CN111084765B - 表大麻二醇水合物在制备预防和/或治疗脑损伤药物中的应用及其药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了表大麻二醇水合物在制备预防和/或治疗脑损伤药物中的应用及其药物组合物。本发明首次发现了表大麻二醇水合物在制备预防和/或治疗脑损伤的药物中的应用，具有显著减轻缺血性脑卒中造成的脑损伤的药效。本发明表明表大麻二醇水合物通过抑制促炎因子和促进促进抗炎因子表达，减轻体内外神经炎症反应，具有显著减少降低短暂性大脑中动脉阻塞后脑梗死体积的作用，减轻缺血脑组织的过度炎症反应，实现脑缺血后的神经保护作用，可以有效应用在预防和/或治疗脑损伤中，尤其是缺血性脑卒中导致的脑损伤；包括本发明的表大麻二醇水合物的药物组合物可以成为新型的预防和/或治疗与脑炎症密切关联的脑疾病脑损伤药物治疗多种脑疾病。

Description

表大麻二醇水合物在制备预防和/或治疗脑损伤药物中的应 用及其药物组合物

技术领域

本发明属于天然药物和药物治疗领域。，具体涉及表大麻二醇水合物在制备预防和/或治疗脑损伤药物中的应用及其药物组合物。

背景技术

脑血管病是全球死亡率最高的三大疾病之一，缺血性脑卒中在脑血管病中是最严重的病症之一，是当今世界严重危害人类健康和生命安全的首要难题之一，具有高发病率、高致残率、高复发率和高死亡率的特点。我国是脑血管疾病大国，每年约有200万人患脑卒中，其中缺血性脑卒中患者约占75％～85％。中国每年用于治疗脑卒中的费用达100亿元以上，给国家、家庭和患者带来沉重的经济负担。缺血性脑卒中对患者健康危害极大，通常会导致不可逆的脑部损伤。缺血性脑卒中发生后，随着大脑分支血管的阻塞，血流和氧气供应的中断，会引发一系列复杂的病理过程，主要包括脑组织能量代谢紊乱、兴奋性氨基酸毒性、自由基损伤、炎症反应、细胞凋亡等。脑缺血一定时间恢复血液正常供应后，其功能不但未能恢复，反而出现了更加严重的脑机能障碍，即脑缺血再灌注损伤。缺血再灌注损伤病生理过程是一个多因素、多途径、多环节损伤的酶促级联反应，涉及兴奋性氨基酸毒性、脑细胞能量代谢紊乱、细胞内钙超载、氧化应激损伤及神经细胞凋亡等。

炎症是对病原体和受损细胞的反应的一种防御反应，而神经炎症是缺血性脑卒中后主要的损伤机制之一。小胶质细胞是大脑中负责免疫应答的关键细胞，对维持稳态至关重要。脑组织缺血后，小胶质细胞、星形胶质细胞被激活，产生大量的细胞因子和化学趋化因子。细胞因子使脑血管内皮细胞黏附分子表达上调，循环中的白细胞在黏附分子和趋化因子的作用下，黏附并迁移至损伤的脑实质，与胶质细胞一起释放大量的白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子，从而加重局部损伤，最终导致神经细胞凋亡、坏死。另一方面，小胶质细胞还具有修复功能，能即时吞噬细胞碎片或坏死的神经元，释放IL-4、IL-10等抗炎因子抑制炎症反应，分泌营养因子促进损伤修复。目前缺血性脑卒中的主要治疗方法是溶栓治疗，组织纤溶酶原激活物(t-PA)是美国食品与药品管理局(FDA)唯一批准用于治疗缺血性脑卒中的药物。因此，干预小胶质细胞免疫功能有望成为治疗缺血性脑卒中的有效治疗手段。

表大麻二醇水合物(CAS 139561-95-8)，化学名称为2-[6-(1-羟基-1-甲基-乙基)-3-甲基-环己-2-烯基]-5-戊基苯-1,3-二醇，为大麻二醇(CBD)类似物。截至目前，表大麻二醇水合物对脑炎症介导的脑损伤疾病的治疗作用尚无报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明的目的是寻找一种全新的可以抑制巨噬细胞及小胶质细胞炎症的药物，能够促进巨噬细胞及小胶质细胞向抗炎型转变，从而对缺血性脑卒中及脑炎症关联的其他脑损伤疾病发挥治疗作用。

