KR101858128B1 - Sulf2 억제제를 포함하는 방사선 내성 암의 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Sulf2 억제제를 포함하는 방사선 내성 암의 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 SULF2의 발현을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 방사선 내성 암 치료용 약학 조성물, 상기 약학 조성물을 투여하여 방사선 내성 암을 치료하는 방법, SULF2의 발현을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 암의 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 약학 조성물을 투여하여 암의 전이를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 약학 조성물을 이용하면, 종래의 방사선 치료방법 등을 그대로 사용하면서도 상기 방사선 조사에 대한 저항성을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 암의 전이를 효과적으로 억제할 수 있으므로, 암의 효과적인 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

SULF2 억제제를 포함하는 방사선 내성 암의 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for treating cancer having radioresistant phenotype comprising SULF2 inhibitor}
본 발명은 SULF2 억제제를 포함하는 방사선 내성 암의 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 SULF2의 발현을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 방사선 내성 암 치료용 약학 조성물, 상기 약학 조성물을 투여하여 방사선 내성 암을 치료하는 방법, SULF2의 발현을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 암의 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 약학 조성물을 투여하여 암의 전이를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
암 치료에 주로 사용되고 있는 방법에는 외과적 수술, 항암 화학 요법, 방사선 요법 등이 있다. 이 중 수술과 방사선치료는 절제부위 또는 조사부위에만 효과가 있는 국소요법이고, 항암제 치료요법은 전신에 효과를 나타내는 전신요법이다. 대부분의 암은 국소에서 발병하여 전신으로 전이되는 질환이며, 아주 조기에 발견된 경우를 제외하고는 이미 미세한 전신 전이가 존재하기 때문에, 효과적인 국소요법에도 불구하고 재발하는 경우가 많아 대부분의 암 치료에는 국소요법 뿐만 아니라 전신에 퍼진 암에 보다 효과가 있는 항암제 치료요법을 함께 사용하고 있다.
암치료 요법에 있어서 항암제 투여는 외과적으로 암부위를 제거한 이후에 육안으로 관찰하기 어려운 아주 작은 암 조직이나 원발성 부위에서 타 조직으로 전이된 암세포를 제거하는 중요한 치료법이다. 그러나, 암종별로 특정한 항암제에 대하여 내성을 갖고 있거나, 또는 장기적으로 특정 항암제를 투여할 때, 암세포가 약물내성을 획득하여 항암 효과를 제대로 볼 수 없게 되는 경우가 발생될 수 있다. 지금까지 알려진 암세포가 내성을 나타내는 항암제로는 주로 친수성의 양쪽 친매성 약물, 예를 들어, 탁산(taxane), 빈카 알카로이드(vinca alkaloid) 계열 약물(vinorelbine, vincristine, vinblastine), 안스라사이클린(anthracycline) 계열약물(doxorubicin, daunorubicin, epirubicin), 에피도필로톡신(epidophyllotoxin: etoposide, teniposide), 대사길항제(antimetabolites: methorexate, fluorouracil, cytosar, 5-azacytosine, 6-mercaptopurine, gemcitabine), 토포테칸(topotecan), 닥티노마이신(dactinomycin), 미토마이신(mitomycin) 등의 항암 약물을 사용하였을 경우 나타날 수 있다. 이러한 암 치료에서 암세포의 항암제 내성 획득이라는 문제는 오래 전부터 종양을 치료하는데 큰 장애요인이 되고 있다.
이러한 장애요인을 해소하기 위하여 다양한 연구가 수행되고 있는데, 예를 들어, 대한민국특허공개 2011-88771호에는 PI3K/Akt 저해제를 세툭시맙 또는 제피티닙과 병용하여 투여함으로써 세툭시맙 또는 제피티닙에 대한 내성을 갖는 암을 치료하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국특허공개 제2011-139397에는 5,6-벤조플라본(5,6-benzoflavone) 화합물을 이용하여 항암제내성 암을 예방 또는 치료하는 방법이 개시되어 있으며, WO 2011/031842에는 N-(4-((3-(2-아미노-4-피리미디닐)-2-피리디닐)옥시)페닐)-4-(4-메틸-2-티에닐)-1-프탈라진아민 또는 그의 제약상 허용되는 염을 이용하여 내성이 형성된 고형종양을 치료하는 방법이 개시되어 있고, WO 2011/031890에는 치료적으로 유효한 양의 소디움 메타 아르세나이트를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하여 약물내성 암을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 이러한 내성 암의 치료방법은 특정한 조건을 갖춘 환자에만 적용될 수 있다는 단점이 있어, 일반적인 내성 암의 치료에는 효과적으로 적용되지 못하고 있는 실정이다.
현재로써 암에 대한 치료율을 향상시키기 위해서는 조기진단에 의해 근치적 수술의 확대가 필요할 뿐만 아니라, 수술이 불가능한 환자 또는 수술 후 재발의 위험이 높은 환자에 대해 항암제 치료요법의 효과적인 사용방법의 개발이 필요지만, 이러한 치료요법의 개발시에는 항암제에 대한 암세포 내성 기작의 규명이 있어야 하며, 이를 토대로 내성극복의 방법이 모색되어야 하지만, 이에 대한 연구는 아직 시작단계에 불과한 수준이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 방사선 내성이 발생된 암환자를 보다 효과적으로 치료할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 다양한 암세포에서 발현되는 SULF2 단백질이 암세포에 방사선에 대한 내성을 부여할 뿐만 아니라, 암세포의 전이를 촉진하는 역할을 수행하므로, 상기 SULF2의 발현을 억제할 경우, 방사선 치료에 대한 암세포의 내성을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 암세포의 전이를 억제할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 SULF2의 발현을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 방사선 내성 암의 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 약학 조성물을 투여하여 방사선 내성 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 SULF2의 발현을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 암의 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약학 조성물을 투여하여 암의 전이를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 내성이 발생된 암환자를 보다 효과적으로 치료할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 방사선 조사에 대하여 저항성을 갖는 암세포에 방사선을 조사하면서, 상기 방사선 조사에 의하여 발현수준이 증가되는 유전자를 발굴한 결과, SULF2를 발굴하였다. 방사선 조사에 대한 상기 SULF2의 작용기작 및 효과를 연구한 결과, 상기 SULF2은 방사선 조사시 p53을 통해서 발현이 증가되므로, 야생형 p53이 발현되는 암세포에서는 방사선 조사시 발현수준이 증가함을 확인하였고, β-카테닌 단백질을 안정화시킴을 통해 IL-6의 발현수준을 증가시키며, 산화라디칼의 처리에 의한 세포사멸에 대하여 저항성을 나타내는 주요 원인임을 확인하였고, 암세포에서 상기 SULF2의 발현을 억제할 경우, 방사선 조사에 대한 저항성을 나타내지 않음을 확인하였다.
뿐만 아니라, 방사선 조사에 의하여 발현수준이 증가된 SULF2는 β-카테닌 및 IL-6 단백질을 통해 STAT3-Bcl-XL 신호전달 경로를 활성화시켜서, 암세포의 침윤 및 전이를 촉진하는 효과를 나타냄을 확인하였는데, 상기 SULF2의 발현을 억제할 경우, 방사선을 조사하여도 암세포의 침윤 및 전이 수준이 저하됨을 확인하였다.
따라서, 상기 SULF2의 발현을 억제하면, 방사선 내성 암의 치료효과를 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 암의 전이를 억제할 수 있음을 알 수 있었다. 이처럼 방사선 내성 암과 암의 전이에 미치는 SULF2의 효과는 지금까지 전혀 알려지지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 SULF2(sulfatase 2) 유전자의 발현을 억제하거나 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 활성을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 방사선 내성 암의 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 SULF2 유전자의 발현을 억제하거나 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 활성을 억제할 수 있는 제제는 SULF2의 발현을 억제하고, 암세포에서 SULF2가 발현되어 나타나는 방사선 내성을 제거 또는 약화시킴으로써, 보다 용이하게 암을 치료할 수 있도록 하는 역할을 수행하며, 이처럼 SULF2 유전자의 발현을 억제하거나 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 활성을 억제하여 암세포 자체의 내성을 제거하거나 또는 약화시킴으로써 새로운 항암제의 개발없이 내성 암을 치료할 수 있는 방법은 종래의 어떤 연구그룹에서도 보고되지 않았으며, 본 발명자에 의하여 최초로 제공되었다.
이에 따라, 본 발명에서 제공하는 약학 조성물은 암이 발생된 개체에 단독으로 투여될 수도 있으나, 바람직하게는, 방사선 조사를 수행하면서 상기 약학조성물이 함께 투여하거나, 또는 다른 항암치료용 조성물(예를 들어, 독소루비신, 빈블라스틴 등)과 함께 병용하여 투여될 수 있다.
