KR20220070809A - Ccl5 또는 ccl5 효능제를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 조성물 - Google Patents
Ccl5 또는 ccl5 효능제를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 본 발명은 CCL5 또는 CCL5의 효능제를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 손상 관련 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CCL5 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자, 또는 이의 효능제를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 CCL5는 중추신경 대뇌피질의 신경세포와 대식세포의 상호작용을 매개하여, 말초신경계에 비해 제한적이던 중추신경계의 축삭 재생을 촉진시키는 바, 이를 이용하여 뇌손상이나 척수손상과 같은 중추신경계 손상 관련 질환을 효과적으로 치료할 수 있다.
상기 CCL5는 중추신경 대뇌피질의 신경세포와 대식세포의 상호작용을 매개하여, 말초신경계에 비해 제한적이던 중추신경계의 축삭 재생을 촉진시키는 바, 이를 이용하여 뇌손상이나 척수손상과 같은 중추신경계 손상 관련 질환을 효과적으로 치료할 수 있다.
Description
본 발명은 CCL5 또는 CCL5의 효능제를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 손상 관련 치료용 조성물에 관한 것이다.
중추신경계(Central Nervous System; CNS)는 두개골에 싸여있는 뇌와 척수를 포함하는 신경계로 말초신경계(Peripheral Nervous System; PNS)와 함께 동물의 행동이나 신체 기작을 제어한다.
중추신경계가 손상되면 근력저하, 감각이상, 언어장애, 운동장애 등 다양한 증상과 증후를 보인다. 뇌혈관 질환인 뇌졸중(뇌경색 및 뇌출혈)으로 인해 한쪽 팔다리에 힘이 없거나 감각이 둔해지고, 말을 못하거나 발음 장애가 오기도 하며, 어지럽고 물체가 두 겹으로 겹쳐 보이기도 한다. 또한 심한 두통과 함께 속이 울렁거리며 구토가 나기도 한다. 뇌졸중뿐만 아니라 파킨슨병, 치매(잊음이병) 등의 질환, 외상성 뇌손상이나 척수손상이 오게 되면 근골격계의 이상이 나타나고, 인지기능 장애가 함께 동반되어 나타나는 경우도 많다.
척수손상(spinal cord injury), 뇌졸중과 같은 중추신경계 손상 후의 신경 재생에는 한계가 있다. 신경의 내재적 재생 잠재력이 매우 제한적이어서 중추신경계 손상 후 한번 소실된 신경기능은 충분히 회복되지 않고 대부분 영구적인 장애로 남게 된다. 중추신경과 말초신경의 수초를 비교해보면 중추신경의 백질(white matter)이 축색 돌기 성장을 선택적으로 억제한다는 사실이 밝혀진 바, 중추신경은 손상 후 재생이 억제되는 면이 있다.
또한, 뇌졸중 이후에 파괴된 신경조직 주변의 신경세포에서 기원하는 액손(축삭)에서 가지치기(sprouting) 및 새로운 성장을 비롯한 구조적 리모델링이 관찰되는 것이 알려져 있으나, 그 정도가 매우 미미하여 의미있는 신경기능의 회복을 유도할 수 없는 것으로 생각되고 있다.
이러한 신경 재생과 관련하여 다양한 연구가 진행되고 있지만, 뇌손상 및 척수손상과 같은 중추신경계 손상은 내과적, 외과적 치료의 비약적인 발전에도 불구하고 고식적인 재활치료 이외에 명확한 치료 방침이 없으며, 소실된 신경기능의 회복을 촉진시킬 수 있는 약물 또한 전무한 상태이다.
본 발명의 목적은 중추신경계 손상에서 우수한 축삭 재생능을 가진 인자를 확인하고, 이를 포함하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CCL5 [Chemokine (C-C motif) ligand 5] 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자, 또는 이의 효능제를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 중추신경계가 손상된 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리하는 단계; 상기 시험물질을 처리한 시료에서 CCL5 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질을 처리한 시료의 CCL5 단백질 또는 이의 유전자의 발현수준이 증가된 시험물질을 선별하는 단계;를 포함하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 CCL5 [Chemokine (C-C motif) ligand 5]는 중추신경 대뇌피질의 신경세포와 대식세포의 상호작용을 매개하여, 말초신경계에 비해 제한적이던 중추신경계의 축삭 재생을 촉진시키는 바, 이를 이용하여 뇌졸중이나 척수손상과 같은 중추신경계 손상 관련 질환을 효과적으로 치료할 수 있다.
