KR102146226B1 - 피토세라마이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경계 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
피토세라마이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경계 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 피토세라마이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경계 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 피토세라마이드를 유효 성분으로 이용 시, 신경학적인 임상증상 척도 개선, 척수의 탈수초화 억제, 척수의 면역세포의 침윤 억제 및 염증성 반응 감소 유도, 혈액뇌장벽(blood-brain barrier, BBB) 투과성 안정화, T 세포의 침윤 및 Th1과 Th17세포 활성도 감소, 염증성 신호기전(MAPKs 및 NF-κB pathway) 억제 효과가 있는 바, 이는 면역 조절 효과가 우수하여, 신경계 자가면역질환에 대한 예방 및 치료용으로 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 피토세라마이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경계 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
면역(immunity)은 생체 조직으로 침입하거나 주입되는 모든 외부 고분자물질에 대한 생체의 자기보호체계의 하나이다. 면역체계의 주요한 구성성분으로 림프구(lymphocytes)가 있는데, 이는 골수(bone marrow)에서 만들어져서 혈액을 따라 림프 조직이나 기관, 주로 림프절(lymph node), 비장(spleen), 편도(tonsil) 등으로 순환하는 백혈구다. B 세포는 적절한 항원에 의해 자극되면 빠르게 증식하여, 그 항원을 중화시킬 특별한 항체(immunoglobulin, 면역글로불린)를 만들어내는 클론(clone)을 형성한다. B세포가 생성하는 항체는 체액에서 순환하면서 체액성면역을 수행한다. T 세포는 흉선(thymus)에서 만들어져 림프 조직으로 이동하는데, 항원을 직접 공격하는 세포매개성면역을 담당한다.
모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원 물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 많은 비자기(non-self) 항원에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것이다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 한다. 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하면서 자가면역질환(autoimmune disease)이 생긴다.
자가면역질환은 숙주의 면역 반응이 외래 항원을 자가 분자(자가 항원)와 구별하는데 실패하여 비정상적인 면역반응을 유도할 때 초래된다. 자가면역 질병에서 자가 분자에 대한 면역 반응은 자가-내성의 정상적인 상태를 벗어나게 하는데, 이는 자가항원에 대해 반응할 수 있는 T 세포 및 B 세포의 파괴를 수반하며 살아있는 동안 면역계의 발육에 조기에 발생하는 사건에 의해 예방되어 왔다. 프로세싱된 펩티드를 T 세포에 결합시키고 제시하는 능력을 통해 면역 반응의 조절에서 중추적인 역할을 하는 세포표면단백질이 주조직적합복합체(major histocompatibility complex, MHC)분자이다. MHC는 두 개의 형태는 클래스Ⅰ또는 클래스Ⅱ로 존재하며, 둘 모두는 단일 유전자 복합체내에서 엔코딩(encoding)된다. 자가면역질환은 MHC 클래스Ⅰ또는 클래스Ⅱ 유전자의 특정 대립유전자와 현저한 유전적 관련성을 갖는다.
자가면역질환의 치료는 자기 세포에 대한 이상 반응으로 나타나는 질병이므로 주로 자기면역 기능을 억제하는 약물이 사용되고 있다. 그러나 부작용이 많아 지속적으로 사용하기 곤란하고 재발을 충분히 막지 못하여 치료에 한계가 있다. 여러 가지 면역요법들이 있으나, 아직 확실한 치료효능을 보이는 방법으로 인정된 사례는 없다. 사람 자가면역질환의 다양한 동물모델이 존재하는데, 이들은 가능 치료법을 실험하는데 사용되고 있다.
다발성 경화증(multiple sclerosis, MS)은 뇌(brain) 및 척수(spinal cord)의 수초(myelin sheath)가 탈락하는 탈수초성 질환(demyelinating disease)이다. 수초란 신경세포의 축삭(axon)을 둘러싸고 있는 절연물질로 수초가 벗겨져 탈락될 경우 신경신호의 전도에 이상이 생기게 된다. 주로 20~40세의 젊은 연령층에서 발생하고 재발과 완화(relapsing and remitting)를 반복하며 재발이 반복될수록 증상이 완전히 호전되지 않고 장애가 남는다[(F.D. Lublin, S.C. Reingold, Neurology 46(4) (1996) 907-11), (J. Goverman, Nat Rev Immunol 9(6) (2009) 393-407)]. 현재 전 세계 약 230만 명의 환자가 이 질환을 앓고 있지만, 발병기전이 명확하지 않은 자가면역질환이기 때문에 발병 시 증상을 완화시켜주는 치료제를 처방 받으며 고통 받고 있다. 다발성 경화증은 자가면역체계의 이상에 의해 뇌실 주위의 백색질(white matter) 및 척수 등에 T세포 같은 림프구(lymphocyte) 및 대식세포(macrophage)가 침투하고, 이 면역 세포들이 수초를 이루는 세포인 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)와 관련된 수초염기성단백질(myelin basic protein, MBP), 희소돌기아교세포 당단백질(myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG)을 파괴시켜 뇌 및 척수의 탈수초화(demyelination)가 진행되게 된다[J. Patel, R. Balabanov, Int J Mol Sci 13(8), (2012), 10647-59].
