CN115607511A - 一种白藜芦醇脂质体、其制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种白藜芦醇脂质体，所述脂质体包括以下原料：蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇2000和白藜芦醇；其中，蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇2000的比例为(49～52):(4～6):(2.5～3)(w/w)，更优选为20:2:1(w/w)；其中，所述白藜芦醇包裹在脂质体中。本发明的白藜芦醇脂质体体外稳定性较好，且相比于游离药物具有缓释作用，可在牙周炎性疾病(特别是牙周炎)治疗领域具有临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种白藜芦醇脂质体、其制备方法及其在牙周炎中的应用。
背景技术
牙周炎是最普遍的口腔疾病之一，可影响全世界90％的人口，并且它已被认为是成年人牙齿脱落的主要原因。而且，牙周炎造成的牙周袋为细菌微生物繁殖提供了有利条件，这增加了全身性疾病的风险。有研究报道，牙周炎在流行病学上与慢性炎症驱动的疾病有关，例如心血管疾病，阿尔茨海默氏病和炎症性肠病。牙菌斑是牙周炎发生发展的始动因子，但是只有当宿主免疫系统紊乱时才能促发牙周炎的发生与发展。因此，宿主的炎症反应被认为是牙周炎病理过程的主要驱动力，其中巨噬细胞在调控炎症过程转归中起着重要的作用。由此靶向巨噬细胞被认为是有潜力的治疗干预牙周炎的策略。但是，目前在牙周炎的治疗方法中，仍然没有有效的免疫疗法药物。而且主要的治疗方法仍然是使用机械清创术加上抗生素辅助治疗。尽管该方法易于操作，但仍存在一些局限性，例如出现了抗生素抗药性和严重的不良反应。考虑到这些问题，抗微生物光动力疗法是目前克服细菌耐药性的治疗牙周炎的新方法。然而，其光源和光敏剂的选择有限，导致光源能够渗透的组织深度不足，无法达到牙周袋深处，这使得光动力疗法无法用于较严重的牙周炎症，从而限制了其临床应用。因此，亟需寻找新的牙周炎替代治疗策略。
白藜芦醇(Resveratrol,RSV)是一种天然存在的非黄酮类多酚化合物，属于类芪类化合物，于1940年首次从白藜芦根中分离。其后研究发现广泛存在于虎杖、葡萄、花生等70多种植物中，在葡萄中的含量尤为丰富。多项研究表明，白藜芦醇具有抗炎，抗氧化、抗微生物和抗肿瘤的特性。在免疫调节方面，先前也有研究报道白藜芦醇可以通过调节心肌梗死和急性痛风性关节炎中的巨噬细胞表型来抑制炎症介质。其机制可能涉及JAK2-SATA3的磷酸化。另外，在炎性疾病的治疗方面，白藜芦醇有效的抗炎和抗氧化功能主要归因于其抑制NF-κB信号通路、炎症小体(Inflammasome)、COX2和活性氧(Reactive oxygen,ROS)。其中，ROS可能在调节巨噬细胞表型中也起到重要的作用。基于上述研究和本发明人的进一步调研发现，白藜芦醇的理化性质较差，尤其是其水溶性极低(30mg/mL)，严重限制了白藜芦醇在临床方面的应用。
总的说来，经过文献和临床调研发现，目前治疗牙周炎的方法存在牙周细菌耐药的风险，严重者可能导致无药可医的尴尬局面，且目前市面上仍然没有安全可靠的治疗牙周炎的免疫调节剂，因此开发一种临床前景好、药效好、安全性好的新制剂具有必要性。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明进一步寻找如何提高白藜芦醇的全身和局部生物利用度的策略。其中，本发明选择将该剂型制备成脂质体，由于脂质成分可以增强亲脂性化合物的吸收，且脂质体的制作相对简单易行，还具有良好的生物相容性、安全性和靶向性等优良特性，因此脂质体被认为是极好的药物递送系统。
本发明设计了一种白藜芦醇脂质体纳米治疗系统，主要针对调控牙周炎中增高表达的M1型巨噬细胞来达到治疗牙周炎的效果，该脂质体处方来源均为药物辅料，评价模型与临床接近，制备方法简单，药效确切，具有开发为口腔科临床治疗牙周炎高端制剂的潜在价值。
为了通过免疫治疗牙周炎，本发明借助脂质体包裹白藜芦醇，并主要针对调控M1型巨噬细胞功能，进一步提高药物对牙周炎的治疗作用。
本发明的一个目的是提供一种白藜芦醇脂质体。
本发明的另一个目的是提供一种白藜芦醇脂质体的制备方法。
本发明的另一个目的是提供所述白藜芦醇脂质体的制药用途。
根据一个方面，本发明提供了一种白藜芦醇脂质体，所述脂质体包括以下原料：
蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和白藜芦醇；
其中，蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的比例为(49～52):(4～6):(2.5～3)(w/w)，优选为20:2:1(w/w)；
其中，所述白藜芦醇包裹在脂质体中；
优选地，所述白藜芦醇脂质体粒径为130～170nm，更优选为140nm，多分散指数为0.05～0.15，更优选为0.1，Zeta电位为-3～-12mV，更优选为-11mV。
本发明的白藜芦醇脂质体中，优选地，基于1重量份白藜芦醇脂质体，所述白藜芦醇为0.036～0.041重量份，更优选为0.040重量份。
根据另一个方面，本发明提供了所述的白藜芦醇脂质体的制备方法，包括以下步骤：
1)将蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和白藜芦醇，用有机溶剂溶解得到溶液；
2)将所述溶液减压蒸发除去有机溶剂得到一层薄膜，并将薄膜用磷酸盐缓冲溶液水化，得到脂质水分散体；
3)将所述脂质水分散体进行超声破碎，之后使用过膜挤出仪反复挤压至脂质体通过微孔滤膜(优选地，膜孔径为200nm)，得到脂质体；
4)将所述脂质体(优选地，利用葡聚糖凝胶柱(G-50))除去游离的白藜芦醇，得到纯化的脂质体。
本发明的制备方法中，优选地，步骤1)中蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000比例为(49～52):(4～6):(2.5～3)(w/w)，更优选为20:2:1(w/w)。
本发明的制备方法中，优选地，步骤1)中所述有机溶剂可为二氯甲烷或三氯甲烷，更优选为三氯甲烷。
本发明的制备方法中，优选地，步骤2)中所述减压蒸发的温度可为37～45℃，更优选为42℃。
本发明的制备方法中，优选地，步骤3)中所述超声破碎的频率可为5％～10％，更优选为5％；所述超声破碎的时间可为4～7min，更优选为5min。
根据再一个方面，本发明提供了所述白藜芦醇脂质体在牙周炎性疾病中的应用。
所述牙周炎性疾病的实例包括但不限于牙周炎、种植体周围炎。
本发明的有益效果在于：
1)本发明的白藜芦醇脂质体体外稳定性较好，且相比于游离药物具有缓释作用。
2)本发明的白藜芦醇脂质体可以被M1型巨噬细胞摄取，有效抑制M1型巨噬细胞的促炎能力，实现促炎M1型巨噬细胞向抗炎M2型巨噬细胞的极化，降低M1型巨噬细胞中的活性氧，并且在细胞水平上有良好的安全性。
3)本发明的白藜芦醇脂质体抑制了NF-κB通路的激活，并减少NLRP3炎症小体的产生，从而抑制肠道牙周炎症。
4)本发明的白藜芦醇脂质体可以对牙周炎模型小鼠起到治疗作用，显著降低牙周组织中的炎症细胞因子，减缓骨吸收。
5)本发明的白藜芦醇脂质体增加了小鼠牙周组织M2型巨噬细胞的数量，而减少M1型巨噬细胞的数量，有良好的炎症治疗效果，并显示出了良好的安全性。
因此，本发明的白藜芦醇脂质体可在牙周炎性疾病(特别是牙周炎)治疗领域有着良好的开发应用前景。
附图说明
图1中A、B、C、D、E-J和K分别为实施例2中白藜芦醇脂质体的组分示意图、为冷冻电镜图、粒径、电位、体外稳定性和释放结果。
图2为实施例3中白藜芦醇脂质体的细胞摄取结果。
图3为实施例4中白藜芦醇和实施例1中白藜芦醇脂质体的细胞安全性试验(CCK8)结果的图。
图4为实施例5中白藜芦醇在15μM的浓度下复极化M1型巨噬细胞。*、***、****分别代表p<0.05、p<0.001、p<0.0001。
图5显示实施例5中白藜芦醇、白藜芦醇脂质体对M1巨噬细胞重极化的影响。图5中A为游离白藜芦醇、白藜芦醇脂质体处理后M1型巨噬细胞表面标志物的变化与未处理的M2型巨噬细胞及M1型巨噬细胞的对比，B和C为对应的统计图。图5中D-I为M1型巨噬细胞经过游离白藜芦醇、实施例1中白藜芦醇脂质体处理后，M2型巨噬细胞M1型巨噬细胞相关mRNA的变化。图5中J为M1型巨噬细胞经过游离白藜芦醇、实施例1中白藜芦醇脂质体处理后，细胞上CD206、iNOS和CD86蛋白表达的变化。图5中K为细胞内STAT1和STAT3及其磷酸化的变化。**、***、****分别代表p<0.01、p<0.001、p<0.0001。