본 발명의 용어 "SULF2(sulfatase 2)"란, 설파타제 2(sulfatase 2) 또는 헤파란 설페이트 6-O-엔도설파타제(heparan sulfate 6-O-endosulfatases)라 명명된 효소를 코딩하는 유전자로서, 암세포에서 p53의 전사표적 유전자로 알려져 있다. 상기 유전자에 의해 발현되는 효소는 약 125kDa의 분자량을 갖는 형태로 발현된 후, 후처리과정을 거쳐 약 75kDa의 크기를 갖도록 가공된 후에 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 상기 효소는 헤파린 결합 성장인자(heparin-binding growth factors)와 사이토카인의 보조수용복합체(coreceptor)인 HSPGs(Heparan sulfate proteoglycans)로부터 6-O-황그룹(6-O-sulfate groups)을 제거하는 활성을 갖고, 대장암 세포, 폐암 세포 등의 다양한 종양세포에서 발현된다고 알려져 있다. 상기 SULF2 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열은 NCBI의 GeneBank 등 공지의 데이터베이스(예를 들어, GenBank No. NM_001161841, NP_001155313 등)에서 얻을 수 있다. 그러나, 상기 공지된 서열 뿐만 아니라, 상기 SULF2와 동일하게 암세포에 방사선 내성을 제공하는 효과를 나타내는 한, 상기 공지된 아미노산 서열의 일부 아미노산이 부가, 치환, 결실 등의 방법으로 변이된 변이체도 본 발명에서 제공하는 SULF2의 범주에 포함될 수 있다.
본 발명의 용어 "발현을 억제할 수 있는 제제"란, 유전자에서 발현되어 생산되는 전사체 또는 단백질의 생성을 억제할 수 있는 물질을 의미한다. 상기 제제로는 유전자에 결합하여 전사수준에서 억제하는 전사인자; 전사되어 합성된 전사체에 결합하는 miRNA, siRNA, shRNA 등의 간섭 RNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드; 발현된 SULF2 단백질과 결합할 수 있는 항체, 앱타머 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "간섭 RNA(short interfering RNA)"란, 유전자의 활성을 억제하는 RNAi를 유발시킬 수 있는 이중가닥 RNA를 의미한다. 본 발명에 있어서 상기 간섭 RNA는 SULF2의 발현을 억제할 수 있는 miRNA, siRNA, shRNA 등이 될 수 있는데, 상기 간섭 RNA는 SULF2의 mRNA를 유발시키기만 하면 어떠한 형태의 것도 가능한데, 예를 들면, 화학합성 또는 생화학적 합성 또는 생체내 합성에 의해 수득되는 siRNA, 혹은 약 40개 염기 이상의 이중가닥 RNA가 체내에서 분해된 10개 염기대 이상의 이중가닥 RNA 등을 사용할 수 있다.
상기 간섭 RNA는 SULF2 RNA의 핵산서열의 일부에 대하여 약 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 100%의 상동성을 가지는 서열로 구성될 수 있고, 이중가닥 부분을 포함하는 RNA 또는 그의 개변체를 사용할 수도 있다. 상동성을 가지는 서열부분은, 통상적으로 적어도 15 뉴클레오티드 이상이고, 바람직하게는 약 19 뉴클레오티드 이상이며, 보다 바람직하게는 적어도 20 뉴클레오티드 이상이고, 더욱 바람직하게는 21 뉴클레오티드 이상이 될 수 있다. 일 예로서, 상기 간섭 RNA는 상기 SULF2 유전자의 발현을 억제하는 간섭 RNA는 서열번호 15 및 16으로 구성되는 siRNA 또는 서열번호 17 및 18로 구성되는 siRNA 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"란, 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하는데, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 구체적으로 8 내지 60 염기, 보다 구체적으로, 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 SULF2 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있고, 바람직하게는 SULF2 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 그의 일부가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "앱타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상기 앱타머는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드, 화합물, 중합체 등의 다양한 물질을 표적분자로서 사용할 수 있고, 단백질보다 안정성이 우수하며, 구조가 간단하면서도, 핵산으로 구성되어 합성이 용이하기 때문에, 다양한 표적분자를 검출하는 방법에 이용되고 있다.
본 발명에 있어서, 상기 앱타머는 SULF2 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "방사선 내성 암"이란, 방사선 치료에 대하여 극히 낮은 감수성을 나타내어 상기 치료법에 의하여 암의 증세가 호전, 완화, 경감 또는 치료증상을 나타내지 않는 암을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 내성암은 방사선 치료에 대하여 처음부터 내성을 갖을 수도 있고, 최초에는 내성을 나타내지 않았으나, 긴시간의 치료로 인하여 암세포내의 유전자가 변이되어 동일한 치료방법에 대하여 더이상 감수성을 나타내지 않게 되어 발생할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 내성 암은 SULF2의 과발현에 의하여 방사선 치료에 대하여 내성을 나타내는 한 이에 특별히 제한되지 않는 모든 암이 될 수 있는데, 일 예로서 암세포에서 야생형 p53, β-카테닌 및 IL-6를 발현하는 암이 될 수 있고, 다른 예로서, 암세포에서 야생형 p53, β-카테닌 및 IL-6를 발현하는 대장암, 폐암, 신경교종 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명의 약학 조성물을 투여함으로써, 방사선 내성 암이 호전되거나 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 본 발명의 방사선 내성 암의 치료용 약학 조성물은 SULF2 억제제를 포함하여, SULF2에 의하여 제공되는 방사선 치료에 대한 내성을 억제하는 효과를 나타내므로, 단독으로 방사선 내성 암이 발병된 환자에게 투여하여 방사선 내성 암을 치료할 수도 있고, 본 발명의 약학조성물과 SULF2에 의하여 발생한 내성에 의하여 별다른 치료효과를 나타내지 못한 종래의 항암제를 병행하여 투여함으로써, 방사선 내성 암을 치료할 수 있다. 특히, 상기 본 발명의 약학조성물과 종래의 항암제를 병용투여할 경우에는, 종래의 항암제가 나타내는 항암활성과 본 발명의 약학 조성물이 나타내는 항암활성이 중복되어 보다 효과적으로 암을 치료할 수 있다. 이때, 사용될 수 있는 종래의 항암제는 SULF2에 의하여 내성을 형성하는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 독소루비신, 빈블라스틴, 탁솔, 에디포사이드, 시스플라틴, 5-FU, 이포스파마이드 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 방사선 조사에 대하여 높은 저항성을 나타내는 A549 세포에 방사선을 조사한 후, DNA 마이크로어레이 분석을 수행하여, 방사선 조사에 대한 내성에 관여하는 유전자를 발굴한 결과, 방사선 조사에 의하여 유전자의 발현수준이 2배 이상 증가된 11종의 유전자를 발굴하고, 이중에서 세포외부로 분비되는 단백질을 코딩하는 2종의 유전자인 IL-6와 SULF2를 확인하였다(표 1). 상기 확인된 2종의 유전자 중에서 IL-6는 방사선 조사에 의하여 발현이 증가됨이 공지되어 있으므로, 나머지 유전자인 SULF2가 방사선 조사와 어떠한 연관성이 있는지를 연구하였다. 그 결과, 방사선을 조사한 세포에서 SULF2의 mRNA 발현수준이 증가되고(도 2a), 방사선 조사에 의해 발현수준이 증가된 SULF2 단백질은 세포내에서 활성화된 후, 세포외로 분비되며(도 2b), 이러한 SULF2의 발현수준 증가는 p53에 의해 매개되고(도 3a), 이러한 현상은 A549 세포 뿐만 아니라, 다양한 폐암 세포, 대장암 세포를 비롯한 야생형 p53을 발현할 수 있는 모든 암세포에 공통적으로 적용될 수 있음을 확인하였다(도 3b).
또한, 방사선 조사에 의하여 발현수준이 증가되는 IL-6와 SULF2가 어떠한 연관성이 있는지를 연구한 결과, 방사선을 조사한 세포에서 IL-6의 mRNA 발현수준이 증가하고(도 4a), 방사선 조사에 의해 발현수준이 증가된 IL-6 단백질은 세포외로 분비되며(도 4b), SULF2의 발현수준이 증가되면 이에 따라 IL-6의 mRNA 및 단백질 수준도 증가하고(도 4c), SULF2가 IL-6의 발현수준을 향상시키는 과정에서 β-카테닌 단백질이 관여하며(도 4d), β-카테닌에 의해 SULF2의 발현수준이 변화되지는 않았으나, IL-6의 발현수준은 변화됨(도 4e)을 확인하였다.
끝으로, 방사선 저항성에 대한 SULF2와 IL-6의 연관성을 연구한 결과, 방사선 조사와 유사한 세포사멸 기작을 나타내는 H2O2가 처리된 암세포에서는 H2O2를 단독으로 처리하면 세포 생존율이 저하되었으나, H2O2를 처리한 경우에도 SULF2를 과발현시키면 저하된 세포 생존율이 회복되었고(도 5a), H2O2를 단독으로 처리하면 세포 생존율이 저하되었으나, IL-6를 전처리한 후 H2O2를 처리하면 세포 생존율의 저하를 억제하며(도 5b), IL-6 대신 방사선을 전처리한 후 H2O2를 처리하여도 세포 생존율의 저하를 억제하였고(도 5c),
방사선을 전처리하고, SULF2 또는 IL-6의 발현을 억제한 후, H2O2를 처리하면 세포 생존율이 저하됨(도 5d)을 확인하였다.
상기 결과로부터, 암세포에 방사선을 처리하여 발현수준이 증가되는 SULF2는 세포내에서 활성화된 후 세포외로 분비되고, 상기 SULF2에 의하여 β-카테닌 단백질이 안정화되고, 상기 안정화된 β-카테닌 단백질에 의하여 IL-6의 발현수준이 증가되며, 상기 방사선 처리와 같이 암세포를 사멸시키기 위한 자극에 대하여, SULF2 및 IL-6가 저항성을 나타내는 역할을 수행함을 알 수 있었다.
따라서, 방사선 조사시에 암세포에서 SULF2의 발현을 억제하면, 방사선 조사에 대한 암세포의 저항성을 제거하여 방사선 치료효율을 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.
