CN116063402A - 一种自组装核基纳米纤维肽peg-q11t肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种自组装核基纳米纤维肽peg-q11t肽及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116063402A
CN116063402A CN202310172015.5A CN202310172015A CN116063402A CN 116063402 A CN116063402 A CN 116063402A CN 202310172015 A CN202310172015 A CN 202310172015A CN 116063402 A CN116063402 A CN 116063402A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peg
peptide
self
assembled
nanofiber
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310172015.5A
Other languages
English (en)
Inventor
董文佩
陈梦婷
许嘉琪
徐凌云
蒋涛
陈长坡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan Normal University
Original Assignee
Henan Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan Normal University filed Critical Henan Normal University
Priority to CN202310172015.5A priority Critical patent/CN116063402A/zh
Publication of CN116063402A publication Critical patent/CN116063402A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7084—Compounds having two nucleosides or nucleotides, e.g. nicotinamide-adenine dinucleotide, flavine-adenine dinucleotide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/70—Web, sheet or filament bases ; Films; Fibres of the matrix type containing drug
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种自组装核基纳米纤维肽PEG‑Q11T肽及其制备方法和应用，所述PEG‑Q11T肽结构为Am‑QQEFQFQFKQQGSGSRTRTRTR‑mPEG。本发明首次使用天然碱基胸腺嘧啶扩展自组装纤维肽链Q11，然后经过PEG修饰得到自组装核基纳米纤维肽PEG‑Q11T，获得的自组装核基纳米纤维肽PEG‑Q11T在PBS缓冲液中可以自组装成纳米级纤维结构，用以负载环二核苷酸2',3'‑cGAMP，不仅细胞毒性低，生物相容性好，而且可以有效提高环二核苷酸2',3'‑cGAMP的负载剂量并控制环二核苷酸2',3'‑cGAMP的释放速率，增强肿瘤免疫治疗的效果。

Description

