KR20110010694A

KR20110010694A - 중추신경계 손상의 치료를 향상시키기 위해 기질 세포를 이용하는 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20110010694A
Application number: KR1020107021678A
Authority: KR
Inventors: 마이클 초프
Original assignee: 헨리 포드 헬쓰 시스템
Priority date: 2008-02-28
Filing date: 2009-02-24
Publication date: 2011-02-07
Also published as: JP2011513318A; WO2009108632A1; CN102014935A; US20110158969A1; MX2010009540A; BRPI0907776A2; WO2009108632A9; EP2262512A1; CA2753833A1; CN102014935B; AU2009219432A1

Abstract

본 발명은 포유동물의 중추신경계에 대한 손상을 치료하기 위한 신규 방법 및 조성물을 제공한다. 이러한 방법은 신경회복, 기능적 신경회복, 기질 세포 생착, 및 퇴행성 신경질환의 치료를 향상시키기 위하여, 뇌혈관장벽 투과제와 조합하여 기질 세포를 투여하는 것을 포함한다.

Description

중추신경계 손상의 치료를 향상시키기 위해 기질 세포를 이용하는 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR USING STROMAL CELLS TO ENHANCE TREATMENT OF CENTRAL NERVOUS SYSTEM INJURIES}

정부 이해의 진술(STATEMENT OF GOVERNMENT INTEREST)

본 발명은 NIH-NIDS에 의해 지급받은 인가 번호 NS042345 하에 미국 정부 지원으로 행해졌다. 미국 정부는 본 발명에 있어서 특정 권리를 갖는다.

본 발명의 분야는 일반적으로 손상된 중추신경계 치료에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 기질 세포 및 뇌혈관장벽(blood-brain barrier) 투과제를 투여함으로써 손상된 중추신경계를 치료하는 것에 관한 것이다.

대부분의 중추신경계(CNS) 손상은 뇌졸중(stroke), 외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 척수 손상(spinal cord injury), 저산소증-허혈(hypoxia-ischemia), 발작(seizure), 감염, 및 중독(poisoning)에 의해 야기되며, 이들 모두는 직접적 또는 간접적으로 CNS로의 혈액 공급의 중단을 야기할 수 있다. 이러한 손상은 흔히 허혈, 비가역적 뇌 및/또는 척수 손상, 손상된 CNS 조직의 세포사멸(apoptosis), 및 일부 경우 손상된 개체의 사망을 유발한다. 뇌졸중은 선진국에서 세 번째 주요 사망 원인이다.

뇌졸중은 성인 불구(adult disability)의 주요 원인 중 하나이며, 전세계적으로 대략 4,000만 명의 사람들에게 영향을 미치고 있다. 뇌졸중의 원인이 되는 뇌혈관(cerebrovascular) 구조의 변화 특성에는 뇌 혈관에서 형성되는 혈병(혈전), 또 다른 위치(색전(emboli)으로부터 뇌로 이동하는 죽상경화반(atherosclerotic plaque) 부분 또는 기타 물질 혈병), 및 혈관의 출혈을 포함한다. 따라서, 뇌졸중은 뇌혈관 출혈 또는 혈병의 결과인 혈류 감소에 의해 야기될 수 있으며, 그 결과 혈액 공급 부족, 허혈, 및/또는 손상 조직의 경색(infarction)을 유발한다.

뇌내출혈(intracerebral hemorrhage, ICH)로도 알려진 출혈성 뇌졸중은 뇌졸중의 10% 내지 15%를 야기하며, 35% 내지 52%의 30일 치사율을 갖고; 상기 사망 중 절반은 초기 이틀 이내에 발생한다 (Broderick JP, Brott T, Tomsick T, Miller R, Huster G. J Neurosurgery. 1993;78:188-191; Anderson CS, Chakera TM, Stewart-Wynne EG, Jamrozik KD. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 1994;57:936-940; Counsell C, Boonyakamkul S, Dennis M, Sandercock P, Bamford J, Cerebrovasc Dis.1995; 5:26-3.). 2002년 중에 미국에서 ICH를 가졌던 67,000명으로 추산되는 환자 중에서, 20%만이 손상 후 6개월에 기능적으로 자유스러운 것으로 예상되었다 (Counsell C, Boonyakamkul S, Dennis M, Sandercock P, Bamford J, Cerebrovasc Dis.1995; 5:26 -3.).

상당한 진행성 출혈이 ICH를 갖는 환자에게, 특히 발병 후 초기 3 내지 4시간 중에 발생하며, 이는 이들 환자에서의 신경 손상(neurological deterioration)과 연관된다. 더욱이, 한 연구에서 뇌졸중 환자가 흔히 뇌졸중 후 3-6시간까지 의료적 조치(medical attention)조차 받지 않는다는 것이 입증되었다 (Evenson 등, 2001 Neuroepidemiology, 20(2): 65-76). 보통, 효과적이기 위해서는 뇌졸중 치료가 손상 후 초기 몇 시간 내에 이루어져야 하며, 상기 치료는 손상된 CNS 조직에 어떠한 신경회복(neurorestorative) 효과를 제공하지 않는다. 따라서, 효과적인 뇌졸중 치료를 위한 시간 제약(time window)이 급성 신경보호성 뇌졸중 치료를 위해 현재 이용가능한 것(즉, 뇌졸중 후 수 분 또는 수 시간보다는, 아마도 수 일 또는 수 주)보다 확장될 수 있다면, 모든 환자는 아니더라도 대부분의 뇌졸중 환자를 치료할 기회가 있을 것이다. 그러한 치료는 또한 이들 환자들에서의 신경회복(neurorestoration) 및 기능적 신경 회복을 향상시킬 것이다. 이러한 관찰에 비추어, 허혈의 초급성(hyper-acute) 단계 이후까지 효과적일 수 있는 신규한 세포적 및 약리적 치료법을 찾을 필요가 현재 절실하다. 신경가소성(neuroplasticity) 및 차후의 신경 회복을 위하여 뇌의 본질적 특성들을 증폭시키는 것이 손상된 뇌의 구조적 및 기능적 재구성(reorganization)을 향상시키고자 고안된 뇌졸중 후 회복 치료에 있어 매우 중요하다.

배아 조직으로부터 얻은 공여 줄기 세포의 뇌내이식(Intracerebral transplantation)이 신경 세포로 분화하는 것으로 나타났다 (Snyder 등, 1997 Adv Neurol. 72:121-32). 중뇌 태아 이식(lntrastriatal fetal graft)이 손상된 기저핵 회로(basal ganglia circuit)를 재구성하고 허혈 포유동물 모델에서의 행동결손(behavioral deficit)을 개선하는데 사용되어 왔다 (Goto 등, 1997 Exp Neurol. 147:503-9). 성인 장기로 이식된 태아 조혈줄기세포(HSC) 또는 배아로 이식된 HSC가 세포가 도말된 미세환경 내에 내인성(endogenous) 세포를 나타내는 키메라(chimera)를 야기하였다 (Geiger 등, 1998, Immunol Today 19:236-41). 또 다른 그룹은 만능(pluripotent) 줄기세포가 성인 CNS에 제공되어 성인 뇌가 새로운 신경세포를 형성할 수 있음을 발견하였다 (Gage, 1998 Curr. Opin. Neurobiol. 8:671-6; Kempermann and Gage, 1998 Nat Med. 4:555-7).

신경줄기세포는 시험관내 및 생체내에서 신경세포, 성상 세포(astrocyte) 및 희돌기교세포(oligodendrocyte)로 분화할 수 있기 때문에, 뇌졸중 및 기타 CNS 질병의 치료를 위한 중요한 세포 치료 후보물질이다. 줄기 세포의 강력한 다기능(multipotent) 잠재력은 일반적으로 뇌졸중과 같이, 하나를 초과하는 세포 집단이 영향을 받는, 신경 회로의 복잡한 붕괴를 갖는 질병 또는 손상을 효과적으로 치료하는 것을 가능케 할 수 있다. 실제로, 최근 몇 년간, 허혈성 뇌졸중, 뇌 외상, 및 척수 손상을 포함하는, 실험적 신경 상태를 개선하기 위하여 미분화 만능 줄기 세포의 능력에 많은 관심이 집중되어 왔다 (Chopp 등, 2000; Li 등, 2000; 및 Mahmood 등, 2003). 특히, 인간 배아 신경줄기세포가 신경 기능을 회복시키고 상기 세포가 출혈 부위로 이동함을 입증하기 위하여 ICH 콜라게나아제 모델에 사용되어 왔다. 하지만, 현재 이용가능한 의료적 치료법은 신경회복(neurorestoration), 기능적 신경 회복, 및 치료 세포의 생착(engraftment)을 개선 또는 향상시키는 관점에서 일정하거나 확실한 이점을 나타내지 못하였다.

세포 기반 치료법을 위한 또 다른 잠재적 방안은 인간 제대혈 세포 (HUCB)인데, 이는 상대적으로 높은 백분율의 조혈줄기세포를 가지며 동물 모델에서 허혈성 뇌졸중을 치료하는데 사용되어 왔다. 몇몇 그룹들이 HUCB 세포가 생존하여 정상 및 병에 걸린 동물의 CNS 내로 이동하였음을 입증하였고, 허혈성 뇌졸중, 척수 손상, 및 뇌내출혈(intracerebral hemorrhage)의 동물 모델에서 기능적 회복을 촉진하는 것으로 나타났다 (Chen 등, 2001 Stroke, 32(11): 2682-8; Lu 등, 2002 Cell Transplant, 11(3): 275-81; Saporta 등, 2003 J. Hematotherapy & Stem Cell Research, 12: 271-278). 비록 HUCB 세포가 허혈성 뇌졸중, 척수 손상, 및 뇌내출혈을 치료하는데 사용되어 왔음에도 불구하고, HUCB 치료의 장기간 효능 및 이들의 중추신경계에서의 신경회복을 생착시키고 촉진시키는 잠재력에 관해서는 여전히 의문이 남는다.

중간엽 줄기 세포 (MSC)로도 알려진 골수 기질 세포(BMSC)는 세포 치료용으로 사용될 잠재력을 가지고 있다 (Pereira 등, 1995; Pereira 등, 1998; Pittenger 등, 1999; 및 Prockop 등, 2003). BMSC는 다양한 비혈액(non-hematological) 조직에서 자기 재생(self-renewal) 및 분화를 위한 능력을 가지고 있다. 손상된 뇌 조직을 보수하고 개조하기 위한 BMSC의 잠재적 용도가 상이한 동물 손상 모델을 이용하여 보고되어 왔다 (Chopp 등, 2000; Mahmood 등, 2003; Li 등, 2001; Kopen 등, 1999; Li 등, 2002; 및 Li 등, 2000). BMSC 치료법은 뇌에서의 신경회복성 변화를 유도하고, 이는 몇 가지 작용 메커니즘을 반영한다.

종래 신경 손상 모델에서, BMSC는 뇌혈관장벽을 통과하여 뇌 병변(lesion) 표적 부위로 이동하는 것으로 나타났다 (Li 등, 2001; Mahmood 등, 2003; 및 Zhang 등, 2002). 신생마우스에서, BMSC는 성장 중인 뇌 도처로 광범위하게 이동하고, 신경세포 및 성상 세포(astrocyte)로 분화하는 능력을 나타내었다 (Kopen 등, 1999). 랫트 내로 전신적으로 주입된 BMSC는 우선적으로 허혈 피질(ischemic cortex)로 이동한다 (Eglitis 등, 1999).

최근 연구에서, 인간 BMSC는 허혈성 뇌졸중 및 폐쇄성 두부손상(closed head injury) 동물 모델에서 현저한 이점을 나타내었다 (Li 등, 2002 및 Mahmood 등, 2003). 이들 신경손상 모델에서, BMSC는 뇌실하 구역(subventricular zone)으로부터 신경 줄기 세포와 같은, 내인성(endogenous) 뇌-유래 세포가 회복 과정에 참여하도록 유도하는 능력을 갖는 것으로 보인다. 하지만, 뇌 손상 영역으로 국한시키고, 신경성장인자, 신경교(glial) 유래 신경성장인자, 뇌 유래 신경성장인자 및 혈관내피세포 성장인자와 같은 성장인자의 국소적 농도를 높이는 BMSC의 능력이 역시 다른 무엇보다도 중요할 수 있다 (Villars 등, 2000; Li 등, 2002; 및 Lu 등, 2004). 이러한 성장인자는 혈관신생(angiogenesis), 신경발생(neurogenesis), 신경세포 이동(neuronal migration), 및 시냅스 가소성(synaptic plasticity)을 지원하고 확대시킨다 (Carmeliet 등, 2002 및 Jin 등, 2002). 따라서, BMSC는 작은 생화학적 및 분자 공장 및 촉매와 같이 행동하여, 허혈 경계에서 혈관신생 및 혈관 안정화를 향상시키는 많은 사이토카인 및 영양인자(trophic factor)를 실질세포(parenchymal cell) 내에서 생산하고 유도하는 것으로 보인다 (Chen 등, 2003). 하지만, 본 기술분야는 BMSC 치료 양식의 효능을 개선시키는 방법을 제공하지 못하였다.

몇몇 그룹들이 신경 손상의 BMSC 치료의 치료적 효능을 입증하기 위해 다양한 BMSC 농도 및 투여 경로를 연구해왔다. 랫트 MCA 폐색(occlusion) 모델을 이용한 연구들은 정맥내로 투여된 100만 개의 hBMSC가 동물 회복에서 현저한 이점을 나타내지 못한 반면, 동맥내로 주사된 200만 개의 hBMSC는 신경기능을 개선시켰음을 입증하였다 (Chen 등, 2003 및 Li 등, 2001). 동맥내 세포 치료법을 이용한 외상성 뇌손상(TBI) 실험 모델에서의 종래 연구가 직접적인 투여 경로를 제공하였지만, 치료 세포 자체에 의한 소혈관 뇌혈관 혈전증(thrombosis)으로 인하여 뇌허혈(cerebral ischemia)의 증가를 야기하였다 (Lu 등, 2001).

MSC를 실험적인 ICH를 치료하는데 적용하는 것이 허혈성 뇌졸중 및 TBI의 치료를 위한 것에 비해 덜 광범위하게 연구되었다. 콜라게나아제 유도 ICH를 치료하기 위해 경동맥(carotid artery)을 통해 전달된 200만 개의 중간엽 줄기세포의 4 투여량이 랫트에서의 운동 기능을 향상시켰다 (Ueda 등, 1998). 또 다른 ICH 손상 모델에서, 하나의 그룹은 BMSC가 ICH 주위(예, 손상 부위)로 국한된다는 것과 3-8백만 개의 BMSC를 정맥내(IV)로 투여한 후 활발한 신경회복 및 신경재생 기능이 나타난다는 것을 입증하였다 (Seyfried 등, 2006). 이 연구는 손상 부위로 보충된 hBMSC의 수가 3 내지 8백만 개의 BMSC를 정맥내로 주입한 후에 안정기(plateau)에 이르렀음을 보여주었다 (Seyfried 등, 2006). 따라서, 복수 투여 및/또는 많은 수의 BMSC를 전달하는 것은 이미 손상된 뇌 미세혈관(microvasculature)에서 추가적인 뇌혈관 폐색을 야기할 심각한 위험성을 수반하기 때문에, 보다 적은 BMSC로 효과적일 수 있는 단일 치료가 본 기술분야에서 바람직하다.

BMSC 투여가 손상된 CNS에서 신경 기능을 개선시킬 수 있음에도 불구하고, 이러한 개선이 단지 부분적이어서, ICH 및 포유동물 CNS의 손상 치료를 위하여 BMSC를 이용하는 효능을 증가시키는데 상당한 여지를 남긴다. 따라서, 신경회복, 기능적 신경 회복, 및 치료 세포의 생착(engraftment)을 향상시키기 위하여, CNS 손상을 치료하는데 사용된 세포-기반의 치료법을 개선시키는 방법 및 조성물에 대한 긴급한 요구가 본 기술분야에서 있게 된다.