图6显示实施例6中白藜芦醇、白藜芦醇脂质体抑制M1巨噬细胞的促炎作用及提高M2巨噬细胞的抗炎作用。其中图6中A-J为实施例6中白藜芦醇、白藜芦醇脂质体对促炎、抗炎细胞因子表达的影响。图6中A-E为酶联免疫吸附(ELISA)实验结果，发现白藜芦醇脂质体能有效抑制促炎因子(IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α)，促进抗炎因子(IL-10)的表达；F-J为即时聚合酶链式反应(qPCR)实验结果，其结果与ELISA结果相对应；K为蛋白质免疫印迹(western blot)结果图：显示IL-1β、IL-6、TNF-α的变化；L为NF-κB信号通路关键蛋白(p65、p-p65、IκB-α和p-IκB-α)的变化情况；M为炎性小体信号通路(NLRP3、TXNIP、Caspase1、cleaved-caspase1、IL-1β)的变化情况。**、***、****分别代表p<0.01、p<0.001、p<0.0001。
图7显示实施例7中白藜芦醇、白藜芦醇脂质体对巨噬细胞内活性氧的清除作用。图7中A为白藜芦醇、白藜芦醇脂质体处理后巨噬细胞的的活性氧流式检测结果图荧光电镜图；B为白藜芦醇、白藜芦醇脂质体处理后的活性氧流式检测结果图；C为流式细胞术的统计图。*、****分别代表p<0.05、p<0.0001。
图8显示实施例8中白藜芦醇和白藜芦醇脂质体对小鼠牙周炎模型的治疗效果。图8中a-e为10倍镜下HE染色切片结果图，圈出感兴趣区域后在f-j中放大到20倍进一步观察上皮连接及炎性细胞浸润情况。虚线框指示不精密的上皮连接；箭头指示炎细胞浸润。
图9显示实施例8中白藜芦醇和白藜芦醇脂质体对小鼠牙周炎模型在骨吸收方面的治疗效果。如图9所示，白藜芦醇脂质体后小鼠牙槽骨的吸收情况大体图及经Image J处理后的骨吸收统计图结果。*、**、***分别代表p<0.05、p<0.01、p<0.001。
图10显示实施例8中白藜芦醇和白藜芦醇脂质体对小鼠牙周炎牙龈中M1型巨噬细胞的复极化作用。图10中A和B为牙龈组织的Western blot结果，显示白藜芦醇脂质体处理后能促进CD206的表达，抑制iNOS、CD86的表达，并且在信号通路方面抑制p-STAT1，促进p-STAT3。如图10中C的荧光染色结果同样验证了Western blot的结果，显示在牙龈中F4/80+CD206+巨噬细胞表达增加，F4/80+CD86+巨噬细胞表达减少。
图11显示实施例9中盐酸米诺环素、游离白藜芦醇、白藜芦醇脂质体的体内安全性评价结果，具体表现形式为各组的组织病理切片图。
图12为本发明的研究思路概括图。
具体实施方式
为了更好地对本发明进行说明，下面将结合实施例对本发明进行清楚、完整的描述，但不能把它们理解为对本发明保护范围的限制。基于本发明中的实施例，熟悉本领域的技术人员可以在本发明的精神和实质的范围内对实施方案进行各种改进和调整。
实施例1：白藜芦醇脂质体的制备
称取蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(20:2:1，w/w)(均购于上海艾韦特医药科技有限公司)和白藜芦醇(大连美伦生物技术有限公司)，用三氯甲烷溶解。所得溶液在37℃条件下将三氯甲烷减压蒸干，并形成一层薄膜。薄膜中加入磷酸盐缓冲溶液水化，形成脂质水分散体。使用超声波细胞粉碎机(JY92-IIN，宁波新芝生物科技股份有限公司)，在5％的功率下超声5min。之后使用过膜挤出仪，反复挤压至使脂质体通过粒径为200nm的膜，制成粒径分布良好的脂质体。使用葡聚糖凝胶柱(G-50)(GEHealthcare,USA)除去游离的白藜芦醇从而得到纯化的脂质体。
实施例2：白藜芦醇脂质体的表征
(1)白藜芦醇脂质体的形态、粒径、多分散系数及Zeta电位的测定
按实施例1中的方法制备白藜芦醇脂质体，使用激光粒径仪(Zetasizer NanoZS90,Malvern,UK)进行粒径、多分散系数和Zeta电位的测定。使用高效液相分析仪来检测载药包封。
如图1中C和D所示，白藜芦醇脂质体粒径为135.9nm，Zeta电位为-11.1mV。
如图1B所示，冷冻电镜结果表示白藜芦醇脂质体粒径分布良好。
如表1所示，白藜芦醇脂质体的载药量较高、均值为81.30％以上，包封率较好，均值为3.89％。
表1.白藜芦醇脂质体的载药量及包封率
(2)体外稳定性评价
按实施例1中的方法制备白藜芦醇脂质体，并溶解于人工唾液中(pH＝7.4)，置于37℃的恒温摇床上，分别在1h、2h、12h、24h、36h、48h取200μL脂质体溶液测量粒径，观察粒径是否有显著变化。