또한, CCL5의 발현 또는 활성을 증진시키는 치료 물질을 확인하여, 중추신경계 손상 질환 치료제로 활용할 수 있다.
도 1은 생쥐 배아 대뇌피질에서 획득한 신경세포와 대식세포의 상호작용을 통해 신경세포의 축삭 재생능이 향상됨을 확인한 것이다.
도 2는 대식세포를 활성화할 수 있는 신경세포 유래 염증세포 인자인 케모카인을 선별한 것이다.
도 3은 도 2에서 선별된 케모카인의 시험관 내 세포 이동 활성을 확인한 것이다.
도 4는 도 3에서 선별된 케모카인 CCL5 및 CCL8의 축삭 재생능을 기능적으로 평가한 것이다.
도 2는 대식세포를 활성화할 수 있는 신경세포 유래 염증세포 인자인 케모카인을 선별한 것이다.
도 3은 도 2에서 선별된 케모카인의 시험관 내 세포 이동 활성을 확인한 것이다.
도 4는 도 3에서 선별된 케모카인 CCL5 및 CCL8의 축삭 재생능을 기능적으로 평가한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명의 발명자들은 뇌졸중 후 주변 신경세포 액손(축삭)의 구조적 리모델링을 촉진할 수 있다면 새로운 신경 연결이 활성화되어 소실된 신경기능의 회복을 촉진시킬 것으로 예상하였고, 관련 연구 중 중추 신경세포인 대뇌피질 신경세포에서 기원하는 케모카인의 일종인 CCL5가 염증세포를 자극하여 액손의 성장을 획기적으로 증가시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 CCL5 [Chemokine (C-C motif) ligand 5] 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자, 또는 이의 효능제를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, "CCL5 [Chemokine (C-C motif) ligand 5]"는 화학 주성 사이토카인(chemotactic cytokine) 또는 케모카인(chemokine)으로 분류되는 8kDa 단백질이다.
상기 CCL5 단백질 또는 이의 유전자, 또는 이의 효능제는 중추신경 대뇌피질의 신경세포와 대식세포의 상호작용을 매개하여 축삭 재생능을 향상시킬 수 있다.
본 명세서에서, "효능제(agonist)"는 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로 유도, 증진 또는 증강시킬 수 있는 물질로, "활성화제", "발현촉진제" 등과 혼용될 수 있다.
상기 효능제는 CCL5 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현을 활성화하거나 촉진시키는 작용을 하는 물질로, 예를 들어, 항체, 펩타이드, 재조합 단백질, GPCR(G protein-coupled receptor) 리간드에서 선택될 수 있으며, 이에 제한되지 않고 공지된 CCL5 단백질 또는 이의 유전자의 발현촉진제 또는 활성화제를 모두 포함할 수 있다.
상기 효능제에 의해 CCL5 단백질 또는 이의 유전자의 발현 또는 활성을 증진시키면, 손상된 중추신경계의 축삭 재생능이 향상될 수 있어, 충추신경계 손상 관련 질환을 치료할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 중추신경계 손상 관련 질환은 척수손상(spinal cord injury) 또는 뇌손상(brain injury)일 수 있고, 상기 뇌손상은 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 또는 퇴행성 뇌질환에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물은 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 적절한 담체와 배합될 수 있고, 필요에 따라, 부형제, 희석제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 결합제, 붕해제, 용제 등을 더 포함하여 제조될 수 있다. 상기 적절한 담체 등은 본 발명에 따른 CCL5 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자, 또는 이의 효능제의 활성 또는 특성을 저해하지 않는 것으로, 투여 형태 및 제형에 따라 달리 선택될 수 있다.
본 명세서에서, "약학적으로 허용가능한"이란, 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 어떠한 제형으로도 적용될 수 있고, 보다 상세하게는 통상의 방법에 따라 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 비경구형 제형으로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 경구형 제형 중 고형 제형은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 형태로, 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 솔비톨, 만니톨, 셀룰로오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있고, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 포함될 수 있다. 또한, 캡술제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 경구형 제형 중 액상 제형은 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 비경구 제형은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 이에 제한되지 않고, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 치료 효능의 증진을 위해 칼슘이나 비타민 등을 더 첨가할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.