상기 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 담체는 비자연적인 담체가 될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물에 포함된 상기 제제의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10 중량%의 함량으로 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있으며, 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학적 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 10 내지 100 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 10 내지 30 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 내지 3회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 방사선 내성 암이 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방사선 내성 암을 치료하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 약학 조성물을 개체에 단독으로 투여할 수도 있고, 방사선 조사를 수행하면서 상기 약학조성물을 투여할 수도 있으며, 본 발명의 약학 조성물과 다른 항암치료용 조성물(예를 들어, 독소루비신, 빈블라스틴 등)을 병용하여 투여할 수도 있다.
본 발명의 용어 "개체"는 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 상기 방사선 내성 암이 발병되거나 발병될 가능성이 있는 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 또는 인간을 포함한다. 본 발명에 따른 약학 조성물을 개체에게 투여함으로써, 상기 방사선 내성 암을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 치료방법은 인간을 제외한 동물을 치료하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 인간의 경우 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있음을 고려할 때, 인간의 치료에 있어서도 충분히 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태로서, 본 발명은 SULF2(sulfatase 2) 유전자의 발현을 억제하거나 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 활성을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 암의 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
통상적으로, 암세포를 대상으로 항암처리를 수행한 경우에, 상기 항암처리 후에도 생존하는 암세포는 항암처리로 인하여 오히려 암세포의 증식이 촉진되거나 또는 암세포의 전이가 유발되는 현상이 나타날 수 있다고 알려져 있다. 이에 따라, 방사선 조사에 의하여 암세포로부터 발현수준이 증가된 SULF2 또는 IL-6가 암세포의 전이에 연관되는지의 여부를 확인한 결과, 방사선이 조사된 암세포에서는 SULF2가 과발현되고, 과발현된 SULF2는 IL-6의 과발현을 유도하며, 상기 과발현된 IL-6는 STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로를 활성화시켜서 암세포의 침윤을 촉진함을 알 수 있었다. 또한, 방사선을 조사한 이종이식 종양 마우스 모델에서도 방사선 조사에 의하여 암세포 내에서 SULF2 mRNA의 수준이 증가하고, 이로 인하여 혈류내 암세포의 수준이 증가하였으나, 상기 마우스 모델에 이식된 종양세포에서 SULF2의 발현을 억제하면 혈류내 암세포의 수준의 증가를 억제할 수 있음을 확인하였다. 따라서, SULF2의 발현을 억제하면, 종양의 전이를 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명에서 제공하는 암의 전이 예방 또는 치료용 약학 조성물에 포함되는 SULF2 유전자의 발현을 억제하거나 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 활성을 억제할 수 있는 제제 및 그의 함량, 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제 등은 상술한 바와 동일하고, 상기 약학 조성물과 병행하여 투여될 수 있는 종래의 항암제, 상기 약학 조성물의 투여량 및 투여빈도 역시 상술한 바와 동일하다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 방사선 조사에 의해 유도된 암세포의 침윤에 미치는 SULF2의 작용을 확인하는 연구를 수행한 결과, 방사선 조사가 SULF2 의존적으로 STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로의 활성화와 세포 침윤을 자극하고(도 6a), SULF2가 과발현되면 STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로에 관여하는 주요 단백질인 STAT3, 인산화된 STAT3 및 Bcl-XL의 수준이 증가하며(도 6b), SULF2가 STAT3-Bcl-XL 신호전달 경로를 활성화시켜서 암세포의 침윤을 유도하고(도 6c), IL-6를 처리하여도 암세포의 침윤 비율 및 STAT3, 인산화된 STAT3 및 Bcl-XL의 수준이 증가하며(도 7a), SULF2의 과발현에 의한 STAT3-Bcl-XL 신호전달 경로의 활성화는 IL-6에 의해 매개되고(도 7b), SULF2의 과발현에 의한 세포 침윤의 촉진 역시 IL-6에 의해 매개됨(도 7c)을 확인하였다.
한편, 암세포의 침윤을 촉진하는 SULF2의 작용이 생체내에서도 나타나는지의 여부를 연구한 결과, 생체내에서도 방사선 조사에 의하여 SULF2 mRNA의 수준이 증가하고(도 8b), 생체내에서도 방사선 조사에 대하여 저항성을 나타내는 종양은 SULF2의 효과로 인하여 증식이 촉진되며(도 9c), 이종이식 종양 마우스 모델에 방사선을 조사한 경우 혈류에 침투한 암세포의 수준이 급격히 증가하였으나, 방사선을 조사하면서 SULF2의 발현을 억제하면 혈류에 침투한 암세포의 수준이 증가하지 않음(도 9d)을 확인하였다.
상기 결과를 종합하면, 암세포에 방사선이 조사되면, p53에 의하여 SULF2의 발현이 증가되고, 암세포내에서 발현된 SULF2는 활성화된 후 세포외부로 분비되며, 상기 세포외로 분비된 SULF2는 암세포내에서 발현된 β-카테닌 단백질을 안정화시키고, 안정화된 β-카테닌 단백질은 IL-6의 발현을 증가시키며, 발현된 IL-6는 세포외로 분비된 다음, STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로를 활성화시켜서, 암세포의 침윤 또는 전이를 촉진시킴을 알 수 있었다(도 1). 도 1은 본 발명에서 제공하는 SULF2가 방사선 조사에 의해 암세포의 침윤을 촉진시키는 작용기작을 도시화하여 나타낸 개략도이다.
따라서, 암세포에 방사선을 조사하여 암세포가 사멸되지 않으면, 상기 방사선의 조사로 인하여 혈류내 암세포의 수준이 증가하여 전이암의 발병 가능성이 증가하지만, SULF2의 발현을 억제하면 이러한 전이암의 발병 가능성을 저하시킬 수 있으므로, 상기 SULF2의 발현을 억제할 수 있는 제제는 암의 전이를 예방 또는 치료하는 치료제의 유효성분으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 암의 전이가 유발될 가능성이 있거나 또는 암의 전이가 유발된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 전이를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 약학 조성물을 개체에 단독으로 투여할 수도 있고, 본 발명의 약학 조성물과 다른 항암치료용 조성물(예를 들어, 독소루비신, 빈블라스틴 등)을 병용하여 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물을 이용하면, 종래의 방사선 치료방법 등을 그대로 사용하면서도 상기 방사선 조사에 대한 저항성을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라, 암의 전이를 효과적으로 억제할 수 있으므로, 암의 효과적인 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에서 제공하는 SULF2가 방사선 조사에 의해 암세포의 침윤을 촉진시키는 작용기작을 도시화하여 나타낸 개략도이다.
도 2a는 방사선 조사 후, 시간의 경과에 따른 SULF2의 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 전기영동 사진 및 그래프이다.
도 2b는 방사선 조사 후, 24시간 또는 48시간 동안 배양된 배양물의 세포 파쇄물과 배지에서 검출된 125kDa의 불활성화된 SULF2 단백질과 125kDa의 활성화된 SULF2 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 3a는 p53의 발현여부 및 방사선 조사여부에 따른, 세포내 SULF2 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 3b는 다양한 암세포주를 대상으로 γ-선의 처리여부에 따른 SULF2 mRNA 수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 4a는 방사선 조사 후, 시간의 경과에 따른 IL-6의 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 전기영동 사진 및 그래프이다.
도 4b는 방사선 조사 후, 24시간 또는 48시간 동안 배양된 배양물의 세포 파쇄물과 배지에서 검출된 IL-6 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다.
도 4c는 SULF2의 과발현이 IL-6의 발현에 미치는 영향을 나타내는 전기영동 사진이다.
도 4d는 SULF2의 발현이 억제된 조건에서 방사선의 조사에 따른 IL-6과 β-카테닌의 mRNA 및 단백질 수준의 변화를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 4e는 β-카테닌, IL-6 및 SULF2의 연관성을 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 5a는 H2O2 처리에 의한 세포사멸에 대한 SULF2의 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 H2O2 처리에 의한 세포사멸에 대한 IL-6 전처리의 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5c는 H2O2 처리에 의한 세포사멸에 대한 방사선 전처리의 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5d는 H2O2 처리에 의한 세포사멸에 대한 방사선 전처리의 효과에 미치는 SULF2 및 IL-6의 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6a는 방사선 조사에 따른 세포 침윤수준 및 STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로에 관여하는 구성요소의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 전기영동 사진이다.
도 6b는 SULF2의 과발현이 STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로에 미치는 영향을 나타내는 전기영동 사진이다.
도 6c는 SULF2의 과발현 및 STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로의 불활성화가 암세포 침윤에 미치는 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프 및 전기영동 사진이다.
도 7a는 IL-6의 처리가 암세포의 침윤 및 STAT3-Bcl-XL 신호전달에 미치는 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프 및 전기영동 사진이다.