발명의 간단한 요약

본 발명은 세포-기반의 치료제 및 뇌혈관장벽 투과제를 포함하는 치료 조성물을 중추신경계 손상을 갖는 포유동물에 투여하는 것을 제공한다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 유효량의 기질 세포 및 뇌혈관장벽 (BBB) 투과제를 비경구적으로 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 중추신경계 (CNS) 손상을 갖는 포유동물의 손상된 중추신경계 조직에서 신경회복을 향상시키는 방법을 제공한다. 관련 구체예에서, 상기 기질세포는 골수 기질 세포, 지방 조직-유래 기질 세포, 간 기질 세포, 및 와튼 제대교질(Wharton's jelly) 기질 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 상기 기질 세포는 골수 기질 세포이다.

관련 구체예에서, 상기 BBB 투과제는 알킬글리세롤(alkylglycerol), RMP-7, 및 만니톨로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 상기 BBB 투과제는 만니톨이다.

추가 관련 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 혈관내로 투여된다. 다른 관련 구체예에서, 상기 기질 세포는 동맥내로 투여되고, 상기 BBB 투과제는 정맥내로 투여된다. 특정 구체예에서, 상기 BBB 투과제는 기질 세포의 투여 이전 또는 거의 동시에 투여된다.

다른 관련 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 중추신경계 손상 후에 투여된다. 특정 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 중추신경계 손상 후 1, 2, 4, 8 또는 12시간을 초과하여 투여된다. 추가 관련 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 중추신경계 손상 후 약 12시간부터 약 1개월까지 투여된다. 특정 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 중추신경계 손상 후 약 12시간부터 약 1주일까지 투여된다. 관련 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 중추신경계 손상 후 약 12시간부터지 약 48시간까지 투여된다.

특정 관련 구체예에서, 상기 포유동물은 인간이다.

다른 관련 구체예에서, 상기 중추신경계 손상은 뇌졸중(stroke), 외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 척수 손상(spinal cord injury), 저산소증-허혈(hypoxia-ischemia), 발작(seizure), 감염, 및 중독(poisoning)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 관련 구체예에서, 상기 중추신경계 손상은 허열 또는 출혈성 뇌졸중이다. 추가 관련 구체예에서, 상기 중추신경계 손상은 테이삭스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병(Sandhoff's disease), 후를러증후군(Hurler's syndrome), 크라베병(Krabbe's disease), 파킨슨병, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증(amyotropic lateral sclerosis) (ALS), 헌팅턴병(Huntington's disease), 간질(epilepsy), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 척수성 근위축증(spinal muscle atrophy) (SMA), 프리드리히 실조증(Friedreich's ataxia), 다운증후군, 베르니케 코르사코프 증후군(Wernicke-Korsakoff syndrome), 및 크로이츠펠트 야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중추신경계의 질병, 질환 또는 상태로부터 야기된다.

특정 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제의 투여 이후, 손상된 중추신경계 조직은 기질 세포 및 BBB 투과제를 투여되지 않은 포유동물에서 동일하게 손상된 중추신경계 조직과 비교하여 볼 때, 시냅토피신(synaptophysin), 신경 클래스 III β-튜불린(neuronal class III β-tubulin) (TUJ1), 및 더블코르틴(doublecortin) (DCX1)의 발현이 증가하였다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 중추신경계 손상을 갖는 포유동물의 인지 및/또는 운동 기능적 신경 회복을 향상시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 기질 세포 및 뇌혈관장벽 (BBB) 투과제를 비경구적으로 포유동물에 투여하는 것을 포함한다. 관련 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제의 투여 이후, 상기 포유동물의 인지 및/또는 운동 기능적 신경 회복은 기질 세포 및 BBB 투과제를 투여하지 않은 동일하게 손상된 포유동물의 인지 및/또는 운동 기능적 신경 회복에 비해 더 크다. 추가 관련 구체예에서, 상기 기질 세포는 골수 기질 세포, 지방 조직-유래 기질 세포, 간 기질 세포 및 와튼 제대교질 기질 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

다른 관련 구체예에서, 상기 BBB 투과제는 알킬글리세롤, RMP-7, 및 만니톨로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 관련 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 혈관내로 투여된다. 관련 구체예에서, 상기 기질 세포는 동맥내로 투여되고, 상기 BBB 투과제는 정맥내로 투여된다.

추가 관련 구체예에서, 상기 BBB 투과제는 기질 세포의 투여 이전 또는 거의 동시에 투여된다. 다른 관련 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 중추신경계 손상 후 12시간을 초과하여 투여된다. 특정 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 중추신경계 손상 후 약 12시간부터 약 1개월까지 투여된다. 특정 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 중추신경계 손상 후 약 12시간부터 약 1주일까지 투여된다. 보다 특정 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 중추신경계 손상 후 약 12시간부터 약 48시간까지 투여된다. 관련 구체예에서, 상기 중추신경계 손상은 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 및 척수 손상으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 추가 관련 구체예에서, 상기 중추신경계는 허혈 또는 출혈성 뇌졸중이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 유효량의 기질 세포 및 BBB 투과제를 비경구적으로 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 중추신경계 손상을 갖는 포유동물의 손상된 중추신경계 조직에 기질 세포의 생착(engraftment)을 향상시키는 것을 제공한다. 관련 구체예에서, 기질 세포 및 BBB 투과제의 투여 이후, 손상된 중추신경계 조직에 생착된 기질 세포의 수는 기질 세포 및 BBB 투과제를 투여하지 않은 포유동물의 동일하게 손상된 중추신경계 조직에 생착된 기질 세포의 수에 비해 더 크다.

특정 관련 구체예에서, 상기 기질 세포는 골수 기질 세포, 지방 조직-유래 기질 세포, 간 기질 세포 및 와튼 제대교질 기질 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

추가 관련 구체예에서, 상기 BBB 투과제는 알킬글리세롤, RMP-7, 및 만니톨로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 다른 관련 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 혈관내로 투여된다. 관련 구체예에서, 상기 기질 세포는 동맥내로 투여되고, 상기 BBB 투과제는 정맥내로 투여된다.

추가 관련 구체예에서, 상기 BBB 투과제는 기질 세포의 투여 이전 또는 거의 동시에 투여된다. 특정 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 중추신경계 손상 후 12시간을 초과하여 투여된다. 관련 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 중추신경계 손상 후 약 12시간부터 약 1개월까지 투여된다. 추가 관련 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 중추신경계 손상 후 약 12시간부터 약 1주일까지 투여된다. 또한 추가 관련 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 중추신경계 손상 후 약 12시간부터 약 48시간까지 투여된다.

관련 구체예에서, 상기 중추신경계 손상은 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 척수 손상, 저산소증-허혈, 발작, 감염, 및 중독으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 관련 구체예에서, 상기 중추신경계 손상은 허혈 또는 출혈성 뇌졸중이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 유효량의 기질 세포 및 뇌혈관장벽 투과제를 비경구적으로 투여하는 것을 포함하는, 중추신경계 손상을 갖는 포유동물의 손상된 중추신경계 조직을 치료하는 것을 제공한다.

특정 구체예에서, 상기 기질 세포는 유전학적으로 변형된다. 관련 구체예에에서, 상기 기질 세포는 신경성장인자, 신경교(glial) 유래 신경영양인자, 섬모체(ciliary) 신경영양인자, 뇌 유래 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 및 혈관내피세포 성장인자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성장인자의 발현을 증가시키기 위해 유전학적으로 변형된다. 특정 구체예에서, 상기 기질 세포는 골수 기질 세포, 지방 조직-유래 기질 세포, 간 기질 세포, 및 와튼 제대교질 기질 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

추가 관련 구체예에서, 상기 BBB 투과제는 알킬글리세롤, RMP-7, 및 만니톨로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 다른 관련 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 혈관내로 투여된다.

특정 관련 구체예에서, 상기 뇌혈관장벽 투과제는 기질 세포의 투여 이전 또는 거의 동시에 투여된다. 관련 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 중추신경계 손상 후 12시간을 초과하여 투여된다. 추가 관련 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 중추신경계 손상 후 약 12시간부터 약 1개월까지 투여된다. 다른 관련 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 중추신경계 손상 후 약 12시간부터 약 1주일까지 투여된다. 또한 다른 관련 구체예에서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제는 중추신경계 손상 후 약 12시간부터 약 48시간까지 투여된다.

특정 관련 구체예에서, 상기 중추신경계 손상은 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 척수 손상, 저산소증-허혈, 발작, 감염, 및 중독으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 상기 중추신경계 손상은 허혈 또는 출혈성 뇌졸중이다. 다른 관련 구체예에서, 상기 중추신경계 손상은 테이삭스병, 샌드호프병, 후를러증후군, 크라베병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 헌팅턴병, 간질, 다발성 경화증, 척수성 근위축증 (SMA), 프리드리히 실조증, 다운증후군, 베르니케 코르사코프 증후군, 및 크로이츠펠트 야콥병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중추신경계의 질병, 질환 또는 상태로부터 야기된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 유효량의 기질 세포 및 BBB 투과제를 포함하는 조성물을 제공한다. 관련 구체예에서, 상기 기질 세포는 유전적으로 변형된다. 추가 관련 구체예에서, 상기 기질 세포는 신경성장인자, 신경교 유래 신경영양인자, 섬모체 신경영양인자, 뇌 유래 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 및 혈관내피세포 성장인자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성장인자의 발현을 증가시키기 위해 유전학적으로 변형된다.

