CN105982844A - 一种白藜芦醇脂质体凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物制剂技术领域,具体涉及一种白藜芦醇脂质体凝胶及其制备方法。本发明首先制备白藜芦醇脂质体,以包封率为考察指标,筛选出合理的处方工艺以及投料比,本发明优选出包封率较高的白藜芦醇脂质体,再将其制备成脂质体凝胶。本发明的白藜芦醇脂质体凝胶经体外释药表明,具有明显缓释及透皮吸收促进效果,与白藜芦醇普通凝胶相比,累积透过量及皮肤蓄积量均有显著提高,本发明的脂质体凝胶作为药物透皮吸收载体更具优势。
Description
技术领域
本发明涉及药物制剂技术领域,具体涉及一种白藜芦醇脂质体凝胶及其制备方法。
背景技术
白藜芦醇又称芪三酚,化学式名称为3,4',5-三羟基二苯乙烯,是非黄酮类多分化合物。白藜芦醇作为一种植物抗毒素,具有广泛的生物学活性,如抗氧化、免疫调节,抗肿瘤,被认为是最有潜力的天然防癌剂之一。但白藜芦醇难溶于水,化学性质不稳定,70-80℃下加热30min有部分分解,易被氧化分解。口服后30-60分钟内迅速代谢,体内生物利用度低,因而制约了其广泛应用(Charles-Henry Cottart,VaalerieNivet-Antione,ChristelleLaguillier-Morizot,etal.Resveratrol bioavailability and toxicity in humans.Mol.Nutr.FoodRes.2010,54:7-16)。
脂质体是由类脂双分子层组成,结构域细胞膜类似,具有良好的细胞融合性和经皮渗透作用。经脂质双分子层包裹的药物容易穿透角质层进入皮肤。脂质体作为药物载体具有延缓药物释放,提高药物疗效及靶向作用等特点。
与白藜芦醇对心脏疾病、各种肿瘤的治疗相比,关于白藜芦醇在皮肤健康方面的研究报道较少。最早报道的文章包括老鼠皮肤预先给予白藜芦醇能够显著降低由TPA诱导产生的氧化应激、恢复谷胱甘肽活性,提示白藜芦醇的皮肤保护作用是通过抗氧化途径发挥的。然而随后的报道关于白藜芦醇对皮肤健康的保护作用是与抗氧化之外的机制相关的。已有的研究结果表明,白藜芦醇对于皮肤癌、皮肤老化、寻常性痤疮、UV辐射、湿疹、创面修复、银屑病等皮肤相关疾病具有一定的治疗或预防作用(Dipak K.Das Ph.D.,D.Sc.,M.D(hon),F.A.H.A.,F.A.C.N.,Hannah Vasanthi Resveratrol in dermal health,Bioactive Dietary Factors and Plant Extracts in Dermatology Nutrition and Health2013,177-187)。
关于白藜芦醇的剂型,已有的研究报道包括脂质体、纳米乳、环糊精包合物、乳脂体、微球、纳米粒、水凝胶等。以上方法或为改善白藜芦醇的水溶性低,或为减少氧化增加其稳定性,或为克服其体内生物利用度低,为临床应用白藜芦醇提供一定的依据(参考文献:Amri A,Chaumeil JC,Sfar S,Charrueau C,Administration of resveratrol:What formulation solutions tobioavailability limitations?J Control Release.2012,158(2):182-193)。