一种自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是人类死亡的主要原因之一。癌症免疫疗法通过诱导持久的抗肿瘤免疫，激活患者自身的免疫系统来攻击和杀死癌症。最近，一系列研究表明，宿主天然免疫cGAS-STING通路可能在抗癌免疫中发挥重要作用，在这一途径中，cGAS与dsDNA的结合变构地激活其催化活性，并导致产生环二核苷酸(CDN)：2',3'-cGAMP，其是STING第二信使，一种天然的STING激动剂，其在癌症免疫治疗中具有治疗潜力。研究表明，外源性2’，3’-cGAMP在各种肿瘤模型中治疗可抑制多种癌症的生长，包括结肠癌、黑色素瘤和腺瘤。然而，由于磷酸酯键的存在，CDN在体内极其不稳定，利用率很低。同时，常规给药方法中涉及的高剂量或多次注射可能会带来许多问题，如安全性问题和疗效。由递送和复杂的肿瘤微环境引起的毒性仍然是开发用于CDN癌症免疫治疗的合适递送系统的挑战，因此迫切需要开发新的CDN递送方法，增加CDN在靶位点的积累，以实现CDN的持续释放，提高CDN的利用率，减少药物给药次数，实现更有效的治疗并减少副作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽及其制备方法和应用，所述PEG-Q11T肽在PBS条件下可自组装成PEG-Q11T纳米纤维，可以作为药物包载的良好载体，提高疗效，改善环二核苷酸2',3'-cGAMP的透膜性，以促进癌症治疗的发展。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽，其结构为Am-QQEFQFQFKQQGSGSRTRTRTR-mPEG。
本发明还提供了上述自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽的制备方法，所述方法包括通过标准Fmoc固相合成法将胸腺嘧啶PNA单体修饰到自组装多肽Q11的N端制成自组装多肽Q11T肽，再通过酰胺化反应将mPEG-COOH修饰到Q11T肽的N端制成自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽；
其中，Q11T肽的结构为：Am-QQEFQFQFKQQGSGSRTRTRTR-NH2；
PEG-Q11T肽的结构为：Am-QQEFQFQFKQQGSGSRTRTRTR-mPEG。
本发明还提供了上述自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽在制备药物载体中的应用。
进一步地，所述应用为将自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽在PBS条件下自组装成PEG-Q11T纳米纤维，然后制成载药系统。
本发明还提供了上述自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽自组装而成的PEG-Q11T纳米纤维。
本发明还提供了上述自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽自组装成纳米纤维的方法，所述方法为：将PEG-Q11T肽溶于无菌水至2mg/mL，放置4℃过夜，再用pH＝7.4的5×PBS溶液自组装PEG-Q11T肽为纳米纤维，得到PEG-Q11T纳米纤维，其中，自组装条件为：浓度为1mg/mL 25℃下静置4.5h。
本发明还提供了上述PEG-Q11T纳米纤维在制备药物载体中的应用。
本发明还提供了上述自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽制成的载药系统。
进一步地，所述载药系统由上述自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽自组装成PEG-Q11T纳米纤维，然后包载环二核苷酸2',3'-cGAMP制成。
本发明还提供了上述载药系统的制备方法，所述方法为将PEG-Q11T肽溶于无菌水至2mg/mL，并放置4℃过夜，再用pH＝7.4的5×PBS溶液自组装PEG-Q11T肽为纳米纤维，得到PEG-Q11T纳米纤维，其中，自组装条件为：浓度为1mg/mL 25℃下静置4.5h；将环二核苷酸2',3'-cGAMP粉末溶解配至150μg/mL，将两者混合超声20min，使用截留分子量1000以上的透析袋进行透析得到包载体系PEG-Q11T@CDN，其中，PEG-Q11T肽和环二核苷酸2',3'-cGAMP的用量重量比为20:3。
进一步地，所述载药系统的包封率66.7％，载药量8.7％。