도 7b는 SULF2의 과발현 및 IL-6의 발현억제가 STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로에 미치는 효과를 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 7c는 SULF2의 과발현 및 IL-6의 발현억제가 세포 침윤에 미치는 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 이종이식 종양이 발생된 동물모델에서 이종이식 종양 부위에 조사된 방사선의 용량에 따른 이종이식 종양의 부피변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8b는 2Gy의 방사선을 조사한 동물모델의 이종이식 종양 부위에서 확인된 SULF2 mRNA의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, (●)는 방사선 조사후 1일이 경과된 시점에서 대조군 동물모델에서 측정된 SULF2 mRNA의 수준을 나타내고, (○)는 방사선 조사후 1일이 경과된 시점에서 실험군 동물모델에서 측정된 SULF2 mRNA의 수준을 나타내며, (▲)는 방사선 조사후 2일이 경과된 시점에서 대조군 동물모델에서 측정된 SULF2 mRNA의 수준을 나타내고, (△)는 방사선 조사후 2일이 경과된 시점에서 실험군 동물모델에서 측정된 SULF2 mRNA의 수준을 나타내며, (■)는 방사선 조사후 5일이 경과된 시점에서 대조군 동물모델에서 측정된 SULF2 mRNA의 수준을 나타내고, (□)는 방사선 조사후 5일이 경과된 시점에서 실험군 동물모델에서 측정된 SULF2 mRNA의 수준을 나타낸다.
도 9a는 sh-SULF2의 도입여부에 따른 세포에서 방사선의 조사에 의한 SULF2 mRNA를 검출한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 9b는 SULF2의 발현억제 및 방사선 조사에 따른, 이종이식 종양의 이식상태를 나타내는 형광사진이다.
도 9c는 SULF2의 발현억제 및 방사선 조사에 따른, 이종이식 종양의 부피변화를 나타내는 그래프이다.
도 9d는 SULF2의 발현억제 및 방사선 조사에 따른, 혈류 침투성 분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프 및 현미경 사진이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 방사선 조사에 대한 내성에 관여하는 유전자의 발굴
실시예 1-1: 방사선 조사에 대한 내성에 관여하는 유전자의 발굴
폐암세포주인 A549 세포는 방사선 조사에 대하여 높은 저항성을 나타내기 때문에, 상기 A549 세포에 방사선을 조사한 후, DNA 마이크로어레이 분석을 수행하여, 방사선 조사에 대한 내성에 관여하는 유전자를 발굴하고자 하였다.
구체적으로, 10%의 불활성화된 FBS를 포함하는 RPMI-1640 배지에서 배양된 A549 세포에 10 Gy의 γ-선을 조사하고 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, Hybrid-RTM Kit (GeneAll, Seoul, Korea)를 이용하여 방사선을 처리하거나 또는 처리하지 않은 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 상기 추출된 총 RNA, M-MLV Reverse Transcriptase 및 Oligo(dT)15 프라이머를 사용하여 cDNA를 합성하고, 상기 합성된 cDNA와 GeneChip® HuGene-1_0-st-v1를 사용한 ISTECH (Seoul, Korea)를 사용하여 DNA 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 상기 분석을 통해 얻어진 자료는 RMA algorithm and Affymetrix Expression Console 프로그램 및 Gene Ontology database (Version 2007-02)을 통해 분석하고, 이로부터 2배 이상 발현수준이 변화된 유전자를 선별하였다. 그 결과, 발현수준이 2배 이상 증가된 11개의 유전자를 확인하였다(표 1).
γ-선 조사에 의하여 A549 세포에서 발현이 증가된 유전자
유전자 발현증가수준 발현위치
TP53INP1
ACTA2
MDM2
BTG2
FDXR
TP53I3
DGKA
CYFIP2
IL-6
SULF2
SESN1		 3.595574
2.920948
2.755156
2.723974
2.621785
2.468641
2.34046
2.24827
2.084982
2.078101
2.033297		 세포내
세포내
세포내
세포내
세포내
세포내
세포내
세포내
세포외
세포외
세포내
상기 표 1에서 보듯이, 11개의 유전자 중에서 2개의 유전자인 IL-6와 SULF2 만이 세포외로 분비되는 단백질을 코딩하는 유전자로 확인되었다. 상기 IL-6는 방사선 조사에 의하여 발현수준이 증가함이 이미 공지되어 있으나, SULF2는 방사선 조사와 관련된 연관성이 전혀 알려져 있지 않고, 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.
실시예 1-2: 방사선 조사후 시간의 경과에 따른 SULF2의 mRNA 발현수준의 변화
상기 실시예 1-1의 방법으로, A549 세포에 10 Gy의 γ-선을 조사하고 24시간 또는 48시간 동안 배양된 세포로부터, 각각의 총 RNA를 추출하고, 이로부터 cDNA를 합성하였다.
먼저, 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하고 하기의 프라이머를 사용한 역전사 PCR을 수행하고, 이의 증폭산물을 전기영동하였다(도 2a의 상단). 이때, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
SULF2 F: 5'-GAA AAG AGG CAG ATT CAC GTC GTT TCC AG-3'(서열번호 1)
SULF2 R: 5'-ATC TGG TGC TTC TTT TGG GAT GCG GGA G-3'(서열번호 2)
GAPDH F: 5'-CAT CTC TGC CCC CTC TGC TGA-3'(서열번호 3)
GAPDH R: 5'-GGA TGA CCT TGC CCA CAG CCT-3'(서열번호 4)
다음으로, 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하고 하기의 프라이머를 사용한 실시간 PCR을 수행하고, 증폭된 산물의 수준을 정량분석하였다(도 2a의 하단). 이때, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
SULF2 F: 5'-CCT CTT CCC AAA CGC ATC TC-3'(서열번호 5)
SULF2 R: 5'-GCG CAT GAT CCA GTG TTT GT-3'(서열번호 6)
GAPDH F: 5'-CAT CTC TGC CCC CTC TGC TGA-3'(서열번호 7)
GAPDH R: 5'-GGA TGA CCT TGC CCA CAG CCT-3'(서열번호 8)
도 2a는 방사선 조사 후, 시간의 경과에 따른 SULF2의 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 전기영동 사진 및 그래프이다. 도 2a에서 보듯이, 방사선을 조사한 세포에서 SULF2의 mRNA 발현수준이 증가됨을 확인하였다.
실시예 1-3: 방사선 조사후 시간의 경과에 따른 SULF2의 단백질 수준의 변화
상기 SULF2 단백질은 세포외로 분비되는 단백질이기 때문에, 방사선 조사후, 시간의 경과에 따른 SULF2 단백질의 위치를 확인하고자 하였다.
이를 위하여, 상기 실시예 1-1의 방법으로, A549 세포에 10 Gy의 γ-선을 조사하고 24시간 또는 48시간 동안 배양된 배양물로부터 배지와 균체를 분리하고, 상기 균체의 파쇄물(cell lysate)과 배지(conditioned media)를 대상으로, 125kDa의 불활성화된 SULF2 단백질과 75kDa의 활성화된 SULF2 단백질의 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 2b). 이때, 균체의 파쇄물에 대한 내부대조군으로는 β-액틴을 사용하였고, 배지에 대한 내부대조군으로는 Ponseau S로 염색한 결과를 사용하였다.
도 2b는 방사선 조사 후, 24시간 또는 48시간 동안 배양된 배양물의 세포 파쇄물과 배지에서 검출된 125kDa의 불활성화된 SULF2 단백질과 125kDa의 활성화된 SULF2 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 2b에서 보듯이, 방사선 조사후 24시간이 경과된 세포에는 125kDa의 불활성화된 SULF2 단백질과 75kDa의 활성화된 SULF2 단백질이 모두 존재하지만, 48시간이 경과된 세포에는 125kDa의 불활성화된 SULF2 단백질이 대다수를 차지하고, 75kDa의 활성화된 SULF2 단백질은 미량으로 존재함을 확인하였다. 이에 반하여, 배지에는 125kDa의 불활성화된 SULF2 단백질은 존재하지 않고, 75kDa의 활성화된 SULF2 단백질 만이 검출되었고, 24시간이 경과된 시점 보다는 48시간이 경과된 시점에서 상기 75kDa의 활성화된 SULF2 단백질의 수준이 증가함을 확인하였다.
상기 결과로부터, 방사선 조사에 의해 발현수준이 증가된 SULF2 단백질은 세포내에서 활성화된 후, 세포외로 분비됨을 알 수 있었다.
실시예 2: SULF2와 방사선 조사와의 연관성 분석
상기 실시예 1의 결과로부터 다음과 같이 가정하고, 이를 확인하고자 하였다: 첫 째, 방사선 조사에 대하여 높은 저항성을 갖는 암세포에서는 방사선 조사시에 SULF2의 발현이 증가하는데, 상기 SULF2의 발현 증가가 방사선 조사에 의해 자극되는 주요 전사인자인 p53과 연관성이 있을 것이라고 가정하였고, 둘 째, 암세포에서는 방사선 조사시에 분비성 단백질을 코딩하는 유전자인 SULF2와 IL-6의 발현수준이 증가하므로, SULF2와 IL-6 사이에 연관성이 있을 것으로 가정하였으며, 셋 째, 상기 SULF2와 IL-6는 방사선 조사에 대한 암세포의 저항성과 연관성이 있을 것으로 가정하였다.
실시예 2-1: SULF2와 p53의 연관성 분석
실시예 2-1-1: A549 세포에서 SULF2와 p53의 연관성 분석
A549 세포에 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 이용하여 대조군 siRNA(si-con) 또는 하기 p53 특이적인 siRNA(si-p53)를 도입하여 각각의 형질전환체를 수득하고, 상기 각 형질전환체에 γ-선(10 Gy)을 조사하거나 또는 조사하지 않은 다음, 24시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 형질전환체를 대상으로, 실시예 1-2의 방법으로 역전사 PCR을 수행하고, 그 결과를 비교하였다(도 2a). 이때, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
si-p53 sense: 5'-GUA AUC UAC UGG GAC GGA Att-3'(서열번호 9)
si-p53 antisense: 5'-UUC CGU CCC AGU AGA UUA Cca-3'(서열번호 10)
도 3a는 p53의 발현여부 및 방사선 조사여부에 따른, 세포내 SULF2 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 3a에서 보듯이, 방사선을 조사하면 SULF2의 mRNA 수준이 증가하지만, p53의 발현을 억제하면 방사선을 조사하더라도 SULF2의 mRNA 수준이 증가하지 않음을 확인하였다.