다발성경화증은 완화와 증세 회복 이후에 악화 등과 같은 다양한 징후와 증상에 의해서 특징지어지며, 가장 일반적인 유형은 재발완화반복성 다발성경화증(relapsing-remitting MS)이다. 계속 진행되면 신경계의 손상이 축적되고 회복은 더뎌지게 되면서 만성 퇴행성 질환과 같은 양상으로 지속적으로 악화되는데 이것을 이차진행성 다발성경화증(secondary progressive MS)이라고 한다. 발병 후 처음부터 뚜렷한 재발 없이 점진적으로 진행하는 경우는 일차진행성 다발성경화증(primary progressive MS)라고 한다.
다발성경화증환자의 생존율을 개선하기 위해서 많은 실험적인 치료법이 개발되었다. Glatiramer acetate나 mitoxantrone 같은 다발성경화증의 치료제가 알려져 있으며, 이러한 약제는 면역학적인 조절을 목표로 한다. 몇몇의 승인된 다발성경화증의 치료법이 존재함에도 불구하고 많은 환자들은 이러한 약제에 적절하게 반응하지 않으므로 다발성경화증을 위한 더욱 효과적인 치료를 위한 프로토콜이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 피토세라마이드(Phytoceramide) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 이용 시, 탈수초 억제 및 신경보호 효과, 척수의 면역세포의 침윤 억제 및 염증성 반응 감소 유도, 혈액뇌장벽(blood-brain barrier, BBB) 투과성 안정화, T 세포의 침윤 및 Th1과 Th17세포 활성도 감소 효과, 염증성 신호기전(MAPKs 및 NF-κB pathway) 억제 효과가 우수하여 면역반응을 조절하는 바, 신경계 질환, 특히 신경계 자가면역질환의 예방 및 치료에 효과적임을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 피토세라마이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경계 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 피토세라마이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경계 자가면역질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공할 수 있다.
상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 피토세라마이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경계 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 피토세라마이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경계 자가면역질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 피토세라마이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 이용 시, 신경학적인 임상증상 척도 개선, 척수의 탈수초화 억제, 척수의 면역세포의 침윤 억제 및 염증성 반응 감소 유도, 혈액뇌장벽(blood-brain barrier, BBB) 투과성 안정화, T 세포의 침윤 및 Th1과 Th17세포 활성도 감소, 염증성 신호기전(MAPKs 및 NF-κB pathway) 억제 효과가 있는 바, 이는 면역 조절 효과가 우수하여, 신경계 자가면역질환에 대한 예방 및 치료용으로 이용할 수 있다.
도 1은 다발성경화증 동물모델(EAE)이 유도된 동물 모델에서 행동학적인 검사를 통한 피토세라마이드의 신경 보호 효과를 확인한 도이다.
A: 행동학적 발병 정도
B: A의 정량적 그래프
도 2은 다발성경화증 동물모델(EAE)이 유도된 동물 모델의 척수에서 조직병리학적 검사를 통한 탈수초화의 정도를 확인한 도이다.
A: LFB염색
B: MBP에 대한 웨스턴블롯 분석 및 정량화
도 3은 다발성경화증 동물모델(EAE)의 척수에서 조직병리학적 및 면역조직학적 검사를 통한 면역세포의 침윤 정도를 확인한 도이다.
A: H&E염색(위)과 Iba-1(아래)에 대한 면역조직화학적 염색
B: CD11b의 웨스턴블롯 분석 및 정량화
도 4는 다발성경화증 동물모델(EAE)의 척수에서 RT-PCR 분석을 시행하여 염증매개인자의 활성도를 검사하고 정량화를 한 결과를 나타낸 도이다.
A: RT-PCR 분석의 밴드
B-I: RT-PCR 분석의 밴드의 정량화
B, MCP-1; C, MIP-1α; D, RANTES; E, IL-1β; F, IL-6; G, TNF-α; H, COX-2; I, iNOS
도 5는 다발성경화증 동물모델(EAE)의 척수에서 혈액뇌장벽의 변화를 조사하고 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
A: GFAP의 면역조직화학적 염색
B: GRAP 및 PECAM-1(혈액뇌장벽의 마커)에 대한 웨스턴블롯 분석과 정량적 그래프
도 6는 다발성경화증 동물모델(EAE)의 척수에서 RT-PCR 분석을 시행하여 T세포의 활성도 검사하고 정량화를 한 결과를 나타낸 도이다.
A: CD3 (T 세포의 마커)
B: IL-2 (Th1 세포의 마커)
C: IFN-γ (Th1 세포의 마커)
D: IL-17 (Th17 세포의 마커)
도 7은 다발성경화증 동물모델(EAE)의 척수에서 웨스턴 블롯 분석을 시행하여 염증반응의 신호기전의 활성도를 검사하고 정량화를 한 결과를 나타낸 도이다.
A: 웨스턴 블롯 분석의 밴드
B-I: 웨스턴 블롯 분석 밴드(A)의 정량화
B, p-ERK; C, p-JNK; D, Rp-p38; E, p-NF-kB; F, p-IkB
A: 행동학적 발병 정도
B: A의 정량적 그래프
도 2은 다발성경화증 동물모델(EAE)이 유도된 동물 모델의 척수에서 조직병리학적 검사를 통한 탈수초화의 정도를 확인한 도이다.