本发明提供在表大麻二醇水合物制备预防和/或治疗脑损伤药物中的应用；本发明中表大麻二醇水合物能够显著抑制脂多糖(LPS)引起的促炎细胞因子表达增加，促进抗炎因子的表达，促进小鼠巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)及小鼠原代小胶质细胞向抗炎型转变；表大麻二醇水合物可显著降低短暂性大脑中动脉阻塞(tMCAO)后小鼠的脑梗死体积。因此，表大麻二醇水合物有望用于治疗包括缺血性脑卒中在内的多种脑损伤疾病。

本发明还提供一种预防或治疗脑损伤的药物组合物。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的表大麻二醇水合物在制备预防和/或治疗脑损伤的药物中的应用。

作为优选，所述表大麻二醇水合物在制备预防和/或治疗缺血性脑卒中导致的脑损伤药物中的应用。

其中，所述表大麻二醇水合物的化学结构式如下：

其中，所述表大麻二醇水合物通过抑制促炎因子和促进促进抗炎因子表达，减轻体内外神经炎症反应，在制备预防和/或治疗脑损伤药物中的应用。

进一步地，所述表大麻二醇水合物能够显著抑制LPS引起的促炎细胞因子表达增加，促进抗炎因子的表达，促进小鼠巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)及小鼠原代小胶质细胞向抗炎型转变，在制备治疗脑损伤药物中的用途。

其中，所述表大麻二醇水合物通过显著降低小鼠短暂性大脑中动脉阻塞后脑梗死体积，在制备治疗脑损伤药物中的用途。

进一步地，所述表大麻二醇水合物可显著降低短暂性大脑中动脉阻塞(tMCAO)后小鼠的脑梗死体积，在制备治疗脑损伤药物中的用途，尤其是具有显著降低短暂性大脑中动脉阻塞后脑梗死体积，减轻缺血脑组织的过度炎症反应，实现脑缺血后的神经保护的作用。

本发明所述的预防或治疗脑损伤的药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的表大麻二醇水合物及药学上可接受的载体、佐剂或媒剂。

其中，所述药物组合物的剂型为胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、霜剂、软膏剂、栓剂或贴剂。

另一方面，一种药物组合物，其中含有治疗有效量的表大麻二醇水合物，所述的药物组合物在制备预防和/或治疗脑损伤药物中的应用。

另一方面，一种药物制剂，其中含有治疗有效量的表大麻二醇水合物及药学上可接受的载体、佐剂或媒剂，所述的药物制剂在制备预防和/或治疗脑损伤药物中的应用。

本发明中，在给予哺乳动物上述化合物及其药学上可接受的盐，以及这些化合物的溶剂化物(这里统称为“治疗药物”)时，可以单独使用，或者最好是按照规范的制药方法将其与适于药用的载体或稀释剂配合后使用。