申请人一直致力于白藜芦醇剂型的改进,已申请中国专利CN201210082278.9,发明名称为“一种皮肤外用微乳温敏凝胶剂及其制法”,公开号CN 102614107A。申请人希望在此基础上,发明一种白藜芦醇脂质体凝胶,由于脂质体溶液流动性强,药物在皮肤表面保留时间短的缺点,本发明进一步将脂质体制备成脂质体凝胶,从而改善脂质体与皮肤的粘附性和涂展性。脂质体凝胶将脂质体与凝胶基质混合,从而增加脂质体的稳定性,提高脂质体作为外用剂型的适用性,并且能够提供包裹药物的缓释和控释。
目前尚无有关白藜芦醇脂质体凝胶的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种维持白藜芦醇稳定性、改善其透皮吸收的白藜芦醇脂质体凝胶,本发明的另一目的在于提供该白藜芦醇脂质体凝胶的制备方法。
本发明的技术方案是,首先制备白藜芦醇脂质体,以包封率为考察指标,筛选出合理的处方工艺以及投料比。优选出包封率较高的白藜芦醇脂质体,再将其制备成脂质体凝胶。
一、制备工艺筛选:固定投料比,筛选出包封率较高的制备方法。分别采用四种方法制备白藜芦醇脂质体,其中薄膜分散法包封率为80.02%,乙醇注入法包封率为37.48%,乙醚注入法包封率为39.26%,逆相蒸发法包封率为72.42%。最终确定,本发明采用薄膜分散法制备白藜芦醇脂质体。
二、正交设计处方配比:确定大豆磷脂、胆固醇、白藜芦醇及pH为7.4的磷酸盐缓冲液的投料比。本发明采用三因素三水平正交试验设计表,制备9组白藜芦醇脂质体,每组三个批次,测定各组的包封率,从而优选出最佳的处方配比。最终确定,本发明白藜芦醇脂质体的原料最佳配比如下:大豆磷脂200mg、胆固醇40mg、白藜芦醇为50mg,pH为7.4的磷酸盐缓冲液的用量为10mL。
本发明的第一方面,提供了一种白藜芦醇脂质体凝胶,所述的白藜芦醇脂质体凝胶中大豆磷脂、胆固醇、白藜芦醇的重量比为20:4:5;且白藜芦醇占脂质体凝胶的重量百分比为0.1%--0.3%;
所述的凝胶基质为卡波姆,且卡波姆占脂质体凝胶的重量百分比为0.5%--3%;
所述的白藜芦醇脂质体凝胶采用薄膜分散法制备。
本发明所述的白藜芦醇脂质体凝胶中各组分及其重量百分比为:
本发明的第二方面,提供了上述的白藜芦醇脂质体凝胶的制备方法,所述的制备方法包括以下步骤:
A、白藜芦醇脂质体的制备
大豆磷脂:胆固醇:白藜芦醇按重量比20:4:5投料,于乙醇溶液中溶解,40℃减压旋转蒸发出去溶剂,使磷脂在容器壁上形成一层均匀薄膜,加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液旋转15—45分钟(较优为30分钟),放置1—3小时(较优为2小时)使胆固醇充分溶胀水合,冰浴下超声15—45分钟(较优为30分钟),得到白藜芦醇脂质体溶液;
B、白藜芦醇脂质体凝胶的制备
卡波姆974PNF、甘油置于烧杯中,混匀,加适量水搅匀,使卡波姆充分分散,逐渐加入三乙醇胺于卡波姆中,溶胀过夜;加入步骤A制得的白藜芦醇脂质体溶液,将两者混合搅拌均匀,加水,制得白藜芦醇脂质体凝胶。
较优的,步骤B为,精密称取卡波姆974PNF 0.1g、甘油0.1g置于烧杯中,混匀,加适量水搅匀,使卡波姆充分分散,逐渐加入三乙醇胺0.135g于卡波姆中,溶胀过夜。加入白藜芦醇脂质体溶液4.6mL,将两者混合搅拌均匀,加水至10g,制得白藜芦醇脂质体凝胶。
每1g凝胶剂中,白藜芦醇含量为2.3mg。
卡波姆最终含量为1%(w/w)。