A: LFB염색
B: MBP에 대한 웨스턴블롯 분석 및 정량화
도 3은 다발성경화증 동물모델(EAE)의 척수에서 조직병리학적 및 면역조직학적 검사를 통한 면역세포의 침윤 정도를 확인한 도이다.
A: H&E염색(위)과 Iba-1(아래)에 대한 면역조직화학적 염색
B: CD11b의 웨스턴블롯 분석 및 정량화
도 4는 다발성경화증 동물모델(EAE)의 척수에서 RT-PCR 분석을 시행하여 염증매개인자의 활성도를 검사하고 정량화를 한 결과를 나타낸 도이다.
A: RT-PCR 분석의 밴드
B-I: RT-PCR 분석의 밴드의 정량화
B, MCP-1; C, MIP-1α; D, RANTES; E, IL-1β; F, IL-6; G, TNF-α; H, COX-2; I, iNOS
도 5는 다발성경화증 동물모델(EAE)의 척수에서 혈액뇌장벽의 변화를 조사하고 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
A: GFAP의 면역조직화학적 염색
B: GRAP 및 PECAM-1(혈액뇌장벽의 마커)에 대한 웨스턴블롯 분석과 정량적 그래프
도 6는 다발성경화증 동물모델(EAE)의 척수에서 RT-PCR 분석을 시행하여 T세포의 활성도 검사하고 정량화를 한 결과를 나타낸 도이다.
A: CD3 (T 세포의 마커)
B: IL-2 (Th1 세포의 마커)
C: IFN-γ (Th1 세포의 마커)
D: IL-17 (Th17 세포의 마커)
도 7은 다발성경화증 동물모델(EAE)의 척수에서 웨스턴 블롯 분석을 시행하여 염증반응의 신호기전의 활성도를 검사하고 정량화를 한 결과를 나타낸 도이다.
A: 웨스턴 블롯 분석의 밴드
B-I: 웨스턴 블롯 분석 밴드(A)의 정량화
B, p-ERK; C, p-JNK; D, Rp-p38; E, p-NF-kB; F, p-IkB
본 발명은 피토세라마이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경계 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 상기 "예방"이란 상기 약학적 조성물의 투여로 신경계 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 상기 "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여로 신경계 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
상기 피토세라마이드는 하기의 화학식 1로 표시될 수 있고, 상기 피토세라마이드는 유도체를 포함할 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 염을 더 포함할 수 있다.
[화학식 1]
상기 신경계 자가면역질환은 다발성경화증(multiple sclerosis), 시신경척수염(neuromyelitis optica), 급성 파종성뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis), 상행성 척수염(ascending myelitis), 중심성 척수염(central myelitis), 하행성 척수염(descending myelitis) 횡단성 척수염(transverse myelitis), 중증근무력증(myasthenia gravis), 길랑바레증후군(guillain-barre syndrome), 자가면역성 포도막염(autoimmuneuveitis), 자가면역성뇌증(autoimmune encephalopathy) 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)으로 이루어진 군이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 피토세라마이드는 신경계 자가면역질환, 특히 다발성 경화증의 신경학적인 신경학적인 임상증상 척도를 개선한다. 또한, 전-염증성 단백질 CD11b, 단핵구 관련 케모카인(MCP-1, MIP-1α 및 RANTES), 전염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6 및 TNF-α), 염증인자(COX-2 및 iNOS)의 발현을 억제하여 염증인자 및 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 바, 염증성 반응을 억제한다. 또한, 별아교세포(astrocyte)의 활성화 억제를 통한 혈액뇌장벽(blood-brain barrier) 투과성을 안정화시킨다. T세포의 침윤 감소, Th1 및 Th17세포의 활성을 억제시켜 면역 반응을 조절하며, 염증성 신호기전의 억제(MAPK 및 NF-kB pathway)를 통한 항-염증 반응 및 탈수초화를 감소시킴을 확인하였다.
상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 술폰산류와 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔술폰산, 주석산, 푸마르산과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 유효성분의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
또한 본 발명은 피토세라마이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경계 자가면역질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 피토세라마이드를 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨,소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능성 식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축 성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<준비예 1>
1-1. 다발성경화증 동물모델(EAE)을 이용한 실험의 실험군 분류
본 발명의 피토세라마이드의 다발성경화증 동물모델에 대한 신경보호 효능을 확인하기 위해, 다음과 같은 실험군으로 구분하였다.