실시예 2-1-2: 다양한 암세포주에서 SULF2와 p53의 관련성 분석
상기 실시예 2-1에서, 폐암세포주인 A549 세포에서 p53의 발현억제를 통해 SULF2의 mRNA 수준의 증가를 억제할 수 있음을 확인하였는 바, 이러한 결과가 다른 암세포주에서도 동등한 수준으로 나타나는지를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 야생형 p53을 발현시키는 대장암 세포주인 HCT116 세포, 상기 HCT116 세포에서 p53의 발현을 억제하도록 형질전환된 HCT116 변이세포, p53을 발현시키지 않는 다른 폐암세포주인 H1299 세포, 야생형 p53을 발현시키는 또 다른 폐암세포주인 H460 세포, DNA 결합활성이 결실된 변이체 p53을 발현시키는 대장암 세포주인 SW620 세포 및 DNA 결합활성이 결실된 변이체 p53을 발현시키는 신경교종 세포주인 U251 세포를 대상으로, γ-선(10 Gy)을 조사하거나 또는 조사하지 않은 조건에서의 SULF2 mRNA 수준을 비교하였다(도 3b).
도 3b는 다양한 암세포주를 대상으로 γ-선의 처리여부에 따른 SULF2 mRNA 수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 3b에서 보듯이, 야생형 p53을 발현시키는 대장암 세포주인 HCT116 세포는 A549 세포와 마찬가지로, p53가 정상적으로 발현되면 방사선 조사에 의하여 SULF2 mRNA 수준이 증가하고, p53의 발현이 억제되면 방사선을 조사하더라도 SULF2 mRNA 수준이 증가하지 않음을 확인하였다. 또한, p53을 발현시키지 않는 다른 폐암세포주인 H1299 세포에서는 방사선을 조사하더라도 SULF2 mRNA 수준이 증가하지 않는 반면, 야생형 p53을 발현시키는 또 다른 폐암세포주인 H460 세포에서는 방사선을 조사할 경우 SULF2 mRNA 수준이 증가함을 확인하였다. 끝으로, 변이된 p53을 발현시키는 대장암 세포주인 SW620 세포와 신경교종 세포주인 U251 세포에서는, 방사선을 조사하더라도 SULF2 mRNA 수준이 증가하지 않음을 확인하였다.
상기 결과를 종합하면, 방사선 조사에 의하여 SULF2의 발현수준이 증가하는 현상은 폐암세포에 제한되지 않고, 대장암 세포를 비롯한 야생형 p53을 발현할 수 있는 모든 암세포에 공통적으로 적용될 수 있는 것이라 할 수 있으며, 방사선이 조사되면 상기 p53을 통해 SULF2의 발현수준을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2-2: 방사선 조사에 따른 SULF2와 IL-6의 연관성 분석
실시예 2-2-1: 방사선 조사후 시간의 경과에 따른 IL-6의 mRNA 발현수준의 변화
SULF2에 대한 프라이머 대신, 하기의 IL-6에 대한 프라이머를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1-2와 동일한 방법을 수행하여 방사선 조사후 시간의 경과에 따른 IL-6의 mRNA 발현수준의 변화를 확인하였다(도 4a).
역전사 PCR용 프라이머
IL-6 F: 5'-TCT GGA TTC AAT GAG GAG AC-3'(서열번호 11)
IL-6 R: 5'-TGA GAT GAG TTG TCA TGT CC-3'(서열번호 12)
실시간 PCR용 프라이머
IL-6 F: 5'-AGT GGC TGC AGG ACA TGA CAA-3'(서열번호 13)
IL-6 R: 5'-CAA TCT GAG GTG CCC ATG CTA-3'(서열번호 14)
도 4a는 방사선 조사 후, 시간의 경과에 따른 IL-6의 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 전기영동 사진 및 그래프이다. 도 4a에서 보듯이, 방사선을 조사한 세포에서 IL-6의 mRNA 발현수준이 증가하였고, 방사선 조사후 시간이 경과됨에 따라 상기 발현수준이 더욱 증가됨을 확인하였다.
실시예 2-2-2: 방사선 조사후 시간의 경과에 따른 IL-6 단백질 수준의 변화
상기 IL-6 단백질은 세포외로 분비되는 단백질이기 때문에, 방사선 조사후, 시간의 경과에 따른 IL-6 단백질의 위치를 확인하고자 하였다.
이를 위하여, 125kDa의 불활성화된 SULF2 단백질과 75kDa의 활성화된 SULF2 단백질의 항체 대신에, IL-6에 대한 항체를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1-3과 동일한 방법을 수행하여 배양물의 세포 파쇄물과 배지에서 방사선 조사후 시간의 경과에 따른, IL-6 단백질의 수준변화를 확인하였다(도 4b).
도 4b는 방사선 조사 후, 24시간 또는 48시간 동안 배양된 배양물의 세포 파쇄물과 배지에서 검출된 IL-6 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다. 도 4b에서 보듯이, 방사선 조사후 24시간이 경과된 세포에는 IL-6 단백질의 수준이 증가되지만, 48시간이 경과된 세포에는 IL-6 단백질의 수준이 오히려 감소함을 확인하였다. 이에 반하여, 배지에는 24시간이 경과된 시점 보다는 48시간이 경과된 시점에서 상기 IL-6 단백질의 수준이 증가함을 확인하였다.
상기 결과로부터, 방사선 조사에 의해 발현수준이 증가된 IL-6 단백질은 세포내에서 생성된 후, 세포외로 분비됨을 알 수 있었다.
실시예 2-2-3: SULF2와 IL-6의 연관성 분석
pcDNA3 벡터에 외래유전자를 도입하지 않은 대조군 벡터와 상기 pcDNA3 벡터에 SULF2 유전자를 도입한 SULF2 발현벡터를 각각 제작하고, 이들 각 벡터를 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)를 이용하여 A549 세포에 도입하여 각각의 형질전환체를 제조하였다.
상기 실시예 1-2 및 2-2-1의 방법을 이용하여 상기 제조된 각 형질전환체로부터 SULF2와 IL-6의 mRNA 수준을 측정한 후 비교하고, 상기 실시예 1-3 및 2-2-2의 방법을 이용하여 상기 제조된 각 형질전환체로부터 SULF2와 IL-6의 단백질 수준을 측정한 후 비교하였다(도 4c).
도 4c는 SULF2의 과발현이 IL-6의 발현에 미치는 영향을 나타내는 전기영동 사진이다. 도 4c에서 보듯이, SULF2의 발현수준이 증가되면 이에 따라 IL-6의 mRNA 및 단백질 수준도 증가됨을 확인하였다.
실시예 2-2-4: 방사선 조사에 따른 SULF2와 IL-6의 연관성 분석
상기 실시예 2-2-3의 결과로부터, SULF2와 IL-6가 연관성이 있다고 확인되었으므로, 상기 SULF2와 IL-6에 공통적으로 영향을 미치는 인자인 β-카테닌이 이들의 연관성에 관여하는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, A549 세포에 Lipofectamine 2000을 이용하여 대조군 siRNA(si-con) 또는 SULF2 특이적인 하기 두 종류의 siRNA(si-SULF2-1 및 si-SULF2-2)를 도입하여 각각의 형질전환체를 수득하고, 상기 각 형질전환체에 γ-선(10 Gy)을 조사하거나 또는 조사하지 않은 다음, 24시간 동안 배양하였다.
si-SULF2-1 sense: 5'-GCU UUC UUC GGG AAG UAU Ctt-3'(서열번호 15)
si-SULF2-1 antisense: 5'-GAU ACU UCC CGA AGA AAG Ctg-3'(서열번호 16)
si-SULF2-2 sense: 5'-GGU UAA GAA ACA ACA GAG Gtt-3'(서열번호 17)
si-SULF2-2 antisense: 5'-CCU CUG UUG UUU CUU AAC Ctt-3'(서열번호 18)
배양이 종료된 형질전환체를 대상으로, 하기의 β-카테닌관련 프라이머를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1-2 및 2-2-1의 방법을 이용하여 상기 제조된 각 형질전환체로부터 IL-6와 β-카테닌의 mRNA 수준을 측정한 후 비교하고, 상기 실시예 1-3 및 2-2-2의 방법을 이용하여 상기 제조된 각 형질전환체로부터 IL-6와 β-카테닌의 단백질 수준을 측정한 후 비교하였다(도 4d).
β-catenin F: 5'-ACA AAC TGT TTT GAA AAT CCA-3'(서열번호 19)
β-catenin R: 5'-CGA GTC ATT GCA TAC TGT CC-3'(서열번호 20)
도 4d는 SULF2의 발현이 억제된 조건에서 방사선의 조사에 따른 IL-6과 β-카테닌의 mRNA 및 단백질 수준의 변화를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 4d에서 보듯이, 방사선이 조사되면 IL-6의 mRNA 및 단백질 수준이 증가되지만, SULF2의 발현이 억제된 경우에는 방사선을 조사하더라도 IL-6의 mRNA 및 단백질 수준이 증가되지 않음을 확인하였다. 한편, β-카테닌의 mRNA 수준은 방사선의 조사여부 또는 SULF2의 발현억제 여부에 상관없이 일정수준을 유지하였으나, β-카테닌의 단백질 수준은 IL-6와 마찬가지로 방사선이 조사되면 증가되지만, SULF2의 발현이 억제된 경우에는 방사선을 조사하더라도 증가되지 않음을 확인하였다.