脂质体具有类似于生物膜结构的双分子层脂质,很容易包裹住脂溶性药物,病可是药物较快地透过皮肤,在皮肤中蓄积,提高药物在治疗部位的浓度,减少全身吸收,降低药物不良反应。将脂质体与凝胶基质混合,制成脂质体凝胶,能够增加脂质体的稳定性,提高脂质体作为外用剂型的适用性,并且能够提供包裹药物的缓释和控释。
本发明的白藜芦醇脂质体凝胶经体外释药表明,白藜芦醇脂质体凝胶具有明显缓释及透皮吸收促进效果,与白藜芦醇普通凝胶相比,累积透过量及皮肤蓄积量均有显著提高,说明脂质体凝胶与凝胶相比,作为药物透皮吸收载体更有优势。
附图说明
图1为体外累计渗透量图。
具体实施方式
现结合实施例和附图,对本发明作详细描述,但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
实施例所用试剂和材料:
白藜芦醇(上海融禾医药科技有限公司);
白藜芦醇对照品(中国药品生物制品检定所,111535-200502);
卡波姆974PNF(美国Lubrizol);
大豆磷脂(生工生物工程有限公司)
胆固醇(生工生物工程有限公司)
无水乙醇(分析纯,常熟市杨园化工有限公司);
冰醋酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);
乙腈(色谱纯);
甘油(浙江遂昌惠康药业有限公司);
0.9%NaCl注射液(四川科伦药业股份有限公司);
裸鼠6-8周龄,雄性(中国人民解放军第二军医大学实验动物中心)。
实施例1:白藜芦醇脂质体制备方法筛选
固定各组分的投料比,以包封率为指标考察不同制备方法所得的白藜芦醇脂质体的包封率。
(1)乙醚注入法制备白藜芦醇脂质体
精密称取大豆磷脂200.0mg,胆固醇50.0mg,白藜芦醇60.0mg于小烧杯中,加入25ml乙醚搅拌均匀使之溶解,匀速注入10mL水浴40℃pH7.4PBS中,慢速搅拌30min,水浴保温1.5h,冰浴条件下超声30min。制备3批样品,测得平均包封率为39.26%。
(2)乙醇注入法制备白藜芦醇脂质体
精密称取大豆磷脂200.0mg,胆固醇50.0mg,白藜芦醇60.0mg于小烧杯中,加入25ml无水乙醇搅拌使之溶解,匀速注入10mL水浴40℃pH7.4PBS中,慢速搅拌30min,水浴保温1.5h,冰浴条件下超声30min。制备3批样品,测得平均包封率为37.48%。
(3)逆向蒸发法制备白藜芦醇脂质体
精密称取大豆磷脂200.0mg,胆固醇50.0mg于梨形瓶中,加入25mL无水乙醇使之溶解,超声10min得到乳浊液,40℃旋转至胶态,再加入含有白藜芦醇60.0mg的无水乙醇溶液5mL,40℃减压旋转蒸发出去溶剂,使得大豆磷脂在甁壁上形成一层均匀薄膜,加入10mL pH7.4PBS,旋转40min,放置2h使其充分水合,冰浴条件下超声30min。制备3批样品,测得平均包封率为72.42%。
(4)薄膜分散法制备白藜芦醇脂质体
精密称取大豆磷脂200.0mg,胆固醇50.0mg,白藜芦醇60.0mg于梨形瓶中,加入25mL乙醇使之溶解,超声10min后,40℃减压旋转蒸发出去溶剂,使得大豆磷脂在甁壁上形成一层均匀薄膜,加入10mL pH7.4PBS,旋转30min,放置2h使其充分水合,冰浴条件下超声30min。制备3批样品,测得平均包封率为80.02%。
实验结果:薄膜分散法最优。
实施例2:白藜芦醇脂质体的处方筛选
以脂质体包封率为考察指标,选用L9(34)因素水平表设计正交试验,考察大豆磷脂/胆固醇质量比(A),大豆磷脂/白藜芦醇(B),pH7.4PBS用量(C),采用薄膜分散法制备脂质体,进行正交试验从而确定各组分的最佳投料比。处方因素水平表见表1。