1) 행동실험
- Sham군: MOG 펩타이드와 피토세라마이드를 투여하지 않은 정상 대조군
- EAE + PBS군: MOG 펩타이드로 EAE를 유도하고 PBS를 구강으로 투여한 군
- EAE+vehicle군: MOG 펩타이드로 EAE를 유도하고 옥수수유를 구강으로 투여한 군
- EAE + Pcer군: MOG 펩타이드로 EAE를 유도하고 피토세라마이드를 옥수수유에 녹여(25, 50, 100 및 200 mg/kg) 구강으로 투여한 군
- Pcer군: MOG 펩타이드로 EAE를 유도하지 않은 정상 마우스에 피토세라마이드를 옥수수유에 녹여(200 mg/kg) 구강으로 투여한 군
2) 조직학적/분자학적 분석
- Sham군: MOG 펩타이드와 추출물을 투여하지 않은 정상 대조군
- EAE군: MOG 펩타이드로 EAE를 유도하고 옥수수유를 구강으로 투여한 군
- EAE+Pcer군: MOG 펩타이드로 EAE를 유도하고 피토세라마이드를 옥수수유에 녹여(200 mg/kg) 구강으로 투여한 군
- Pcer군: MOG 펩타이드로 EAE를 유도하지 않은 정상 마우스에 피토세라마이드를 옥수수유에 녹여(200 mg/kg) 구강으로 투여한 군
1-2. 다발성 경화증 동물모델 유도
본 발명의 피토세라마이드의 다발성경화증 동물모델에 대한 신경보호 효능을 확인하기 위해, MOG 펩타이드을 사용하여 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE, experimental autoimmune encephalomyelitis) 동물 모델을 제조하였다. 구체적으로, 동물 모델은 출생 후 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스(Narabiotechnology, 대한민국; 체중 22-24 g)를 준비하여 일주일 동안 안정시켰다. 마우스에 MOG 펩타이드35-55 (Sigma-Aldrich, 미국) 200 ug이 포함된 에멀전(emulsion)과 결핵균(mycobacterium tuberculosis; Difco, 미국) 400 ug이 포함된 IFA (Incomplete Freund's adjuvant; Difco, 미국)를 혼합하여 도합 0.1 ml의 에멀전을 EAE군의 양쪽 허리부위에 피하로 주사하였고, 동시에 백일해독소(PTX, pertussis toxin; List Biologic, 미국) 200 ng을 복강으로 주사하였다. 48시간 후에 동일한 양의 백일해독소를 복강으로 다시 주사하였다.
상기 MOG에 의해 유도된 만성 EAE 동물모델의 임상 증상의 척도를 8가지로 구분하여 확인하였다. 즉, 반응이 없음(0 단계), 꼬리 끝이 쳐짐(1 단계), 꼬리 전체가 쳐짐(2 단계), 한쪽 뒷다리의 약한 마비(3 단계), 양쪽 뒷다리의 마비(4 단계), 한쪽 앞 다리까지 마비(5 단계), 앞쪽 양쪽 다리까지 마비(6 단계) 및 죽음(7 단계)으로 구분하였다.
1-3. 피토세라마이드(피토세라마이드) 정제 및 특징 확인
피토세라미이드(Doosan Glonet, Suwon, Korea)는 플래시 칼럼 크로마토그래피(flash column chromatography)로 정제한 후 다음과 같은 특징을 확인하였다(Molecules 2011, 16, 9090-9100; doi:10.3390/molecules16119090). R f = 0.4 (85:15:2; 클로로포름(chloroform)-메탄올(methanol)-수산화 암모늄(ammonium hydroxide) 28%, v/v); IR (neat, NaCl) 3316, 2921, 2851, 1736, 1633, 1540, 1466, 1377, 1246, 1042, 721 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.30 (t, 2H, J = 5.60 Hz, CH=CH), 4.67 (s, 3H, 3 Х OH), 4.06 (dd, 1H, J = 4.80, 4.80 Hz, CH-NH), 3.76-3.64 (m, 2H, CH2OH), 3.55-3.40 (m, 2H, 2 Х CHOH), 3.36-3.27 (m, 1H, NH), 2.19 (t, 2H, J = 7.60 Hz, CH2CO), 2.04-1.89 (m, 4H, CH2CH=CHCH2), 1.68-1.46 (m, 4H, CH2CH2, CH2CHOH), 1.43-1.18 (m, 44H, 22 Х CH2), 0.85 (t, 6H, J = 6.80 Hz, 2 Х CH3); 13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ 175.49, 130.51, 130.32, 75.86, 73.00, 61.76, 52.74, 37.01, 33.15, 32.58, 32.56, 30.49, 30.35, 30.29, 30.19, 30.15, 30.08, 30.00, 29.98, 29.96, 29.93, 29.91, 29.81, 27.78, 26.55, 26.53, 23.28, 14.36; MS calcd. for C36H71NO4Na: 604.52 [M+Na]+, found: 604.58.
1-4. 피토세라마이드의 투여
본 발명의 피토세라마이드 (25, 50, 100 및 200 mg/kg)를 옥수수유(Sigma, St. Louis, MO, USA)에 녹여 EAE를 유도한 다음 임상증상이 나타나기 시작하는 시점(7-8일째)부터 30일째까지 매일 1회씩 구강으로 투여하였다. 피토세라마이드는 개체 당 투여량이 100 ㎕이 되도록 하였다.
1-5. 조직병리학적 분석
피토세라마이드 (200 ㎎/㎏)를 EAE를 유도한 후에 온셋투여(유도 후 8-9일)로 투여한 후 임상증상이 가장 심한 시기인 16일 내지 18일 사이에 마우스를 마취하고, 4% 파라포름알데하이드(PFA, paraformaldehyde)를 심장으로 관류하여 고정하고, 허리부위의 척수(요추 4-5번; L4-5)를 적출하였다. 적출한 척수는 4% PFA에 담가 4℃에서 하루 정도 더 고정시킨 다음, 30% 수크로스(sucrose)로 바꾸어 4℃에서 3일 이상 기간 동안 보관하여 동결 손상을 방지하였다.