如图1中E-J所示，白藜芦醇脂质体稳定性较好。
(3)体外释放评价
按实施例1中的方法制备白藜芦醇脂质体，并以磷酸盐缓冲溶液分别配制成1mL的溶液，装入截留分子量为14K的透析袋中。使用含0.1％Tween-80的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)作为溶出介质。将透析袋置于大量的溶出介质中，置于37℃摇床，转速150rpm。分别在设定时间点取0.5mL释放介质，并补充0.5mL新鲜的释放介质。通过HPLC(AgilentTechnologies,USA)测定各时间点的药物浓度最终计算得出药物的体外释放曲线。
如图1中K所示，药物在4h释放达到50％左右，之后开始缓慢释放，在8h达到70％，具有缓释作用。
实施例3：细胞摄取评价
(1)载香豆素-6脂质体的制备
称取蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(20：2：1，w/w)和白藜芦醇，用三氯甲烷溶解并加入香豆素-6(上海百灵威科技有限公司)。按实施例1中的方法分别制备载香豆素-6的脂质体和载香豆素-6的白藜芦醇脂质体(香豆素-6终浓度均为200μg/mL)，超声、过200nm的膜使脂质体粒径分布均匀，使用葡聚糖凝胶柱(G-50)除去游离香豆素-6。
(2)细胞摄取实验
将骨髓来源的巨噬细胞(提取自BALB/c型小鼠)按每孔1×106个细胞种板，并诱导其分化为M1型巨噬细胞。待细胞分化完成后，分别加入实施例3(1)中的载香豆素-6的白藜芦醇脂质体并共孵育，孵育1h后，弃掉上清，使用磷酸盐缓冲溶液清洗三遍，除去多余的脂质体和培养基。加入胰酶(碧云天生物技术有限公司)消化细胞，1500rpm离心5min，弃上清，磷酸盐缓冲溶液重悬细胞，使用流式细胞仪(FACS Calibur,Becton Dickinson,USA)检测细胞中荧光强度。另取一批细胞，按照同样方法孵育1h，弃掉上清，磷酸盐缓冲溶液清洗三遍后，使用4％的多聚甲醛(Sigma-Aldrich,USA)覆盖细胞，固定15min。使用磷酸盐缓冲溶液清洗三遍，除去多聚甲醛。使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(碧云天生物技术有限公司)对细胞核染色10min。磷酸盐缓冲溶液清洗三遍后，使用荧光显微镜(CARL ZEISS,Germany)观察细胞对白藜芦醇脂质体摄取情况。结果如图2所示，巨噬细胞在荧光显微镜下可见胞质内有荧光信号，即代表香豆素被巨噬细胞摄取，表明该处方可被巨噬细胞摄取，而且巨噬细胞形态无明显异常，说明巨噬细胞对脂质体具有耐受性。
实施例4：细胞安全性评价
将HUVEC、RAW264.7和L929细胞按照每孔1×104个细胞接种于96孔板中，每孔100μL，分别给予游离白藜芦醇和和实施例1中制备的脂质体，每组均按照一定浓度梯度给药，给药后继续培养24h，再按照10μL每孔加入CCK8(Sigma-Aldrich,USA)，继续孵育2h，之后吸去，使用酶标仪(Multiskan,ThermoFisher，USA)检测每孔的OD值(波长450nm)，计算细胞的存活率(％)＝实验组平均OD值/空白组均OD值×100％。
如图3所示，当白藜芦醇的剂量范围在0-22.8μg/mL时，脂质体对细胞几乎没有毒性，细胞的存活率始终保持在80％以上，生物安全性较好，对巨噬细胞主要起调控作用而不是杀伤作用。
实施例5：巨噬细胞的重极化
按实施例3中的方法对骨髓来源的巨噬细胞(提取自BALB/c型小鼠)进行处理，用流式细胞术标记F4/80+CD206+的巨噬细胞为M2型巨噬细胞，F4/80+CD86+的巨噬细胞为M1型巨噬细胞，并做统计分析。
实时定量基因扩增荧光检测系统(q-PCR)检测M2型巨噬细胞的表面标志物(CD206、Arg1和Chil3)的mRNA水平及M1型巨噬细胞的表面标志物(CD86、iNOS和CCR7)的mRNA水平。
Western blot方法检测M1型巨噬细胞经过实施例1中制作的白藜芦醇脂质体处理后，检测细胞内CD206、iNOS、CDD86的表达情况及STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3的表达情况。