表1:处方因素水平
精密称取适量大豆磷脂、胆固醇、白藜芦醇于梨形瓶中,加入25mL乙醇使之溶解,超声10min后,40℃减压旋转蒸发出去溶剂,使得大豆磷脂在甁壁上形成一层均匀薄膜,加入适量pH7.4PBS,旋转30min,放置2h使其充分水合,冰浴条件下超声30min。正交试验及结果见表2。
表2:正交试验及结果
由表2实验结果可知,各因素的作用强度依次为:B>A>C,最佳工艺组合为A1B1C1。即大豆磷脂:胆固醇:白藜芦醇为质量比为20:4:5。
最佳工艺验证:按照优选处方进行了5次重复验证试验,制备了5批脂质体。精密称取大豆磷脂200.0mg,胆固醇40.0mg,白藜芦醇50.0mg于梨形瓶中,加入25mL乙醇使之溶解,超声10min后,40℃减压旋转蒸发出去溶剂,使得大豆磷脂在甁壁上形成一层均匀薄膜,加入10mL pH7.4PBS,旋转30min,放置2h使其充分水合,冰浴条件下超声30min。采用鱼精蛋白凝聚法测定脂质体的包封率。结果表明制得的5批脂质体的平均包封率为90.27%,其RSD为0.95%。验证试验结果表明制备工艺条件稳定可靠。
实施例3:白藜芦醇脂质体的制备
精密称取大豆磷脂200.0mg,胆固醇40.0mg,白藜芦醇50.0mg于梨形瓶中,加入25mL乙醇使之溶解,超声10min后,40℃减压旋转蒸发出去溶剂,使得大豆磷脂在甁壁上形成一层均匀薄膜,加入10mL pH7.4PBS,旋转30min,放置2h使其充分水合,冰浴条件下超声30min。得到白藜芦醇脂质体溶液。
一、粒径和电位测定
取白藜芦醇脂质体溶液,用纯水稀释,测定其粒径大小和Zeta电位。结果,平均粒径530±12.0nm,平均电位为-45.3±1.02mV。
二、鱼精蛋白凝聚法测定白藜芦醇脂质体包封率
(一)加样回收率试验:
取白藜芦醇乙腈-水溶液,加入空白脂质体0.1ml,添加0.2ml鱼精蛋白(10mg/mL),混匀后静置3min,加入生理盐水至1ml,使最终白藜芦醇的浓度分别为0.25、1、5μg/ml。4℃下3000r/min离心30min。精密吸取上清液,于高效液相色谱仪上测定,并计算加样回收率。结果表明采用鱼精蛋白凝聚法分离脂质体和游离药物,从而测得脂质体的包封率,这一方法稳定可靠。结果见表3。
表3:鱼精蛋白凝聚法加样回收率试验结果(n=9)
(二)白藜芦醇脂质体EE测定
采用鱼精蛋白凝聚法分离游离药物和脂质体。精密吸取0.1mL白藜芦醇脂质体于Ep管中,加入10mg/mL的鱼精蛋白溶液0.2ml,混匀后静置3min,加入生理盐水至1ml,混匀,4℃下3000r/min离心30min,沉淀脂质体。精密吸取上清液,稀释后于高效液相色谱仪上测定,计算游离药物浓度(C游离)。
取白藜芦醇质体溶液0.1mL,置于Ep管中,加入乙腈至1ml,超声1min,4℃下12000r/min离心5min,取上清液于高效液相色谱仪上测定,计算白藜芦醇脂质体中白藜芦醇含量(C总),根据下式计算白藜芦醇脂质体
EE:EE=(C总-C游离)/C总×100%。
实施例4:白藜芦醇脂质体凝胶的制备
精密称取卡波姆974PNF 0.1g、甘油0.1g置于烧杯中,混匀,加适量水搅匀,使卡波姆充分分散,逐渐加入三乙醇胺0.135g于卡波姆中,溶胀过夜。加入白藜芦醇脂质体溶液4.6mL,将两者混合搅拌均匀,加水至10g,制得白藜芦醇脂质体凝胶。每1g凝胶剂中,白藜芦醇含量为2.3mg。卡波姆最终含量为1%(w/w)。