상기 약학 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 예를 들어, 일정하지는 않지만 일반적으로 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 중추신경계 손상 관련 질환이 발생할 수 있는 임의의 동물에 투여할 수 있고, 상기 동물은 예를 들어, 인간 및 영장류뿐만 아니라 소, 돼지, 말, 개 등의 가축 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여될 수 있고, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 특히 한정할 필요 없이, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피부 도포, 호흡기내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracere-broventricular) 주사 등의 통상적인 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 중추신경계 손상 관련 질환의 치료 또는 개선을 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 수술 또는 다른 약물 치료 등과 병용하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 중추신경계가 손상된 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리하는 단계; 상기 시험물질을 처리한 시료에서 CCL5 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질을 처리한 시료의 CCL5 단백질 또는 이의 유전자의 발현수준이 증가된 시험물질을 선별하는 단계;를 포함하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법은 중추신경계 손상 관련 질환 치료제 후보 물질의 존재 또는 부존재 하에서 상기 CCL5 단백질 또는 이의 유전자의 발현 또는 활성의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로, CCL5 단백질 또는 이의 유전자의 효능제, 중추신경계 손상 관련 질환 개선 또는 치료제 등을 스크리닝 하는데 유용하게 사용될 수 있다.
상기 CCL5 단백질 또는 이의 유전자의 발현수준을 증가시키는 상기 치료제는 축삭 재생 촉진 효과를 가지는 바, 중추신경계 손상 관련 질환 치료제로서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 CCL5 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자, 또는 이의 효능제를 유효성분으로 함유하는 축삭 재생 촉진용 시약 조성물을 제공할 수 있다.
이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.
또한, 본 발명은 개체로부터 분리된 세포에 CCL5 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자, 또는 이의 효능제를 처리하는 단계를 포함하는 축삭 재생 촉진 방법을 제공할 수 있다.
이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험방법>
1. 실험동물
모든 실험에서 성체 C57BL/6 마우스가 이용되었다. 마우스의 대뇌피질 신경세포의 초대배양을 위해서 임신 17일차의 암컷 마우스를 구매하였다. 동물들은 안락사 이전동안 개별 환기 케이지에서 길러졌으며, 모든 동물 실험 방법들은 아주대학교 실험동물관리 위원회에 의해 승인되었다. 동물들은 초대배양 직전에 CO2 노출을 통해 안락사 되었다.
2. 대뇌피질 신경세포 일차 세포배양
마우스의 뇌에서 대뇌피질 신경세포를 초대배양하기 위해, 임신 17일차의 생쥐의 복강에서 제왕절개를 통해 태아를 분리해냈다. 대뇌피질 조직을 조심스럽게 해부한 뒤 차가운 HBSS (Hank's Balanced Salt Solution; Gibco, NY, USA) 버퍼 (5% HEPES; Gibco, NY, USA, 0.1% penicillin streptomycin; GE health care, Austria)로 조직을 이동시켰다. 생쥐의 대뇌피질은 면도날을 이용하여 작게 다진 후에 DNaseI (40μg/ml ; Roche, Mannheim, German)을 포함하고 있는 Accumax 효소액 (Gibco, NY, USA)으로 옮겨주었다. 조직을 포함한 효소액은 37℃에서 5분간 배양되었다.
이후 조직은 가공된 유리 피펫을 이용하여 단일세포 수준으로 분해되었다. 분리된 세포들은 70μm 크기의 필터 (SPL, Korea)를 통해 걸러진 뒤 신경세포 배양 배지 (Neurobasal media, 2% B27, 2% Glutamax, 1% sodium pyrubate; Gibco, NY, USA, 0.1% penicillin streptomycin; GE health care, Austria)를 10ml 까지 채워주었다. 그 다음, 5분간 239g에서 원심분리하여 세포를 펠렛 형태로 모아주었다. 모아진 펠렛을 세포배양배지에 다시 풀어준 뒤 세포의 숫자를 계수하였다. 총 7.5×105 만큼의 세포가 PDL (100μg/ml, Sigma Aldrich, StLouise, USA) 로 코팅된 6-well 배양판에 배양되었다. 이후 사흘마다 배양액의 절반을 새로운 배지로 교체해주었다.