EAE 동물모델에서 피토세라마이드의 탈수초 현상의 억제 효과를 확인하기 위하여 수초의 주성분인 인지질을 염색하는 룩솔 페스트 블루(luxol fast blue; LFB) 염색을 통해 탈수초화 정도를 비교하고, H&E염색을 통해 면역세포의 침윤 정도를 비교하기 위해 실험을 하여 확인하였다. 동결절편기를 이용하여 척수를 30 ㎛ 두께로 잘라 PBS에 5분간 담근 후 95% 에탄올에 5분 동안 담갔다. 그 후 95% 에탄올에 녹아있는 0.1% 룩솔 페스트 블루 용액에 조직을 담가 56℃에서 14시간 동안 방치한 다음 0.5% 리튬 카보네이트(lithium carbonate) 용액과 70% 에탄올, 증류수에 순서대로 각각 30초씩 담그는 과정을 5-6회 반복하여 색을 조절한 뒤 95%, 100% 에탄올에 5분씩 담가 탈수한 후 자일렌(xylene)에 담근 뒤 커버 그라스를 덮었다. 척수 바깥 부분의 백질에 축삭이 존재하기 때문에 정상 조직을 염색한 경우에는 척수 백질이 진한 파란색으로 나타나지만, 외상 후 탈수초화 현상으로 인하여 수초가 소실되게 되면 듬성듬성 염색이 되며 흐린 파란색을 띤다.
또한, 염증 세포의 침윤을 확인하기 위해 H&E 염색을 수행하였다. 구체적으로, 상기와 동일한 방법으로 준비한 척수조직을 H&E 염색을 위해 슬라이드에 두고 헤마톡실린(hematoxylne) 용액을 떨어뜨려 3분간 기다린 후 증류수로 1분씩 세 번 세척하였다. 그리고 에오진(eosin) 용액을 떨어뜨려 10분간 기다린 후 증류수로 1분씩 세 번 세척하였으며, 70%, 90%, 95%, 100% 에탄올에 차례로 2분간 담그어 탈수한 후 자일렌(xylene)에 담근 뒤 커버 그라스를 덮었다.
1-6. 면역조직화학염색법
피토세라마이드 (200 ㎎/㎏)를 EAE를 유도한 후에 온셋투여(유도 후 8-9일)로 투여한 후 임상증상이 가장 심한 시기인 16일 내지 18일 사이에 마우스를 마취하고, 상기 조직병리학적 분석과 동일한 방법으로 동결 절편을 제작하였다. 염색 방법은 절편을 블로킹 솔루션 [200 ㎍ 소혈청알부민(BSA, Bovin serum albumin, sigma, 미국), 500 ㎕ FBS (Fetal bovine serum, Gibco, 독일), 500 ㎕ NGS (Normal goat serum, Vector, 미국) 및 10 ㎕ Triton X-100 (sigma, 미국)을 PBS에 넣어 10ml을 만듦]을 넣은 플레이트에 담가 1시간 반응시킨다. 그 다음 PBS로 수세한 후 1차 항체[Iba-1(ionized calcium-binding adapter molecule-1, 미세아교세포의 마커) 및 GFAP(glial fibrillary acidic protein, 별아교세포의 마커)을 블로킹 솔루션에 의석한 용액으로 교체하고 12시간 이상 반응시켰다. 그 다음 PBS로 수세한 후 2차 항체를 PBS에 1:200으로 희석한 용액으로 교체하고 1시간 반응한 후 PBS로 수세하였다. 그리고 아비딘-바이오틴화 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)-복합체 (1:200; Vector Laboratories), 및 3,3'-diamino-benzidine를 이용하여 면역염색을 하였다.
1-7. 웨스턴블롯 분석
MOG로 유도한 동물 모델에서 탈수초화, 아교세포의 활성화, 염증성사이토카인의 분비 및 염증기작의 활성화에 대한 효과를 확인하기 위해 다양한 마커들의 발현을 웨스턴 블롯을 이용해서 확인하였다.
피토세라마이드 (200 ㎎/㎏)을 EAE를 유도한 후에 온셋투여로 투여한 후 임상증상이 가장 심한 시기인 14일 내지 18일 사이에 마우스를 마취하여 안락사 한 뒤 허리부위의 척수(요추 4-5번; L4-5)를 적출하였고, 이를 단백질 용해 완충액(protein lysis buffer; 10 mM 트리스, 0.5 mM EDTA, 0.25 M 수크로스) 200 ul를 넣고 분쇄기를 이용하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질은 소혈청알부민(BSA, bovine serum albumin, sigma, 미국)를 사용한 Bradford(Bio-rad, 미국) 방법을 이용하여 각 개체의 단백질을 정량한 뒤 단백질 25 ㎍은 10% SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 분리하여 PVDF(polyvinylidene difluoride) 멤브레인(membrane, Gendepot, 영국)으로 이동시켰다. PVDF 멤브레인은 5% 탈지유(skimmed milk, BD, 미국)에서 1시간 동안 블로킹시켰다. TBST로 씻은 후 1차 항체[CD11b(단핵구 마커), GFAP(별아교세포 마커), CD31(=PECAM-1; 혈액뇌장벽의 마커), MBP(수초의 마커), p-ERK, p-JNK, p-p38, p-NF-κB, p-IκB 및 GAPDH]를 3% 탈지유에 1:1,000으로 희석시켜 4℃에서 하루 동안 반응시킨 후 TBST로 10분씩 3회 씻고 2차 항체와 함께 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 2차 항체 반응 후 TBST에 씻은 뒤 ECL system(Santacruz, 미국)로 밴드를 확인하였다. 단백질의 확인 및 정량 분석은 이미지 장비 ChemiDoc XRS+(Bio-Rad)를 이용하였다.