도 1은 기능적 신경학적 테스트 결과를 제공한다.
4개의 그룹(대조군, 인간 1차 섬유아세포 (FB); 만니톨 (MT); 인간 골수 간엽세포 (hBMSC); 복합치료, hBMSC+MT)의 신경 중증도 수치(NSS)(우측 패널) 및 코너 턴 테스트(CTT)(좌측 패널)의 정량적 막대 그래프 결과를 제시한다.
도 2는 4개의 그룹(대조군, 인간 1차 섬유아세포 (FB); 만니톨 (MT); 인간 골수 간엽세포 (hBMSC); 복합치료, hBMSC+MT)의 반대편 정상 부분에 비교하여 ICH 부위에서 선조체(striatal) 조직 손실의 정량적 비율을 막대 그래프로 제공한다. 통계학적 유의적 수준은 *P<0.05이다.
도 3은 대조군 및 복합 치료 랫트 선조체의 mAb 1281, BrdU, 시넵토피신(synaptophysin), TUJ1 및 DCX의 대표적인 면역착색 및 정량적인 면역 반응성을 나타낸다. 모든 처리 그룹의 정량적인 면역반응성은 각 패널의 우측편에 막대 그래프로 제공된다. 복합 그룹의 손상된 부위 인접한 세포 하위군에서 BrdU 및 TUJ1의 공동 국소화는 하부 패널에 제공된다. 화살표는 BrdU 및 TUJ1에 대해 모두 양성적으로 착색된 세포를 가리킨다.
발명의 상세한 설명
A. 신경 손상의 치료 및 예방법
본 발명은 포유류의 손상된 중추신경계 (CNS)에 치료 조성물의 투여에 일부 기초한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "중추신경계" 또는 "CNS"는 포유류의 뇌 및 척추를 포함하는 것으로 간주해야 한다. 이 용어는 또한 후각 및 시각 두개(cranial) 신경도 포함한다. CNS 조직에는 뇌, 척추, 시신경, 언급된 조직의 개별 부위 및 상기 조직 및 부위를 포함하는 신경성 세포 및 비-신경성 세포가 포함되나 이에 국한되지는 않는다.
본 발명의 방법 및 조성물은 손상후 상당시간동안 손상된 CNS를 가지는 환자에게 효과적으로 투여되는 세포 기반 치료 조성물을 위한 것이다. 따라서, 본 발명의 방법은 이미 가능한 것으로 간주된 것 이상으로 상당수의 더 많은 환자를 효과적으로 치료할 수 있는 기회를 제공한다. 더욱이, 본 발명은 세포 기반 치료제와 복합하여 혈액뇌관문을 침투할 수 있는 물질을 투여함으로써, 세포 기반 치료제의 동맥내 운반과 관련된 뇌혈관 폐색 위험을 감소시키는 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 세포 치료제가 혈액뇌관문을 침투하여 손상된 CNS 조직으로 들어가는 능력에 의해 손상된 중추신경계에서 세포 기반 치료제의 안정성 및 효과의 강화가 대개 결정된다. 기존 연구에서, 3 내지 8 백만개 hBMSC의 정맥 주입후 손상된 중추신경계로 모이는 hBMSC의 수치가 정지국면에 도달하는데, 이는 hBMSC가 손상된 부위에 도달함에 있어서 혈액뇌관문이 속도-제한 단계중에 하나임을 제시한다고 지적하였다(Seyfried et al, 2006). 혈액뇌관문은 내피세포의 연속 층들이 서로 단단하게 엮어있는 것으로 구성된 복합 맥관 구조다. 혈액뇌관문의 특징으로 볼 때 정상적인 생리학적 상태에서 뇌에 항상성(homeostatic) 환경을 제공하기 위해 혈액과 뇌 사이에 매우 선택적인 교환 시스템이 발달된 것으로 본다. 이와 같은 제어된 환경은 긴장과 같은 생리적인 조건하에 투과성의 증가 또는 외상, 허혈(ischemia), 종양 및 알레르기 또는 염증 질환과 같은 병리학적 상태에서 발생되는 내피 막의 물리적 손상에 의해 변경될 수 있다. 또한, 브래디키닌(bradykinins), 세로토닌, 히스타민, 아라키돈산, 루코트리엔 및 자유 라디칼과 같은 화학 매개물질의 방출에 의해 혈액뇌관문의 투과성이 증가될 수도 있다.
뇌 유조직으로 약물의 운반을 증가시킬 때, BBB의 투과성을 증가시키는 화학적 매개물질을 이용하면 유익할 수 있다. 실험적 및 임상적 이용에서, 합성된 노나펩티드(nonapeptide) 및 브래디키닌 유사체인 Cereport -앞서 RMP-7으로 언급되기도 함-은 기니아피그에서 뇌 종양으로 약물의 운반을 선택적으로 증가시키고, 혈액-안구관문의 투과성도 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 정맥 또는 경동맥(intracarotid) 경로를 통하여 투여되는 경우, 세레포트는 뇌 내피상의 수용체 β₂ 아류(subclass)의 자극을 통하여 선택적으로 혈액뇌관문을 개방한다. 이와 같은 자극으로 세포내 자유 Ca²⁺가 신속하고, 일시적으로 증가되며, 이는 다시 내피 포어 크기를 증가시키게 된다. β₂ 수용체 자극의 속성 또는 감도의 감소로 인하여 이와 같은 효과는 일시적이다(~20분).
혈액뇌관문의 투과성을 개선시키고, 신경손상의 세포계 요법에서 개선 방법을 제공할 수 있는 또 다른 화합물은 만니톨이다. 예를 들면, 만니톨은 당알코올이며 및 체액/물의 증가로 인한 의학적 병태를 예방 또는 치료하는데 이용되는 삼투조절물질(osmolyte)이다(Winkler and Munoz-Ruiz, 1995). 부속 치료로써, 만니톨은 부종을 감소시키기 위하여 또는 뇌의 상당한 병소로 인한 두개골내 압력을 감소시키는데 흔히 이용되어 왔다(Schwarz et al., 1998 and McGraw and Howard, 1983). 만니톨은 관문을 이루는 매우 단단하게 결합된 내피세포들의 일시적인 수축에 의해 혈액뇌관문을 개방하여, 뇌로 약물을 직접적으로 운반할 수 있게 하는데에도 사용되었다(Kroll and Neuwelt, 1998).
뇌 혈관상에 만니톨 효과의 또 다른 제안된 기전은 증가된 내피 투과성 및 소맥관 팽창이다(Machi et al, 1996). 뇌 혈류의 유동성이 만니톨에 의해 개선될 수 있는데, 그 이유는 만니톨은 점성을 낮추고, 더 나은 모세관 유동을 허용하기 때문이다(Burke et al, 1981 ). 만니톨은 세포 팽창을 저지할 수 있으며, 손상된 부위 인접한 후속적인 세포 손상을 경감시킬 수 있다 (Tranum-Jensen et al, 1981 ). 비록 아직 찬반 논란이 있기는 하지만, 고약량의 만니톨은 급성 및 외상에 의한 뇌 손상의 치료와 상승된 두개골 압력을 감소시키는 것으로 보고되었다 (Cruz et al, 2001 and Tranum-Jensen et al, 1981 ).
따라서, 만니톨은 손상후 급격한 스트레스에 대해 조직 내성을 강화시킬 수 있고, 손상부위에 인접한 생존 세포를 더 많이 구해줄 수 있을 가능성이 있다(Lizasoain et al, 2006). 이와 같이, 만니톨은 발작 쇼크를 감쇠시키고 따라서, 손상된 조직의 생존 시간을 연장시킬 수 있다(Chen, et al 2008). 그러나, ICH 치료제로써 또는 손상된 CNS 조직에 대해 세포 기반 치료법에 부속적인 형태로 만니톨과 같은 물질의 사용에 대해 많은 연구가 없었다.
따라서, 다양한 구체예에서, 본 발명은 신경복원 및 기능성 신경 회복을 강화시키고, 손상된 CNS에서 BMSC의 접목을 강화시키고, CNS 손상과 관련된 조직 손상을 감소시키고, 시냅스형성(synaptogenesis), 미숙 뉴우런 형성 및 뉴우런 이동을 증가시키기 위하여, 손상된 CNS에서 좀더 많은 내생 세포를 활성화시키기 위하여, 손상된 CNS을 가진 포유류에게 간엽세포 및 혈액뇌관문 투과제를 비경구로 투여한다.
특정 구체예에서, 간엽세포는 BMSC, 지방세포 조직 유도된 간엽세포 (ADSCs); 간 간엽세포 (LSCs); 및 워튼 연육(Wharton's jelly) 간엽세포로 구성된 군에서 선택된다.
다양한 구체예에서, 혈액뇌관문 투과제는 만니톨, RMP-7, 및 기타 적절한 알킬글리세롤로 구성된 군에서 선택된다. 특정 구체예에서, 혈액뇌관문 투과제는 별도의 또는 동일한 조성물내에서 간엽세포와 거의 동시에 또는 간엽세포 투여전에 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CNS 손상후 개체에 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 CNS 손상후 최소 1 시간, 최소 2 시간, 최소 3 시간, 최소 4 시간, 최소 5 시간, 최소 6 시간, 최소 7 시간, 최소 8 시간, 최소 9 시간, 최소 10 시간, 최소 12 시간, 최소 24 시간, 최소 48 시간, 최소 72 시간, 최소 1 주, 최소 2 주, 최소 3 주, 및 최소 1 달후에 CNS 손상된 개체에 투여된다. 특정 구체예에서, 간엽세포 및 혈액뇌관문 투과제는 CNS 손상 시작후 약 1 주 내지 1 달, 약 12 시간 내지 1 달, 약 12 시간 내지 2 주, 약 12 시간 내지 1주, 약 12 시간 내지 72 시간, 약 12 시간 내지 48 시간, 또는 약 12 시간 내지 24 시간사이에 투여된다.
본 발명의 방법은 혈액뇌관문 투과제와 병용하여 간엽세포의 비경구(예, 정맥 및 동맥내 뿐만 아니라 다른 적절한 비경구 경로), 척추내(intrathecal), 뇌실내(intraventricular), 유조직내(intraparenchymal)(척추, 뇌간 또는 운동 피질 포함), 뇌수조내(intracisternal), 두개골내(intracranial), 선조체내(intrastriatal) 또는 흑질내(intranigral) 투여를 고려한다.
특정 구체예에서, 간엽세포와 혈액뇌관문 투과제의 투여는 정맥 또는 동맥내 경로를 통하여 이루어질 수 있다. 특정 구체예에서, 간엽세포는 혈액뇌관문 투과제와는 다른 경로를 통하여 투여된다. 특정 구체예에서, CNS 손상된 개체에게 유효량의 간엽세포의 동맥 투여전, 투여와 동시에 또는 투여후에 혈액뇌관문 투과제는 정맥으로 투여된다. 또 다른 구체예에서, CNS 손상된 개체에게 유효량의 간엽세포의 동맥 투여전, 투여와 동시에 또는 투여후에 혈액뇌관문 투과제는 동맥으로 투여된다. 또 다른 관련 구체예에서, CNS 손상된 개체에게 유효량의 간엽세포의 정맥 투여전, 투여와 동시에 또는 투여후에 혈액뇌관문 투과제는 정맥으로 투여된다. 또 다른 구체예에서, CNS 손상된 개체에게 유효량의 간엽세포의 정맥 투여전, 투여와 동시에 또는 투여후에 혈액뇌관문 투과제는 동맥으로 투여된다.
다양한 구체예에서, 혈액뇌관문 투과제 투여를 포함한 방법에서 투여되는 간엽세포는 동일한 치료요법적 장점을 얻기 위하여 혈액뇌관문 투과제없이, 동일하게 손상된 CNS에 투여된 간엽세포와 동일한 또는 다소 적은 양이다. 특정 구체예에서, 혈액뇌관문 투과제와 병용하여 투여되는 간엽세포의 효과적인 세포수량은 100 kg당 1×10¹² 세포 미만, 100 kg당 1×10¹¹ 세포 미만, 100 kg당 1×10¹⁰ 세포 미만, 100 kg당 1×10⁹ 세포 미만, 100 kg당 1×10⁸ 세포 미만, 100 kg당 1×10⁷ 세포 미만, 100 kg당 5×10⁶ 세포 미만, 100 kg당 4×10⁶ 세포 미만, 100 kg당 3×10⁶ 세포 미만, 100 kg당 2×10⁶ 세 미만, 100 kg당 1×10⁶ 세포 미만, 100 kg당 5×10⁵ 세 미만, 100 kg당 4×10⁵ 세포 미만, 100 kg당 3×10⁵ 세포 미만, 100 kg당 2×10⁵ 세포 미만, 100 kg당 1×10⁵ 세포 미만, 100 kg당 5×10⁴ 세포 미만, 또는 100 kg당 1×10⁴ 세포 미만이다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 포유류의 손상된 CNS 또는 CNS 조직에서 신경복원을 강화시킨다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "신경복원" 또는 "신경복원적"이란 시냅스 성형력(예, 시냅스형성), 미숙 신경 세포 형성(예, 신경형성), 맥관형성, 신경 이동 뿐만 아니라 백질 및 엑손 리모델링을 포함하는 과정을 설명하는데, 이들 모두 손상된 CNS에서 기능성 신경 개선에 기여할 수 있다. 한 가지 특정 이론에 결부되지 않고, 손상된 중추신경계 조직은 다양한 방식으로 개체발생을 반복한다(Cramer et al., 2000 and Goldman et al., 1996). 예를 들면, 발작 및 기타 중추신경계 손상후, 뇌조직은 발생의 초기 단계로 되돌아가서, 사이토킨, 영양성 인자 및 생장 인자에 의한 자극에 상당한 반응성을 가지게 된다.
특정 구체예에서, 강화된 신경복원은 본 발명의 방법에 의해 이루어지는데, 본 발명의 세포 기반 치료 조성물의 투여에 의해, 손상된 CNS의 내생 세포내에 있는 뇌 유도된 신경 생장 인자(NGF), 아교세포(glial) 유도된 신경성장인자(GDNF), 섬모 신경성장인자(CTNF), 뇌유도된 생장인자(BDNF), 혈소판 유도된 생장인자(PDGF), 섬유아세포 생장인자(FGF), 및 맥관 내피 생장인자(VEGF), 및 기타 사이토킨과 같은 생장인자의 발현에 의해 부분적으로 유도된다. 따라서, 특정 구체예에서, "신경복원 강화"는 치료를 받지 않은 또는 대조군 처리된 손상되지 않은 또는 손상된 CNS와 비교하여 간엽세포 및 혈액뇌관문 투과제와 같은 세포 기반 치료제의 투여로 인하여, 시냅스형성, 신경형성, 맥관형성 및/또는 신경 이동을 겪고 있는 세포의 비율 또는 양의 증가와 연관된다.
특정 구체예에서, 간엽세포 및 혈액뇌관문 투과제가 투여되지 않은 개체에서 동일하게 손상된 중추신경계 조직과 비교하여, 시넵토피신, 뉴우런 부류 III β-투블린(TUJ1), 및 더블코르틴(DCX1)의 발현 증가에 의해 손상된 중추신경계 조직에서 신경복원의 강화가 증명된다. 신경복원 지표는 시넵토피신, 뉴우런 부류 III β-투블린 (TUJ1), 및 더블코르틴 (DCX)과 같은 유전자의 발현 증가를 포함한다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 시넵토피신 발현은 시넵스형성을 나타내고; TUJ1는 미숙 뉴우런 및 뉴런 전구세포에서 발현되고; 및 DCX는 이동 뉴우런에서 발현된다.
"미숙 뉴우런" 및 "뉴우런 전구세포"는 본 발명의 많은 측면에서 호환적으로 이용된다. 미숙 뉴우런은 Musashi-1, Nestin, NeuN, 부류 III β-투블린, GFAP, NF-L, NF-M, 미소관 연합된 단백질(MAP2), S100, CNPase, 글리피칸(특히 글리피칸 4), 뉴우런 펜트라신 II, 뉴우런 PAS 1, 뉴우런 생장 연관 단백질 43, 신경돌기 파생 연장 단백질, 비멘틴(vimentin), Hu, 인테메신(intemexin), 04, 미엘린 염기성 단백질 및 플레오트로핀과 같은 하나 또는 그 이상의 뉴우런/ 표현형 마커들의 발현에 의해 추가 탐지될 수 있다. 물론, 당업자는 시냅스 형성, 신경형성 및 뉴우런 이동을 탐지하는데 흔히 이용되는 다른 많은"마커"를 인지할 수 있을 것이며, 이들 각각 신경복원을 결정하는데 적절하게 이용된다.
신경복원은 손상에 반응하여 CNS에서 정상적으로 발생되는 내생성 반응이다. 예를 들면, 성인 뇌의 발작후, 증가된 TUJ1 발현에 의해 나타난 신경모세포(neuroblasts) 집단은 뇌실하조직(subventricular zone : SVZ)에서 상당히 확장되며, 이들 세포는 경색에 인접한 부위로 다시 모이고, 이부위에서 이들 세포는 뉴우런으로 분화되어, 손실된 뉴우런을 대체한다(Parent et al. Ann Neurol 2002; 52:802-813; Arvidsson et al. Nature Medicine 2002; 8: 963-970). 뉴우런 세포 이동의 증가는 증가된 DCX 발현으로 설명된다. 또한, 신경모세포는 맥관형성을 촉진시키기 위하여(증가된 VEGF 발현으로 나타남) 및 시냅스 형성(증가된 시넵토피신 및 생장-연관된 단백질 43 발현으로 나타남)을 자극하기 위하여 마이크로맥관과 공조하고, 이에 의해 신경복원 및 기능성 신경 회복이 촉진된다.
다른 다양한 구체예에서, 본 발명의 방법은 손상된 CNS를 가진 포유류의 인지 및/또는 운동 기능 신경 회복의 강화를 제공한다. 중추신경계 손상은 손상 원인에 따라 운동 능력 및/또는 인지 능력에 음성적으로 영향을 줄 것이다. 예를 들면, 랫트의 중뇌 동맥 폐색 모델에서, 실험군과 대조군에서 운동 능력, 신경 기능 및 인지 실행의 결함이 관찰되었다(Borlognan et al., 1998; Roof et al., 2001 ).
인지 및 운동 기능 신경 회복을 측정하기 위하여, 당업자에 공지된 흔히 실시되는 다양한 방법을 이용하여 인지 및 운동 기능 신경 회복이 분석될 수 있다. 설치류에서, 예를 들면, 통상의 기능 신경 회복의 인지 테스트는 Morris Water Maze (MWM), 수동 회피 실험(passive avoidance tasks), Y-maze/T-maze, 공포 조건화(fear conditioning) 및 물체 인지 실험을 포함한다. 운동 기술에서 기능 신경 회복을 측정하는데 이용되는 통상적인 테스트에는 코너 턴 테스트(CTT), 신경 중증도 수치(NSS), 광장 보행 활동량 검사(open field locomotor activity test), 로타로드(rotarod) 검사, 악력 분석(grip strength assay), 고양이 걸음걸이 분석(cat-walk gait analysis), 평균대 테스트(balance beam test), 및 경사대 테스트(inclined screen test)가 포함된다. 유사하게, 당업자는 인지 및 운동 기능 신경 회복을 측정하기 위하여 인간에게서 흔히 실행되는 기능 신경 분석을 이용한다.
본 발명의 다른 다양한 구체예는 포유류의 손상된 CNS에 세포 기반 치료제, 예를 들어, 간엽세포의 접목을 강화시키는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "접목하다(engraft)" 또는 "접목(engraftment)"은 손상된 CNS 또는 CNS 조직에서 세포 기반 치료제의 생존을 의미하는데, 여기에서 세포 기반 치료제가 투여된 후 손상된 CNS에서 최소 2 주, 최소 한 달, 또는 최소 1년 유지된다.
임의 특정 이론에 구속되지 않으면서, 본 발명은 치료 세포와 내생 세포 사이에 효과적인 소통을 증가시키는 세포 기반 치료제의 강화된 접목을 고려한다. 세포간 소통의 증가는 CNS에 손상후 신경재생 과정에 참여하는 내생성 세포 고유 능력을 보강한다. 따라서, 접목된 세포가 분화되어, 손상된 CNS 세포를 대체하는 것을 공식적으로 배제하지는 않지만, 당업자는 내생성 중추신경계 세포에 의해 소통되는 신경재생성 시그날의 증가는 세포 치료제의 접합의 증가에 의해 중재되며, 본 발명의 치료법 및 조성물의 중요한 유익한 결과이다.
B. 중추신경계의 질환, 장애 및 상태