3. 골수대식세포 배양 및 공배양 배지 추출
차가운 PBS를 양쪽 대퇴골과 정강이 뼈 안쪽으로 분사해 생쥐의 골수를 분리해냈다. 분리된 골수는 239g로 4℃에서 10분간 원심분리하여 모아주었다. 그 다음 골수를 단일세포 수준으로 풀어준 뒤 70μm 세포거름망 (SPL, Korea) 에 걸러주었다. 세포액을 150mm 페트리 디쉬 4장에 나누어 처리한 뒤, 골수줄기세포의 골수대식세포로 분화시키기 위해 40mg/ml의 CSF-1 (Colony stimulating factor-1; Biolegend, San Diego, USA)을 처리하였다. 7일간 세포를 분화시킨 뒤 골수대식세포를 Accumax (Gibco, New York, USA) 효소를 통해 배양판에서 떼어냈다. 골수대식세포를 239g에서 3분간 원심분리하여 펠렛 형태로 모아주었다. 상층액을 제거하고, 펠렛을 신경세포배지에 다시 풀어주었다.
배양 7일차의 대뇌피질 신경세포 위에 부속 배양판을 설치한 뒤, 신경세포 숫자의 약 5배의 골수대식세포를 삽입한 부속 배양판 (Corning, New York, USA)에 뿌려주었다. 4시간 후 100μM의 cAMP (Cyclic adenosine monophosphate; Millipore, Massachusetts, USA)와 대조군인 PBS를 처리하였다. 24시간 후 부속 배양판을 새로운 6-well 배양판으로 옮겨준 뒤 새로운 배양액(Neurobasal media, 2% B27, 2% Glutamax, 1% sodium pyrubate; Gibco, NY, USA, 0.1% penicillin streptomycin; GE health care, Austria)으로 교체해 주었다. 그 다음 골수대식세포를 72시간 동안 추가 배양한 뒤 대식세포 조건배지를 추출해냈다. 추출한 배지는 일정 용량으로 나누어져 사용 전까지 -70℃에 보관되었다.
4. 신경돌기 성장 측정을 위한 후근신경절 세포 배양 및 면역염색
성체 생쥐를 CO2 체임버에서 안락사 시킨 뒤에, 피부를 절개하고 등측 근육을 제거하여 척추를 노출시키고 후궁절제술을 통해 척수까지 노출시켰다. 요추부터 경추까지의 모든 DRG (Dorsal root ganglia)를 분리하여 차가운 세포배지 (Neurobasal 배지, 2% Glutamax; Gibco, NY, USA, 0.1% penicillin streptomycin; GE health care, Austria) 로 옮겨주었다. 분리된 DRG는 5% 콜라게네이즈 용액 (10μg/ml; Sigma Aldrich, StLouise, USA) 을 첨가한 뒤 90분간 37℃에서 배양되었다. 효소반응 이후 조직 이물질을 제거하기 위해 수차례 배양액을 교체해주었다. 그 다음 1200rpm으로 3분간 원심분리하여 DRG 조직을 모아주었다. 모아진 DRG 조직은 피펫을 이용하여 균질화 되었다. 균질화된 DRG 신경세포는 PDL (100μg/ml, Sigma Aldrich, StLouise, USA) 코팅된 8-well 슬라이드 체임버 (SPL, Korea)에 분주되었다.
4시간 후 대식세포 조건배지를 DRG 신경세포에 처리해주었다. 15시간 후 세포들은 4% 파라포름알데하이드를 처리해 15분간 고정되었다. 그 다음, 20분간 10% NGS (;Normal goat serum), 0.1% triton-x100 (Duksan, Korea) 용액에서 배양한 위 tuj-1 (1:500 ; Promega, Wisconsin, USA) 1차 항체를 처리하여 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 다음날, 적절한 이차항체를 이용하여 염색되었다. 이렇게 처리한 세포들은 커버슬립으로 표본제작되었다. 생장한 뉴라이트는 NeuronJ 이미지 분석 도구 (ImageJ plugin ; https://imagej.net/NeuronJ) 을 이용하여 측정되었다.
