がある。Ｎａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，４（１４９），１４９ｒａ１１９（２０１２）。

ガドリニウム造影強調に基づくＭＲＩ分析により、ブタにおいて、マウスで観察された結果と非常に類似した結果（ＳＮ比の約４倍の増加）が示された。これはＭＲＩが生体の脳のリアルタイムシグナルを測定しており、一方で他の方法が死後の組織採取、薬剤抽出、及び定量に依存していることを考慮すると有望な結果である。ＭＲＩは同じ動物の事前事後比較も可能にし、動物間の内在的不均一性に対抗する。

結果はＶＥＧＦ投与後すぐに脳内でＴｊｐ２（ＺＯ－２）及びＣｌｄｎ５の遺伝子発現が低下することを本明細書において示している。ＶＥＧＦ後の脳切片の染色によってもこれらの発見は確認された。腫瘍モデルは増殖が遅い（処置無しで生存期間の中央値が５０～６０日）にもかかわらず、タイトジャンクションの内皮細胞との高度の共局在を示し、ＢＢＴＢが比較的に完全であることを示した。実際、健常対側と比較して、腫瘍内には、わずかに２．３倍のＬｉｐｏＤｏｘ進入したことがわかった。同じ腫瘍細胞株を使用して皮下ＧＢＭ異種移植片を構築した場合、腫瘍内のＬｉｐｏＤｏｘ濃度は同所異種移植片での濃度よりも２５倍高く、ＢＢＢが脳への効果的な薬剤送達を妨げている程度を明瞭に示している。

内在性ＶＥＧＦは星状細胞の活性化を調節し、次にＢＢＢ完全性を仲介することが知られている。このことは、星状細胞から分泌されるＶＥＧＦがＢＢＢ透過性を局所的に上昇させる、虚血などの損傷に対する応答時に特に関連している。Ａｒｇａｗ ｅｔ ａｌ．、２０１２。しかしながら、分析を行った条件下では星状細胞の形態又はＧｆａｐ遺伝子発現に変化は観察されなかった。これまでの研究から、外因性ＶＥＧＦは、単離された脳毛細管及びｉｎ ｓｉｔｕのラットの脳において、Ｐ－糖タンパク質活性を調節可能であることがわかっている。Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１０，３０（４），１４１７－１４２５（２０１０）。所与の用量のＶＥＧＦの投与後、Ｐ－糖タンパク質遺伝子（Ａｂｃｂ１ａ）発現又は凍結切片中のＰ－糖タンパク質染色の形態的外観（図１１ｂ）に変化は見られなかった。しかしながら、腫瘍異種移植片では血管の周皮細胞被覆率が既に健康な脳と比較して有意に低下しており、ＶＥＧＦ前処理によってさらに低下することがなかった。したがって、静脈内ＶＥＧＦは脳内皮細胞タイトジャンクションの一過性分解によってＢＢＢ透過性を上昇させると考えられるが、他の機構が関与する可能性もある。

安全性に関して静脈内ＶＥＧＦは、他の点では健康なマウスの脳において多数の神経炎症関連遺伝子の発現を高めることがわかった。神経炎症は、局所的なサイトカイン生産、及びより多くの外部産生されたサイトカインが脳内へ入ることを可能にするＢＢＢサイトカイントランスポーターの活性上昇が関わる、複雑で多角的な過程である。Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，１９（１２），１５８４－１５９６（２０１３）。

まとめると、本明細書において報告された結果は、低用量の静脈内ＶＥＧＦがナノ医療治療薬の脳への送達を改善したことを示している。最も緊急性のある解決されていない臨床的必要性である脳腫瘍治療の改善を可能にするため、本発見は臨床に技術移転される可能性がある。

他の実施形態
本明細書中で開示された特徴の全てを任意の組合せで組み合わせてもよい。本明細書中に開示されたそれぞれの特徴は、同様、同等、又は類似の目的に適う代替の特徴によって置き換えられてもよい。したがって、別途明記されない限り、開示されたそれぞれの特徴は包括的な一連の同等又は類似の特徴のうちの一例に過ぎない。

上記の説明から当量者は本発明の基本的特徴を容易に確かめることができ、且つ、本発明を様々な用途及び条件に適合させるために本発明の主旨と範囲から逸脱せずに本発明に様々な変更及び改変を加えることができる。したがって、他の実施形態も本特許請求の範囲内である。