본 발명의 방법은 sic, 출혈성 발작, 허혈성 발작, 외상에 의한 뇌 손상, 척추 손상, 혈중산소감소-허혈, 경색 및 중독을 포함하는 CNS에 다양한 타입의 하나 또는 그 이상의 손상을 가지는 포유류에서 신경복원, 기능 신경 회복 및 세포 기반 치료제 접합을 강화시키는데 이용될 수 있다. 당업자는 유아 및 성인에서 개시되는 유전적 및/또는 신경퇴행성 질환도 CNS에 손상을 포함한다는 것을 인지할 것이며, 이들은 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 효과적으로 치료될 수 있을 것이다.
본 발명의 치료 조성물은 테이-삭스병(Tay-Sachs disease) 및 관련 샌드호프병(Sandhoff's disease), 후를러 증후군(Hurler's syndrome) 및 관련 뮤코폴리사카라이드 및 크랩병(Krabbe's disease)을 포함하는 CNS 손상을 가진 성인, 신생아 및 어린이에 투여될 수 있을 것이다. CNS의 성인 질환에 대해, 본 발명의 방법 및 조성물은 파킨슨 질환, 알츠하이머병, 근위축성 측색 경화증, 헌팅턴 질환, 간질 및 이와 유사한 질환을 포함하나 이에 국한되지 않는 다양한 신경 질환의 신경 복원, 기능회복 및 치료에 유용하다. 다발성 경색의 치료 또한 고려된다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 기타 신경퇴행성 질환 및 CNS 관련 손상에는 AIDS 치매복합; 탈수초성 질환(demyelinating diseases), 예를 들어, 다발성경색 및 급성 전이효소 신경염; 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE); 추체외로 및 소뇌 질환(extrapyramidal and cerebellar disorders) 예를 들어 피질척수계 병소; 기저핵 또는 소뇌 질환; 과운동성 질환 예를 들어, 헌팅턴 무도병 및 노인 무도병; 약물에 의해 유도된 운동성 질환 예를 들어, CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유도된 질환; 저운동성 질환, 예를 들어, 파킨슨 질환; 진행성 핵성 마비(progressive supra-nucleopalsy); 소뇌 구조적 병소; 척수소뇌변성증(spinocerebellar degenerations) 예를 들어, 척수성 운동실조(spinal ataxia), Friedreich's 운동실조, 소뇌 피질 퇴행, 다발계통 퇴행(Mencel, Dejerine Thomas, Shi-Drager, Machado-Joseph), 전신성 장애, 예를 들면, Rufsum's 질환, 아베타리포프로테인혈증(abetalipoprotemia), 운동실조, 모세혈관확장증(telangiectasia); 및 미토콘드리아 다중 질환; 탈수초성 핵 질환 예를 들어, 다발성 경색, 급성 횡단 신경염; 및 운동 단위 질환, 예를 들어 신경근 위축(전방 뿔 세포 퇴행, 예를 들어, 근위축성 측색 경화증, 유아 척추 근위축 및 청소년 척추 근위축); 알츠하이머병, 중년의 다운 증후군; 확산성 루이스 바디 질환(Diffuse Lewy body disease); 노인성 치매 루이스 바디 타입(Senile Demetia of Lewy body type); Wernicke-Korsakoff 증후군; 만성 알코올 중독; 크로이츠펠트-야콥병; 준급성 경색성 범뇌염 할레로드덴-스파츠(Subacute sclerosing panencephalitis Hallerrorden-Spatz) 질환; 및 권투선수 치매를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 참고 Berkow et al., (eds.) (1987), The Merck Manual, (15.sup.th edition), Merck and Co., Rahway, N.J., 이들 문헌들은 참고로 전문 첨부된다.
C. 본 발명의 세포
본 발명의 방법 및 조성물은 손상된 CNS 또는 CNS 조직을 치료하기 위하여 세포 기반 치료제, 예를 들어, 간엽세포의 유효량을 투여하는 것을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 원하는 기능, 예를 들어, 여기에서 언급된 바와 같은 신경복원, 기능 신경 회복 또는 접목의 강화를 실행하는데 필수적인 세포 기반 치료제의 양을 말한다. 유효량은 이용되는 세포 기반 치료제의 타입, 나이, 체중, 성별, 전반적인 건강, 치료될 질환의 중증도를 포함하는 다양한 인자들 뿐만 아니라, 간엽세포와 같은 세포 기반 치료제와 함께 투여될 혈액뇌관문 투과제의 타입 및 그 양에 따라 달라질 것이다. 본 발명은 여기에서 설명되는 것과 같이 혈액뇌관문 투과제를 포함하는 치료에서 세포 기반 치료제의 유효량은 혈액뇌관문 투과제 없이 동일한 정도의 치료를 얻는데 요구되는 세포 기반 치료제의 유효량보다는 일반적으로 적은 양이 되는 것을 고려한다.
다양한 구체예에서, 본 발명에 따라 임의 타입의 세포도 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 임의의 중배엽, 내배엽 또는 외배엽 계통의 세포는 중추신경계가 손상된 환자에게 혈액뇌관문 투과제와 병용하여 투여될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 바람직한 세포 기반 치료제는 간엽세포이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 간엽세포는 골수 간엽세포, 지방-조직 유도된 간엽세포 (ADSCs); 간 간엽세포 (LSCs); 또는 워튼(Wharton) 연육 간엽세포이다. 간엽세포- 또는 메센키말(mesenchymal) 줄기 세포라고 칭하기도 함-는 줄기세포 및 선조세포를 포함하는 혼합형 세포군이다. 그러나, "간엽세포"는 명시된 기준에 의해 줄기세포 활성을 설명하는 이들 세포의 부분집합으로 분류되어야 한다(Horwitz et al., 2005. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy Position Statement, Cytotherapy, 7, pp.393-395).
하나의 구체예에서, 골수 간엽세포 (BMSC)가 세포 기반 치료제로 이용된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "골수 간엽세포", "BMSC", "골수 간엽세포", "메센키말 줄기 세포", 또는 "MSC"는 호환되며, 골세포(osteocytes), 연골세포(chondrocytes), 근육세포(myocytes), 지방세포(adipocytes), 및 중추신경계의 신경 및 비-신경세포에 줄기 세포 유사 선조세포로 기능을 할 수 있는 골수에 있는 세포의 작은 분류를 지칭한다. BMSC는 많이 연구되어 왔다 (Castro-Malaspina et al., 1980, Blood 56:289-30125; Piersma et al, 1985, Exp. Hematol 13:237-243; Simmons et al, 1991 , Blood 78:55-62; Beresford et al., 1992, J. Cell. Sci. 102:341-3 51; Liesveld et al., 1989, Blood 73:1794-1800; Liesveld et al., Exp. Hematol 19:63-70; Bennett et al., 1991 , J. Cell. Sci. 99:131-139). BMSC는 다양한 소스로부터 상업적으로 수득될 수도 있다. 예를 들면, 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 염소, 양, 돼지 및 말에서 분리한 BMSC는 Cognate Bioservices Incorporated (Baltimore, MD)로부터 구할 수 있다. 대안으로, 당업자는 당분야에 공지된 방법들에 의해 임의의 동물로부터 BMSC를 새로 분리해낼 수 있을 것이다. 일부 구체예에서, 간엽세포는 포유류로부터 유도되었고, 특정 구체예에서, 간엽세포는 인간에서 유도되었다.
BMSC의 소스 및 이들 소스로부터 BMSC를 수득하고 배양하는 방법은 당분야에 설명되어 있다(예를 들면, Friedenstein et al., 1976 Exp. Hematol. 4 : 267-274; Friedenstein et al., 1987, Cell Tissue Kinetics 20 : 263-272; Castro-Malaspina et al., 1980, Blood 56 : 289-301; Mets et al., 1981 , Mech. Aging Develop. 16 : 81-89; Piersma et al., 1985, Exp. Hematol. 13 : 237-243 ;Owen et al., 1988, Cell and Molecular Biology of Vertebrate Hard Tissue, Ciba Foundation Symposium, Chichester, U. K., 42- 60; Caplan, 1991 , J. Orthoped. Res. 9 : 641-650; Prockop, 1997, Science 276 : 71-74; Beresford et al., 1992, J. Cell Sci. 102 : 341-351; Cheng et al., 1994,Endocrinology 134 : 277-286; Rickard et al., 1994, Develop. Biol. 161 : 218-228; Clark et al., 1995, Ann. N. Y. Acad. Sci. 770 : 70-78). BMSC는 임의 골수, 예를 들면, 인간 기증자의 장골 모서리의 흡출에 의해 수득된 골수를 포함한 임의 골수로부터 수득될 수 있다. 기증자로부터 골수를 수득하는 방법은 당분야에 공지되어 있다.
간엽세포가 정상적으로 증식될 수 있는 임의 조건(온도, 대기, 생장 배지 조성물, 습도, 교반도 등)을 포함하는 생장-촉진 조건하에 배양될 수 있다. 이들 조건들중 결정적인 것은 없다. 온도는 정상적인 인간 체온(예를 들어 약 37℃)에 근접해야 하지만, 간엽세포가 증식할 수 있는 임의의 온도(예, 30℃ 내지 43℃)가 될 수도 있다. 간엽세포는 대기 또는 5% CO₂가 보충된 대기에서 생장할 수 있다. 생장 배지는 간엽세포의 증식을 지원할 수 있는데 충분한 영양소 및 인자를 포함하는 임의의 액상 배지가 될 수 있다. 이와 같은 배지에는 예를 들면, 탄소원(예, 포도당) 및 최소 필수 영양소를 포함하며, 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 포유류 혈청(예, 태아 송아지 혈청), 항생제(예, 페니실린 또는 스트렙토마이신), 및 L-글루타민(예, 단백질 생합성을 위한 아미노산 공급을 개선시키기 위하여)을 포함한다.
포유류 혈청은 전체 생장 배지 용적의 약 1% 내지 20%의 농도로 이용될 수 있다. 혈청은 바람직하게는 간엽세포의 활발한 생장을 지원할 수 있는지를 확인하기 위하여 사전 선별될 수 있는데, 동일한 공급업자가 제공하는 물품이라도 일부는 간엽세포의 활발한 생장을 지원하지 못한다. 대안으로, 포유류 혈청은 하나 또는 그 이상의 생장인자(예, 섬유아세포 생장인자, 혈소판 유도된 생장 인자, 인슐린 생장 인자, 또는 내피 생장 인자)로 대체될 수 있다. 예를 들면, 생장 배지는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드가 없는, 및 태아 송아지 혈청, 항생제 및 L-글루타민이 보충된 최소 필수 배지-알파(Minimal Essential Medium-alpha); 둘베코(Dulbecco) 최소 필수 배지; 당분야의 당업자에 잘 공지된 기타 배지가 될 수 있다. 생장 배지는 간엽 세포의 배양 동안 한번 또는 그 이상(매 3일 또는 4일) 대체되는 것이 바람직하다.
당업자는 BMSC는 확장되고 동시에 다능 상태(예, 골아세포, 지방세포, CNS 세포와 같은 다양한 세포 타입중 하나로 분화될 수 있는 능력)를 유지한다는 것을 인지할 것이다. 더욱이, BMSC를 실험실내에서 다양한 세포 타입으로 분화시키는 방법들도 당분야에 설명되어 있다 (예, WO 96/30031 , WO 99/43286, 및 U.S. 특허 No. 7,279,331 ).
본 발명의 방법에서 투여되는 간엽세포(예, BMSC)는 약 1시간 내지 1년 동안 당분야에 공지된 방법을 이용하여 배양될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 간엽세포는 약 1 내지 30일, 약 5일 내지 20일, 또는 약 3일 내지 14일 동안 배양에서 유지되며, 바람직하게는 약 14일, 10일 또는 7일을 넘기지 않고 수확되는 것이 바람직하다.
간엽세포는 생장 배지 존재하에 생장 표면에 세포를 접종시키고, 그 다음(예를 들어 10일 후) 세포를 수확함으로써 확장될 수 있다. 대안으로, 간엽세포 확장은 연속적으로 실행될 수 있는데, 이는 세포가 1회 이상 확장되는 것을 의미한다. 예를 들면, 제1생장 표면에서 제1 확장후, 간엽세포가 수확되고, 그 다음 생장 배지내 제2생장 표면상에서 확장된다. 물론, 두 번 확장된 간엽세포는 수확되고, 동일한 방법을 이용하여 1회 또는 그 이상의 추가로 확장될 수 있다. 실행될 수 있는 확장 및 수확의 횟수는 이론적인 제한되지 않는다.
그러나, 대부분 경우, 간엽세포의 경우 10회 이상의 확장 및 수확은 보통 필요하지 않으며, 여기에서 설명된 것(손상된 CNS 또는 CNS 조직 치료를 위한 세포 기반 치료제로 이용되는 것)을 포함하는 많은 경우에 1, 2, 3, 4, 또는 5회와 같은 적은 수도 충분하다.
추가로, 당업자는 여기에서 설명되는 다양한 타입의 간엽세포를 분리시키는 방법도 당분야에 공지되어 있다는 것을 인지할 것이다(e.g., ADSCs, Rodbell (1964) J Biol Chem 239:375 and Hanuer et al. (1989) J Clin Invest 84:1663-1670; LSCs, U.S. Patent App. Pub No. 2006/0057125; and Wharton's kelly stromal cells, McElreavey et al., 1991 , Biochem. Soc. Trans. 636th Meeting Dublin 19:29S and U.S. Patent App. Pub No. 2004/0136967). 일부 구체예에서, 포유류로 도입되는 간엽세포는 상이한 기증자(동종이계)로부터 유도될 수 있거나 또는 치료될 개체로부터 수득된(자가조직) 간엽세포가 될 수도 있다. 또한, 개체로 도입될 간엽세포는 완전히 상이한 종(이종)으로부터 수득될 수도 있다.
D. 혈액뇌관문 투과제
당업자는 당분야에 공지된 다양한 혈액뇌관문 투과제가 있으며, 시판되는 것이 있다는 것을 인지할 것이며, 이들 모두 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다. 예를 들어, Cereport (예, RMP-7)는 Alkermes Inc.(Cambridge, MA)에서 구할 수 있는 시판되는 혈액뇌관문 투과제이다. 다른 특정 구체예에서, 혈액뇌관문 투과제는 RMP-7, 만니톨, 기타 적절한 알킬글리세롤, 및 분지쇄 친지성 분자의 인 유도체(예를 들면, U.S. 특허 No. 7,186,703에서 설명된 것을 포함함-전문이 참고문헌으로 첨부됨)로 구성된 군에서 선택된다. 특정 구체예에서, 혈액뇌관문 투과제는 만니톨이다.
관련 구체예에서, 혈액뇌관문 투과제는 혈액뇌관문의 투과성을 증가시키는데 충분한 농도로 투여된다. 특정 구체예에서, 예를 들면, 혈액뇌관문 투과제가 만니톨인 경우, 혈액뇌관문 투과제는 약 0.25 g/kg 내지 3 g/kg, 약 0.5 g/kg 내지 2.5 g/kg, 약 1 g/kg 내지 2g/kg, 약 1.25 g/kg 내지 1.75 g/kg 또는 약 1.5 g/kg의 농도로 투여된다. 특정 구체예에서, 혈액뇌관문 투과제(예, 만니톨)는 0.10 g/kg 이상, 0.25 g/kg 이상, 0.50 g/kg 이상, 0.75 g/kg 이상, 1.0 g/kg 이상, 1.25 g/kg 이상, 1.50 g/kg 이상, 1.75 g/kg 이상 또는 2.00 g/kg 이상의 농도에서 투여된다.
다른 관련 구체예에서, 예를 들면, 혈액뇌관문 투과제가 세레포트(Cereport)인 경우, 혈액뇌관문 투과제는 약 0.01 ㎍/kg 내지 1 mg /kg, 약 0.1 ㎍/kg 내지 100 ㎍/kg, 또는 약 1 ㎍/kg 내지 10 ㎍/kg 또는 상기 임의 농도 증가범위에서 투여된다. 예를 들면, 특정 구체예에서, 세레포트는 약 1 ㎍/kg, 약 2 ㎍/kg, 약 3 ㎍/kg, 약 4 ㎍/kg, 약 5 ㎍/kg, 약 6 ㎍/kg, 약 7 ㎍/kg, 약 8 ㎍/kg, 약 9 ㎍/kg, 또는 약 10 ㎍/kg의 농도에서 투여된다.
특정 구체예에서, 세레포트는 0.005 ㎍/kg 이상, 0.01 ㎍/kg 이상, 1.0 ㎍/kg 이상, 10 ㎍/kg 이상, 50 ㎍/kg 이상, 100 ㎍/kg 이상, 250 ㎍/kg 이상, 500 ㎍/kg 이상 또는 1000 ㎍/kg 이상 또는 그 이상의 농도에서 투여된다. 당업자가 인지할 수 있는 바와 같이, 임의의 특정 혈액뇌관문 투과제의 용량은 당분야에 통상적인 방법에 의해 결정될 수 있다. 또한, 의도된 기간동안 혈액뇌관문 투과성을 유도하기 위하여 제조업자의 권장 용량이 이용될 수도 있다. 상기 설명된 용량은 예시일 뿐이며, 이에 한정시키려는 의도로 해석되어서는 안 된다.
특정 구체예에서, 혈액뇌관문 투과제는 혈액뇌관문의 일시적 투과성을 유도한다. 관련 구체예에서, 투과성 지속 시간은 약 1 분 내지 약 1 시간, 약 2 분 내지 45 분, 약 5 분 내지 30 분, 약 10 분 내지 30 분, 또는 약 15 분 내지 25 분이다.
관련 구체예에서, 일시적인 혈액뇌관문의 투과성은 약 1 분, 2 분, 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 25 분, 30 분, 35 분, 40 분, 45 분, 50 분, 55 분, 또는 60 분 또는 상기 범위 사이의 임의의 시간(분)동안 유지된다.
E. 손상된 CNS에서 신경복원 강화