상기 결과로부터 방사선이 조사된 암세포에서는 방사선에 의하여 발현수준이 증가된 SULF2가 IL-6의 발현수준을 향상시키고, 이과정에서 β-카테닌 단백질이 관여함을 알 수 있었다.
실시예 2-2-5: β- 카테닌 , IL-6 및 SULF2의 연관성 분석
상기 실시예 2-2-4의 결과로부터, 방사선이 조사된 암세포에서 SULF2가 IL-6의 발현수준을 향상시키고, 이과정에서 β-카테닌 단백질이 관여함을 확인하였는 바, 상기 β-카테닌에 의하여 SULF2 및 IL-6의 발현수준이 영향을 받는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, A549 세포에 Lipofectamine 2000을 이용하여 대조군 siRNA(si-con) 또는 β-카테닌 특이적인 siRNA(si-β-catenin)(sc-44275, Santa Cruz Biotechnology)를 도입함으로써, β-카테닌의 발현이 억제되거나 또는 억제되지 않은 각각의 형질전환체를 제작하였다.
상기 제작된 각 형질전환체에 pcDNA3 벡터에 외래유전자를 도입하지 않은 대조군 벡터와 상기 pcDNA3 벡터에 SULF2 유전자를 도입한 SULF2 발현벡터를 각각 도입한 이중형질전환체를 수득하였다.
또한, 상기 제작된 각 형질전환체에 방사선을 조사하거나 또는 조사하지 않은 방사선조사 형질전환체를 각각 수득하였다. 상기 수득한 이중형질전환체 또는 방사선조사 형질전환체를 대상으로, SULF2와 β-카테닌의 mRNA 수준 및 β-카테닌과 IL-6의 단백질 수준을 비교하였다(도 4e).
도 4e는 β-카테닌, IL-6 및 SULF2의 연관성을 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 4e에서 보듯이, 방사선이 조사되지 않고 SULF2의 과발현이 유도된 조건에서 β-카테닌의 발현수준이 억제되는 경우, SULF2의 발현수준은 변화되지 않았으나, SULF2의 과발현에 의해 증가된 IL-6의 발현수준이 감소되었다. 또한, SULF2이 과발현되지 않고, 방사선이 조사된 조건에서도, β-카테닌의 발현수준이 억제되는 경우, SULF2의 발현수준은 변화되지 않았으나, 방사선 조사에 의해 증가된 IL-6의 발현수준이 감소되었다.
상기 결과로부터, β-카테닌에 의해 SULF2의 발현수준이 변화되지는 않았으나, IL-6의 발현수준은 변화됨을 확인하였다.
따라서, 상기 실시예 2-2-4 및 2-2-5의 결과로부터, SULF2에 의하여 β-카테닌 단백질의 안정화 여부가 조절되고, 상기 β-카테닌 단백질에 의하여 IL-6의 발현수준이 조절됨을 알 수 있었다.
실시예 2-3: 방사선 저항성에 대한 SULF2와 IL-6의 연관성 분석
상술한 바와 같이, 방사선 조사에 대하여 저항성을 나타내는 암세포에서는 SULF2 및 IL-6의 발현수준이 증가되므로, 상기 SULF2 및 IL-6가 방사선 조사에 대한 암세포의 저항성에 연관될 것으로 가정하고, 이를 확인하고자 하였다.
실시예 2-3-1: H 2 O 2 처리에 대한 SULF2의 연관성 분석
방사선 조사된 세포에서는 세포내 자유라디칼의 수준이 증가하게 되므로, 이와 유사한 효과를 H2O2를 처리하여 유발시킨 후, SULF2의 과발현이 미치는 영향을 분석하였다.
구체적으로, 10%의 불활성화된 FBS를 포함하는 RPMI-1640 배지에서 배양된 H460 세포에 pcDNA3 벡터에 외래유전자를 도입하지 않은 대조군 벡터와 상기 pcDNA3 벡터에 SULF2 유전자를 도입한 SULF2 발현벡터를 각각 도입한 형질전환체를 수득하였다.
상기 수득한 각 형질전환체를 48시간동안 배양한 후, 320 μM H2O2를 처리하거나 또는 처리하지 않고 16시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 각 세포를 PI(propidium iodide, 5 ㎍/mL)로 염색하고, 유세포 분석을 통해 PI가 침투하거나 또는 크기가 감소된 세포는 죽은 세포로 간주하여, 세포생존율을 측정하고, 이를 비교하였다(도 5a).
도 5a는 H2O2 처리에 의한 세포사멸에 대한 SULF2의 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5a에서 보듯이, H2O2를 단독으로 처리하면 세포 생존율이 저하되었으나, H2O2를 처리한 경우에도 SULF2를 과발현시키면 저하된 세포 생존율이 회복됨을 확인하였다.
실시예 2-3-2: H 2 O 2 처리에 대한 IL-6 전처리의 효과분석
상기 H460 세포에 24시간 동안 IL-6 (20 ng/mL)를 처리하거나 또는 처리하지 않고 배양하였다. 상기 배양된 세포에 320 μM H2O2를 처리하거나 또는 처리하지 않고 16시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 각 세포를 PI(5 ㎍/mL)로 염색하고, 유세포 분석을 통해 PI가 침투하거나 또는 크기가 감소된 세포는 죽은 세포로 간주하여, 세포생존율을 측정하고, 이를 비교하였다(도 5b).
도 5b는 H2O2 처리에 의한 세포사멸에 대한 IL-6 전처리의 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5b에서 보듯이, H2O2를 단독으로 처리하면 세포 생존율이 저하되었으나, IL-6를 전처리한 후 H2O2를 처리하면 세포 생존율의 저하를 억제할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2-3-3: H 2 O 2 처리에 대한 방사선 전처리의 효과분석
상기 H460 세포에 γ-선(2 Gy)을 조사하거나 또는 조사하지 않고 48시간 동안 배양한 다음, 배양된 각 세포에 320 μM H2O2를 처리하거나 또는 처리하지 않고 8시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 각 세포를 PI(5 ㎍/mL)로 염색하고, 유세포 분석을 통해 PI가 침투하거나 또는 크기가 감소된 세포는 죽은 세포로 간주하여, 세포생존율을 측정하고, 이를 비교하였다(도 5c).
도 5c는 H2O2 처리에 의한 세포사멸에 대한 방사선 전처리의 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5c에서 보듯이, H2O2를 단독으로 처리하면 세포 생존율이 저하되었으나, IL-6와 마찬가지로 방사선을 전처리한 후 H2O2를 처리하면 세포 생존율의 저하를 억제할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2-3-4: H 2 O 2 처리와 방사선 전처리에 대한 SULF2 및 IL-6의 효과분석
상기 H460 세포에 Lipofectamine 2000을 이용하여 대조군 siRNA(si-con), SULF2 특이적인 siRNA(si-SULF2-1, 서열번호 15 및 16) 또는 IL-6 특이적인 siRNA(si-IL-6)를 도입하여 각각의 형질전환체를 수득하고, 상기 각 형질전환체에 γ-선(2 Gy)을 조사하거나 또는 조사하지 않고 48시간 동안 추가로 배양하였다.
si-IL-6 sense: 5'-CUU CCA AUC UGG AUU CAA Utt-3'(서열번호 21)
si-IL-6 antisense: 5'-AUU GAA UCC AGA UUG GAA Gca-3'(서열번호 22)
그런 다음, 상기 각 세포에 320 μM H2O2를 처리하거나 또는 처리하지 않고 8시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 상기 각 세포를 PI(5 ㎍/mL)로 염색하고, 유세포 분석을 통해 PI가 침투하거나 또는 크기가 감소된 세포는 죽은 세포로 간주하여, 세포생존율을 측정하고, 이를 비교하였다(도 5d).
도 5d는 H2O2 처리에 의한 세포사멸에 대한 방사선 전처리의 효과에 미치는 SULF2 및 IL-6의 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5d에서 보듯이, 방사선을 조사하지 않은 조건에서는 H2O2의 처리에 의하여 세포 생존율이 감소되었고, SULF2의 발현이 억제된 경우에는 세포 생존율이 더욱 감소되었으나, 방사선을 전처리한 조건에서는 H2O2의 처리에 의한 세포 생존율의 감소를 억제할 수 있었다. 그러나, 상기 방사선을 전처리한 경우에도 SULF2 또는 IL-6의 발현이 억제되면 방사선 전처리에 의한 세포 생존율의 감소 억제가 나타나지 않았다.
따라서, 방사선 처리와 같이 암세포를 사멸시키기 위한 자극에 대하여, SULF2 및 IL-6가 저항성을 나타내는 역할을 수행함을 알 수 있었다.
실시예 3: SULF2와 암전이와의 연관성 분석
암세포를 대상으로 항암처리를 수행한 경우에, 상기 항암처리 후에도 생존하는 암세포는 항암처리로 인하여 암세포의 증식이 촉진되거나 또는 암세포의 전이가 유발되는 현상이 나타날 수 있다고 알려져 있다.