实验过程中，所述表大麻二醇水合物的药物用量为：细胞(1-50μM)，动物(1mg/kg和10mg/kg)。

细胞实验结果显示：脂多糖引起小胶质细胞中炎症因子TNF-α蛋白的表达，并促进促炎细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6的mRNA表达上调，10μM的表大麻二醇水合物能够显著抑制TNF-α蛋白及以上促炎细胞因子mRNA的表达。并且，表大麻二醇水合物能够显著促进抗炎细胞因子CD206及TGF-β1mRNA的表达，在10μM及以下浓度未见明显细胞毒性。动物实验结果显示：表大麻二醇水合物能够可改善脑缺血再灌注损伤所致的神经功能缺损，减轻小鼠短暂性大脑缺血再灌注损伤后的梗死体积，显著抑制小鼠大脑皮层促炎细胞因子mRNA的增加，促进抗炎因子mRNA的表达，具有神经保护作用。并且，表大麻二醇水合物能够改善脂多糖诱导的小鼠神经炎症反应，显著抑制小鼠大脑皮层促炎细胞因子mRNA的增加，促进抗炎因子mRNA的表达，具有抗神经炎症及神经保护作用。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明首次发现了表大麻二醇水合物在制备预防和/或治疗脑损伤的药物中的应用，具有显著减轻缺血性脑卒中造成的脑损伤的药效。本发明研究表明表大麻二醇水合物通过抑制抗炎因子和促进抗炎因子表达，减轻体内外神经炎症反应，具有显著减少降低短暂性大脑中动脉阻塞(tMCAO)后小鼠脑梗死体积的作用，可以有效应用在预防和/或治疗脑损伤中，尤其是缺血性脑卒中导致的脑损伤。而包括本发明的表大麻二醇水合物的药物组合物可以成为新型的预防和/或治疗脑损伤药物，治疗包括脑卒中、脑外伤、高原脑损伤、抑郁症、癫痫等在内的多种脑血管疾病。

(2)本发明首次发现了表大麻二醇水合物具有抑制小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)及小鼠原代小胶质细胞炎症的作用，并且在有效剂量下无明显细胞毒性。

(3)本发明中首次发现了表大麻二醇水合物能够促进小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)及小鼠原代小胶质细胞向抗炎型转变，发挥体内外的抗炎作用。

(4)本发明化合物表大麻二醇水合物具有显著降低短暂性大脑中动脉阻塞后脑梗死体积，减轻缺血脑组织的过度炎症反应，实现脑缺血后的神经保护作用。包括本发明的表大麻二醇水合物的药物组合物可以成为新型的预防和/或治疗与脑炎症密切关联的脑疾病脑损伤药物，治疗包括脑卒中、脑外伤、高原脑损伤、抑郁症、癫痫等在内的多种脑疾病。

附图说明

图1为实施例中表大麻二醇水合物对RAW264.7细胞(A)及小鼠原代小胶质细胞(B)活力影响示意图；其中^*P<0.05,^**P<0.01,vs Control,(Graphpad 6.0,One-way Anova)；

图2为实施例中表大麻二醇水合物对LPS刺激的RAW264.7细胞(A)及小鼠原代小胶质细胞(B)中炎症因子TNF-α蛋白表达的影响；其中^*P<0.05,^***P<0.001,vs Control；^#P<0.05,^##P<0.01,^###P<0.001,vs LPS,(Graphpad 6.0,One-way Anova)；

图3(A、C、E)为实施例中表大麻二醇水合物对LPS刺激的RAW264.7细胞中炎症因子TNF-α(A)、IL-1β(C)及IL-6(E)的mRNA表达的影响，图3(B、D、F)为实施例中表大麻二醇水合物对LPS刺激的小鼠原代小胶质细胞中炎症因子TNF-α(B)、IL-1β(D)及IL-6(F)的mRNA表达的影响；其中^**P<0.01,^***P<0.001,vs Control；^#P<0.05,^##P<0.01,^###P<0.001,vs LPS,(Graphpad 6.0,One-way Anova)；

图4(A、C)为实施例中表大麻二醇水合物对LPS刺激的RAW264.7细胞中抗炎因子CD206(A)及TGF-β1(C)mRNA表达的影响，图4(B、D)为实施例中表大麻二醇水合物对LPS刺激的小鼠原代小胶质细胞中抗炎因子CD206(B)及TGF-β1(D)mRNA表达的影响；其中^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001,vs Control；^#P<0.05,^##P<0.01,^###P<0.001,vs LPS,(Graphpad 6.0,One-way Anova)；

图5为实施例中表大麻二醇水合物对小鼠短暂性大脑中动脉阻塞模型72h后脑梗死体积的影响；其中^***P<0.001,vs Sham；^##P<0.01,^###P<0.001,vs Vehicle,(Graphpad6.0,One-way Anova)；

图6为实施例中表大麻二醇水合物对小鼠短暂性大脑中动脉阻塞模型后神经行为学的影响，表大麻二醇水合物减轻小鼠短暂性大脑缺血再灌注损伤后的梗死体积图(A)，(B)为其统计图；其中^**P<0.01,vs Control；^#P<0.05,vs LPS,(Graphpad 6.0,One-wayAnova)；