本发明还提供了上述PEG-Q11T肽、PEG-Q11T纳米纤维、上述载药系统在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明首次使用天然碱基胸腺嘧啶扩展自组装纤维肽链Q11，然后经过PEG修饰得到自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T，获得的自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T在PBS缓冲液中可以自组装成纳米级纤维结构，用以负载环二核苷酸2',3'-cGAMP，不仅细胞毒性低，生物相容性好，而且可以有效提高环二核苷酸2',3'-cGAMP的负载剂量并控制环二核苷酸2',3'-cGAMP的释放速率，增强肿瘤免疫治疗的效果。
(2)本发明所述PEG-Q11T肽在PBS条件下可自组装成PEG-Q11T纳米纤维，可以作为药物包载的良好载体，提高疗效，改善环二核苷酸2',3'-cGAMP的透膜性，促进癌症治疗的发展。
附图说明
图1为PEG-Q11T纳米纤维的MALDI-TOF图；
图2为PEG-Q11T纳米纤维的TEM图；
图3为包载体系PEG-Q11T@CDN的TEM图；
图4为PEG-Q11T纳米纤维的ThT荧光实验结果；
图5为包载体系PEG-Q11T@CDN的释药曲线；
图6为PEG-Q11T纳米纤维对MCF-7细胞的存活影响
图7为PEG-Q11T纳米纤维对CT26细胞的存活影响
图8为PEG-Q11T纳米纤维A375细胞的存活影响；
图9为PEG-Q11T纳米纤维HepG2细胞的存活影响；
图10为PEG-Q11T纳米纤维对RAW细胞的存活影响；
图11为PEG-Q11T@CDN体内抗肿瘤免疫策略的实验程序示意图；
图12为PEG-Q11T@CDN体内抗肿瘤免疫策略后小鼠肿瘤生长曲线图；
图13为PEG-Q11T@CDN体内抗肿瘤免疫策略后小鼠体重变化曲线图；
图14为体内抗肿瘤免疫策略后小鼠的IFN-β的含量变化结果；
图15为体内抗肿瘤免疫策略后小鼠的TNF-α的含量变化结果；
图16为体内抗肿瘤免疫策略后小鼠的IL-6的含量变化结果；
图17为HPLC法得到的CDN标准曲线；
图18生物安全性评价小鼠各器官的病理切片；
图19为体内抗肿瘤免疫策略后小鼠的各器官病理切片；
图20为体内抗肿瘤免疫策略后小鼠的肿瘤病理切片。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂，可商业购买得到的。
实施例1PEG-Q11T肽的制备
(1)在无水DMF 24ml中加入胸腺嘧啶1g和碳酸钾1.096g搅拌悬浮，滴加溴乙酸甲酯0.75mL并将混合物在N2条件下剧烈搅拌过夜；冷却至0℃，用水7.5mL和4M盐酸水溶液0.32mL处理，并搅拌30分钟。过滤，收集沉淀物并用水洗涤，共三次，每次4mL。将沉淀物用8mL水和4mL 2M NaOH水溶液处理并煮沸10分钟；冷却至0℃，用4M HCl水溶液2.7mL处理，并搅拌30分钟。过滤，收集沉淀物，用水3x 4mL洗涤，并经P2O5干燥制得2-(5-甲基-2，4-二氧基-3，4-二氢嘧啶-1(2H)-基)乙酸。
(2)在4℃冰浴中冷却的同时搅拌乙二胺50mL，分十份加入固体氯乙酸7.5g，使每次加入之间完全溶解。室温下搅拌反应混合物过夜。真空蒸发除去未反应的乙二胺。用DMSO研磨剩余的糊状物并过滤。用DMSO和乙醚洗涤固体滤渣。在甲醇中重结晶得到N-(2-氨基乙基)甘氨酸。
(3)将步骤(2)所得的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸25g，23℃下在二氯甲烷425mL和DMF25mL中的搅拌悬浮液中加入三甲基氯硅烷54mL。40分钟后，将反应混合物冷却至0℃并加入Fmoc-OSu 67.2g，然后在0℃经30分钟滴加入N-甲基吗啉90mL。2小时后，加入MeOH50mL淬灭反应，20分钟后加入EtOAc 500mL以沉淀所需化合物。滤出沉淀，用EtOAc洗涤并真空干燥过夜。将固体用750mL水研磨1小时。过滤沉淀物并再次用水洗涤，悬浮在MeOH(500mL)中并再次过滤。最后用MeOH洗涤并真空干燥过夜，得到N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸，为白色固体(44.8g，61％产率)。