均等物
いくつかの本発明の実施形態が本明細書において説明及び例示されてきたが、当業者は本明細書に記載される機能を実施するために、及び／又は本明細書に記載される結果及び／又は本明細書に記載される利点のうちの１又は複数を得るために様々な他の手段及び／又は構造を容易に想定し、そのような変更及び／又は改変のそれぞれが本明細書に記載される本発明の実施形態の範囲内にあるとみなされるだろう。より一般的に言うと、当業者は、本明細書に記載される全てのパラメーター、寸法、材料、及び構成は例示的であるとされ、実際のパラメーター、寸法、材料、及び／又は構成は本発明の教示が使用される特定の用途又は特定の複数の用途に依存することを容易に理解するだろう。当業者は本明細書に記載される特定の本発明の実施形態に対する多くの均等物を認識し、又は日常的な実験法に過ぎない方法を用いてそのような均等物を確かめることができるだろう。したがって、前記の実施形態は単なる例として示されており、本発明の実施形態が具体的に説明及び請求されたように実施される以外にも添付されている請求項及びそれらの均等物の範囲内で実施され得ることを理解されたい。本開示の本発明の実施形態は本明細書に記載されるそれぞれ個々の特徴、系、物品、材料、キット、及び／又は方法を対象としている。また、２種類以上のそのような特徴、系、物品、材料、キット、及び／又は方法の任意の組合せは、そのような特徴、系、物品、材料、キット、及び／又は方法が相互に矛盾しなければ、本開示の本発明の範囲の中に含まれる。

本明細書において定義及び使用される場合の全ての定義は、辞書的定義、参照により取り込まれる文書内での定義、及び／又はそれらの定義された用語の通常の意味よりも優先されることを理解されたい。

本明細書に開示される全ての参照文献、特許、及び特許出願は各々が引用されている内容に関して参照により取り込まれ、いくつかの事例ではその文献の全体が包含される場合もある。

本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は反対の趣旨が明確に示されていなければ「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。

本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、「及び／又は」という言葉はそのように結合させられた要素のうちの「どちらか又は両方」、すなわち要素がある例では結合して存在し、他の例では分離して存在することを意味すると理解されるべきである。「及び／又は」を用いて挙げられた複数の要素は同様に解釈されるべきであり、すなわち、そのように結合させられたそれらの要素のうちの「１又は複数」と解釈されるべきである。場合によっては「及び／又は」によって具体的に特定される要素以外に他の要素が具体的に特定された要素に関連しているにしても関連していないにしても存在する可能性がある。したがって、非限定的な例としては「Ａ及び／又はＢ」に対する参照は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの開放系の言葉と併用されると１つの実施形態ではＡのみ（場合によってはＢ以外の要素を含む）を意味することがあり、別の実施形態ではＢのみ（場合によってはＡ以外の要素を含む）を意味することがあり、さらに別の実施形態ではＡとＢの両方（場合によっては他の要素を含む）を意味すること等がある。

本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、「又は」は上で定義された「及び／又は」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分ける場合、「又は」又は「及び／又は」は包括的であると理解され、すなわち多数又は一連の要素、及び場合によっては挙げられていない追加の要素のうちの少なくとも１つを含むだけでなく、それらのうちの２つ以上を含むこともあると理解されるものとする。「ただ１つ（ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」又は「１つのみ（ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」などの明確に反対の趣旨を示す用語、又は特許請求の範囲の中で「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」と使用される場合のそれらの用語は、多数又は一連の要素のうちの１つの要素のみを含むことを意味する。一般に、本明細書において使用される「又は／若しくは」という用語は、「どちらか（ｅｉｔｈｅｒ）」、「１つ（ｏｎｅ ｏｆ）」、「ただ１つ（ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」、又は「１つのみ（ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」などの除外を意味する用語が前置されると除外的選択（すなわち、「一方又は他方であって両方ではない」）を意味するとだけ理解されるものとする。特許請求の範囲の中で使用されるときに「から基本的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。

本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、１又は複数の要素からなるリストを参照するときの「少なくとも１つ」という言葉はその要素のリスト中の要素のうちのいずれか１又は複数から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであり、その要素リスト内で具体的に挙げられたそれぞれ個々の要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含むわけではなく、その要素リスト内の要素の任意の組合せを除外するものでもない。この定義は、場合によっては「少なくとも１つ」という言葉が言及している要素リスト内で具体的に特定された要素以外に、具体的に特定された要素に関連していても関連していなくても、存在する可能性があることも許容する。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（又は同じく「Ａ又はＢのうちの少なくとも１つ」、又は同じく「Ａ及び／又はＢのうちの少なくとも１つ」）は、ある実施形態では少なくとも１つのＡ、場合によっては２つ以上のＡを含み、Ｂが無いこと（場合によってはＢ以外の要素を含む）を意味することがあり、別の実施形態では少なくとも１つのＢ、場合によっては２つ以上のＢを含み、Ａが無いこと（場合によってはＡ以外の要素を含む）を意味することがあり、さらに別の実施形態では少なくとも１つのＡ、場合によっては２つ以上のＡ、及び少なくとも１つのＢ、場合によっては２つ以上のＢ（場合によっては他の要素を含む）のこと等を意味し得る。

反対の趣旨が明確に示されていない限り、２つ以上の多数のステップ又は動作を含む本明細書において権利請求されているいずれの方法においても、その方法のステップ又は動作の順序は、その方法のステップ又は動作が列挙されている順序に必ずしも限定されないことも理解されたい。

Claims (25)