이에 따라, 방사선 조사에 의하여 암세포로부터 발현수준이 증가된 SULF2 또는 IL-6가 암세포의 전이에 연관되는지의 여부를 확인하고자 하였다.
실시예 3-1: SULF2와 암세포 침윤과의 연관성 분석
방사선 조사가 STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로를 자극하여 A549 세포의 침윤을 촉진시킴이 보고된 바 있으며(Ho JN, et al., Cancer Sci. 2010; 101: 1417-1423), 이러한 암세포의 침윤에 SULF2가 어떠한 역할을 수행하는지 확인하고자 하였다.
구체적으로, A549 세포에 Lipofectamine 2000을 이용하여 대조군 siRNA(si-con) 또는 SULF2 특이적인 두 종류의 siRNA(si-SULF2-1 및 si-SULF2-2)를 도입하여 각각의 형질전환체를 수득하고, 상기 각 형질전환체에 γ-선(10 Gy)을 조사하거나 또는 조사하지 않은 다음, 24시간 동안 배양하였다.
상기 배양이 종료된 형질전환체를 이용하여 세포 침윤 비율을 비교하였다: 구체적으로, 상기 형질전환체를 마트리겔 코팅된 트랜스웰 챔버의 상단에 접종하고, 상기 챔버의 하단에 10% 열처리 불활성화된 FBS를 포함하는 배지를 채운 다음 16시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 상기 챔버의 하부로 침투한 세포를 Diff-Quick Kit로 염색하고, 염색된 세포를 현미경하에서 계수하였으며, 이로부터 세포 침윤 비율을 산출하고 비교하였다.
또한, 상기 배양이 종료된 형질전환체로부터 STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로에 관여하는 주요 단백질인 STAT3, 인산화된 STAT3, Bcl-XL 및 SULF2의 수준을 측정하고, 상기 SULF2의 mRNA 수준을 별도로 측정하였다. 이때, 단백질 수준 측정시에 내부대조군으로는 β-액틴을 사용하였고, mRNA 수준 측정시에 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다(도 6a).
도 6a는 방사선 조사에 따른 세포 침윤수준 및 STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로에 관여하는 구성요소의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 전기영동 사진이다. 도 6a에서 보듯이, 방사선이 조사되지 않은 A549 세포에서는 SULF2의 발현을 억제하면 침율 비율이 감소될 뿐만 아니라 인산화된 STAT3 및 Bcl-XL가 낮은 수준으로 검출되어 STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로가 활성화되지 않았으나; 상기 A549 세포에 방사선이 조사되면, 침율 비율이 증가될 뿐만 아니라 인산화된 STAT3 및 Bcl-XL가 높은 수준으로 검출되어 STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로가 활성화되며; 상기 A549 세포에 방사선을 조사함과 동시에 SULF2의 발현을 억제하면, 상기 방사선 조사에 의하여 증가된 침율 비율이 급격히 감소될 뿐만 아니라, 인산화된 STAT3 및 Bcl-XL가 낮은 수준으로 검출되어 STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로가 활성화되지 않음을 확인하였다.
상기 결과로부터, 방사선 조사가 SULF2 의존적으로 STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로의 활성화와 세포 침윤을 자극함을 알 수 있었다.
실시예 3-2: SULF2의 과발현과 STAT3 / Bcl - X L 신호전달 경로의 연관성 분석
상기 실시예 2-2-3에서 제작된 각각의 형질전환체를 대상으로, SULF2의 mRNA 수준과, STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로에 관여하는 주요 단백질인 STAT3, 인산화된 STAT3 및 Bcl-XL의 수준을 측정하고 비교하였다(도 6b).
도 6b는 SULF2의 과발현이 STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로에 미치는 영향을 나타내는 전기영동 사진이다. 도 6b에서 보듯이, SULF2가 과발현되면 STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로에 관여하는 주요 단백질인 STAT3, 인산화된 STAT3 및 Bcl-XL의 수준이 증가함을 확인하였다.
실시예 3-3: SULF2의 과발현 및 STAT3 / Bcl - X L 신호전달 경로의 불활성화가 암세포 침윤에 미치는 효과 분석
상기 실시예 2-2-3에서 제작된 각각의 형질전환체에 Lipofectamine 2000을 이용하여 대조군 siRNA(si-con), STAT3 특이적인 siRNA(si-STAT3)(sc-29209, Santa Cruz Biotechnology) 또는 Bcl-XL 특이적인 siRNA(si-Bcl-XL)를 도입하여 각각의 이중형질전환체를 수득하였다.
상기 수득한 이중형질전환체를 대상으로 실시예 3-1의 방법을 수행하여 암세포 침윤 비율을 분석하고, STAT3 및 Bcl-XL의 단백질 수준을 분석하였다(도 6c).
si-Bcl-XL sense: 5'-GGA GAA CCA CUA CAU GCA Gtt-3'(서열번호 23)
si-Bcl-XL antisense: 5'-CUG CAU GUA GUG GUU CUC Ctg-3'(서열번호 24)
도 6c는 SULF2의 과발현 및 STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로의 불활성화가 암세포 침윤에 미치는 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프 및 전기영동 사진이다. 도 6c에서 보듯이, SULF2가 과발현되면 방사선을 조사하지 않더라도 STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로를 구성하는 구성요소의 발현수준이 증가되어 상기 신호경로가 활성화되고, 이로 인하여 암세포의 침윤 비율이 증가하지만, STAT3 또는 Bcl-XL의 단백질의 발현이 억제되면 이러한 SULF2의 과발현 효과가 나타나지 않음을 확인하였다.
상기 결과로부터 SULF2가 STAT3-Bcl-XL 신호전달 경로를 활성화시켜서 암세포의 침윤을 유도함을 알 수 있었다.
실시예 3-4: IL- 6와 암세포 침윤과의 연관성 분석
방사선 조사시 SULF2에 의하여 IL-6의 발현수준이 조절됨을 확인하였으므로, 상기 IL-6도 STAT3-Bcl-XL 신호전달 경로를 활성화시켜서 암세포의 침윤을 유도할 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, A549 세포에 IL-6 (20 ng/mL)를 처리하거나 또는 처리하지 않고, 24시간 동안 배양한 다음, 실시예 3-1의 방법을 수행하여 암세포 침윤 비율을 분석하고, STAT3, 인산화된 STAT3 및 Bcl-XL의 단백질 수준을 분석하였다(도 7a).
도 7a는 IL-6의 처리가 암세포의 침윤 및 STAT3-Bcl-XL 신호전달에 미치는 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프 및 전기영동 사진이다. 도 7a에서 보듯이, IL-6를 처리하면 암세포의 침윤 비율이 증가하고, STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로에 관여하는 주요 단백질인 STAT3, 인산화된 STAT3 및 Bcl-XL의 수준이 증가됨을 확인하였다.
실시예 3-5: SULF2의 과발현 및 IL-6의 발현억제가 STAT3 / Bcl - X L 신호전달 경로에 미치는 효과 분석
실시예 2-2-3에서 제조한 각각의 형질전환체에 대조군 siRNA(si-con) 또는 IL-6 특이적인 siRNA(si-IL-6)를 도입하여 각각의 이중형질전환체를 제작하고, 상기 이중형질전환체로부터 SULF2 및 IL-6의 mRNA 수준과 STAT3, 인산화된 STAT3 및 Bcl-XL의 단백질 수준을 분석하였다(도 7b).
도 7b는 SULF2의 과발현 및 IL-6의 발현억제가 STAT3/Bcl-XL 신호전달 경로에 미치는 효과를 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 7b에서 보듯이, SULF2가 과발현되면 이에 따라 IL-6의 발현수준과 STAT3, 인산화된 STAT3 및 Bcl-XL의 단백질 수준이 증가하였으나, SULF2가 과발현되더라도 IL-6의 발현이 억제되면 STAT3, 인산화된 STAT3 및 Bcl-XL의 단백질 수준이 증가하지 않음을 확인하였다.
따라서, SULF2의 과발현에 의한 STAT3-Bcl-XL 신호전달 경로의 활성화는 IL-6에 의해 매개됨을 알 수 있었다.
실시예 3-6: SULF2의 과발현 및 IL-6의 발현억제가 세포 침윤에 미치는 효과 분석
상기 실시예 3-5에서 제작된 이중형질전환체의 세포 침윤 비율을 측정하였다(도 7c).
도 7c는 SULF2의 과발현 및 IL-6의 발현억제가 세포 침윤에 미치는 효과를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 7c에서 보듯이, SULF2가 과발현되면 이에 따라 세포 침윤의 비율이 증가하였으나, SULF2가 과발현되더라도 IL-6의 발현이 억제되면 세포 침윤의 비율이 증가하지 않음을 확인하였다.
따라서, SULF2의 과발현에 의한 세포 침윤의 촉진 역시 IL-6에 의해 매개됨을 알 수 있었다.
실시예 3-7: 생체내에서 방사선 조사와 SULF2의 연관성 분석
6주령의 BALB/cAnNCrj-nu/nu 마우스의 뒷다리에 H460 세포를 경피적으로 주사하고(3 x 106/mouse), 7일 동안 사육하여 약 200 ㎣의 크기를 갖는 이종이식 종양이 형성된 동물모델을 제작하였다.
상기 제작된 동물모델의 이종이식 종양부위에 60Co를 이용하여 0, 2, 5 또는 10Gy의 γ-선을 조사하고, 5일 동안 추가로 사육하여, 방사선 조사량에 따른 이종이식 종양의 부피변화를 측정하고, 이를 비교하였다(도 8a).
도 8a는 이종이식 종양이 발생된 동물모델에서 이종이식 종양 부위에 조사된 방사선의 용량에 따른 이종이식 종양의 부피변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 8a에서 보듯이, 방사선을 처리하지 않은(0Gy) 대조군에 비하여, 2Gy의 방사선을 조사한 동물모델에서는 이종이식 종양의 크기에 변화가 없었으나, 5 또는 10Gy의 방사선을 조사한 동물모델에서는 이종이식 종양의 크기가 감소됨을 확인하였다.
본 발명에서는 방사선 조사에 대하여 저항성을 갖는 암세포를 연구하고자 하였으므로, 2Gy의 방사선을 조사한 동물모델을 대상으로 이후의 연구를 수행하였다.
상기 2Gy의 방사선을 조사한 동물모델을 1일, 2일 또는 5일 동안 추가로 사육하고, 각 시점에서 종양을 적출한 후, 이에 포함된 SULF2 mRNA의 수준을 비교하였다(도 8b).
도 8b는 2Gy의 방사선을 조사한 동물모델의 이종이식 종양 부위에서 확인된 SULF2 mRNA의 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, (●)는 방사선 조사후 1일이 경과된 시점에서 대조군 동물모델에서 측정된 SULF2 mRNA의 수준을 나타내고, (○)는 방사선 조사후 1일이 경과된 시점에서 실험군 동물모델에서 측정된 SULF2 mRNA의 수준을 나타내며, (▲)는 방사선 조사후 2일이 경과된 시점에서 대조군 동물모델에서 측정된 SULF2 mRNA의 수준을 나타내고, (△)는 방사선 조사후 2일이 경과된 시점에서 실험군 동물모델에서 측정된 SULF2 mRNA의 수준을 나타내며, (■)는 방사선 조사후 5일이 경과된 시점에서 대조군 동물모델에서 측정된 SULF2 mRNA의 수준을 나타내고, (□)는 방사선 조사후 5일이 경과된 시점에서 실험군 동물모델에서 측정된 SULF2 mRNA의 수준을 나타낸다. 도 8b에서 보듯이, 2Gy의 방사선을 조사한 동물모델을 2일 동안 사육한 시점에서는 SULF2 mRNA의 수준이 급격히 증가하였으나, 5일 동안 사육한 시점에서는 SULF2 mRNA의 수준이 정상수준으로 저하됨을 확인하였다.
따라서, 생체내에서도 방사선 조사에 의하여 SULF2 mRNA의 수준이 증가하지만, 이러한 증가는 일시적으로 나타남을 알 수 있었다.
실시예 3-8: 생체내에서 암세포의 전이와 SULF2의 연관성 분석
상기 실시예 3-7의 결과에서와 같이, 암세포의 증식에 영향을 미치지 못하는 수준의 방사선을 처리하여도 암세포 내에서 SULF2 mRNA의 수준이 증가함을 확인하였는 바, 상기 SULF2 mRNA의 수준 증가로 인하여 암세포의 전이가 활성화되는지의 여부를 확인하고자 혈류 침투성(intravasation potential) 분석을 수행하였다.
구체적으로, H460 세포에 pEGFP-C1 벡터를 도입하여 GFP를 발현하는 세포를 수득하고, 1 mg/mL G418 sulfate가 포함된 배지에서 형질전환체를 선별하였다. 상기 선별된 형질전환체에 대조군 또는 SULF2 특이적 shRNA(sh-SULF2)를 발현시키는 레트로바이러스를 감염시켰다. 이어, 1 ㎍/mL 푸로마이신이 포함된 배지를 사용하여 상기 감염된 세포를 선별하고, 선별된 세포에 γ-선(2 Gy)을 조사하고 24시간 동안 배양한 후, SULF2 mRNA 수준을 비교하였다(도 9a). 도 9a는 sh-SULF2의 도입여부에 따른 세포에서 방사선의 조사에 의한 SULF2 mRNA를 검출한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
상기 선별된 세포를 마우스의 뒷다리에 주사하여 이종이식 종양이 형성된 마우스 모델을 제작하였다. 상기 마우스 모델을 9일 동안 사육하여 형성된 종양의 부피가 약 500 mm에 도달하면, 상기 종양 부위에 γ-선(2 Gy)을 조사하고, 3일 동안 사육하면서, 마우스 모델의 뒷다리에 형성된 이종이식 종양의 형광사진을 촬영하고(도 9b), 상기 형성된 이종이식 종양의 부피를 측정하였다(도 9c). 이때, 디지털 카메라(Nikon Coolpix L100)를 사용하여 종양을 촬영하였고, 녹색형광(GFP)은 IF550 emission filter (Olympus)를 사용하여 촬영하였다.
도 9b는 SULF2의 발현억제 및 방사선 조사에 따른, 이종이식 종양의 이식상태를 나타내는 형광사진이고, 도 9c는 SULF2의 발현억제 및 방사선 조사에 따른, 이종이식 종양의 부피변화를 나타내는 그래프이다. 도 9c에서 보듯이, 방사선을 조사한 경우 종양의 부피가 증가하였으나, 방사선을 조사하면서 SULF2의 발현을 억제하면 종양의 부피가 증가되지 않음을 확인하였다.
따라서, 생체내에서도 방사선 조사에 대하여 저항성을 나타내는 종양은 SULF2의 효과로 인하여 증식이 촉진됨을 알 수 있었다.
한편, 상기 3일 동안 사육된 마우스 모델을 대상으로 혈류 침투성(intravasation potential) 분석을 수행하였다. 즉, 상기 마우스 모델의 심장으로부터 채혈하고, 채혈된 혈액을 20배 부피의 RBS 용혈완충액(Intron Biotech, Seoul, Korea)에 혼합하였으며, 이를 원심분리(350 x g, 5 min)하여 침전된 세포를 수득하고, 수득한 세포를 PBS에 현탁시킨 다음, DAPI로 염색하고, 공초점 현미경으로 관찰하여, GFP 및 DAPI로 염색된 세포를 혈류에 침투한 암세포로 간주하였다(도 9d).
도 9d는 SULF2의 발현억제 및 방사선 조사에 따른, 혈류 침투성 분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프 및 현미경 사진이다. 도 9d에서 보듯이, 방사선을 조사한 경우 혈류에 침투한 암세포의 수준이 급격히 증가하였으나, 방사선을 조사하면서 SULF2의 발현을 억제하면 혈류에 침투한 암세포의 수준이 증가하지 않음을 확인하였다.
상기 혈류내 침투한 암세포는 혈류를 따라서 다른 조직으로 이동하여 전이를 유발할 수 있는데, 혈류내 암세포의 수준이 증가할 수록 전이암의 발병 가능성이 증가한다.
상기 결과에서 보듯이, 암세포에 방사선을 조사하여 암세포가 사멸되지 않으면, 상기 방사선의 조사로 인하여 혈류내 암세포의 수준이 증가하여 전이암의 발병 가능성이 증가하지만, SULF2의 발현을 억제하면 이러한 전이암의 발병 가능성을 저하시킬 수 있으므로, 상기 SULF2의 발현을 억제할 수 있는 제제는 암의 전이를 예방 또는 치료하는 치료제의 유효성분으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
<110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> Pharmaceutical composition for treating cancer having radioresistant phenotype comprising SULF2 inhibitor <130> KPA160129-KR-P1 <150> KR 10-2016-0016251 <151> 2016-02-12 <160> 24 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gaaaagaggc agattcacgt cgtttccag 29 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 atctggtgct tcttttggga tgcgggag 28 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 catctctgcc ccctctgctg a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggatgacctt gcccacagcc t 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cctcttccca aacgcatctc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcgcatgatc cagtgtttgt 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 catctctgcc ccctctgctg a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggatgacctt gcccacagcc t 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 9 guaaucuacu gggacggaat t 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 10 uuccguccca guagauuacc a 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tctggattca atgaggagac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tgagatgagt tgtcatgtcc 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 agtggctgca ggacatgaca a 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 caatctgagg tgcccatgct a 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 15 gcuuucuucg ggaaguauct t 21 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 16 gauacuuccc gaagaaagct g 21 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 17 gguuaagaaa caacagaggt t 21 <210> 18 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 18 ccucuguugu uucuuaacct t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 acaaactgtt ttgaaaatcc a 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cgagtcattg catactgtcc 20 <210> 21 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 21 cuuccaaucu ggauucaaut t 21 <210> 22 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 22 auugaaucca gauuggaagc a 21 <210> 23 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 23 ggagaaccac uacaugcagt t 21 <210> 24 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 24 cugcauguag ugguucucct g 21

Claims (15)

  1. SULF2(sulfatase 2) 유전자의 발현을 억제하거나 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 활성을 억제할 수 있는 제제를 포함하는 방사선 내성 암의 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제제는 SULF2 유전자의 발현을 억제하는 miRNA, siRNA, shRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것인, 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 SULF2 유전자의 발현을 억제하는 siRNA는 서열번호 15 및 16 또는 서열번호 17 및 18로 구성되는 siRNA인 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제제는 SULF2 유전자로부터 발현된 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 앱타머인 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 방사선 내성 암은 암세포에서 야생형 p53, β-카테닌 및 IL-6를 발현하는 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 방사선 내성 암이 발병된 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방사선 내성 암을 치료하는 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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