손상된 CNS에서 신경복원성 치료에서 최근 관심은 허혈성 발작, 머리 손상, 및 척추 손상을 포함하는 실험적인 신경 손상후 신경 결과의 개선에 미분화된 전능 간엽세포(예, BMSC)을 이용하는 것에 초점을 두고 있다(Chopp et al., 2000; Eglitis et al., 1999; and Mahmood et al., 2003). 그러나, 혈액뇌관문은 혈액에서 파생된 많은 물질들이 뇌로 유입되는 것을 조절하고, 잠재적 치료제가 뇌로 유입되는 것을 차단시킬 수 있다. 중요하게는, BMSC가 혈액뇌관문을 통과하여 실험적 조건하에 뇌 병소의 표적 부위로 간다는 것이 증명되었다(Prockop et al., 1997; Li et al., 2001; and Zhang et al., 2002). BMSC는 뉴우런 및 성상세포로 분화되는 능력을 보유하며, 손상된 피질로 선호적으로 이동하는 능력도 가지는 것으로 나타났다 (Kopen et al., 1999). 신경재생 및 신경복원에 도움이 되는 국소 환경을 만드는 생장 인자의 분비 또는 분비를 자극시키는 BMSC의 능력이 특히 중요하다(Chopp and Li, 2002).
다양한 보고서에서, 허혈 발작 및 외상성 뇌 손상후 인간 BMSC로 치료를 받은 동물은 상당한 개선을 보였다(Mahmood et al., 2003; Li et al., 2001; Li et al., 2002; Li et al., 2000; and Lu et al., 2004). Seyfried 및 그의 동료들은 출혈성 발작 또는 뇌 출혈(ICH)을 가진 쥐게 hBMSC 주입하여 얻은 유익한 효과를 설명하였는데, 이는 조직 손실 감소, 유사 분열 활성, 미숙 뉴우런 형성, 시냅스 형성 및 뉴우런 이동으로 증명되었다(Seyfried et al. 2006). 그러나, hBMSC의 최저 주사 농도를 이용하여 최대의 치료요법적 운반을 얻는 것이 임상적인 관심이다. 최소량의 BMSC으로 치료 효과를 최대화시키기 위하여, 본 발명은 간엽세포와 복합하여 혈액뇌관문 투과제를 투여한다.
본 발명의 다양한 구체예는 중추신경계 손상에 대해 내생 반응을 증폭시켜 포유류의 손상된 CNS에서 신경복원을 강화시키는 것에 관한 것들이다. 특정 구체예에서, 이는 간엽세포 및 혈액뇌관문 투과제의 유효량을 복합 투여하여, 손상된 CNS에서 시냅스 형성, 신경재생 및 뉴우런 이동을 강화시킴으로써 성취된다. 따라서, 1회 또는 그 이상의 신경복원성 사건을 강화시키는 세포 기반 치료제는 손상된 CNS에서 신경복원을 강화시키고, 기능 신경 회복을 강화시킨다. 더욱이, 이와 같은 신경복원성 반응은 간엽세포와 혈액뇌관문 투과제를 복합 투여하면 가능하다.
하나의 구체예에서, 포유류의 간엽세포 및 혈액뇌관문 투과제의 유효량의 투여에 의해 이루어진다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "혈액뇌관문 투과제" 및 "혈액뇌관문 투과성 물질"은 혈액뇌관문의 온전성을 파괴시킬 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명은 증가된 수의 간엽세포와 높은 수준의 신경영양 인자가 뇌로 들어갈 수 있도록 혈액뇌관문을 부분적으로 파괴시켜, 포유류의 손상된 CNS에서 신경복원을 강화시키는 것을 고려한다. 특정 구체예에서, 포유류는 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 염소, 양, 돼지 및 말로 구성된 군에서 선택된다. 다른 구체예에서, 포유류는 인간이다.
F. 본 발명의 세포 투여
본 발명의 다양한 구체예에서, 포유류의 손상된 CNS에서 신경 복원을 강화시키는 방법은 간엽세포 및 혈액뇌관문 투과제의 유효량의 투여에 의해 이루어진다. 특정 구체예에서, 치료 효과를 얻기 위하여, 손상된 CNS를 가지는 포유류에 투여되는 간엽세포의 양은 혈액뇌관문 투과제를 투여하는 단계를 포함하지 않은 방법에서 치료 효과를 얻기 위하여 동일하게 손상된 CNS를 가진 포유류에 투여되어야 하는 간엽세포의 양보다 적거나, 거의 동일하거나 또는 그 양보다 많다. 예를 들면, 혈액뇌관문 투과제는 손상된 CNS에 더 많은 세포에 도달하도록 허용하기 때문에, 더 적은 수의 세포가 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 음성적 부작용(예, 뇌혈관 폐색)없이 혈액뇌관문 투과제와 병용하여 더 많은 수의 세포가 이용될 수 있다.
특정 구체예에서, 혈액뇌관문 투과제와 병용하여 투여되는 간엽세포의 효과적인 양은 동일하게 손상된 CNS를 가진 포유류에게 혈액뇌관문 투과제를 투여하지 않는 방법에서 투여되는 간엽세포의 수보다 최소 또는 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7- 배, 8배, 9배, 또는 10배 적다. 다른 구체예에서, 혈액뇌관문 투과제와 병용하여 투여되는 간엽세포의 유효량은 동일하게 손상된 CNS를 가진 포유류에게 혈액뇌관문 투과제를 투여하지 않는 방법에서 투여되는 간엽세포의 수와 동일하거나 약 5배 적거나, 약 2배 내지 4배 적거나, 또는 약 2.5배 내지 3.5배 적다. 특정 구체예에서, 혈액뇌관문 투과제와 병용하여 투여되는 간엽세포의 유효량은 동일하게 손상된 CNS를 가진 포유류에게 혈액뇌관문 투과제를 투여하지 않는 방법에서 투여되는 간엽세포의 수의 99% 미만, 95% 미만, 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 또는 10% 미만이다. 일부 구체예에서, 손상된 CNS를 가진 포유류에 투여되는 간엽세포의 유효량은 포유류 100kg당 약 1×10⁴ 내지 약 1×10¹³ 세포이다. 일부 구체예에서, 투여되는 간엽세포의 유효량은 포유류 100kg당 약 1×10⁶내지 약 1×10⁹ 세포 또는 100kg당 약 1×10⁸내지 약 1×10¹² 세포이다. 일부 구체예에서, 투여되는 간엽세포의 유효량은 100kg당 약 1×10⁹내지 약 5×10¹¹ 세포이다. 일부 구체예에서, 투여되는 간엽세포의 유효량은 100kg당 약 5×10¹⁰ 세포이다. 일부 구체예에서, 투여되는 간엽세포의 유효량은 100kg당 약 1×10¹⁰ 세포이다.
특정 구체예에서, 혈액뇌관문 투과제와 병용하여 투여되는 간엽세포의 유효량은 100kg당 1×10¹² 세포 미만, 100kg당 1×10¹¹ 세포 미만, 100kg당 1×10¹⁰ 세포 미만, 100kg당 1×10⁹ 세포 미만, 100kg당 1×10⁸ 세포 미만, 100kg당 1×10⁷ 세포 미만, 100kg당 5×10⁶ 세포 미만, 100kg당 4×10⁶ 세포 미만, 100kg당 3×10⁶ 세포 미만, 100kg당 2×10⁶ 세포 미만, 100kg당 1×10⁶ 세포 미만, 100kg당 5×10⁵ 세포 미만, 100kg당 4×10⁵ 세포 미만, 100kg당 3×10⁵ 세포 미만, 100kg당 2×10⁵ 세포 미만, 100kg당 1×10⁵ 세포 미만, 100kg당 5×10⁴ 세포 미만, 100kg당 1×10⁴ 세포 미만, 또는 100kg당 1×10³ 세포 미만이다. 당업자는 본 발명의 방법을 위하여 간엽세포의 효과적인 양의 정확한 투여량을 결정하기 위하여 일상적인 방법을 이용할 수 있을 것이다.
특정 구체예에서, 세포계 요법에서 뇌혈관 폐색의 위험을 감소시키기 위하여, 혈액뇌관문 투과제와 공동 투여를 포함하지 않는 방법과 비교하였을 때, 혈액뇌관문 투과제와 병용하여 더 적은 수의 간엽세포의 유효량을 투여하는 것이 유익하다. 당업자는 이와 같은 폐색은 손상된 CNS에서 신경복원 및 기능 신경 회복에 유해하다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 방법은 CNS 손상이 개시된 후에 신경복원 및 기능 신경 회복을 강화시키는데 유용하다. 일반적으로, 허혈 및 출혈성 발작의 급성 관리는 손상후 몇 시간이내에 일어나야 하며, 주로 신경호보 효과를 가져온다. 더욱이, 특정 경우에 신경 손상의 일부 급성 관리가 필수적인 것으로 간주되지만, 본 발명의 방법에서 제공되는 것과 같이, 이와 같은 처지가 손상된 신경에서 신경복원 및 기능 신경 회복을 담당하는 지속적인 세포 변화를 항상 확립하도록 작용하지는 않는다.
하나의 구체예에서, 포유류의 손상된 CNS에서 신경복원을 강화시키는 방법은 유효량의 간엽세포와 혈액뇌관문 투과제의 투여에 의해 이루어지는데, 이때 간엽세포와 혈액뇌관문 투과제는 CNS 손상 개시후에 투여된다. 기타 관련 구체예에서, 간엽세포와 혈액뇌관문 투과제는 손상후 최소 12시간 시점에 손상된 CNS의 개체로 투여된다. 다른 관련 구체예에서, 간엽세포와 혈액뇌관문 투과제는 CNS 손상 개시후 약 최소 1 시간, 최소 2 시간, 최소 3 시간, 최소 4 시간, 최소 5 시간, 최소 6 시간, 최소 7 시간, 최소 8 시간, 최소 9 시간, 최소 10 시간, 최소 12 시간, 최소 24 시간, 최소 48 시간, 최소 72 시간, 최소 1 주, 최소 2 주, 최소 3 주, 또는 최소 1 달 시점에 손상된 CNS를 가진 개체로 투여된다. 또한, 다른 특정 구체예에서, 간엽세포 및 혈액뇌관문 투과제는 CNS 손상 개시 후 약 1 주 내지 1 달 사이, 약 12 시간 내지 1 달 사이, 약 12 시간 내지 2 주 사이, 약 12 시간 내지 1 주 사이, 약 12 시간 내지 72 시간 사이, 약 12 시간 내지 48 시간 사이, 또는 약 12 시간 내지 24 시간 사이에 투여된다. 당업자는 CNS 손상후 최소 12시간 시점을 포함하는 임의 시점에 본 발명의 방법 및 조성물을 실행할 수 있으며, 원하는 효과를 유도할 수 있을 것이다.
특정 구체예에서 유효량의 간엽세포 및 혈액뇌관문 투과제의 투여 시점은 많은 CNS 손상의 급성 치료 시기보다 훨씬 늦기 때문에 더 많은 환자들이 이 치료의 후보가 될 수 있다는 것이 고려된다. 더욱이, 본 발명의 특정 방법에 의해 이용되는 나중 단계 치료에 의해 강화된 신경복원 및 기능 신경 회복이 있으며, 이는 당분야에서 현재 이용되는 다른 나중 단계 요법이나 급성 관리 전략에서 볼 수 없는 것들이다.
본 발명의 방법은 부분적으로 유효량의 간엽세포와 혈액뇌관문 투과제의 투여가 정확히 동시에 일어날 필요가 없다는 것을 고려한다. 특정 구체예에서, 손상된 CNS를 가진 개체로 간엽세포 투여전, 투여와 동시에, 또는 투여후에 혈액뇌관문 투과제를 투여한다. 특정 구체예에서, 손상된 CNS에 간엽세포 투여직전 또는 약 30 분전, 20 분전, 10 분전, 5 분전, 2 분전, 1 분전 또는 30 초전에 혈액뇌관문 투과제를 투여한다. 특정 구체예에서, 손상된 CNS에 간엽세포 투여 직전에서 약 30분 또는 약 0분 내지 30분 사이의 임의 시점에 혈액뇌관문 투과제가 투여된다. 특정 구체예에서, 손상된 CNS에 간엽세포 투여 약 24 시간 전, 18 시간 전, 12 시간 전, 6 시간 전, 3 시간 전, 2 시간 전 또는 1시간 전에 혈액뇌관문 투과제가 투여된다.
본 발명의 방법은 당업자에 공지된 다양한 경로를 통하여 유효량의 간엽세포와 혈액뇌관문 투과제의 투여를 고려한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "투여" 또는 "투여하는"은 명세서 전반에 걸쳐 본 발명의 간엽세포 및 혈액뇌관문 투과제가 치료 목적으로 손상된 CNS를 가진 개체로 운반되는 과정을 설명하는데 이용된다.
본 발명의 조성물은 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있는데, 예를 들면 비경구(예, 정맥 및 동맥내 뿐만 아니라 다른 적절한 비경구 경로를 지칭하는 용어임), 척추내(intrathecal), 뇌실내(intraventricular), 유조직내(intraparenchymal)(척추, 뇌간 또는 운동 피질 포함), 뇌수조내(intracisternal), 두개골내(intracranial), 선조체내(intrastriatal) 또는 흑질내(intranigral) 투여를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이와 같은 투여에 의해 필요한 표적 부위로 본 발명의 방법에서 이용된 간엽 세포의 이동이 허용되다.
특정 구체예에서, 투여는 치료될 질환 또는 상태에 따라 변형될 수 있으며, 비경구 경로, 예를 들면, 정맥내 또는 동맥내 또는 뇌의 손상 조직으로 직접 투여가 바람직하다. 예를 들면, 뇌맥관 손상의 경우, 본 발명의 간엽세포 운반을 위한 동맥내 경로는 손상된 조직의 맥관 영역에 바로 주어진 양의 세포의 운반을 최대화시키는 이론적 관점에서 매력적이다. 임상적 견지에서, 동맥내 경로가 매력적인데, 그 이유는 화학요법, 종양의 색전 폐색(embolization) 및 동정맥 기형성 및 두개내(intracranial) 동맥 색전증 또는 급성 혈전성 폐색의 맥관내 치료를 포함하는 다른 요법에 광범위하게 이용되었기 때문이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 만니톨과 같은 혈액뇌관문 투과제를 여기에서 설명된 범위내에서 상대적으로 높은 용량으로 투여하는 것을 고려하는데, 이는 CNS 손상 부위로 간엽세포의 이동에 유익한 영향을 줄 뿐만 아니라 간엽세포의 맥관내 투여와 연관된 합병증을 감소시켜 신경복원 및 기능 신경 회복을 강화시킨다.
하나의 구체예에서, 포유류의 손상된 CNS 조직에서 신경복원을 강화시키는 방법은 유효량의 간엽세포와 혈액뇌관문 투과제의 비경구 투여에 의해 이루어진다. 관련 구체예에서, 간엽세포와 혈액뇌관문 투과제의 투여는 정맥내 또는 동맥내 경로에 의해 이루어질 수 있다. 특정 구체예에서, 간엽세포는 혈액뇌관문 투과제와는 다른 경로를 통하여 투여된다. 당업자는 간엽세포와 혈액뇌관문 투과제를 상이한 투여 경로를 통하여 투여하여도 간엽세포 투여 시간에 대해 혈액뇌관문 투과제의 투여 시간을 변경시키지 않는다는 것을 인지할 것이다.
예를 들면, 본 발명의 특정 방법에서, 손상된 CNS를 가진 개체에게 유효량의 간엽세포를 동맥내 투여 전, 동맥내 투여와 동시에 또는 투여후에 혈액뇌관문 투과제가 정맥으로 투여된다. 다른 구체예에서, 손상된 CNS를 가진 개체에게 유효량의 간엽세포를 동맥내 투여 전, 동맥내 투여와 동시에 또는 투여후에 혈액뇌관문 투과제가 동맥으로 투여된다. 다른 관련 구체예에서, 손상된 CNS를 가진 개체에게 유효량의 간엽세포를 정맥내 투여 전, 동맥내 투여와 동시에 또는 투여후에 혈액뇌관문 투과제가 정맥으로 투여된다. 또 다른 구체예에서, 손상된 CNS를 가진 개체에게 유효량의 간엽세포를 정맥내 투여 전, 동맥내 투여와 동시에 또는 투여후에 혈액뇌관문 투과제가 동맥으로 투여된다.
당업자는 간엽세포, 혈액뇌관문 투과제, 간엽세포의 유효량 및 간엽세포와 혈액뇌관문 투과제의 투여 경로 및 투여 시점 뿐만 아니라 포유류의 손상된 CNS에서 신경복원을 강화시키기 위하여 설명된 세포 및 물질의 용량이 포유류의 손상된 CNS에서 인지 및 운동 기능 신경 회복, 및 간엽세포의 접목 강화에 일반적으로 관계되는 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기에 적합하다는 것을 인지할 것이다.
G. 손상된 CNS에서 기능 신경 회복 강화
본 발명의 기타 다양한 구체예는 유효량의 간엽세포 및 혈액뇌관문 투과제 (예, 만니톨)를 비경구 투여함으로써 손상된 CNS를 가진 포유류에서 인지 및 운동 기능 신경 회복을 강화시키는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "기능 신경 회복" 또는 "인지 및 운동 기능 신경 회복"이란 본 발명의 방법 또는 조성물을 이용한 결과, 손상된 CNS를 가지는 포유류에서 인지 기술 또는 운동 및/또는 운동 능력 활성이 개선되었음을 의미한다. 개선은 치료 전후 임의의 주어진 기능 신경 테스트에서 차이로 측정될 수 있다. 따라서, 손상된 CNS를 가지는 포유류의 인지 및 운동 기능 신경 회복의 강화는 주어진 기능 신경 테스트의 실행에서 증가를 의미하고, 이때 간엽세포와 혈액뇌관문 투과제가 투여되지 않은 (즉, 간엽세포 단독 또는 혈액뇌관문 투과제 단독) 그러나 동일하게 손상된 CNS를 가지는 포유류의 테스트 실행 능력과 비교하여, 간엽세포 및 혈액뇌관문 투과제의 유효량은 손상된 CNS를 가진 포유류에 투여된다.
관련 구체예에서, 인지 및 운동 기능 신경 회복은 약 1 % 내지 100%, 약 5% 내지 75%, 약 10% 내지 60%, 약 25% 내지 50%, 또는 약 35% 내지 40% 강화되는데, 이때 CNS 손상이 없는 포유류에 존재하는 정상적인 인지 및 운동 신경 기능 수준은 100%로 나타낸다. 특정 구체예에서, 인지 및 운동 기능 신경 회복은 약 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 강화되거나 또는 이들 수치 사이의 임의 비율로 회복된다.
H. 손상된 CNS에서 간엽세포 접목 강화
본 발명의 기타 다양한 구체예는 간엽세포 및 혈액뇌관문 투과제, 예를 들어 만니톨의 비경구 투여에 의해 포유류의 손상된 CNS 조직에서 간엽세포의 접목을 강화시키는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "접목(engraftment)"은 포유류의 손상된 CNS에서 투여된 간엽세포가 치료후 약 2 주 내지 약 1년간 존재하는 것을 의미한다. 따라서, 손상된 CNS에서 간엽세포의 접목 강화는 혈액뇌관문 투과제 없이 간엽세포로만 치료후 손상된 CNS에 존재하는 투여된 간엽세포의 수와 비교하여 간엽세포 및 혈액뇌관문 투과제를 포함하는 치료후, 약 2주 내지 약 1년 사이 시점에서 증가된 것을 의미한다.
본 발명은, 포유류의 손상된 CNS 조직내에 접목된 간엽세포 수의 강화로 손상된 CNS 조직의 내생 세포에 의해 더 많은 신경재생을 촉진하고, 따라서, 손상된 CNS에서 신경복원, 기능 긴경 회복 및 신경 재생의 속도 및/또는 그 정도가 강화됨으로써 이익을 얻는 것을 고려한다.
접목된 간엽세포는 당업자에 공지된 다양한 기술을 이용하여 탐지될 수 있다. 포유류의 손상된 중추신경계 조직내에 유전적으로 변형된 간엽세포의 통합, 분화, 이동을 추적하는 단백질에는 녹색 형광 단백질(GFP), 기타 형광 단백질(예, 강화된 녹색, 청록색, 황색, 청색 및 적색 형광 단백질; Clontech, Mountain View, Calif.), 또는 기타 태그 단백질(예, LacZ, FLAG, Myc, His6, V5 및 이와 유사한 것들)이 포함되나 이에 국한되지 않는다.
포유류의 손상된 중추신경계 조직에서 유전적으로 변형된 간엽세포의 통합, 분화 및 이동의 추적은 벡터 또는 바이러스에서 발현된 탐지가능한 분자를 이용하는 것으로 국한되지 않는다. 간엽세포의 이동, 통합 및 분화는 이식된 골수 간엽세포의 국소화를 허용하는 일련의 프로브를 이용하여 결정될 수도 있다. 이와 같은 프로브에는 인간 특이적 Alu에 대한 것들이 포함되며, 이는 매 500개의 염기쌍에 약 1개로 존재하는 풍부한 전이가능한 요소이며, 따라서, 당업자는 이식된 세포의 진행을 추적할 수 있다. 이식된 세포의 추적은 여기에서 언급된 세포 특이적 마커에 대한 항체 또는 핵산 프로브를 이용하여 실시될 수 있는데 예를 들면, NeuN, MAP2, 신경섬유 단백질 및 이와 유사한 것들이 포함되나 이에 국한되지는 않는다.