如图5中A-C所示，白藜芦醇脂质体可以促进M1型巨噬细胞表面CD206的表达，抑制CD86的表达；图5中D-I所示，白藜芦醇脂质体可以显著增加CD206、Arg1和Chil3的mRNA水平，抑制CD86、iNOS和CCR7mRNA的水平，表明M1型巨噬细胞发生了重极化，转变为M2型巨噬细胞。
实施例6：炎性细胞因子的检测及抗炎机制评价
将骨髓来源的巨噬细胞(提取自BALB/c型小鼠)按每孔1×106个细胞种板，并诱导其分化为M1、M2型巨噬细胞。待其分化完成后，设置M1、M2空白对照组及M1分别与游离白藜芦醇、实施例1中制备的脂质体共孵育组。共孵育24h后采用实时定量基因扩增荧光检测系统(q-PCR)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)和蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测细胞因子的变化。
实时定量基因扩增荧光检测系统(q-PCR)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测M1型巨噬细胞经过实施例1中制作的白藜芦醇脂质体处理后促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α及抗炎细胞因子IL-10的mRNA表达水平的变化。蛋白质免疫印迹法(WesternBlot)检测促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达变化。
如图6中A-K所示，白藜芦醇脂质体和白藜芦醇相比抑制促炎因子(IL-6、IL-1β、IL-12、TNF-α)的效果最优，促进抗炎因子(IL-10)的表达也是最优。因此白藜芦醇脂质体能有效抑制M1巨噬细胞的促炎作用，增加其抗炎作用，具有良好的抗炎效果。
按实施例5中的方法对骨髓来源的巨噬细胞(提取自BALB/c型小鼠)进行处理，用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测NF-κB的通路的蛋白变化(p-65，p-p65，IκB-α和p-IκB-α)，以及NLRP3炎症小体、pro-IL-1β和IL-1β的蛋白变化。
如图6中L、M所示，白藜芦醇脂质体能够显著降低IκB-α的降解和p65的磷酸化，降低炎性小体的激活，从而抑制pro-IL-1β转化成IL-1β。
实施例7：细胞内活性氧水平检测
将骨髓来源的巨噬细胞(提取自BALB/c型小鼠)按每孔1×106个细胞种板，并诱导其分化为M1、M2型巨噬细胞。待其分化完成后，设置M1、M2空白对照组及M1分别与游离白藜芦醇、白藜芦醇脂质体共孵育组。共孵育6h，检测细胞中活性氧的水平。同时设立阳性对照组，以1:1000的比例稀释阳性对照(Rosup,50mg/mL)，与细胞共孵育1h，消化并收集细胞。用无血清培养基按照1:1000的比例稀释2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(Sigma-Aldrich,USA)，加入到收集了细胞的各个样品中，置于37℃恒温培养箱(MCO-18AIC,Sanyo,Japan)中孵育20min，每隔一段时间轻轻摇晃。探针装载完成后，用无血清培养基漂洗细胞3次，除去过量的2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐，使用流式细胞仪分析细胞荧光情况。
如图7所示，白藜芦醇脂质体可以明显降低M1型巨噬细胞内活性氧水平，因此可以减轻由于活性氧造成的炎症加剧。
实施例8：体内药效学评价
选择牙周结扎绑线加注射LPS的方法诱导小鼠发生实验性牙周炎、2周后给药，小鼠被随机分为：盐酸米诺环素组(MH)、空白组(N)、模型组(PD)、白藜芦醇组(R/RSV)、白藜芦醇脂质体组(Lipo-RSV)。
动物实验周期到达终点时，将小鼠安乐死，解剖分离小鼠的上颌，其中一部分直接浸泡在4％多聚甲醇中48h，随后脱钙、脱水包埋、制作石蜡切片；另一部分用组织磷酸盐缓冲溶液润洗，滤纸滤干，分离牙龈及上颌骨，以备后续实验。
牙龈组织被进一步用于蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测CD206、iNOS、CD86和STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3的表达变化。上颌骨被收集来进行亚甲蓝染色，检测骨吸收情况。包埋后的石蜡组织块，一是进行切片脱蜡后用苏木精-伊红染色，使用组织切片成像仪(TCS-SP8,Leica Germany)拍摄；二是进行切片脱蜡后的荧光染色，使用荧光显微镜拍摄，最后观察并评价效果。