5. PCR 분석 및 샘플링
신경세포에서 발현하는 특정 케모카인 유전자의 발현을 분석하기 위해 cAMP 및 PBS처리 24시간 후 대뇌피질 신경세포를 수확하였다. 대뇌피질 세포의 모든 RNA를 Quiazol (Qiagen, Hilden, German)을 사용하여 추출되었다. cDNA는 RT2 First Strand Kit (Cellsafe, Korea)를 이용하여 추출된 RNA로부터 얻어졌다. 2 마이크로 그램의 cDNA 주형을 PCR master mix (Bioneer, Korea)와 섞어준 뒤 Applied BIosystems 7500을 통해 real-time PCR을 수행하였다. 각 실험조건마다 4번의 독립적인 분석이 진행되었다. cAMP 처리 이후 각 후보 케모카인 유전자의 발현 수준은 독립적인 샘플을 사용하여 검증되었다.
이때, 하기 표 1과 같은 프라이머를 사용하였다.
| 프라이머 | 방향 | 시퀀스 | 서열번호 |
| 18S rRNA |
forward | 5'-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3' | 서열번호 1 |
| reverse | 5'-TGCTGGCACCAGACTTGCCCTC-3' | 서열번호 2 | |
| CCL5 |
forward | 5'-TGCCCTCACCATCATCCTCA-3' | 서열번호 3 |
| reverse | 5'-ACTTGGCGGTTCCTTCGAGT-3' | 서열번호 4 | |
| CCL8 |
forward | 5'-GCTGTGGTTTTCCAGACCAA-3' | 서열번호 5 |
| reverse | 5'-GAAGGTTCAAGGCTGCAGAA-3' | 서열번호 6 | |
| CCL26 |
forward | 5'-TCCTGGCCATCTTCCTCAGT-3' | 서열번호 7 |
| reverse | 5'-ATCACACCGTCACTGGTGCA-3' | 서열번호 8 | |
| CXCL15 |
forward | 5'-TCAAGAGCTACGATGTCTGT-3' | 서열번호 9 |
| reverse | 5'-TCAGGTAGGAACCTGTTAGT-3' | 서열번호 10 |
6. 면역세포이주 실험
세포 주화성 이주 실험은 골수대식세포, 복강대식세포, BV2 미세아교세포주를 이용하여 수행되었다. 골수대식세포는 앞서 표기한 방법대로 진행되었다.
골수대식세포를 이용한 세포이주 실험에서는 총 1.0×104 만큼의 세포를 8 마이크론 사이즈의 12-well 부속 배양판 (Corning, New York, USA) 위에 뿌려주었다. 아래 쪽 배양판에는 CCL5, CCL8, CCL26, CXCL15 (Mybiosource, San Diego, USA) 네 가지 케모카인(chemokine)을 각각 250μg/ml의 농도로 처리해주었다. 골수대식세포를 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 15시간 동안 추가로 배양한 뒤, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde, PFA)를 포함한 0.1% 크리스탈바이올렛 용액 (Sigma Aldrich, StLouise, USA)으로 20분간 염색 및 고정되었다. 부속배양판 안쪽의 세포들을 젖은 면봉으로 제거한 뒤 증류수에 담구어서 염색약을 씻어내준다. 씻어낸 부속배양판은 상온에서 건조시킨 뒤 100배율 현미경으로 촬영되었다. 부속배양판 밑면으로 이동한 세포를 분석하기 위해 각 사분면을 촬영한 뒤 세포의 숫자를 계수하였다.
복강대식세포의 배양을 위해서 성체 마우스의 복강으로 10ml의 차가운 PBS를 주입하였다. 복강을 1분간 가볍게 마사지 한 뒤, 복강액을 50ml 튜브에 옮겨주었다. 복강액은 4℃에서 239g로 10분간 원심분리 되었다. 펠렛 형태의 세포를 세포배양액에 풀어준 뒤 5 마이크론 크기의 부속배양판 (Corning, New York, USA)에 1.0×105 만큼의 세포를 뿌려주었다. 복강대식세포는 24시간 동안 추가로 배양한 뒤 고정 및 염색되었다. 부속배양판 아래 배양판에는 앞서 설명한 것과 같은 방식으로 케모카인 단백질을 처리하였다.
BV2 미세아교세포주를 이용한 세포 이주 실험에서는 세포계대 하루 뒤의 세포가 사용되었다. Accumax 효소 ( Gibco, NY, USA,)를 이용하여 배양판에서 분리한 세포들을 계수하여 총 5.0×104 만큼의 세포를 5 마이크론 크기의 부속배양판 (Corning, New York, USA)에 배양하였다. 세포들은 총 6시간 동안 배양된 뒤 고정 및 염색되었다. BV2 미세아교세포주를 이용한 이주실험도 앞서 설명한 것과 같은 방법으로 이미지 촬영 후 분석되었다.