(4)将与步骤(3)所得的N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸用无水DMF溶解，然后加入TSTU，然后加入EtiPr2N 2.58mL。20分钟后，步骤(1)所得化合物加入，接着加入EtiPr2N(加入至碱性pH)。反应在23℃下搅拌1小时，溶液用20％柠檬酸酸化至pH＝3。15分钟后，过滤胶状沉淀，用4*75mL水洗涤并在高真空下干燥。水相用CH2Cl2(3*300mL)萃取，合并的有机相用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩得到粗产物。粗产物用EtOAc重结晶。过滤，用冷的EtOAc洗涤，在高真空下干燥并从MeCN:H2O(1:1)中冻干，制得纯的胸腺嘧啶PNA单体，收率为64％，为白色粉末。
(5)使用标准Fmoc固相合成法在Rink酰胺树脂上将胸腺嘧啶PNA单体修饰到自组装多肽Q11的N端制成自组装多肽Q11T，具体步骤如下：首先称取MNHA树脂400mg于合成柱中，滴管吸取3mL DCM清洗树脂一次；同样再用MeOH清洗一次，重复两到三次。再加入DCM4mL溶胀树脂，一个小时后用DMF清洗5-6次，每次4mL。接着进行树脂的脱保护，脱保护的溶液为DMF与哌啶体积比为4：1的混合溶液成为DEP溶液。每次添加4mL DEP溶液，盖上合成柱，在摇床上摇6min，转速为200r/min。结束后，合成柱打开，用DMF清洗5-6次，每次4mL。接着是第一个氨基酸的连接，称取三倍当量的氨基酸，加入3mL的缩合剂与2mL的活化碱，摇床200r/min活化6min,接着将活化好的氨基酸倒入装有脱保护的树脂的合成柱中开始第一个氨基酸的连接，反应时间为2h，用茚三酮检测液检测氨基酸的连接情况，反应完全后则进行下一个氨基酸的连接，反应步骤与第一个氨基酸相同，一直反应到最后一个氨基酸，在Q11最后一个氨基酸后则进行精氨酸与胸腺嘧啶单体的连接。连接原理与上述氨基酸相同，称取三倍当量的胸腺嘧啶单体，加入3mL的缩合剂与2mL的活化碱，摇床200r/min活化6min,接着将活化好的氨基酸倒入合成柱中开始胸腺嘧啶的连接，反应时间为2h，用茚三酮检测液检测氨基酸的连接情况，若检测反应完全，则接着进行下一个氨基酸精氨酸的连接，直到最后一个精氨酸的连接完成，此时完成Q11T的反应。
(6)再通过酰胺化反应将mPEG-COOH连接到Q11T的N端。称取mPEG-COOH，加入3mL的缩合剂与2mL的活化碱，摇床200r/min活化6min,接着将活化好的氨基酸倒入合成柱进行Q11T与mPEG-COOH的连接，反应时间为24h。反应完成后加入脱保护剂4mL摇床200r/min脱保护6min，用DMF洗3次每次3mL。最后切割，切割剂的配置比例为TFA/Tis/H2O＝95:2.5:2.5，加入切割剂3mL裂解12h。收集裂解液加入冷乙醚沉淀，得到沉淀产物即为PEG-Q11T肽。粗产物通过使用截留分子量为3500的透析袋透析72h去除未连接PEG的多肽得到PEG修饰的Q11T即PEG-Q11T肽，如图1所示，为PEG-Q11T肽的MALDI-TOF分子量分布。
实施例2：PEG-Q11T纳米纤维的制备及形态表征
将PEG-Q11T肽溶于无菌水至2mg/mL，并放置4℃过夜，再用pH＝7.4的5×PBS溶液自组装PEG-Q11T肽为纳米纤维，得到PEG-Q11T纳米纤维，其中，自组装条件为：浓度为1mg/mL25℃下静置4.5h。将环二核苷酸2',3'-cGAMP粉末溶解到纳米纤维肽溶液中配至150μg/mL，混合超声20min，使用截留分子量1000以上的透析袋进行透析得到包载体系PEG-Q11T@CDN,其中，PEG-Q11T肽和环二核苷酸2',3'-cGAMP的用量重量比为20:3。
通过透射电子显微镜(TEM)观察PEG-Q11T纳米纤维与包载体系PEG-Q11T@CDN的纤维形态。实验步骤为：将做好标签的滤纸置于平皿上，用无水乙醇洗好镊子，滴加样品15μl到铜网上，等候15min，用滤纸吸掉多余的样品溶液；在铜网上加一滴磷酸钨染液，染色25s，接着洗掉多余染液；最后用滤纸将铜网从镊子转移到预先准备的平皿中，上机观察。结果如图2-图3所示，结果表明PEG-Q11T肽能够自组装形成PEG-Q11T纳米纤维，包载环二核苷酸2’3’-cGAMP后纳米纤维结构依然，对形态结构没有影响，表明这种纳米纤维具有核酸递送的潜力。