如图8所示，白藜芦醇脂质体对牙周炎模型小鼠起到的治疗作用最好，修复了受损的上皮屏障，并减少了炎性细胞的浸润。如图9所示，白藜芦醇脂质体还有效抑制了牙周炎牙槽骨的吸收。如图10中A和C所示，经白藜芦醇脂质体处理后M2型巨噬细胞标志CD206上调，M1型巨噬细胞标志iNOS、CD86下调。如图10中B所示，白藜芦醇脂质体处理后p-STAT1下调、p-STAT3表达上调。由此认为白藜芦醇具有很好的复极化M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的能力。
实施例9：体内安全性评价
按实施例8中的方法对小鼠进行诱导、给药。动物实验周期到达终点时，将小鼠安乐死，取出小鼠的心、肝、脾、肺、肾，称重，计算脏器系数。心、肝、脾、肺、肾用4％福尔马林溶液进行固定，石蜡包埋制片，切片脱蜡后用苏木精-伊红染色，使用组织切片成像仪(TCS-SP8,Leica Germany)拍摄，观察并评价。
如图11所示，各给药组的主要脏器病理切片均无明显病变，证明了游离药物、脂质体与乳铁蛋白修饰的脂质体生物安全性良好。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种白藜芦醇脂质体，所述脂质体包括以下原料：
蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和白藜芦醇；
其中，蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的w/w比例为(49～52):(4～6):(2.5～3)，优选为20:2:1；
其中，所述白藜芦醇包裹在脂质体中。
2.根据权利要求1所述的白藜芦醇脂质体，其中
所述白藜芦醇脂质体粒径为130～170nm，优选为140nm，多分散指数为0.05～0.15，优选为0.1，Zeta电位为-3～-12mV，优选为-11mV。
3.根据权利要求1所述的白藜芦醇脂质体，其中
基于1重量份白藜芦醇脂质体，所述白藜芦醇为0.036～0.041重量份，优选为0.040重量份。
4.一种白藜芦醇脂质体的制备方法，包括以下步骤：
1)将蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和白藜芦醇，用有机溶剂溶解得到溶液；
2)将所述溶液减压蒸发除去有机溶剂得到一层薄膜，并将薄膜用磷酸盐缓冲溶液水化，得到脂质水分散体；
3)将所述脂质水分散体进行超声破碎，之后使用过膜挤出仪反复挤压至脂质体通过微孔滤膜(优选地，膜孔径为200nm)，得到脂质体；
4)将所述脂质体(优选地，利用葡聚糖凝胶柱(G-50))除去游离的白藜芦醇，得到纯化的脂质体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中
步骤1)中蛋黄卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000w/w比例为(49～52):(4～6):(2.5～3)，优选为20:2:1。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其中
步骤1)中所述有机溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷，优选为三氯甲烷。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其中
步骤2)中所述减压蒸发的温度为37～45℃，优选为42℃。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其中
步骤3)中所述超声破碎的频率为5％～10％，优选为5％；所述超声破碎的时间为4～7min，优选为5min。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的白藜芦醇脂质体在制备治疗牙周炎性疾病中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述牙周炎性疾病包括牙周炎、种植体周围炎。
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