7. 케모카인 기능저해 항체 처리 조건배지 처리
케모카인 단백질 후보의 기능적 역할을 분석하기 위해서, CCL5와 CCL8 케모카인 단백질에 결합하여 기능을 저해하는 항체를 사용하였다. 신경세포-대식세포 공배양 4시간 후 cAMP와 PBS를 처리함과 동시에, cAMP 처리 실험군에 CCL5 항체 (R&D systems, Minnesota, USA) 또는 CCL8 (Antibodies-online, Aachen, German) 항체 또는 대조군 IgG 이형질체 항체 (R&D systems, Minnesota, USA)를 각각 처리하였다. 24시간 후 세포부속배양판을 새로운 배양판으로 옮겨준 뒤 총 72시간 동안 조건배지를 추출하였다. 이렇게 생산한 대식세포 조건배지를 DRG 신경세포 배양 4시간 후 각각 처리했다. DRG 신경세포는 15시간 동안 배양한 뒤 tuj-1 (1:500 ; Promega, Wisconsin, USA) 항체를 이용하여 염색되었다. 염색한 세포 이미지는 각 사분면과 중앙에서 촬영되었다. 신경돌기의 길이 측정은 NeuronJ 이미지 분석 도구 (ImageJ plugin ; https://imagej.net/NeuronJ)를 사용하여 측정하였다.
<실험예 1> 중추신경 대뇌피질 신경세포에서의 신경세포-대식세포 상호작용 확인
설치류의 후근신경절 신경세포는 축삭 재생을 촉진하는 특정 조건에서 대식세포(macrophage)와의 상호작용을 통해 신경세포의 축삭재생능을 촉진한다. 축삭재생능 촉진을 위한 신경세포-대식세포 상호작용은 시험관 환경에서도 재현이 가능하다. 이러한 신경세포-대식세포 상호작용이 말초신경이 아닌 중추신경 대뇌피질 신경세포에서도 일어나는지를 알아보기 위하여, 생쥐 배아 대뇌피질에서 획득한 신경세포를 대식세포와 공배양하여 상호작용을 유도할 수 있는 cAMP를 처리하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 이러한 공배양 조건에서 72시간 동안 추출한 조건배지를 후근신경절 신경세포에 처리했을 때, 신경세포의 축삭재생능을 향상시키는 것을 관찰할 수 있다. 이는 중추신경인 대뇌피질 신경세포도 대식세포와의 상호작용을 통해 대식세포가 축삭재생능을 촉진시킬수 있는 표현형을 획득할 수 있게 한다는 것을 의미한다.
<실험예 2> 신경세포 유래 염증신호 인자 확인
신경세포-대식세포 상호작용을 위해서는 대식세포를 활성화 시킬 수 있는 신경세포 유래 염증신호 인자의 매개가 필요하다. 축삭재생능을 촉진시키는 대뇌피질세포-대식세포 공배양 조건에서 대뇌피질세포가 특정하게 발현하는 염증신호인자를 84개 후보 케모카인 및 사이토카인을 검출할 수 있는 PCR (Polymerase-Chain Reaction) array 분석을 통해 발굴하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, CCL5를 포함한 CCL8, CCL26, CXCL15의 발현이 공배양 대뇌피질 신경세포에서 cAMP처리 후 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었고, real time PCR을 통하여 상기 4가지 케모카인 발현이 실제로 증가함을 검증하였다. 이는 이들 후보물질이 대뇌피질 신경세포-대식세포 간의 상호작용을 매개할 수 있음을 보여준다.
<실험예 3> 염증 세포의 이주 활성 확인
축삭 재생능을 촉진하는 염증신호인자는 신경세포-대식세포 상호작용을 유도하기 위해 대식세포에 대한 주화성을 가져야 한다. 후보물질로 선정된 CCL5, CCL8, CCL26, CXCL15의 대식세포 주화성을 확인하기 위해 세포 이주활성을 시험관 내에서 실험하였다. 수용성 염증신호인자가 농도기울기를 형성할 수 있는 미세세공막 세포배양 조건에서 대식세포를 배양할 경우 염증신호인자에 대한 주화성을 확인할 수 있다.