图7为实施例中表大麻二醇水合物对小鼠短暂性大脑中动脉阻塞模型72h后大脑皮层炎症因子TNF-α(A)、IL-1β(B)的mRNA表达的影响；其中^***P<0.001,vs Sham；^##P<0.01,^###P<0.001,vs Vehicle,(Graphpad 6.0,One-way Anova)；

图8为实施例中表大麻二醇水合物对LPS诱导的小鼠神经炎症模型3h后神经行为学的影响，表大麻二醇水合物改善小鼠神经炎症模型后的自发运动(A)，(B)为其统计图；(C)图为表大麻二醇水合物降低小鼠神经炎症模型后的静止时间；其中^**P<0.01,vsControl；^#P<0.05,vs LPS,(Graphpad 6.0,One-way Anova)；

图9为实施例中表大麻二醇水合物对LPS诱导的小鼠神经炎症模型3h后大脑皮层炎症因子TNF-α(A)、IL-1β(B)的mRNA表达的影响；其中^**P<0.01,vs Control；^#P<0.05,vsLPS,(Graphpad 6.0,One-way Anova)；

具体实施方式

下面通过一系列实施例进一步说明本发明，这些实施例完全是例证性的，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例中所使用的表大麻二醇水合物购自云南西力生物技术有限公司，CAS号：139561-95-8。

实施例中所使用的RAW264.7细胞购自美国模式培养物集存库(ATCC)。

实施例中所使用的小鼠为C57BL/6，雄性，体重在18-25g，购自浙江省实验动物中心，合格证号：SCXK(浙)2014-0001。等级：SPF级；饲养于中国药科大学药学动物实验中心SPF级动物房内，室温24±2℃，湿度40～60％，人工照明模拟昼夜变化，自由进食与饮水。

实施例1

细胞抗炎药理活性的测定：

(1)细胞毒性测定：

将表大麻二醇水合物溶于二甲基亚砜(DMSO)，配制成0.1,1,2,5,10,20，50μM浓度的溶液，96孔细胞培养板板中每孔加入100μL 5000个RAW264.7的细胞或小鼠原代小胶质细胞，并加入各浓度10μL表大麻二醇水合物溶液进行培养24小时后，每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养2h，在450nm下测定吸光度。

试验结果如图1A和图1B所示，其中^*P<0.05,^**P<0.01,vs Control,(Graphpad6.0,One-way Anova)。由图可见，表大麻二醇水合物在10μM及以下浓度对RAW264.7的细胞或小鼠原代小胶质细胞未见显著毒性。

(2)细胞释放炎症因子蛋白的测定：

将RAW264.7的细胞或小鼠原代小胶质细胞按每孔500μL，5*10⁴个接种于24孔细胞培养板，分别加入表大麻二醇水合物(终浓度1,2,5,10μM)预处理3h后，加入脂多糖(LPS)(终浓度100ng/mL)孵育2小时，取细胞上清，双抗夹心ELISA法(试剂盒Mouse TNF-αPrecoated ELISA kit Cat#:1217202购自深圳市达科为生物工程有限公司)检测细胞上清中炎症因子TNF-α的含量，具体操作方法如下：

1)100μL/孔加入样品，对照孔加入100μL/孔的Dilution buffer。

2)每孔中加入50μL Biotinlated antibody工作液，盖上封板膜，37℃孵育2h。

3)弃掉孔内液体，每孔中加入300μL Washing buffer工作液，1min后弃掉孔内液体，重复5次。

4)每孔中加入100μL Streptavidin-HRP工作液，盖上封板膜，37℃孵育1h。

5)重复步骤3)。

6)每孔中加入100μL TMB，37℃避光孵育10min，每孔加入100μL Stop sollution，在450nm下测定吸光度。

试验结果如图2(A和B)所示，其中^*P<0.05,^***P<0.001,vs Control；^#P<0.05,^##P<0.01,^###P<0.001,vs LPS,(Graphpad 6.0,One-way Anova)。由此可见，脂多糖能够显著上调RAW264.7的细胞及小鼠原代小胶质细胞中炎症因子TNF-α的释放，表大麻二醇水合物能够有效抑制细胞中炎症因子TNF-α的释放，抗炎活性良好，有效浓度为5-10μM，10μM时药效最佳。