为了证明PEG-Q11T纳米纤维的二级结构，使用硫黄素T测定β折叠片含量的方式来分析其二级结构。将PEG-Q11T纳米纤维在0.05mM的ThT溶液中稀释至0.2mM，并在440nm激发和482nm发射波长测定荧光强度。结果如图4所示，高荧光强度证明了其能够形成β折叠。
实施例3：CDN包载率与载药量的确定
用透析法与HPLC法研究PEG-Q11@CDN的药物CDN包载率与载药量的确定。
将PEG-Q11T肽溶于无菌水至2mg/mL，并放置4℃过夜，再用pH＝7.4的5×PBS溶液自组装PEG-Q11T肽为纳米纤维，得到PEG-Q11T纳米纤维，其中，自组装条件为：浓度为1mg/mL25℃下静置4.5h。将环二核苷酸2',3'-cGAMP粉末溶解配至150μg/mL，将两者混合超声20min，使用截留分子量1000以上的透析袋进行透析得到包载体系PEG-Q11T@CDN,其中，PEG-Q11T肽和环二核苷酸2',3'-cGAMP的用量重量比为20:3，透析时间为12h。透析结束后冻干外液，取样通过HPLC测定当时外液体系中药物质量。
HPLC条件为：C18柱(4.6mm*250mm，5μm)，柱温40℃，流动相为乙腈和0.1M甲酸铵水溶液，CDN标准曲线如图17所示。包封率％＝(1-Cf/Ct)×100％，式中Cf：游离药物的质量；Ct：药物总质量。载药量％＝We/Wm×100％，式中We：包封于脂质体内的药量；Wm：载药脂质体的总质量。通过以上包封率与载药量的公式计算得到包封率66.7％，载药量8.7％。CDN包载率与载药量的确定实验表明PEG-Q11T能够有效的包载CDN，达到较高的包封率与载药量。
实施例4：PEG-Q11T纳米纤维包载CDN的释药曲线测定
将PEG-Q11T肽溶于无菌水至2mg/mL，并放置4℃过夜，再用pH＝7.4的5×PBS溶液自组装PEG-Q11T肽为纳米纤维，得到PEG-Q11T纳米纤维，其中，自组装条件为：浓度为1mg/mL25℃下静置4.5h。将环二核苷酸2',3'-cGAMP粉末溶解配至150μg/mL，将两者混合超声20min，使用截留分子量1000以上的透析袋进行透析得到包载体系PEG-Q11T@CDN,其中，PEG-Q11T肽和环二核苷酸2',3'-cGAMP的用量重量比为20:3，透析时间为12h。接着换成截留分子量为3500的透析袋进行透析来计算药物保留能力，在第二次透析时不同时间点取样透析外液通过HPLC测定当时的透析外液体系中药物浓度其中，透析条件为：将透析袋置于37℃水浴，外液为PH＝7.4的水溶液，每隔3h换一次水，共透析36h。
HPLC条件为：C18柱(4.6mm*250mm，5μm)，柱温40℃，流动相为乙腈和0.1M甲酸铵水溶液。
最终得到CDN随着时间释放的曲线，如图5结果显示，前四小时药物释出迅速，四小时后药物释出速率下降，但36小时内PEG-Q11T能够持续释出CDN，达到缓释效果。
实施例4：PEG-Q11T纳米纤维的细胞毒性研究
通过MTT法检测PEG-Q11T纳米纤维在MCF-7、CT26、A375、HepG2、RAW细胞的毒性。将含有5000个细胞的200μl培养基分别接种在96孔板中，孵育24小时后，将制备的PEG-Q11T纳米纤维悬浮液添加到相应的孔中，不添加药物的作为对照；37℃孵育样品，然后向每个孔中加入100μl 5mg/mL MTT溶液，孵育4小时后，移除培养基，向每个孔中加入150μl二甲基亚砜并震荡均匀15min.最后使用ELISA微孔板读取器在490nm处读取培养基的吸光度。实验设置浓度为，每个药物浓度三个复孔，不加药的为空白对照组，计算各药物浓度对不同细胞的抑制效果，最终计算得到PEG-Q11T纳米纤维在五种细胞种的存活率。结果如图6-10所示，结果表明，PEG-Q11T纳米纤维对细胞存活率没有大影响，即使在高浓度的情况下，细胞的存活率依然在70％以上。
实施例5：PEG-Q11T纳米纤维的溶血毒性评价
通过使用小鼠红细胞评估溶血毒性，以实现PEG-Q11T纳米纤维的生物安全性评价。