당업자는 간엽세포가 투여되는 포유류의 손상된 CNS의 내생 세포로부터 투여된 간엽세포를 구별할 수 있는 임의 타입의 프로브, 항체, 마커, 라벨, 태그, 핵산 또는 단백질 또는 이와 유사한 것들을 이용하여 본 발명의 간엽세포의 접목을 정량화할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
특정 구체예에서, 혈액뇌관문 투과제 없이 간엽세포만 투여되었을 때 관찰되는 접목의 양에 비교하여, 혈액뇌관문 투과제와 병용하여 유효량의 간엽세포를 투여하면 약 1.1배 내지 10배, 약 1.2배 내지 5배, 약1.25배 내지 2.5배, 또는 약 1.25배 내지 2-배로 간엽세포의 접목이 강화된다. 특정 구체예에서, 간엽세포 접목은 최소 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 5배, 10배, 또는 그 이상으로 강화된다. 특정 구체예에서, 접목은 손상된 CNS 조직 또는 손상된 CNS 조직 부근에서 일어난다.
I. 본 발명의 방법에서 이용되는 유전적으로 변형된 간엽세포
본 발명의 방법 및 조성물은 외생성 단백질 또는 분자를 발현시키는 간엽세포(예를 들면, 치료 목적 또는 포유류의 손상된 중추신경계 조직으로 통합, 분화 및 이동을 추적하는 방법을 위해)와 복합하여 혈액뇌관문 투과제의 투여를 위한 것이다. 따라서, 본 발명은 발현 벡터를 포함하는 간엽세포의 이용도 포함한다. 외생성 DNA를 동시에 발현시키는 간엽세포내로 외생성 DNA를 도입시키는 방법은 예를 들면, Sambrook et al. (2001 , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), 및 Ausubel et al. (2007, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)에서 설명된다.
세포내로 전이유전자를 도입시키는 수단은 공지되어 있다. 포유류 세포내로 핵산을 운반시키고 발현시키는 방법은 당업자에 공지된 것이다. 이와 같은 방법에는 예를 들면, 바이러스 벡터, 리포좀계 유전자 운반(WO 93/24640; Mannino Gould-Fogerite, BioTechniques, vol. 6(7):682-691 (1988); U.S. Pat. No. 5,279,833; WO 91/06309; Feigner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 84:7413-7414 (1987); and Budker, et al., Nature Biotechnology, vol. 14(6):760-764 (1996)) 등이 포함된다. 당업자에 공지된 기타 방법에는 전기천공(U.S. Pat. Nos. 5,545,130, 4,970,154, 5,098,843, 5,128,257), 직접적인 유전자 전달, 세포 융합, 침전법, 입자 투하 및 수용체 매개된 취입(U.S. Pat. Nos. 5,547,932, 5,525,503, 5,547,932, 5,460,831) 등이 포함된다. U.S. Pat. No. 5,399,346 참고.
광범위하게 이용되는 레트로바이러스 벡터에는 뮤린 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스(GaLV), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 이의 복합이 포함된다. 예를 들면, Buchscher, et al, J. Virol., vol. 66(5):2731- 2739 (1992); Johann, et al., J. Virol., vol. 66(5): 1635-1640 (1992); Sommerfelt, et al, Virol., vol. 176:58-59 (1990); Wilson, et al., J. Virol., vol. 63:2374-2378 (1989); Miller, et al., J. Virol., vol. 65:2220-2224 (1991 ); PCT/US94/05700, 그리고Rosenburg and Fauci, in Fundamental Immunology, Third Edition (Paul ed., 1993)) 참고.
AAV-계 벡터는 실험실내 핵산 및 폴리펩티드의 생산 및 생체내 및 생체외 유전자 치료법 과정에서 표적 핵산으로 세포를 형질도입하는데 이용될 수 있다. AAV 벡터에 대한 검토는 West, et al., Virology, vol. 160:38-47 (1987); U.S. Pat. No. 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy, vol. 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest., vol. 94:1351 (1994), and Samulski (supra) 참고. 재조합 AVV 벡터의 작제는 여러 공개자료에서 설명되고 있는데 예를 들면, Lebkowski, U.S. Pat. No. 5,173,414; Tratschin, et al, MoI. Cell. Biol., vol. 5(11 ):3251 -3260 (1985); Tratschin, et al, MoI. Cell. Biol. Vol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat and Muzyczka, Proc. Natl. Acad. ScL, USA, vol. 81 :6466- 6470 (1984); and Samulski, et al, J. Virol., vol. 63:03822-3828 (1989)이 포함된다.
유전적으로 변형된 간엽세포를 이용하는 유전자 요법은 신체내로 직접적인 유전자 전달에 몇 가지 독특한 장점을 제공한다. 우선, 간엽세포로 치료요법적인 전이 유전자의 첨가는 환자의 몸 밖에서 실시되어, 임상의가 중요한 측정의 제어를 가능하게 하는데, 그 이유는 전이유전자를 포함하고 충분한 양으로 치료제를 생산할 수 있는 간엽세포만을 선별하고, 이것으로만 작업을 하기 때문이다.
따라서, 본 발명의 방법은 분리된 핵산이 간엽세포내로 도입되고, 원하는 핵산에 의해 인코드된 단백질이 이로부터 발현되는 간엽세포를 투여하여 장점을 얻는데, 이때 기존의 세포에 존재하거나 발현되지 않은 세포부터 단백질이 발현되거나 또는 전이유전자가 도입되기 전과는 상이한 환경에서 또는 수준으로 발현된다. 이와 같은 장점은 치료요법적이며, 또는 장점에는 실험실에서 또는 세포가 거주하는 포유류에서 원하는 핵산의 발현이 실험실내에서 연구되는 시스템이 제공되며, 도입된 핵산을 포함하는 세포를 가지는 시스템은 연구, 진단 및 치료 도구로 이용될 수 있으며, 포유류에서 선택된 질병 상태를 위하여 새로운 진단 및 치료 도구 개발에 유용한 포유류 모델을 만드는 시스템이 제공된다는 사실이 포함될 수 있다.
원하는 분리된 핵산을 발현시키는 간엽세포 투여를 이용하여 분리된 핵산 산물을 또 다른 세포, 조직 또는 전체 포유류에 제공하며, 더 높은 수준의 유전자 산물은 비정상적인 발현 및/또는 활성과 연관된 질병, 장애 또는 상태를 치료 또는 경감시키는데 유용하다. 따라서, 본 발명은 원하는 분리된 핵산을 발현시키는 간엽세포의 투여를 고려하는데, 이때 원하는 단백질의 발현 증가, 단백질 수준의 증가 및/또는 활성의 증가는 CNS와 관련된 질병, 장애 또는 상태를 치료 또는 경감시키는데 유용할 것이다.
또한, 본 발명의 다양한 구체예는 유효량의 간엽세포 및 만니톨과 같은 혈액뇌관문 투과제의 비경구 투여에 의해 포유류의 손상된 CNS를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 유전적으로 변형된 간엽세포와 혈액뇌관문 투과제가 투여되지 않은 또는 간엽세포만 투여된 포유류의 동일하게 손상된 CNS와 비교하였을 때, 포유류의 손상된 CNS를 만니톨과 같은 혈액뇌관문 투과제와 다양한 CNS 생장인자, 신경영양성 인자들 및 사이토킨을 발현시키도록 유전적으로 조작된 간엽세포의 유효량으로 치료하면, 포유류에서 신경복원, 신경재생 및 기능 신경 회복이 더 강화될 것이다.
유전적으로 조작된 간엽세포를 이용하는 본 발명의 방법은 여기에서 설명된 것과 같은 중추신경계의 실질적인 임의 질환, 장애 또는 상태를 치료하는데 유용할 것으로 생각된다.
특정 구체예에서, 손상된 CNS 조직를 가진 포유류에 유효량의 간엽세포 및 혈액뇌관문 투과제를 투여하기 전에, 간엽세포는 영양성 인자, 생장 인자, 사이토킨, 뉴로트로핀 예를 들어, 신경 생장 인자, 아교세포 유도된 신경성장인자, 섬모 신경성장인자, 뇌 유도된 생장 인자, 혈소판 유도된 생장 인자, 섬유아세포 생장 인자, 및 맥관 내피 생장 인자와 같은 분자들을 생산하도록 유전적으로 조작되는데, 이들은 CNS에 이미 존재하는 세포들에게 유익하다.
예를 들면, 간엽세포는 손상된 CNS를 가진 포유류내로 도입되기 전에 배양되고 유전적으로 조작된다. 조작된 간엽세포는 변형된 BMSC의 강화된 접목을 실행하기 위하여 만니톨과 같은 혈액뇌관문 투과제와 함께 손상된 CNS를 가진 포유류로 투여된다. 유전적으로 변형된 간엽세포 및 혈액뇌관문 투과제가 투여되지 않은 포유류에서 동일하게 손상된 CNS와 비교하였을 때, 유전적으로 조작된 BMSC의 강화된 접목의 증가는 포유류에서 신경복원, 신경재생 및 기능 신경 회복을 더 강화시킬 것이다.
J. 본 발명의 세포계 조성물
본 발명은 신경복원, 기능 신경 회복, 간엽세포 접목을 강화시키는 조성물을 제공하며, 여기에서 설명된 것과 같이, 포유류의 손상된 중추신경계의 치료를 제공한다. 본 발명의 조성물은 유전적으로 변형된 또는 변형안된 유효량의 간엽세포와 혈액뇌관문 투과제를 포함한다. 특정 구체예에서, 간엽세포는 골수 간엽세포, 지방조직 유도된 간엽세포, 간 간엽세포, 또는 워튼 연육 간엽세포이다. 관련 구체예에서, 혈액뇌관문 투과제는 알킬글리세롤, RMP-7, 또는 만니톨이다. 당업자는 여기에서 설명되는 간엽세포 및 혈액뇌관문 투과제의 농도 범위가 본 발명의 조성물에 적합하다는 것을 인지할 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 유전적으로 변형된 또는 변형안된 간엽세포 유효량과 혈액뇌관문 투과제를 포함하고, 선택적으로 제약학적으로 수용가능한 캐리어, 첨가제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 간엽세포 및 혈액뇌관문 투과제를 포함하는 조성물은 멸균 염, 링거 용액, 한스 안정된 염 용액 (HBSS), 또는 이소라이트(lsolyte) S (pH 7.4)를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 임의의 조성물은 무혈청 세포 배지를 선택적으로 포함할 수 있다.
이제, 본 발명은 다음의 실시예를 통하여 더 상세하게 설명될 것이다. 그러나, 본 발명은 많은 다양한 형태로 구체화될 수 있고, 따라서 여기에서 제시되는 구체예로 한정시키는 것으로 해석해서는 안되며; 다만 이와 같은 구체예는 설명된 내용이 완전하고, 철저하여 당업자에게 본 발명의 범위를 충분히 전달할 수 있도록 제공된다.
실시예
실시예 1
만니톨의 사전투여는 뇌출혈(ICH) 모델의 랫트에서 hBMSC의 동맥내 운반을 개선시키고, 기능 신경 회복을 상당히 개선시켰다.
실험적 개요
사전 연구로부터, ICH (Seyfried et al., 2006) 마우스 모델에서 3 내지 8백만 hBMSC의 맥관내 주사는 기능 신경 회복을 상당히 개선시킨 것으로 나타났다. 그 다음, 우리는 대조군과 비교하였을 때, 혈액뇌관문 투과제, 본 경우에는 만니톨과 hBMSC의 공동 투여로 ICH이후 맥관내 MSC 운반 효과가 더 개선되었고(예, 만니톨 없이 투여된 3 내지 8백만 hBMSC와 동일한 치료 효과를 얻기 위하여 더 적은 수의 주사된 세포가 요구되었음), 기능 신경 결과가 개선되었다.
만니톨과 hBMSC의 공동 투여는 별도로 투여된 경우와 비교하거나 또는 인간 섬유아세포의 대조군 투여와 비교하였을 때, 실험적으로 유도된 ICH가 있는 다자란 수컷 위스타(Wistar) 랫트에서 기능 신경 결과가 상당히 개선되었다. 자가 혈액의 선조체내 주입으로 36마리 수컷 위스타(Wistar) 랫트에서 ICH가 유도되었다. 4개의 포스트-ICH 그룹 (N=9)이 있다: 그룹 1, 백만의 인간 섬유아세포를 동맥내 주입시킨 음성 대조군; 그룹 2, 만니톨의 정맥 주사; 그룹 3, 백만 hBMSC 세포의 동맥 주사; 그룹 4, 만니톨의 정맥 주사에 이어 백만의 hBMSC의 동맥 주사. 모든 동물들은 2주간 실험 기간동안 생존했으며, 신경 중증도 수치 및 코너 턴 테스트 수치를 이용하여 기능 결과를 측정하였다. 도 1에서는 만니톨 및 hBMSC 복합치료를 제공받은 랫트들만 코너 턴 및 NSS 테스트에서 상당한 개선을 나타내었다는 것을 보여주었다.
이 실험 결과에서 만니톨의 공동 투여는 더 낮은 용량으로 투여된 hBMSC의 효과를 증가시켰다는 것을 나타낸다. 이 요법은 미숙한 사망을 초래하지 않았으며, 실험적으로 유도된 ICH에 효과적인 치료였다. 이 연구는 ICH를 치료하기 위해 만니톨 및 hBMSC의 병용 요법제가 동맥으로 제공될 경우, 단독 요법보다 기능 신경 회복을 증가시키는데 더 효과적이었다는 것을 설명하였다.
재료 및 방법:
동물 및 시약. 다자란 수컷 위스타(Wistar) 랫트는 Jackson Laboratory에서 구입하였다. 모든 동물 연구는 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of Henry Ford Health System의 지침하에 실시되었다. 인간 골수 간엽세포 (hBMSC)는 Cognate Therapeutics (Sunnyville, CA)에서 제공받았다. 인간 1차 섬유아세포는 Theradigm (Baltimore, MD)에서 제공받았다. 만니톨은 Sigma (St. Louis, MO)에서 구입하였다.
정맥 출혈, 만니톨의 정맥내 주입 및 hBMSC의 동맥 주입의 동물 외과적 과정. 36마리의 수컷 위스타(Wistar) 랫트(체중 270 내지 320g)를 뇌출혈 연구를 위하여 이용하였다. 이미 설명된 바와 같이(Seyfried et al., 2006), 전신 마취하에 마우스에 정위 안정화(Stereotactic stabilization) 및 국소화(localization)가 이용되었다. 대퇴 정맥으로부터 수득한 자가 혈액 100 ㎕를 분당 10㎕의 일정한 주입 속도로 우측 선조체로 주사하여 ICH를 유도하였다(Seyfried et al., 2004). ICH후 24시간 시점에, 동물을 4가지 실험 그룹으로 나누었다. 그룹 1에게는 대조군으로써 인간 완충염(PBS)내 백만개의 인간 1차 섬유아세포를 동맥주사(내부 경동맥을 통하여)로 제공하였다. 그룹 2에게는 꼬리 정맥을 통하여 1.5g/kg PBS의 용량으로 만니톨을 정맥 주사하였다. 그룹 3에게는 백만개 hBMSC/PBS를 동맥 주사(내부 경동맥)하였다. 그룹 4는 만니톨을 1.5g/kg 용량으로 정맥 주사한 후 10분뒤 백만개 hBMSC/PBS를 동맥 주사하였다. 모든 처리는 ICH 유도후 24시간 시점에 투여되었다. 모든 랫트들에게 ICH 유도후 1일 시점에서 시작하여 14일간 100 mg/kg BrdU를 매일 복막 주사하였다.
기능 신경 테스트. 기능 신경 결과는 Seyfried et al, 2006에서 이미 설명된 것과 같이, 신경 중증도 수치 테스트(NSS) (Chen et al., 2001) 및 코너 턴 테스트(Zhang et al., 2002)에 의해 측정되었다,
통계학적 분석. 기능 수치의 통계학적 분석은 개별 시료의 Student's two-tailed t-test를 이용하여 실행되었다. 데이터는 평균±표준 오차로 나타내며, P 값이 <0.05 인 경우에 유의적인 것으로 간주되었다.
결과:
ICH 동물 모델에서 만니톨의 정맥 투여후 hBMSC의 동맥 주사되면 상당히 개선된 기능 신경 결과가 초래되었다. 다자란 수컷 위스타(Wistar) 랫트의 4 그룹은 재료 및 방법 부분에서 설명된 것과 같이 처리되었고, ICH후 1일, 7일 및 14일 시점에서 기능 신경 결과는 NSS 및 코너 턴 테스트에 의해 평가되었다. 모든 동물은 2주간 실험 기간동안 생존하였다. 도 1에서 볼 수 있는 것과 같이, ICH 유도후 1일 시점에서, 4가지 치료 부류 투여 직후 NSS 및 코터 턴 테스트에 의하면 4개의 군에서 외양적인 차이는 관찰되지 않았다. 실험적으로 ICH를 유도한 후 7일 시점에, NSS에 의해 측정된 기능 신경 결과는 만니톨 및 hBMSC 병용 요법 그룹에서만 통계학적으로 유의적인 개선을 보이기 시작하였다(도 1, 우측 패널, 그룹 4). 발작(ictus)후 두 번째 주가 끝날 시점에서, 인간 섬유아세포 요법 대조 그룹과 비교하였을 때, NSS 및 코너 테스트(P < 0.05)평가에서, 만니톨 및 hBMSC 병용 요법 그룹은 상당히 개선된 기능 신경 결과를 보였다(도 1, 그룹 1과 4의 비교). 개별적인 만니톨 및 hBMSC 요법 군은 개선 경향이 있기는 하나 임의의 통계학적으로 유의적인 신경 개선은 보이지 않았다(도 1, 그룹 2와 3).
정맥으로 만니톨 주사후 낮은 용량의 hBMSC를 동맥으로 투여하는 병용 요법은 발작후 7일 시점과 같이 초기에 랫트 ICH 모델에서 안전하고 효과적인 치료라는 것이 증명되었다. 치료요법적 처리에 의해 미숙한 죽음이 초래되지 않았으며, 만니톨이 hBMSC보다 선행된 경우에만 상당한 기능적 잇점이 있었다. NSS 및 코터 턴 테스트에 의해 측정되었을 때, BMSC전에 만니톨이 투여됨으로써 기존에 설명된 것(Seyfried et al., 2006)보다 훨씬 적은 양의 BMSC를 이용하여도 기능 신경 결과에서 상당한 개선이 있었다.
뇌 허혈 모델에서 동맥으로 hBMSC의 동맥내 투여로 구성된 요법이 효과적이었지만, 고유의 혈액 덩어리 병리생리학의 상이한 특징으로 인하여 ICH 모델에서 만니톨의 장점은 더욱 명백하다. 실질(parenchymal) 혈종은 급성 질량 효과(acute mass effect)를 만들고, 주변 작은 혈관을 압박하고, 혈관성 혈액 붕괴 산물을 분비한다; 만니톨은 세포의 운반을 개선시키면서 이와 같은 효과를 중화시킬 수 있다(Boulard et al., 2003). 이와 같은 결과는 제기능을 하지 못하는 맥관 구조를 표적으로 하는 요법에서 또는 부종이 주어진 요법의 효과를 제한시키는 상황에서 중요한 지류를 가지며, 이때 더 많은 양의 BMSC와 연관된 동일한 장점을 얻기 위하여 만니톨과 더 적은 양의 BMSC를 투여하여도 유리할 수 있다.

실시예 2
ICH 랫트 모델에서 hBMSC 단독으로 치료한 것과 비교하여, 만니톨과 hBMSC로 치료하면 조직 손실이 상당히 감소되었다.
실험적 개요:
이 실험은 만니톨과 hBMSC를 공동 투여하면 랫트 ICH 모델에서 뇌 조직 손실 정도가 통계학적으로 유의적 감소를 결과할 것이라는 가설을 테스트하였다. 발작후 14일 시점에 실시예 1에서 사용된 다자란 수컷 위스타(Wistar) 랫트로부터 파라핀 뇌 절편을 준비하였다. 각 랫트의 뇌로부터 6개 단편을 헤마톡실린과 에오신(H & E)으로 착색시켰고, 전체 세포 수를 카운터하였다. 기타 처리 그룹과 비교하였을 때, 만니톨 및 hBMSC 복합치료 그룹에서 처리안된 반대축 반구체의 비율로 동축(ipsilateral) 선조체 조직 손실 비율은 상당히 감소되었다(도 2).
이들 실험 결과로부터 만니톨 및 hBMSC의 병용 요법은 ICH 랫트 모델에서 기능 신경 결과를 개선시킬 뿐만 아니라, 조직 손실을 상당히 감소시켰다는 것이 설명된다. 또한, 병용 요법 그룹에서만 ICH후 뇌 조직 손실의 상당한 감소가 설명되었다(도 2, 그룹 4).
재료 및 방법:
조직학 및 면역 조직 화학. 수술 후 14일 시점에서, 동물들은 마취시키고, 인산염 완충된 염에 4% 파라포름알데히드를 심장으로 관류시켰다. 뇌 조직을 절제하여, 포르말린에 고정시키고, 2mm 두께로 잘게 자른다. 단편들을 파라핀에 묻고, 총 6개 단편에 대해 각각 랫트 뇌의 봉합점 +0.1mm 내지 -0.86mm 사이에 6㎛ 두께로 잘라낸 매 40번째 두정(coronal) 단편은 H & E 착색 및 면역화학 착색에 이용되었다. 반대축 선조체와 비교하여 선조체 조직 손실 비율은 영상 분석 시스템(Data Translation, Marlboro, MA)을 이용하여 계산되었다.
통계학적 분석. 독립적인 Student t-test를 이용하여 ICH-관련 조직 손상 부위의 통계학적 분석이 실시되었다. 데이터는 평균±표준 오차로 나타내었으며, P 값 <0.05 인 경우, 유의적인 것으로 간주되었다.
결과:
ICH 영향을 받은 부위에서 치료 그룹중 뇌 조직 손실 정도를 검사하기 위하여, 실시예 1의 실험에서 사용된 36마리 다자란 수컷 위스타(Wistar) 랫트들이 추가 분석되었다. 다른 세 가지 그룹에서 조직 손실 비율에 기준하여 만니톨 및 hBMSC 병용 요법을 제공받은 랫트에서 조직 손실 비율이 눈에 띄게 감소되었다.
정상적인 반구에서 선조체 조직 손실과 관련하여 동축 선조체 조직 손실 비율이 계산되었다. 출혈 있는 측면상에 선조체 조직의 손실 비율은 다음과 같이 도 2에 제공된다: 인간 섬유아세포 = 32.4±2.8%; 백만 hBMSC 단독 = 24±3.4% (P>0.05); 만니톨 단독 = 25.9±1.75% (P>0.05); 및 만니톨과 hBMSC = 21±3.2% (P<0.01). 따라서, 대조군과 비교하였을 때, 복합 그룹에서 선조체 조직 손실 비율이 상당히 감소되었다. 만니톨 또는 hBMSC만을 단독으로 투여하였을 때에도 개선된 경향이 관찰되기는 하지만, 이와 같은 경향은 통계학적으로 유의적이지 않았다.
이 실험에서, 만니톨에 이어, hBMSC를 동맥내로 투여하는 병용 요법은 뇌연화 또는 조직 손실 양을 상당히 감소시키는 것으로 설명되었다. 이와 같은 감소된 조직 손실은 만니톨과 hBMSC가 동물에 제공되는 경우에만 의미가 있으며, hBMSC 단독을 동맥내 제공받은 동물에서는 의미가 없었다. 이와 같은 결과는 신경 허혈 모델에서 조직 손실 감소에 만니톨과 hBMSC의 병용 요법의 추가적인 양성 효과를 강조하였다.
실시예 3
만니톨 및 hBMSC 복합 치료 그룹에서 ICH를 가진 랫트 뇌 병소주변(perilesional) 단편들의 면역착색에서 신경 복원이 강화되었음이 나타났다.
실험적 개요:
이 실험은 ICH 랫트 모델에서 만니톨 및 hBMSC의 공동 투여에 의해 뇌 조직 손실 정도가 통계학적으로 유의적으로 감소된다는 가설을 테스트하였다. 발작 14일 후에, 실시예 1에서 사용된 다자란 수컷 위스타(Wistar) 랫트들로부터 파라핀 뇌 단편들을 준비하였다. 각 랫트의 뇌로부터 6개 단편들은 하기에서 설명되는 것과 같이, 신경 복원 지표인 항체에 하이브리드되었다.
이들 실험 결과는 만니톨 및 hBMSC의 병용 요법은 랫트 동축 선조체에서 hBMSC의 접목을 강화시켰으며(mAB 1281 착색의 증가로 증명됨), 신경복원을 증가시켰다(BrdU, 시넵토피신, 더블코르틴, 및 뉴우런 β- 투블린 이소타입 III에 대한 착색의 증가로 증명됨)는 것이 설명되었다.
재료 및 방법
시약. 5'-브로모-2' 데옥시우리딘(BrdU)은 Sigma (St. Louis, MO)에서 구입하였다. 다음의 1차 항체들이 이용되었다: BrdU (1:100 Dako, Carpenteria, CA.); 시넵토피신 (1:1 ,000 mAb, Clone SY 38; Chemicon. Temecula.CA); 더블코르틴 (DCX) (1 :50; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 뉴우런 β-투블린 이소타입 III (TUJ1) (1:5,000 mAb; Covance, Berkeley, CA) 및 항-Nuclei(1:500;모든 인간 세포 타입에 특이적; Chemicon. Temecula.CA)에 대한 단클론 항체.
조직학 및 면역조직화학. 수술 후 14일 시점에서, 동물들은 마취시키고, 인산염 완충된 염에 4% 파라포름알데히드를 심장으로 관류시켰다. 뇌 조직을 절제하여, 포르말린에 고정시키고, 2mm 두께로 잘게 자른다. 단편들을 파라핀에 묻고, 총 6개 단편에 대해 각각 랫트 뇌의 봉합점 +0.1mm 내지 -0.86mm 사이에 6㎛ 두께로 잘라낸 매 40번째 두정(coronal) 단편은 H & E 착색 및 면역화학 착색에 이용되었다. 단편들은 5% 정상 염소 혈청, 1 % BSA 및 0.05% Tween-20이 포함된 트리스-완충된 염에서 봉쇄(block)되었다. 그 다음 단편들은 BrdU (증식 세포용 마커), TUJ1 (미숙 뉴우런의 마커), DCX (신경모세포 이동의 마커, Feng et al, 2001) 및 mAb 1281 (인간 핵에 특이적인 마커, Mahmood et al, 2003)의 국소화를 위한 1차 항체와 항온처리되었다. 모든 면역착색은 1차 항체를 사용 하지 않은 두가지 음성 대조군과 면역 착색 과정의 양질 대조군을 위하여 사전-면역 혈청의 사용과 함께 동시에 실행되었다. 시넵토피신, TUJ1 및 DCX의 반정량적 측정을 위하여, 동일한 블록으로부터 상이한 수준의 6개 슬라이드 시리즈가 이용되었다. 시넵토피신은 선조체 부위에서 측정되었다. TUJ 1 및 DCX는 뇌실하조직에서 측정되었다. 시넵토피신, TUJ1 및 DCX는 2Ox 대물렌즈(Olympus BX40; Olympus Optical Co, Tokyo, Japan) 아래에서, MCID 영상 분석 시스템(Imaging Research, Inc, St. Catharines, ON, Canada)과 인터페이스로 접속된 3-CCD 컬러 비디오 카메라(model DXC-970MD; Sony Corp, Tokyo, Japan)를 이용하여 계수화되었다. 시넵토피신, TUJ1 및 DCX의 경우, 데이터는 필드(628×480 μm²)에 있는 전체 부위를 각 필드에서 면역 포지티브 부위로 나눈 비율로 나타내었다(Chen et al. , 2003). BrdU-포지티브 세포의 수는 병소 주변 경계에서 카운트되었다. MAB1281 정량적 데이터는 각 슬라이드의 병소 주변 경계내 MAB1281 면역 반응성 세포 수로 나타내었다. 미숙 뉴우런 및 뉴우런 이동의 증가를 나타내기 위하여 면역조직화학 분석 및 동축 조직 손실 비율도 또한 실행되었다.
통계학적 분석. 독립 스튜던트(Student) t-테스트를 이용하여 기능 수치, ICH-관련된 조직 손상 부위 및 조직화학적 결과의 통계학적 분석이 모두 실행되었다. 데이터는 평균±표준 오차로 나타내었으며, P 값 <0.05 인 경우, 유의적인 것으로 간주되었다.
결과:
실시예 1과 2의 실험에 사용된 36마리 다자란 수컷 위스타(Wistar) 랫트로부터 뇌 단편들을 BrdU, mAb 1281에 대해, 시넵토피신, TUJI 및 DCX 유전자의 발현을 위해 면역조직화학적으로 착색되었다.
도 3A에서 볼 수 있는 것과 같이, mAb 1281를 이용한 면역조직화학에서, hBMSC 그룹의 것보다(157±21), 복합 그룹의 손상된 부위에서 포지티브-착색 세포가 실질적으로 더 많은 것(216±16, P<0.05)은, 만니톨이 손상된 부위로 hBMSC의 이동을 효과적으로 증가시켰다는 것을 말한다. mAb 1281 면역착색에 근거하면, 만니톨 처리만을 받은 경우와 비교하였을 때, 복합 치료 그룹에서 손상된 부위로 모인 hBMSC의 수가 상당히 증가되었다.
BrdU에 대한 면역 착색에서, 대조군과 비교하였을 때, 만니톨 및 hBMSC 복합치료 그룹의 손상된 부위 주변 경계 지역에서 BrdU 포지티브 착색 세포가 상당히 더 많았다(P<0.05)는 것이 설명되었다(도 3B). BrdU 포지티브 세포 수의 이와 같은 증가는 만니톨 및 hBMSC가 세포 증식과 손상된 부위로 세포의 이동을 공조적으로 촉진시켰다는 것을 말한다. 한 가지 흥미로운 관찰은 단독의 만니톨은 손상 부위(P<0.05) 주변에서 BrdU 라벨링을 상당히 증가시켰는데, 이는 만니톨 자체에 DNA 복제를 개시하는 미토겐 활성이 포함될 수 있다는 것이다.
대조군과 비교하였을 때, 만니톨 및 hBMSC 병용 요법 그룹의 면역조직화학적 착색에서 ICH 영향을 받은 부위내에서 시넵토피신, TUJ1, DCX 발현이 상당히 증가되었다(P<0.05)(도 3, 패널 C, D, E). 시넵토피신 발현의 증가는 시냅스형성의 증가를 나타낸다. TUJ1 발현의 증가는 미숙 뉴우런 증식 증가와 일치하며, DCX 발현의 증가는 뉴우런 이동에서 증가를 의미한다. 임의의 새로운 미숙 뉴우런이 형성되는지를 탐지하기 위하여, BrdU 및 TUJ1으로 공동-면역 착색이 실행되었다. 도 3F에서 설명된 것과 같이, BrdU 및 TUJ1에 대한 이중 착색에서 여전히 분할하면서 뉴우런 마커를 발현시키는 하위 세포 집단이 나타났는데, 이는 복합 치료 그룹에서 회복 단계동안 미숙 뉴우런이 새로 형성되었다는 것을 나타낸다.
이 실험에서 만니톨에 이어 hBMSC를 동맥내로 투여하는 병용 요법은 만니톨 주입에 의해 손상된 부위로 도달하는 hBMSC의 수가 상당히 증가되었다는 것이 증명되었으며, 미소맥관을 통하여 운반이 개선되었거나 및/또는 혈액뇌관문 침투가 더 나아졌다는 것을 나타내었다. 또한, 대조군과 비교하여 ICH 부위에서 BrdU 포지티브 세포 존재가 증가되었기 때문에, ICH 후에 신경복원 과정에서 만니톨이 효과적으로 도움이 되었다는 것을 나타내었다. 만니톨 또는 hBMSC 단독으로 치료하였을 때, 기능 신경 결과의 통계학적으로 유의적인 개선은 없었지만, 만니톨 단독 또는 낮은 용량의 hBMSC 만으로 치료하였을 때 손상된 부위에서 세포 증식이 상당히 유도되었다. 이는 hBMSC 및 만니톨을 이용한 병용 요법이 실제 공조적(synergistic)이며, ICH 모델에서 상당한 기능 신경 회복을 가져왔다는 것을 나타낸다.
MSC의 동맥내 주입의 유익한 효과는 만니톨의 정맥내 주입으로 확대되었다. 5'-브로모-2' 데옥시우리딘 결합으로 세포 수의 증가와, 뉴우런 마커에 대한 항체로 착색된 미숙 세포의 수가 증가로 이어졌다. 만니톨의 사전 투여는 ICH 부위에 위치한 hBMSC의 수를 상당히 증가시켰고, 신경 재생 및 신경 복원의 조직화학적 변수가 개선되었으며, ICH의 해부학적 및 신경병리학적 결과가 감소되었다. 이 연구에서는 또한 ICH를 치료하기 위하여 이들 단독 치료제가 동맥으로 제공되었을 때보다 만니톨 및 hBMSC의 복합 투여가 더 효과적이라는 것을 보여주었다.
더욱이, 이 연구에서는 여기에서 설명된 본 발명의 조성물을 이용할 경우 통상적인 급성 관리 요법의 정상 기간을 훨씬 넘어 중추신경계의 손상을 치료하는 것이 가능하다는 것을 보여주었고, 손상된 중추신경계 조직의 재건에 매우 효과적이라는 것을 보여주었다.
상기 언급된 U.S. 특허, U.S. 특허 출원 공개, U.S. 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 본 명세서에서 언급된 및/또는 열거된 비-특허 공개는 모두 전문을 참고 문헌으로 첨부된다. 전술한 내용으로부터, 본 발명의 특정 구체예는 설명을 목적으로 제시되었지만, 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않고도 다양한 변형등이 있을 수 있다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위를 제외하고 이에 제한되지 않는다.