1. （ｉ）投与を必要とする対象に血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）ポリペプチドの１回目の用量を全身投与すること、
   （ｉｉ）ステップ（ｉ）の１５分～３時間後に前記対象に有効量の治療薬を全身投与すること、及び
   （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の２～２４時間後に前記対象に前記ＶＥＧＦポリペプチドの２回目の用量を全身投与すること
   を含む、対象の脳に治療薬を送達する方法。
2. ステップ（ｉｉｉ）の前記ＶＥＧＦポリペプチドの前記２回目の用量が、ステップ（ｉｉ）の前記治療薬の投与の２～８時間後に投与される（所望によりステップ（ｉｉ）の前記治療薬の投与の３～５時間後に投与される）、請求項１に記載の方法。
3. 前記方法が、
   （ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の前記ＶＥＧＦポリペプチドの前記２回目の用量の投与の２～２４時間後、好ましくはステップ（ｉｉｉ）の前記ＶＥＧＦポリペプチドの前記２回目の用量の投与の２～１２時間後、より好ましくはステップ（ｉｉｉ）の前記ＶＥＧＦポリペプチドの前記２回目の用量の投与の３～５時間後に、前記ＶＥＧＦポリペプチドの３回目の用量を投与すること
   をさらに含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 前記治療薬が、ステップ（ｉ）の前記ＶＥＧＦポリペプチドの前記１回目の用量の投与の約４５分後に前記対象に投与される、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の方法。
5. ステップ（ｉｉｉ）の前記ＶＥＧＦポリペプチドの前記２回目の用量が、ステップ（ｉｉ）の前記治療薬の投与の約３時間後に前記対象に投与される、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の方法。
6. ステップ（ｉｖ）の前記ＶＥＧＦポリペプチドの前記３回目の用量が、ステップ（ｉｉｉ）の前記ＶＥＧＦポリペプチドの前記２回目の用量の投与の約３時間後に前記対象に投与される、請求項３～請求項５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記ＶＥＧＦポリペプチドの前記１回目の用量、前記２回目の用量、及び／又は前記３回目の用量が約５０～２００ｎｇ／ｋｇである、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記ＶＥＧＦポリペプチドの前記１回目の用量、前記２回目の用量、及び／又は前記３回目の用量が約１００～１５０ｎｇ／ｋｇである、請求項７に記載の方法。
9. 前記ＶＥＧＦポリペプチドがＶＥＧＦ－Ａポリペプチドである（所望により前記ＶＥＧＦ－ＡポリペプチドがヒトＶＥＧＦ１６５Ａである）、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記治療薬がリポソーム若しくはナノ粒子に被包されているか、又はリポソーム若しくはナノ粒子に結合している、請求項１～請求項９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記リポソーム又は前記ナノ粒子がＰＥＧ化されている、請求項１０に記載の方法。
12. 前記リポソーム又は前記ナノ粒子が約２０～５００ｎｍ（所望により約２０～３００ｎｍ）のソリッドコア直径を有する、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
13. 前記治療薬が医薬組成物として製剤されており、薬学的に許容可能な担体が前記医薬組成物にさらに含まれている、請求項１～請求項１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記治療薬が遊離型である、請求項１～請求項１２のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記治療薬が小分子、タンパク質、又は核酸である、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記治療薬が水溶性であり、且つ、５００ダルトンを超える分子量を有しており、所望により前記治療薬がドキソルビシンである、請求項１～請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記対象が脳疾患を有することが疑われているヒト患者、脳疾患のリスクがあるヒト患者、又は脳疾患のヒト患者であり、所望により前記脳疾患が脳腫瘍、脳卒中、精神神経障害、及び神経変性疾患からなる群から選択される、請求項１～請求項１６のいずれか一項に記載の方法。
18. ＶＥＧＦの前記１回目の用量及び／又はＶＥＧＦの前記２回目の用量が静脈内注射又は動脈内注射により投与される、請求項１～請求項１７のいずれか一項に記載の方法。
19. （ｉ）投与を必要とする対象に約５０～２００ｎｇ／ｋｇの用量で血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）ポリペプチドを全身投与すること、
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）の１５分～３時間後に前記対象に治療薬を投与すること
    を含む、対象の脳に治療薬を送達する方法。
20. 前記治療薬が、ステップ（ｉ）の約４５分後に前記対象に投与される、請求項１９に記載の方法。
21. ステップ（ｉ）の前記ＶＥＧＦポリペプチドの前記用量が約１００～１５０ｎｇ／ｋｇである、請求項１９又は請求項２０に記載の方法。
22. 前記治療薬がリポソームに被包されているか、又はリポソームに結合している、請求項１９～請求項２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記治療薬がドキソルビシンである、請求項２２に記載の方法。
24. 前記対象が脳疾患を有することが疑われているヒト患者、脳疾患のリスクがあるヒト患者、又は脳疾患のヒト患者であり、所望により前記脳疾患が脳腫瘍、脳卒中、精神神経障害、及び神経変性疾患からなる群から選択される、請求項１９～請求項２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記ＶＥＧＦが静脈内注射又は動脈内注射により投与される、請求項１９～請求項２４のいずれか一項に記載の方法。

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