实施例5:白藜芦醇脂质体凝胶体外经皮渗透动力学考察
取6-8周龄的裸鼠,背部用酒精消毒断颈处死,用手术刀部至剥离裸鼠背部皮肤,剔除皮下组织和脂肪,以生理盐水漂洗干净,-80℃保存,备用。采用Franz扩散池,有效渗透面积A为0.85cm2,接收介质为含30%乙醇的生理盐水,接收池体积为3.9mL。分别取白藜芦醇普通凝胶剂及脂质体凝胶剂0.6g,置于供给池中,于(37±1)℃、150r/min进行透皮实验,分别于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12h从接收池中取样0.3ml,并及时补充同温等量的接收液。4℃,10000r/min离心10min,取上清液,采用高效液相色谱法测定其中白藜芦醇的含量。计算单位面积累积经皮渗透量Qn。经皮渗透实验的单位面积累积经皮渗透量的计算公式:Qn=(CnVn+∑CiVi)/A。公式中Cn为第n个取样点的药物浓度,Ci是第i个取样点测得的药物浓度,Vn和Vi分别是接收池体积(3.9mL)和取样体积(0.3mL)。A是扩散池的扩散面积(A=0.85cm2)。结果见表4)
表4 体外累积渗透量
终止实验后,将皮肤上的药物刮掉,将有效扩散面处皮肤剪下,用生理盐水冲洗,滤纸吸干水分,称重,将皮肤剪碎,添加乙腈2ml,超声2h,PVDF针式滤器过滤。稀释至适当倍数进样测定。结果凝胶组平均蓄积量为5.2μg,脂质体凝胶组平均蓄积量为7.6μg。(n=5)
体外释药结果表明,白藜芦醇脂质体凝胶具有明显缓释及透皮吸收促进效果,与白藜芦醇凝胶相比,累积透过量及皮肤蓄积量均有显著提高,说明脂质体凝胶与凝胶相比,作为药物透皮吸收载体更有优势。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (5)
1.一种白藜芦醇脂质体凝胶,其特征在于,所述的白藜芦醇脂质体凝胶中大豆磷脂、胆固醇、白藜芦醇的重量比为20:4:5;且白藜芦醇占脂质体凝胶的重量百分比为0.1%--0.3%;所述的凝胶基质为卡波姆,且卡波姆占脂质体凝胶的重量百分比为0.5%--3%。
2.根据权利要求1所述的一种白藜芦醇脂质体凝胶,其特征在于,所述的白藜芦醇脂质体凝胶采用薄膜分散法制备。
3.根据权利要求1所述的一种白藜芦醇脂质体凝胶,其特征在于,所述的白藜芦醇脂质体凝胶中各组分及其重量百分比为:
4.根据权利要求1所述的一种白藜芦醇脂质体凝胶,其特征在于,所述的白藜芦醇脂质体凝胶中各组分及其重量百分比为:
5.一种如权利要求1所述的白藜芦醇脂质体凝胶的制备方法,其特征在于,所述的制备方法包括以下步骤:
A、白藜芦醇脂质体的制备
大豆磷脂:胆固醇:白藜芦醇按重量比20:4:5投料,于乙醇溶液中溶解,40℃减压旋转蒸发出去溶剂,使磷脂在容器壁上形成一层均匀薄膜,加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液旋转15—45分钟,放置1—3小时使胆固醇充分溶胀水合,冰浴下超声15—45分钟,得到白藜芦醇脂质体溶液;
B、白藜芦醇脂质体凝胶的制备
卡波姆974PNF、甘油置于烧杯中,混匀,加适量水搅匀,使卡波姆充分分散,逐渐加入三乙醇胺于卡波姆中,溶胀过夜;加入步骤A制得的白藜芦醇脂质体溶液,将两者混合搅拌均匀,加水,制得白藜芦醇脂质体凝胶。
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