Claims

유효량의 기질 세포 및 뇌혈관장벽(blood-brain barrier, BBB) 투과제를 비경구적으로 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 중추신경계 (CNS) 손상을 갖는 포유동물의 손상된 중추신경계 조직에서 신경회복(neurorestoration)을 향상시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 기질 세포가 골수 기질 세포, 지방 조직-유래 기질 세포, 간 기질 세포, 및 와튼 제대교질(Wharton's jelly) 기질 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제2항에 있어서, 상기 기질 세포가 골수 기질 세포인 방법.
제1항에 있어서, 상기 BBB 투과제가 알킬글리세롤(alkylglyerol), RMP-7, 및 만니톨로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제4항에 있어서, 상기 BBB 투과제가 만니톨인 방법.
제1항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 혈관내로 투여되는 방법.
제6항에 있어서, 상기 기질 세포가 동맥내로 투여되고, 상기 BBB 투과제가 정맥내로 투여되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 BBB 투과제가 기질 세포의 투여 이전 또는 거의 동시에 투여되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 투여되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 약 2시간부터 투여되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 약 12시간부터 투여되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 약 1주일부터 투여되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 약 1주일 내지 약 1개월부터 투여되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
제1항에 있어서, 상기 중추신경계 손상이 뇌졸중(stroke), 외상성 뇌손상(traumatic brain injury), 척수 손상(spinal cord injury), 저산소증-허혈(hypoxia-ischemia), 발작(seizure), 감염, 및 중독(poisoning)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제15항에 있어서, 상기 중추신경계 손상이 허혈 또는 출혈성 뇌졸중인 방법.
제1항에 있어서, 상기 중추신경계 손상이 테이삭스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병(Sandhoff's disease), 후를러증후군(Hurler's syndrome), 크라베병(Krabbe's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증(amyotropic lateral sclerosis) (ALS), 헌팅턴병(Huntington's disease), 간질(epilepsy), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 척수성 근위축증(spinal muscle atrophy) (SMA), 프리드리히 실조증(Friedreich's ataxia), 다운증후군, 베르니케 코르사코프 증후군(Wernicke-Korsakoff syndrome), 및 크로이츠펠트 야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중추신경계의 질병, 질환, 또는 상태로부터 야기되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제의 투여 이후, 손상된 중추신경계 조직이 기질 세포 및 BBB 투과제를 투여하지 않은 포유동물에서 동일하게 손상된 중추신경계 조직과 비교하여 볼 때, 시냅토피신(synaptophysin), 신경 클래스 III β-튜불린(neuronal class III β-tubulin) (TUJ1), 및 더블코르틴(doublecortin) (DCX1)의 발현이 증가된 방법.
기질 세포 및 뇌혈관장벽 (BBB) 투과제를 비경구적으로 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 중추신경계 손상을 갖는 포유동물의 인지 및/또는 운동 기능적 신경 회복을 향상시키는 방법.
제19항에 있어서, 기질 세포 및 BBB 투과제 투여 이후, 포유동물의 인지 및/또는 운동 기능적 신경 회복이 기질 세포 및 BBB 투과제를 투여하지 않은 동일하게 손상된 포유동물의 인지 및/또는 운동 기능적 신경 회복에 비해 더 큰 방법.
제19항에 있어서, 상기 기질 세포가 골수 기질 세포, 지방 조직-유래 기질 세포, 간 기질 세포, 및 와튼 제대교질 기질 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제19항에 있어서, 상기 BBB 투과제가 알킬글리세롤, RMP-7, 및 만니톨로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제19항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 혈관내로 투여되는 방법.
제23항에 있어서, 상기 기질 세포가 동맥내로 투여되고, 상기 BBB 투과제가 정맥내로 투여되는 방법.
제19항에 있어서, 상기 BBB 투과제가 기질 세포 투여 이전 또는 거의 동시에 투여되는 방법.
제19항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 투여되는 방법.
제19항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 약 2시간부터 투여되는 방법.
제19항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 약 12시간부터 투여되는 방법.
제19항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 약 1주일부터 투여되는 방법.
제19항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 약 1주 내지 약 1개월부터 투여되는 방법.
제19항에 있어서, 상기 중추신경계 손상이 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 및 척수 손상으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제31항에 있어서, 상기 중추신경계 손상이 허혈 또는 출혈성 뇌졸중인 방법.
유효량의 기질 세포 및 BBB 투과제를 비경구적으로 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 중추신경계 손상을 갖는 포유동물의 손상된 중추신경계 조직에 기질 세포의 생착(engraftment)을 향상시키는 방법.
제33항에 있어서, 기질 세포 및 BBB 투과제의 투여 이후, 손상된 중추신경계 조직에 생착된 기질 세포의 수가 기질 세포 및 BBB 투과제를 투여하지 않은 포유동물의 동일하게 손상된 중추신경계 조직에 생착된 기질 세포의 수에 비해 더 큰 방법.
제33항에 있어서, 상기 기질 세포가 골수 기질 세포, 지방 조직-유래 기질 세포, 간 기질 세포, 및 와튼 제대교질 기질 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제33항에 있어서, 상기 BBB 투과제가 알킬글리세롤, RMP-7, 및 만니톨로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제33항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 혈관내로 투여되는 방법.
제37항에 있어서, 상기 기질 세포가 동맥내로 투여되고, 상기 BBB 투과제가 정맥내로 투여되는 방법.
제33에 있어서, 상기 BBB 투과제가 기질 세포의 투여 이전 또는 거의 동시에 투여되는 방법.
제33항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 투여되는 방법.
제33항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 약 2시간부터 투여되는 방법.
제33항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 약 12시간부터 투여되는 방법.
제33항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 약 1주일부터 투여되는 방법.
제33항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 약 1주일 내지 약 1개월부터 투여되는 방법.
제33항에 있어서, 상기 중추신경계 손상이 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 척수 손상, 저산소증-허혈, 발작, 감염, 및 중독으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제45항에 있어서, 상기 중추신경계 손상이 허혈 또는 출혈성 뇌졸중인 방법.
유효량의 기질 세포 및 뇌혈관장벽 투과제를 비경구적으로 투여하는 것을 포함하는, 중추신경계 손상을 갖는 포유동물의 손상된 중추신경계 조직을 치료하는 방법.
제47항에 있어서, 상기 기질 세포가 유전학적으로 변형된 방법.
제48항에 있어서, 상기 기질 세포가 신경성장인자, 신경교(glial) 유래 신경영양인자, 섬모체(ciliary) 신경영양인자, 뇌 유래 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 및 혈관내피세포 성장인자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성장인자의 발현을 증가시키기 위해 유전학적으로 변형된 방법.
제48항에 있어서, 상기 기질 세포가 골수 기질 세포, 지방 조직-유래 기질 세포, 간 기질 세포, 및 와튼 제대교질 기질 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제48항에 있어서, 상기 BBB 투과제가 알킬글리세롤, RMP-7, 및 만니톨로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제48항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 혈관내로 투여되는 방법.
제48항에 있어서, 상기 뇌혈관장벽 투과제가 기질 세포의 투여 이전 또는 거의 동시에 투여되는 방법.
제48항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 투여되는 방법.
제48항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 약 2시간부터 투여되는 방법.
제48항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 약 12시간부터 투여되는 방법.
제48항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 약 1주일부터 투여되는 방법.
제48항에 있어서, 상기 기질 세포 및 BBB 투과제가 중추신경계 손상 후 약 1주일 내지 약 1개월부터 투여되는 방법.
제48항에 있어서, 상기 중추신경계 손상이 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 척수 손상, 저산소증-허혈, 발작, 감염, 및 중독으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제59항에 있어서, 상기 중추신경계 손상이 허혈 또는 출혈성 뇌졸중인 방법.
제48항에 있어서, 상기 중추신경계 손상이 테이삭스병, 샌드호프병, 후를러증후군, 크라베병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 헌팅턴병, 간질, 다발성 경화증, 척수성 근위축증 (SMA), 프리드리히 실조증, 다운증후군, 베르니케 코르사코프 증후군, 및 크로이츠펠트 야콥병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중추신경계의 질병, 질환, 또는 상태로부터 야기되는 방법.
유효량의 기질 세포 및 BBB 투과제를 포함하는 조성물.
제62항에 있어서, 상기 기질 세포가 유전학적으로 변형된 조성물.
제63항에 있어서, 상기 기질 세포가 신경성장인자, 신경교(glial) 유래 신경영양인자, 섬모체(ciliary) 신경영양인자, 뇌 유래 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 및 혈관내피세포 성장인자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성장인자의 발현을 증가시키기 위해 유전학적으로 변형된 방법.