1-8. 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction)
MOG로 유도한 EAE 동물모델에서 염증성사이토카인의 분비 및 염증기작의 활성화에 대한 피토세라마이드의 억제 효과를 확인하기 위하여 실시간 PCR 분석을 이용하여 mRNA 발현을 확인하였다. 피토세라마이드 (200 ㎎/㎏)을 EAE를 유도한 후에 온셋투여로 투여한 후 임상증상이 가장 심한 시기인 14일 내지 18일 사이에 마우스를 마취하여 안락사 한 뒤 허리부위의 척수(요추 4-5번; L4-5)를 적출하였다. 조직은 트리졸(Trizol, Invitrogen, 미국) 1 ml을 넣고 분쇄기로 조직을 갈고 원심분리하여 RNA를 분리하였다. cDNA를 합성하기 위해 0.5 μg의 Oligo dT, 0.5 mM dNTP mix, 5x first-strand buffer, RNase out, 5 mM dithiothreitol (DTT), 및 M-MLV 역전사효소를 포함하는 반응 혼합물(reaction mixture) 중에서 1 μg의 총 RNA를 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. RT-PCR 분석은 제조사의 메뉴얼에 따라 수행되었다(RT-PCR kit; Roche, Germany). PCR 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다. PCR 증폭을 위해, 특정 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍은 6 μl of PCR Master Mix (Lucigen, WI, USA) 중에서 1 μl의 cDNA 및 0.6 U의 Econo TaqDNA 중합효소를 반응시켰다. 결과물의 5-7 μl를 2% 아가로스 젤에서 전기영동하고 트랜드일루미네이터에서 브롬화 에티듐(ethidium bromide)으로 염색한 후 확인하였다. 각 유전자의 발현 수준은 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)으로 표준화 하였다.
목적 유전자 |
primer | 서열번호 | ||
명칭 | 서열 | 방향 | ||
CD3 | CD3_F | CTC TGG GCT TGC TGA TGG | 정방향 | 1 |
CD3_R | GGT TGG GAA CAG GTG GTG | 역방향 | 2 | |
COX-2 | COX-2_F | CAG TAT CAG AAC CGC ATT GCC | 정방향 | 3 |
COX-2_R | GAG CAA GTC CGT GTT CAA GGA | 역방향 | 4 | |
GAPDH | GAPDH_F | AGG TCA TCC CAG AGC TGA ACG | 정방향 | 5 |
GAPDH_R | CAC CCT GTT GCT GTA GCC GTA T | 역방향 | 6 | |
IFN-γ | IFN-γ_F | ACA ATG AAC GCT ACA CAC TGC AT | 정방향 | 7 |
IFN-γ_R | TGG CAG TAA CAG CCA GAA ACA | 역방향 | 8 | |
IL-1β | IL1b_F | TTG TGG CTG TGG AGA AGC TGT | 정방향 | 9 |
IL1b_R | AAC GTC ACA CAC CAG CAG GTT | 역방향 | 10 | |
IL-17 | IL-17_F | GTG TCT CTG ATG CTG TTG | 정방향 | 11 |
IL-17_R | AAC GGT TGA GGT AGT CTG | 역방향 | 12 | |
IL-6 | IL6_F | TCC ATC CAG TTG CCT TCT TGG | 정방향 | 13 |
IL6_R | CCA CGA TTT CCC AGA GAA CAT G | 역방향 | 14 | |
iNOS | iNOS_F | GGC AAA CCC AAG GTC TAC GTT | 정방향 | 15 |
iNOS_R | TCG CTC AAG TTC AGC TTG GT | 역방향 | 16 | |
MCP-1 | MCP-1_F | CTT CTG GGC CTG CTG TTC A | 정방향 | 17 |
MCP-1_R | CCA GCC TAC TCA TTG GGA TCA | 역방향 | 18 | |
MIP-1α | MIP-1α_F | CAG CCA GGT GTC ATT TTC CT | 정방향 | 19 |
MIP-1α_R | AGG CAT TCA GTT CCA GGT CA | 역방향 | 20 | |
RANTES | RANTES_F | ACA CCA CTC CCT GCT GCT TT | 정방향 | 21 |
RANTES_R | GAC TGC AAG ATT GGA GCA CTT G | 역방향 | 22 | |
TNF-α | TNFa_F | AGC AAA CCA CCA AGT GGA GGA | 정방향 | 23 |
TNFa_R | GCT GGC ACC ACT AGT TGG TTG T | 역방향 | 24 | |
IL-2 | IL-2_F | GCC CAA GAA GGC CAC AGA | 정방향 | 25 |
IL-2_R | GCA CTT CCT CCA GAG GTT TGA G | 역방향 | 26 |
1-9. 통계처리
모든 결과는 SPSS 23.0 package (SPSS Inc, Chicago, USA)을 이용하여 분석하였으며, 실험결과는 mean±standard deviation(평균±표준편차) 값으로 표시하였다. 통계적 유의성 검증은 ANOVA(일원배치 분산분석)를 이용하여 분석 후 Tukey post hoc로 사후분석 하였고, 유의확률(p-value) 값은 p<0.05 및 p<0.01 미만인 경우에만 인정하였다.