取血液200μl，加入肝素钠润好瓶壁的EP管中，3000r/min离心10min，弃上清，用PBS吹打洗涤，再相同条件离心两次，至上清液不显红色，弃上清后，取0.1mL再加入9.9mLPBS缓冲液即得红细胞悬液。首先配置不同浓度的PEG-Q11T纳米纤维分散液，浓度分别为3.9、7.8、15.6、31.3、62.5、125、250 500 1000μg/mL。在1.5mL离心管中加入200μl红细胞悬液，每个离心管中再加入不同浓度的PEG-Q11T纳米纤维分散液10μL。37℃水浴条件下孵育1h，再在5000r/min条件下离心10min。取上清液100μL加入96孔板中，每组平行三个重复，用纯DMSO组做空白对照，Triton-x100作为完全溶血组，测试孔内OD595的值。结果如表1所示，在肿瘤实验使用的浓度下，溶血率低于10％，PEG-Q11T纳米纤维表现出低溶血毒性。
表1不同浓度下的PEG-Q11T纳米纤维的溶血毒性
Figure BDA0004099621810000071
实施例6：PEG-Q11T纳米纤维材料小鼠生物安全评价
将PEG-Q11T纳米纤维材料皮下注射到小鼠体内，以研究其对小鼠存活和器官的影响。小鼠来源于河南斯克贝斯生物科技有限公司，实验所用垫料均经过立方式压力蒸汽灭菌器进行高压灭菌，所用笼具和饲料均经过紫外照射30min以上。实验小鼠均为BALB/c雌鼠，4周龄。PEG-Q11T纳米纤维材料用PBS溶解配置浓度为1mg/mL,然后通过皮下注射到小鼠体内。每天观察小鼠的饮食状况，体重等信息。最终所有的小鼠均存活，在注射PEG-Q11T纳米纤维材料的期间小鼠无任何不良反应，如图18所示，各器官的HE染色也证明，各组织细胞形态正常，没有出现明显的器官损伤。这些初步结果表明，PEG-Q11T具有良好的生物相容性，可进一步用于体内治疗。
实施例7：小鼠移植肿瘤模型建立和PEG-Q11T包载CDN的体内抗肿瘤活性研究
体内抗肿瘤小鼠实验的小鼠和实施例5的小鼠为同一批，环境与喂养均相同，实验程序如图11所示。
CT26细胞来源于武汉普诺赛生物科技有限公司，CT26细胞培养至对数期后，按照贴壁细胞处理的方法处理细胞，离心收集细胞沉淀，用生理盐水调整细胞的密度为1*107。将分散在约50μlPBS中的2*106CT26细胞皮下注射到雌性BALB/c小鼠(4-5周龄，18-20g)体内。接种结束后每天观察小鼠活动及其接种部分有无肿瘤的形成，饮水量，饮食变化。当肿瘤长出后，每天使用游标卡尺测量肿瘤的长径L和短径W，肿瘤体积的大小按照V＝0.5*L*W2计算体积，记录每只小鼠的肿瘤体积，当肿瘤体积增长到80-1000mm3时，体内肿瘤抑制实验开始。为了研究PEG-Q11T@CDN癌症免疫治疗能力，小鼠被分为4组(每组n＝8只小鼠)，PBS(50μl)；包载体系PEG-Q11T@CDN(i.t.，注射剂量＝50μl:5μg)；PEG-Q11T纳米纤维(i.t.，注射剂量＝50μl)；CDN(i.t.，注射剂量＝50μl:5μg)。随后对各个小组进行瘤内注射治疗。每天测量小鼠的肿瘤体积和体重，结果如图12-图13所示，结果表明，在治疗期间，各组别小鼠体重没有显著性差异，这说明给药期间并没有使小鼠造成损伤、体重减轻；而PBS与PEG-Q11T组随着时间的增加，由第七天的100mm3长到第32天的1200mm3和900mm3，增长速率也高于CDN与PEG-Q11T@CDN组。给药17天后CDN与PEG-Q11T@CDN组小鼠肿瘤生长被抑制，PEG-Q11T@CDN生长速率低于CDN组。由实验结果可知，PEG-Q11T的包载能够稳定CDN，达到缓慢释放CDN的效果，使得被治疗小鼠的肿瘤得到抑制，不仅降低了CDN的用量，节约了成本，还可以达到抗肿瘤的效果。
治疗21天之后，解剖的主要器官(如心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤组织，用PBS冲洗，固定在4％的甲醛后，包埋在石蜡中，切为5μm切片，苏木精和伊红染色后进行病理切片检验。器官的切片结果如图19所示，各组别的脏器未见明显的损伤，细胞状态正常。通过对比得到，PBS与PEG-Q11T组的脾脏细胞明显减少，这可能是由于PBS与PEG-Q11T荷瘤小鼠的免疫细胞在不断消耗。肿瘤组织的切片结果如图20所示，对比各组别移植瘤切片PBS与PEG-Q11T肿瘤细胞数目密集并且生长情况良好，而CDN组肿瘤细胞减少，细胞膜破损，细胞质皱缩，消融，PEG-Q11T@CDN组肿瘤细胞明显减少，大部分细胞坏死、消融或者萎缩。由以上结果可知，CDN具有抗肿瘤的效果，PEG-Q11T能够包载CDN，得到的PEG-Q11T@CDN能够达到缓释CDN，持续提高CDN水平的效果，最终达到改善CDN的性质，治疗肿瘤的作用。