(3)促炎/抗炎细胞因子mRNA表达的测定：

将RAW264.7的细胞或小鼠原代小胶质细胞按每孔500μL，5*10⁴个接种于24孔细胞培养板，加入表大麻二醇水合物(终浓度1,2,5,10μM)预处理3h后，加入脂多糖(LPS)(终浓度100ng/mL)孵育2小时，Trizol法提取总RNA，RT-qPCR法测定细胞中TNF-α、IL-1β及IL-6mRNA的含量；将RAW264.7的细胞或小鼠原代小胶质细胞按每孔500μL，5*10⁴个接种于24孔细胞培养板，分别加入表大麻二醇水合物(终浓度1,2,5,10μM)预处理3h后，加入脂多糖(LPS)(终浓度100ng/mL)孵育12小时，Trizol法提取总RNA，RT-qPCR法测定细胞中CD206及TGF-β1mRNA的含量。具体操作方法如下：

1)总RNA的提取

弃掉培养基，每孔加入500μL Trizol溶液，冰上孵育30min，收集到1.5mL无核酶离心管中，每管加入100μL三氯甲烷，充分混匀，冰上静置30min，12000rpm 4℃下离心20min，将上层溶液转移至新一1.5mL无核酶离心管中，每管加入300uL异丙醇，充分混匀，冰上静置30min，12000rpm 4℃下离心20min，弃掉上清，每管加入1mL 75％乙醇无核酶水溶液，充分混匀，12000rpm 4℃下离心10min，弃掉上清，待乙醇完全挥发后每管加入20uL无核酶水，冰上静置30min，充分溶解。

2)逆转录

在200μL无核酶离心管中依次加入5×HiScript II Select qRT SuperMix(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)4μL，模版RNA 1μg，加无核酶水至20μL，混合均匀后进行逆转录反应，反应条件为50℃15min，85℃5sec，反应产物即为cDNA，每管加入80μL无核酶水稀释后，放入-20℃保存。

3)实时荧光定量PCR(qPCR)

在200μL无核酶离心管中依次加入2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)10μL，cDNA样品4μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，无核酶水5μL，qPCR反应条件如表1所示，所使用引物序列如表2所示。

表1：qPCR反应条件

表2：qPCR引物序列

反应结束后用ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。试验结果如图3(A-F)至图4(A-D)所示。结果显示，表大麻二醇水合物能够显著抑制LPS引起的细胞促炎细胞因子mRNA的增加，其中^**P<0.01,^***P<0.001,vs Control；^#P<0.05,^##P<0.01,^###P<0.001,vs LPS,(Graphpad 6.0,One-way Anova)促进抗炎因子mRNA的表达，其中^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001,vs Control；^#P<0.05,^##P<0.01,^###P<0.001,vs LPS,(Graphpad 6.0,One-wayAnova)。表大麻二醇水合物能促进RAW264.7的细胞及小鼠原代小胶质细胞向抗炎型转型，抗炎活性良好。

实施例2

表大麻二醇水合物对缺血性脑卒中的改善作用

(1)实验分组

小鼠随机分为4组，每组8只，分别为假手术组、缺血再灌注模型组(模型组)、化合物治疗低剂量组(低剂量组，1mg/kg)和化合物治疗高剂量组(高剂量组，10mg/kg)。

(2)小鼠短暂性大脑中动脉阻塞模型(tMCAO)的建立

将小鼠置于麻醉诱导盒中，给予2～2.5％异氟烷诱导麻醉，待翻正反射消失后，取出，戴上呼吸面罩，给予1～1.5％异氟烷维持麻醉，使用多普勒血流仪测定右脑血流后仰卧位固定小鼠，颈部备皮、碘伏消毒，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，在颈总动脉近心端挂线，在颈外动脉远心端系死结，用电凝笔熔断颈外动脉，在颈内动脉远心端挂线，用在颈外动脉近心端切口，插入硅胶线栓(头部直径0.22±0.01mm)至颈内动脉，避过翼鄂动脉，遇到阻力即停，深度约为0.9cm，此时到达大脑中动脉起始端，在颈外动脉近心端系一活结，碘伏消毒伤口，缝合伤口，右侧脑血流下降至造模前25％以下时认定造模成功，在37℃恒温箱内缺血45min后按上述方法麻醉，取出线栓，将颈外动脉近心端活结系死，完成再灌注操作，碘伏消毒伤口，缝合伤口得到是缺血再灌注模型组(模型组)。假手术组模型制备方法同上，但线栓只插入5mm左右，右侧脑血流无显著变化。

(3)给药方案

在再灌注1h，24h后(即缺血45min后再灌注，再灌注1h后(也就是造模后1h)和24h后给药)，分别尾静脉注射表大麻二醇水合物DMSO溶液，浓度0.25mg/mL和2.5mg/mL，剂量是1mg/kg,10mg/kg，给药体积为4mL/kg，假手术组和模型组注射等量的DMSO。

(4)神经功能缺损评分

在再灌注1h，24h，48h，72h后，用Zea-Longa法(Longa,E.Z.,Weinstein,P.R.,Carlson,S.,Cummins,R.,1989.Reversible middle cerebral artery occlusionwithout craniectomy in rats.Stroke 20,84–91.)对小鼠的运动功能进行评价，评价标准如下，评分越高，神经损伤越重。

0分：行动正常，无神经功能缺损；

1分：左侧前爪不能完全伸展，轻微神经功能缺损；

2分：左侧前爪不能完全伸展，放在平地时，自发向左侧转圈，中度神经功能缺损；

3分：左侧前爪不能完全伸展或无运动，放在平地时，自发向左侧倾倒，维持平衡困难，重度神经功能缺损；

4分：无法运动，意识丧失，通常生存期较短。

本发明表大麻二醇改善小鼠短暂性大脑中动脉阻塞后造成的神经功能缺损图如图5所示，说明其可改善脑缺血再灌注损伤所致的神经功能缺损，具有神经保护作用，同时高剂量组药效优于低剂量组。

(5)小鼠脑梗死体积的评价

采用TTC法对脑梗死体积进行评价。在再灌注72h后，以5％异氟烷过量麻醉处死小鼠后取大脑，置于-20℃冰箱内10min后取出，自前脑额极起向后连续切出5片厚度约2mm的冠状位脑切片。将脑片放入2％的TTC溶液中，37℃避光孵育约5min，弃掉溶液，加入4％甲醛溶液固定30min，观察并拍照。正常脑组织呈鲜红色，梗死脑组织呈苍白色。使用Image Jv1.51软件计算大脑梗死体积百分比。计算公式如下：大脑梗死体积百分比＝0.5×(对侧脑面积-同侧正常组织面积)/对侧脑面积。

图6A为本发明实施例的表大麻二醇水合物减轻小鼠短暂性大脑缺血再灌注损伤后的梗死体积图，图6B为其统计图，其中^***P<0.001,vs Sham；^##P<0.01,^###P<0.001,vsVehicle,(Graphpad 6.0,One-way Anova)；说明大麻二醇水合物具有脑组织保护作用。

(6)脑组织促炎/抗炎细胞因子mRNA表达的测定

在再灌注72h后，以5％异氟烷过量麻醉处死小鼠后取大脑皮层，在脑组织匀浆中提取总RNA，RT-qPCR法检测脑组织中TNF-α、IL-1β的表达量，方法同实施例1中所述。

反应结束后用ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。试验结果如图7A至图7B所示，其中^***P<0.001,vs Sham；^##P<0.01,^###P<0.001,vs Vehicle,(Graphpad 6.0,One-wayAnova)。结果显示，表大麻二醇水合物能够显著抑制tMCAO后小鼠大脑细胞促炎细胞因子mRNA的增加，在动物水平上具有抗炎的药效。

实施例3

表大麻二醇水合物对脂多糖诱导的小鼠神经炎症的改善作用

(1)实验分组及给药方案

小鼠随机分为4组，每组8只，分别为空白对照组、模型组、化合物治疗低剂量组(低剂量组)和化合物治疗高剂量组(高剂量组)。在造模前48h，24h时，尾静脉注射表大麻二醇水合物DMSO溶液(1mg/kg,10mg/kg)，给药体积为4mL/kg，空白对照组和造模组注射等量的DMSO。

(1)脂多糖诱导的小鼠神经炎症模型的建立

小鼠腹腔注射脂多糖生理盐水溶液0.33mg/kg，10mL/kg。三小时后，进行后续试验。

(3)小鼠自主行为、探究行为与紧张度的评价

试验在安静的环境下进行。将动物放入底边长50cm，高度30cm的箱内底面中心，同时进行摄像和计时。观察5min后停止摄像。清洗方箱内壁及底面，以免上次动物余留的信息(如动物的大、小便、气味等)影响之后测试结果。更换动物，继续试验。使用Any-maze软件统计运动距离，静止时间等参数。

本发明表大麻二醇改善脂多糖诱导的小鼠神经炎症图如图8A至8C所示，其中^**P<0.01,vs Control；^#P<0.05,vs LPS,(Graphpad 6.0,One-way Anova)；说明其可改善脂多糖诱导的神经炎症反应，具有神经保护作用。

(4)脑组织促炎/抗炎细胞因子mRNA表达的测定

以5％异氟烷过量麻醉处死小鼠后取大脑皮层，在脑组织匀浆中提取RNA，RT-qPCR法检测脑组织中TNF-α、IL-1β的表达量，方法引物等同实施例1中所述。

反应结束后用ΔΔCt法计算各基因的相对表达量。试验结果如图9A至图9B所示，其中^**P<0.01,vs Control；^#P<0.05,vs LPS,(Graphpad 6.0,One-way Anova)。结果显示，表大麻二醇水合物能够显著抑制LPS刺激后小鼠大脑细胞促炎细胞因子mRNA的增加，在动物水平上具有抗炎的药效。

通过以上3个实施例，分别从细胞和动物水平上验证了表大麻二醇水合物抗炎及抗缺血性脑卒中的作用，结果表明：脂多糖引起小胶质细胞中炎症因子TNF-α蛋白的表达，并增加促炎细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6的mRNA表达上调，但10μM的表大麻二醇水合物能够显著抑制TNF-α蛋白及以上促炎细胞因子mRNA的表达。并且，表大麻二醇水合物能够显著促进抗炎因子CD206及TGF-β1mRNA的表达，在10μM及以下浓度未见明显细胞毒性。动物实验结果显示：表大麻二醇水合物能够显著改善脑缺血再灌注损伤所致的神经功能缺损，减轻小鼠短暂性大脑缺血再灌注损伤后的脑梗死体积，显著抑制小鼠大脑促炎细胞因子mRNA的增加，具有神经保护作用。并且，表大麻二醇水合物能够显著改善脂多糖诱导的神经炎症反应，显著抑制小鼠大脑促炎细胞因子mRNA的增加，具有抑制神经炎症及神经保护作用。这些实例结果表明：表大麻二醇水合物具有治疗包括缺血性脑卒中、出血性脑卒中、脑外伤、高原脑损伤、抑郁症、癫痫等其它脑损伤疾病的潜力，用于制备预防和/或治疗脑损伤的药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.表大麻二醇水合物在制备预防和/或治疗缺血性脑卒中导致的脑损伤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述表大麻二醇水合物的化学结构式如下：

。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述表大麻二醇水合物通过抑制促炎因子和促进抗炎因子表达，减轻体内外神经炎症反应，在制备预防和/或治疗缺血性脑卒中导致的脑损伤药物中的应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述表大麻二醇水合物通过显著降低短暂性大脑中动脉阻塞后脑梗死体积，在制备治疗缺血性脑卒中导致的脑损伤药物中应用。

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