<실시예 1> 행동학적인 검사를 통한 피토세라마이드의 탈수초 억제 및 신경보호 효능 확인
상기 마우스의 EAE가 유도된 날부터 30일 동안 매일 상기의 임상 증상의 척도를 사용하여 행동학적인 변화에 대한 피토세라마이드(피토세라마이드)의 효능을 확인하였다. EAE군의 행동학적인 증상은 EAE 유도 후, 8일째에서 9일째 사이에 나타나기 시작하여 16일째에서 18일째 사이에 최고조(3.3)에 도달하였으며, 그 이후에도 지속되었다. EAE 유도 후 9일째부터 30일째까지의 스코어의 합은 58.4였다. 그러나 EAE+Pcer군에서의 행동학적인 증상은 EAE군에 비하여 감소하는 경향이었으며, EAE + Pcer 100 및 200군에서는 유의한 감소를 보였다. EAE 유도 후 8일째부터 30일째까지의 스코어의 합은 피토세라마이드 100 mg/kg 투여군에서 38.3 ± 3.7였고, 200 mg/kg 투여군에서 27.8 ± 3.9 임을 확인하였다(도 1A와B).
또한, 피토세라마이드의 EAE 동물모델에서의 탈수초 현상의 억제 효과를 확인하기 위하여, 수초의 주성분인 인지질을 염색하는 룩솔 페스트 블루(LFB) 염색을 통해 탈수초화 정도를 비교하고, 수초의 마커인 MBP를 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 그 결과, EAE군은 정상군에 비하여 수초의 마커인 MBP 발현이 감소되어 탈수초화가 증가되었으며, 피토세라마이드 투여군은 EAE군에 비하여 수초의 마커인 MBP 발현이 증가되어 탈수초화를 감소시키는 것을 확인했다(도 2A 및 B).
<실시예 2> 척수의 면역세포의 침윤 억제 및 염증성 반응 감소 확인
피토세라마이드의 EAE 동물모델에서의 면역세포의 침윤 정도를 비교하기 위해 H&E 염색법과 Iba-1 면역 염색을 실시하였다. 그 결과, EAE군은 정상군에 비하여 면역세포의 침윤과 미세아교세포의 활성화가 증가되었으며, 피토세라마이드 투여군은 EAE군에 비하여 감소하였다. CD11b를 이용한 웨스턴블롯 실험에서도 전-염증성 단핵구 마커인 CD11b의 발현이 피토세라마이드 투여군에서 유의적으로 감소됨을 확인하여 동일한 결과를 나타내었다(도 3A와 B).
또한, 피토세라마이드의 전염증성 사이토카인 및 단핵구 관련 케모카인의 mRNA 발현 억제 효과를 확인하기 위해 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 실험을 하였다. 그 결과, EAE + Pcer군은 EAE군에 비하여 단핵구 관련 케모카인(MCP-1, MIP-1α 및 RANTES), 전염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6 및 TNF-α), COX-2 및 iNOS의 mRNA 발현 정도를 유의하게 감소시키는 것을 확인하였다(도 4A-I).
<실시예 3> 혈액뇌장벽(blood-brain barrier, BBB) 투과성 안정화 확인
자가면역성 뇌질환의 진행은 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier, BBB)을 통과해서 중추신경계에 침윤하는 단핵구 유래 큰포식세포와 CD4+ T 세포의 염증세포의 침윤에 의해 악화되며, 활성화된 큰포식세포의 수초의 탐식으로 인해 중추신경계의 탈수초화가 진행되는 것으로 알려져 있다.
피토세라마이드의 EAE 동물모델에서 혈액뇌장벽 투과성의 안정화 정도를 확인하였다. 별아교세포는 혈액뇌장벽의 형성과 연관되기 때문에 별아교세포 활성화 수준을 확인하였으며, 이는 GFAP(glial fibrillary acidic protein)로 표지되는 바, 이를 확인하였다(도 5A). 또한, 상기 면역조직화학염색법과 동일한 방법으로 GFAP에 대한 항체를 이용하여 면역 염색을 시행하였으며, GFAP 항체와 혈관 투과성 정도와 관련된 마커인 PECAM-1(CD31) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였고, 이들의 발현에 대한 피토세라마이드의 효과를 확인하였다.
그 결과, Sham군에 비해 EAE군에서 GFAP 및 PECAM-1(CD31)의 발현이 증가하였고, EAE + Pcer군은 EAE군에 비하여 발현이 다소 감소하였다(도 5A와 B).
<실시예 4> T 세포의 침윤과 활성도 확인
피토세라마이드의 T 세포의 분화 및 침윤 억제 효과를 확인하기 위해 T세포 마커인 CD3 프라이머를 사용하여 RT-PCR 분석을 수행하였다. 또한, T 세포의 활성을 확인하기 위해 상기 표 1의 Th1 마커(IL-2 및 IFN-γ) 및 Th17의 마커(IL-17)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, EAE + Pcer투여군은 EAE군에 비하여 T세포의 침윤 정도, 특히 Th1과 Th17세포의 활성을 감소시키는 것을 확인하였다(도 6A-D).
<실시예 5> MAPKs 및 NF-κB 신호기전 억제 확인
피토세라마이드의 MAPKs 및 NF-κB 신호기전(염증성 신호 기전) 억제효과를 확인하기 위해 웨스턴 블롯 실험을 하였다. 1차 항체로 ERK (extracellular signal-regulated kinase 1/2), JNK(c-Jun N-terminal kinase), p38, NF-κB 및 IκB를 사용하여 확인하였다.
그 결과, EAE + Pcer군은 EAE에 의해 증가된 p-NF-κB(p65) 및 p-IκB의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다. 이로 인해 척수의 신호전달 경로인 NF-κB 신호전달의 인산화를 억제하여 탈수초화를 감소시키는 것을 확인하였다(도 7A-F).
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University
<120> Phytoceramide or pharmaceutically acceptable salt thereof and
composition for preventing or treating autoimmune disease in
nervous system
<130> PN1901-067
<160> 26
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3_F primer
<400> 1
ctctgggctt gctgatgg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3_R primer
<400> 2
ggttgggaac aggtggtg 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COX-2_F primer
<400> 3
cagtatcaga accgcattgc c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COX-2_R primer
<400> 4
gagcaagtcc gtgttcaagg a 21
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<211> 21
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH_F primer
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFN-gamma_F primer
<400> 7
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aacgtcacac accagcaggt t 21
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<220>
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<400> 26
gcacttcctc cagaggtttg ag 22
Claims (10)
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 신경계 자가면역질환은 다발성경화증(multiple sclerosis), 시신경척수염(neuromyelitis optica), 급성 파종성뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis), 상행성 척수염(ascending myelitis), 중심성 척수염(central myelitis), 하행성 척수염(descending myelitis) 횡단성 척수염(transverse myelitis), 중증근무력증(myasthenia gravis), 길랑바레증후군(guillain-barre syndrome), 자가면역성 포도막염(autoimmuneuveitis), 자가면역성뇌증(autoimmune encephalopathy) 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 전-염증성 단백질 CD11b, 단핵구 관련 케모카인(MCP-1, MIP-1α 및 RANTES), 전염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6 및 TNF-α), COX-2 및 iNOS의 발현을 억제하여 염증인자 및 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 바, 염증성 반응을 억제하는 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 별아교세포(astrocyte)의 활성화 억제를 통한 혈액뇌장벽(blood-brain barrier) 투과성을 안정화시키는 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 T세포의 침윤 감소, Th1 및 Th17세포의 활성을 억제시켜 면역 반응을 조절하는 것인, 조성물,
- 제1항에 있어서, 염증성 신호기전의 억제(MAPK 및 NF-kB pathway)를 통한 항-염증 반응 및 탈수초화를 감소시키는 것인, 조성물.
- 삭제
- 제8항에 있어서, 상기 신경계 자가면역질환은 다발성경화증(multiple sclerosis), 시신경척수염(neuromyelitis optica), 급성 파종성뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis), 상행성 척수염(ascending myelitis), 중심성 척수염(central myelitis), 하행성 척수염(descending myelitis) 횡단성 척수염(transverse myelitis), 중증근무력증(myasthenia gravis), 길랑바레증후군(guillain-barre syndrome), 자가면역성 포도막염(autoimmuneuveitis), 자가면역성뇌증(autoimmune encephalopathy) 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 조성물.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020190026162A KR102146226B1 (ko) | 2019-03-07 | 2019-03-07 | 피토세라마이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경계 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020190026162A KR102146226B1 (ko) | 2019-03-07 | 2019-03-07 | 피토세라마이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경계 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
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KR20100021139A (ko) * | 2008-08-14 | 2010-02-24 | 충북대학교 산학협력단 | 파이토세라마이드를 포함하는 뇌혈관 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물 및 식품 조성물 |
KR20120116511A (ko) * | 2004-08-27 | 2012-10-22 | 알버트 아인슈타인 컬리지 오브 메디신 오브 예쉬바 유니버시티 | 면역 및 자가면역의 조절제로서의 세라마이드 유도체 |
-
2019
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KR20120116511A (ko) * | 2004-08-27 | 2012-10-22 | 알버트 아인슈타인 컬리지 오브 메디신 오브 예쉬바 유니버시티 | 면역 및 자가면역의 조절제로서의 세라마이드 유도체 |
KR20100021139A (ko) * | 2008-08-14 | 2010-02-24 | 충북대학교 산학협력단 | 파이토세라마이드를 포함하는 뇌혈관 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물 및 식품 조성물 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
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ARCHIVES OF PHARMACAL RESEARCH VOLUME 38, PAGES 2241~2250 (2015) * |
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