在给药之后，分别于0、4、8、12、24h对小鼠进行摘眼球取血，然后室温放置1-2h后进行离心15mim，转速4500r/min.将得到的血清存放于零下80℃冰箱中。用ELISA试剂盒测定血清中IFN-β，TNF-α，IL-6的浓度，以评估各个治疗组引起小鼠体内炎症因子的表达情况。结果如图14-16所示，结果表明，各组别的小鼠均在给药4h后IFN-β、IL-6、TNF-α达到最大值，且PEG-Q11T@CDN的表达量高于CDN组，随着给药时间越来越久，细胞因子水平也在下降，但比PBS组还是高出许多，这可能是由于STING通路被持续激活，造成I型干扰素和其他细胞因子的产生，在给药时间24小时后还仍保持较高的炎症水平。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽，其结构为Am-QQEFQFQFKQQGSGSRTRTRTR-mPEG。
2.权利要求1所述的自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括通过标准Fmoc固相合成法将胸腺嘧啶PNA单体修饰到自组装多肽Q11的N端制成自组装多肽Q11T肽，再通过酰胺化反应将mPEG-COOH修饰到Q11T肽的N端制成自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽；
其中，Q11T肽的结构为：Am-QQEFQFQFKQQGSGSRTRTRTR-NH2；
PEG-Q11T肽的结构为：Am-QQEFQFQFKQQGSGSRTRTRTR-mPEG。
3.权利要求1所述自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽在制备药物载体中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为将自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽在PBS条件下自组装成PEG-Q11T纳米纤维，然后制成载药系统。
5.权利要求1所述自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽自组装而成的PEG-Q11T纳米纤维。
6.根据权利要求5所述的PEG-Q11T纳米纤维，其特征在于，所述PEG-Q11T纳米纤维的组装方法为：将PEG-Q11T肽溶于无菌水至2mg/mL，放置4℃过夜，再用pH＝7.4的5×PBS溶液自组装PEG-Q11T肽为纳米纤维，得到PEG-Q11T纳米纤维，其中，自组装条件为：浓度为1mg/mL25℃下静置4.5h。
7.权利要求1所述自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽制成的载药系统。
8.根据权利要求7所述的载药系统，其特征在于，所述载药系统由权利要求1所述自组装核基纳米纤维肽PEG-Q11T肽自组装成PEG-Q11T纳米纤维，然后包载环二核苷酸2',3'-cGAMP制成。
9.根据权利要求8所述的载药系统，其特征在于，所述载药系统的制备方法包括如下：将PEG-Q11T肽溶于无菌水至2mg/mL，并放置4℃过夜，再用pH＝7.4的5×PBS溶液自组装PEG-Q11T肽为纳米纤维，得到PEG-Q11T纳米纤维，其中，自组装条件为：浓度为1mg/mL 25℃下静置4.5h；将环二核苷酸2',3'-cGAMP粉末溶解配至150μg/mL，将两者混合超声20min，使用截留分子量1000以上的透析袋进行透析得到包载体系PEG-Q11T@CDN，其中，PEG-Q11T肽和环二核苷酸2',3'-cGAMP的用量重量比为20:3。
10.权利要求1所述PEG-Q11T肽、权利要求5所述PEG-Q11T纳米纤维、权利要求7至9任一项所述载药系统在制备治疗肿瘤药物中的应用。