복강대식세포, 골수대식세포, 미세아교세포를 대상으로 각 후보물질의 주화성을 실험한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, CCL5와 CCL8 케모카인이 염증세포에서 유의미한 이주활성의 증가를 보였다. 이는 CCL5와 CCL8의 대식세포 및 미세아교세포의 활성화 유도 가능성을 시사한다.
<실험예 4> 신경세포-대식세포 상호작용에서 CCL5 매개 활성 확인
앞선 세포이주 실험에서 염증세포에 대한 주화성을 가진 CCL5, CCL8의 축삭재생능 촉진을 기능적으로 평가하기 위해, 케모카인 단백질의 기능을 생리학적으로 억제하는 항체를 대뇌피질세포-대식세포 공배양 조건에 처리하여 조건배지를 추출하였다.
조건배지를 후근신경절 신경세포에 처리한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 대조군인 IgG 처리 조건배지와 비교하여 CCL5 기능 억제 항체를 처리한 실험군에서 축삭재생능 촉진이 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 한편, CCL8 기능 억제 항체를 처리한 실험군에서는 cAMP처리를 통해 증가하는 축삭재생능의 변화를 관찰할 수 없었다. 이 실험 결과는 신경세포-대식세포 상호작용에서 CCL5 케모카인이 축삭재생능 촉진을 매개하는데 필수적이라는 것을 의미한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION
<120> COMPOSITION FOR TREATING CNS INJURY-RELATED DISEASES COMPRISING
CCL5 OR CCL5 AGONIST
<130> ADP-2020-0501
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18S rRNA primer-f
<400> 1
cggctaccac atccaaggaa 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 18S rRNA primer-r
<400> 2
tgctggcacc agacttgccc tc 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCL5 primer-f
<400> 3
tgccctcacc atcatcctca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCL5 primer-r
<400> 4
acttggcggt tccttcgagt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCL8 primer-f
<400> 5
gctgtggttt tccagaccaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCL8 primer-r
<400> 6
gaaggttcaa ggctgcagaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCL26 primer-f
<400> 7
tcctggccat cttcctcagt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCL26 primer-r
<400> 8
atcacaccgt cactggtgca 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CXCL15 primer-f
<400> 9
tcaagagcta cgatgtctgt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CXCL15 primer-r
<400> 10
tcaggtagga acctgttagt 20
Claims (7)
- CCL5 [Chemokine (C-C motif) ligand 5] 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자, 또는 이의 효능제를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 CCL5 단백질 또는 이의 유전자, 또는 이의 효능제는,
중추신경 대뇌피질의 신경세포와 대식세포의 상호작용을 매개하여 축삭 재생능을 향상시키는 것을 특징으로 하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약학 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 효능제는,
항체, 펩타이드, 재조합 단백질 및 GPCR(G protein-coupled receptor) 리간드로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약학 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 중추신경계 손상 관련 질환은,
척수손상 또는 뇌손상인 것을 특징으로 하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약학 조성물. - 제 4 항에 있어서,
상기 뇌손상은,
뇌졸중, 외상성 뇌손상, 또는 퇴행성 뇌질환에서 선택되는 것을 특징으로 하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 약학 조성물. - 중추신경계가 손상된 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리하는 단계;
상기 시험물질을 처리한 시료에서 CCL5 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
상기 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질을 처리한 시료의 CCL5 단백질 또는 이의 유전자의 발현수준이 증가된 시험물질을 선별하는 단계;를 포함하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료제 스크리닝 방법. - 제 6 항에 있어서,
상기 치료제는,
축삭 재생 촉진 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료제 스크리닝 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020200157757A KR20220070809A (ko) | 2020-11-23 | 2020-11-23 | Ccl5 또는 ccl5 효능제를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 조성물 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020200157757A KR20220070809A (ko) | 2020-11-23 | 2020-11-23 | Ccl5 또는 ccl5 효능제를 유효성분으로 함유하는 중추신경계 손상 관련 질환 치료용 조성물 |
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ID=81779533
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| KR (1) | KR20220070809A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20110010694A (ko) | 2008-02-28 | 2011-02-07 | 헨리 포드 헬쓰 시스템 | 중추신경계 손상의 치료를 향상시키기 위해 기질 세포를 이용하는 조성물 및 방법 |
-
2020
- 2020-11-23 KR KR1020200157757A patent/KR20220070809A/ko not_active Application Discontinuation
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