CN202310172015.5A 2023-02-27 2023-02-27 一种自组装核基纳米纤维肽peg-q11t肽及其制备方法和应用 Pending CN116063402A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310172015.5A CN116063402A (zh) 2023-02-27 2023-02-27 一种自组装核基纳米纤维肽peg-q11t肽及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310172015.5A CN116063402A (zh) 2023-02-27 2023-02-27 一种自组装核基纳米纤维肽peg-q11t肽及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116063402A true CN116063402A (zh) 2023-05-05

Family

ID=86178495

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310172015.5A Pending CN116063402A (zh) 2023-02-27 2023-02-27 一种自组装核基纳米纤维肽peg-q11t肽及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116063402A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108379549B (zh) 含酪丝缬肽并基于d构型短肽自组装的抗癌超分子水凝胶的制备方法与应用
CN107446019A (zh) 抗菌肽衍生物及其用途
JP6880073B2 (ja) マルチアーム重合標的抗がんコンジュゲート
CN107184987B (zh) 一种硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体及其制备方法和应用
Yang et al. Preparation and antitumor effects of nanovaccines with MAGE-3 peptides in transplanted gastric cancer in mice
KR102279429B1 (ko) 멀티 암 표적 항암 콘쥬게이트
CN111467472B (zh) 一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的免疫调节微球制剂及其制备方法与应用
CN109432049B (zh) 一种具有肾脏靶向分布特性的大黄酸脂质囊纳米粒及应用
CN110746490A (zh) 一种基于点击反应阻断免疫检查点的多肽组合物及其制备方法和应用
US11963997B2 (en) Anti-tumor polypeptide Bax-BH3, fluorescent polymeric nanomicelle, preparation method and use thereof
CN110840844A (zh) 生物素与葡萄糖共同修饰的乳腺癌靶向脂质体的制备和应用
CN110507826B (zh) 一种基于巨噬细胞的活细胞载药系统、其制备方法和应用
CN116948901A (zh) 食窦魏斯氏菌d-2胞外多糖在抑制结肠癌细胞中的应用
CN108727583A (zh) 多臂靶向抗癌偶联物
CN108853147B (zh) 一种缓释外泌体的多肽纳米纤维水凝胶及其制备方法与应用
CN116063402A (zh) 一种自组装核基纳米纤维肽peg-q11t肽及其制备方法和应用
CN108379595B (zh) 多功能靶向性基因载体及制备方法及用途
CN113004372B (zh) 一种免疫多肽及其应用
CN106947084B (zh) 用于络合铜离子的高分子材料及其抗肿瘤用途
CN109776787B (zh) 多臂靶向偶联物
WO2018137658A1 (zh) CP-iRGD多肽、iDPP纳米粒、载药复合物及其制备方法和应用
CN111603567A (zh) Cd44靶向多臂偶联物
CN110862458B (zh) 具有酸激活抗肿瘤活性的组合肽及其临床应用
CN111729070B (zh) 多肽fl15在制备抗肿瘤药物中的应用
CN113350296B (zh) 一种crgd序列肽修饰壳聚糖负载的pad4抑制剂及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination