KR101810156B1 - 폴리에틸렌 글리콜 및 플라보노이드 나노복합체를 유효성분으로 함유하는 안구 건조증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

폴리에틸렌 글리콜 및 플라보노이드 나노복합체를 유효성분으로 함유하는 안구 건조증 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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김채은
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Abstract

본 발명은 폴리에틸렌 글리콜 및 플라보노이드 나노복합체를 유효성분으로 함유하는 안구 건조증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서는 항산화제인 카테킨과 약물 전달 시스템에 사용되는 친수성 고분자인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 이용하여 카테킨의 생체 이용률을 증가시킨 카테킨/PEG 나노복합체를 제조하였으며, 안구 건조증 마우스 모델에서 상기 카테킨/PEG 나노복합체에 의한 눈물 생성 증가, 각막 상피 세포의 안정화, 결막 배상 세포 증가 및 PEG 투여량에 따른 항염증 개선 효과를 확인하였다.
따라서, 상기와 같은 효과를 가지는 카테킨/PEG 나노복합체는 눈물 막의 안정화 및 염증 억제를 통하여 안구 건조증을 치료하기 위한 새로운 생물의학 재료로 활용될 수 있다.

Description

폴리에틸렌 글리콜 및 플라보노이드 나노복합체를 유효성분으로 함유하는 안구 건조증 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating comprising poly(ethylene glycol) and flavonoid nanocomplex}
본 발명은 폴리에틸렌 글리콜 및 플라보노이드 나노복합체를 유효성분으로 함유하는 안구 건조증 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
안구 건조증(dry eye disease)은 눈물 막(tear film)의 불균형, 고삼투압 및 염증성 손상을 포함하는 눈물 및 안구 표면의 질환이다. 염증은 안구 건조 발병에 주요한 요인으로 눈물샘(lacrimal glands)의 점진적 기능부전 및 결막 상피 손상을 포함하는 안구 표면 손상의 악순환을 야기한다. 따라서, 항염증제의 사용은 안구 건조를 치료하는 다양한 치료 옵션 중 가장 일반적으로 사용된다.
카테킨(catechin, flavan-3-ol)은 플라보노이드(flavonoids)에 속하는 물질로, 다양한 과일, 음료 및 차에서 발견되는 천연 항산화제이다. 카테킨은 항박테리아, 항발암성, 항염증성 특징을 포함하는 유익한 효과가 보고되면서 최근 주목을 받고 있다. 이전 연구에서 카테킨 유도체인 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG)가 항염증 및 항산화 효과를 통하여 안구 건조증, 녹내장 및 다양한 망막 기능 장애를 포함하는 안구 질환 치료에 효과가 있는 것으로 보고되었다. 또한, EGCG가 안구 건조증 마우스 모델에서 전-염증성 매개체(pro-inflammatory mediators)를 억제하는 것이 보고된 바 있다. 그러나 플루오레세인(fluorescein) 염색을 이용한 임상적 소견만을 확인되었고, 염증, 림프관 형성 및 세포 사멸과 같은 병인성은 생체 외(in vitro) 실험으로 각막 상피 세포에서만 평가되었다. 카테킨은 강력한 항산화제이지만, 카테킨은 물에 대한 용해도가 낮아 생체 이용률이 낮고, 투여량에 따라 산화 촉진제로 작용하는 성향 때문에 사용이 제한적이다. 현재, 카테킨의 분자량을 증가시키는 것이 체내 순환 시간을 증가시켜 생물학적 특성을 향상시킨다는 연구들이 보고되고 있다.
폴리에틸렌 글리콜(poly(ethylene glycol); PEG)은 약물 전달 시스템으로 다양한 치료용 생물학적 약물에 널리 사용되는 비이온성 및 친수성 고분자이다. PEG 기반 공중합체는 생체 적합성, 생분해성 및 감열성(thermosensitive)을 가지며 이러한 특성들을 쉽게 제어할 수 있기 때문에 생물의학적 용도를 위한 생물의학적 물질로서 잠재적인 역할을 한다. 2008년 발표된 연구에 따르면, PEG 및 생체 고분자(단백질, DNA, 탄수화물 등)의 나노복합체(nanocomplex)가 치료용 생물학적 약물로, 장시간 작용 및 지속-방출형 제형으로서의 가능성이 보고된 바 있다. 또한, PEG 기반 양극성 나노입자는 신약 전달 시스템 개발을 통해 암세포에 다약제 내성을 극복하는데 사용될 수 있다고 보고된 바 있다. 그러나, PEG의 대부분 연구는 물질 공학 접근에 국한되어 있어, PEG의 효능 연구는 여전히 미흡한 실정이다. 2014년 발표된 연구에 따르면, 약물 전달체로서 지질 나노입자의 사용을 보고한 바 있다. 이 연구는 지질 나노입자에 캡슐화된 EGCG가 약물의 산화 및 에피머화(epimerization) 반응을 억제한다는 것을 보고하였다.
그럼에도 불구하고, 안구 건조증 마우스 모델에서 카테킨 및 카테킨/PEG 나노복합체에 대한 연구는 현재까지 보고된 바 없다. 본 발명에서는 PEG가 카테킨의 생체 이용률을 증가시키고, 카테킨/PEG 나노복합체가 카테킨의 항염증 효과를 향상시킴으로써 안구 건조증 치료에 있어서 시너지 효과 및 치료 효과를 가질 것으로 예상하였다.
대한민국 등록특허 제 10-1008189호(2011.01.07 등록)
본 발명의 목적은 플라보노이드 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 나노복합체의 제조방법 및 상기 나노복합체를 유효성분으로 함유하는 안구 건조증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라보노이드 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 나노복합체를 유효성분으로 함유하는 안구 건조증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 플라보노이드를 C1 내지 C4 알코올에 용해시켜 플라보노이드 용액을 제조하는 제 1단계, 폴리에틸렌 글리콜을 물에 용해시켜 폴리에틸렌 글리콜 용액을 제조하는 제 2단계, 상기 제 1단계의 플라보노이드 용액과 상기 제 2단계의 폴리에틸렌 글리콜 용액을 혼합하여 혼합물을 제조하는 제 3단계, 상기 혼합물에서 C1 내지 C4 알코올을 제거하는 제 4단계 및 상기 C1 내지 C4 알코올이 제거된 혼합물을 필터로 여과하는 제 5단계를 포함하는 플라보노이드 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 나노복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서는 항산화제인 카테킨과 약물 전달 시스템에 사용되는 친수성 고분자인 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 이용하여 카테킨의 생체 이용률을 증가시킨 카테킨/PEG 나노복합체를 제조하였으며, 안구 건조증 마우스 모델에서 상기 카테킨/PEG 나노복합체에 의한 눈물 생성 증가, 각막 상피 세포의 안정화, 결막 배상 세포 증가 및 PEG 투여량에 따른 항염증 개선 효과를 확인하였다.
따라서, 상기와 같은 효과를 가지는 카테킨/PEG 나노복합체는 눈물 막의 안정화 및 염증 억제를 통하여 안구 건조증을 치료하기 위한 새로운 생물의학 재료로 활용될 수 있다.
도 1은 안구 건조증 마우스 모델에서 눈물 생성에 대한 PEG/카테킨 나노복합체의 효과를 확인한 것으로 베이스라인(baseline), 건조 스트레스 10일 후(desiccation stress; DS 10일) 및 PEG, 카테킨/PEG 나노복합체(CP1, CP5 및 CP10), 카테킨 치료 10일 후의 눈물의 양을 페놀 레드-침윤 면 스레드(phenol red-impregnated cotton threads)를 이용하여 측정한 결과이다.
도 2는 각막 이상에 대한 카테킨/PEG 나노복합체의 효과를 확인한 것으로 (A)는 각막 표면의 백색 링(ring)을 현미경 이미지 확인한 것이며, (B)는 각막 이상을 점수로 나타낸 결과이다.
도 3은 각막 형광 염색에 대한 카테킨/PEG 나노복합체의 효과를 확인한 것으로 (A)는 각막 형광 염색을 생체 현미경 이미지로 확인한 것이며, (B)는 각막 형광 염색을 점수로 나타낸 결과이다.
도 4는 각막 상피세포 박리에 대한 카테킨/PEG 나노복합체의 효과를 확인한 것으로 (A)는 각막 절편을 이용하여 박리된 각막 상피세포를 헤마톡실린 & 에오신(hematoxylin & eosin; H&E) 염색으로 확인한 것이며, (B)는 박리된 각막 상피 세포의 수를 정량화하여 나타낸 결과이다.
도 5는 결막 배상 세포 밀도에 대한 카테킨/PEG 나노복합체의 효과를 확인한 것으로 (A)는 결막 배상 세포를 PAS(periodic acid Schiff) 염색으로 확인한 것이며, (B)는 결막 배상 세포의 밀도를 정량화하여 나타낸 결과이다.
도 6은 눈물샘에서 전염증성 사이토카인 발현에 대한 카테킨/PEG 나노복합체의 효과를 확인한 것으로 (A)는 눈물샘 절편을 이용하여 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 발현을 면역 염색으로 확인한 것이며, (B)는 상기 발현을 정량화하여 나타낸 결과이다.
도 7은 눈물샘에서 IL-17 발현에 대한 카테킨/PEG 나노복합체의 효과를 확인한 것으로 (A)는 눈물샘 절편을 이용하여 IL-17의 발현을 면역 염색으로 확인한 결과이며, (B)는 상기 발현을 정량화하여 나타낸 결과이다.
도 8은 부착 분자 및 기질금속단백분해효소(matrix metalloproteinases; MMPs)에 대한 카테킨/PEG 나노복합체의 효과를 확인한 것으로 (A)는 눈물샘 절편을 이용하여 ICAM-1, VCAM-1, MMP-2 및 MMP-9의 발현을 면역 염색으로 확인한 결과이며, (B)는 상기 발현을 정량화하여 나타낸 결과이다.
본 발명의 발명자들은 건조 스트레스가 눈물 생성 감소, 각막 이상 증가, 각막 상피 세포의 박리 증가, 결막 배상 세포 감소 및 염증 관련 인자의 발현을 유도하는 것을 확인하였으며, 카테킨/PEG 나노복합체에 의한 눈물 생성 증가, 각막 상피 세포의 안정화, 결막 배상 세포 증가 및 PEG 투여량에 따른 항염증 개선 효과를 확인하며 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 플라보노이드 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 나노복합체를 유효성분으로 함유하는 안구 건조증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 나노복합체는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다:
[화학식 1]
Figure 112017044345035-pat00001
상기 R1 내지 R4는 각각 동일하거나 다를 수 있고, 수소 또는 플라보노이드이며, 상기 m은 8 내지 460 중 어느 하나의 정수임.
바람직하게는, 상기 플라보노이드는 카테킨, 케르세틴, 바이칼레인, 갈로카테킨 갈레이트, 탁시폴린, 미리세틴, 모린 및 피세틴으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
바람직하게는, 상기 나노복합체는 플라보노이드 용액과 폴리에틸렌 글리콜 용액을 1:1 내지 15의 중량비로 혼합하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
바람직하게는, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 수평균 분자량은 400 내지 20,000 g/mol일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
바람직하게는, 상기 나노복합체의 평균 직경은 100 내지 200 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
바람직하게는, 상기 나노복합체는 눈물 생성 및 결막 배상 세포의 밀도를 증가시킬 수 있다.
바람직하게는, 상기 나노복합체는 각막 상피 세포의 박리, 부착 분자, 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 및 기질금속단백분해효소(matrix metalloproteinase; MMP)를 감소시킬 수 있다.
바람직하게는, 상기 부착 분자는 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1) 및 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)이고, 상기 전염증성 사이토카인은 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-17이며, 상기 기질금속단백분해효소는 MMP-2 및 MMP-9일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
바람직하게는, 상기 약학 조성물은 상기 나노복합체와 약제학적으로 허용 가능한 담체를 혼합하여 점안제 형태의 안약이나 주사제, 또는 젤 형태의 안연고나 주사제로 제공될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 약학조성물은 점안제, 주사제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 젤, 시럽, 현탁제, 유제, 점적제 및 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 플라보노이드를 C1 내지 C4 알코올에 용해시켜 플라보노이드 용액을 제조하는 제 1단계, 폴리에틸렌 글리콜을 물에 용해시켜 폴리에틸렌 글리콜 용액을 제조하는 제 2단계, 상기 제 1단계의 플라보노이드 용액과 상기 제 2단계의 폴리에틸렌 글리콜 용액을 혼합하여 혼합물을 제조하는 제 3단계, 상기 혼합물에서 C1 내지 C4 알코올을 제거하는 제 4단계 및 상기 C1 내지 C4 알코올이 제거된 혼합물을 필터로 여과하는 제 5단계를 포함하는 플라보노이드 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 나노복합체의 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 나노복합체는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다:
[화학식 1]
Figure 112017044345035-pat00002
상기 R1 내지 R4는 각각 동일하거나 다를 수 있고, 수소 또는 플라보노이드이며, 상기 m은 8 내지 460 중 어느 하나의 정수임.
바람직하게는, 상기 플라보노이드는 카테킨, 케르세틴, 바이칼레인, 갈로카테킨 갈레이트, 탁시폴린, 미리세틴, 모린 및 피세틴으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
바람직하게는, 상기 제 3단계는 플라보노이드 용액과 폴리에틸렌 글리콜 용액을 1:1 내지 15의 중량비로 혼합하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
바람직하게는, 상기 제 4단계는 40 내지 60℃에서 1시간 내지 3시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
바람직하게는, 상기 나노복합체의 평균 직경은 100 내지 200 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 카테킨/PEG 나노복합체의 제조
카테킨 및 평균 분자량이 1몰 당 4,600 g인 폴리에틸렌 글리콜(poly(ethylene glycol); PEG)은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 메탄올은 머크 밀리포아(Merck Millipore, Temecula, CA, USA)에서 구입하였다.
카테킨 및 PEG 용액은 복합체를 제조하기 전에 별도로 제조하였다. 먼저, 카테킨을 메탄올에 용해시켜 10 mg/mL 농도가 되도록 준비하고, PEG는 증류된 탈이온수(distilled and deionized water; DDW)에 용해시켜 2, 10 및 20 mg/mL의 다양한 농도가 되도록 준비하였다. 카테킨 용액은 각 PEG 용액과 1:1, 1:5 및 1:10의 메탄올 대 DDW의 부피비로 혼합하였다. 카테킨/PEG 1(CP1), 카테킨/PEG 5(CP5) 및 카테킨/PEG 10(CP10)의 카테킨 대 PEG 중량비로 혼합된 용액은 15분 동안 세게 혼합하였다. 그 후, 용액 혼합물은 증발기로 옮겨 50℃에서 2시간 동안 잔류하는 메탄올을 제거하였다. 이어서, 용액 혼합물을 0.4 μm 필터로 여과하고 동결 건조시켜 분말 형태로 제조하였다. 순수 카테킨과 PEG도 동일한 과정을 수행하였다. 동물실험을 위해, 완전히 건조된 카테킨/PEG, 카테킨, 또는 PEG 분말은 식염수(JW Pharmaceutical, Seoul, Korea)에 재용해시키고, 이때 이들의 카테킨 농도는 10 mg/mL이 되도록 제조하였다.
모든 점안액은 10 mL로 만들고 1 mL 바이알(vials)에 분주하여 -20℃에서 보관하였다. 1개의 바이알은 매일 해동하여 냉장고에 보관하고, 1일 5회 점적 후 폐기하였다.
카테킨 및 PEG를 이용한 카테킨/PEG 나노복합체 제조에 있어서, 반응식은 하기 반응식 1과 같다.
[반응식 1]
Figure 112017044345035-pat00003
실시예 2 : 안구 건조증 마우스 모델
동물 보호 및 모든 실험 절차는 인제대학교 부산백병원 동물실험 지침에 따라 동물실험 윤리위원회(No. 2016-005) 및 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology statement for the use of animals in ophthalmic and vision research) 권고사항을 준수하여 수행하였다.
총 83마리의 NOD.B10.H2b 마우스(6주령)는 잭슨 연구소(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA)에서 얻었고 6주 내지 10주 동안의 순화 기간을 거쳤다. 마우스는 SPF(semi-pathogen free) 시설에서 보관하였고, 사료와 물은 자유 급이로 제공하였다.
6마리의 마우스는 베이스라인(baseline)으로 조직병리학적 분석에 사용하였다. 77마리의 마우스는 무스카린 수용체 차단제(muscarinic receptor blocker)인 스코폴라민 하이드로브로마이드(scopolamine hydrobromide, Sigma-Aldrich) 500 μg/200 μL을 10일 동안 매일 4회 피하로 주사하였다. 이때 마우스는 매일 18시간 동안 평균 40% 이하의 주위 습도로 팬에 의한 공기 통풍을 포함하는 건조 스트레스(desiccation stress; DS)에 10일 동안 노출되었다. 스코폴라민 하이드로브로마이드 주사 및 건조 스트레스 노출 10일(DS 10일) 후, 눈물 생성을 측정하고 각막의 사진을 찍었다.
그 결과, 베이스라인과 비교하였을 때 모든 마우스에서 최소 65% 이상 눈물 양이 감소하였고, 각막 이상 점수가 2등급 이상 증가한 안구 건조 증상을 나타내었다.
DS 10일째, 11마리의 마우스는 조직병리학적 분석에 사용하였다. 66마리의 마우스는 무작위로 6개의 군으로 나누었다: 비히클(vehicle) 군(n=11, 생리 식염수 5 μL), 카테킨 군(n=11, 1% 카테킨 5 μL), CP1 군(n=11, 1% CP1 5 μL), CP5 군(n=11, 1% CP5 5 μL), CP10 군(n=11, 1% CP10 5 μL) 및 PEG 군(n=11, 1% PEG 5 μL). 모든 치료는 하루에 5번씩 주입되었고, 베이스라인, DS 10일, 및 치료 후 3일, 5일, 7일 및 10일째에 눈물 양, 각막 이상 및 플루오레세인 점수를 측정하였다. 각막 및 결막에서 각각 헤마톡실린 & 에오신(hematoxylin & eosin; H&E) 및 PAS(periodic acid Schiff) 염색을 수행하였다. 또한, 눈물샘에서 면역조직화학 염색과 관련된 염증 인자의 발현을 평가하였다.
실시예 3 : 눈물 생성 분석
눈물 양은 이전에 보고된 논문(Eye Contact Lens. 2006;32(6):272-276)을 참고하여 측정하였다. 간략하게, 페놀 레드-침윤 면 스레드(phenol red-impregnated cotton threads, Zone-Quick, Oasis, Glendora, CA, USA)를 측면 안각에 위치시키고, 20초 후, 눈물에 젖어 적색으로 변한 스레드를 입체 줌(zoom) 현미경(SZX7, Olympus Corp., Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 눈물 양은 염기성 용액(0.9% 식염수 1.5 L 및 5 N 수산화나트륨(NaOH) 5 mL)으로 나타낸 표준곡선과 비교하여 계산하였다.
그 결과, 도 1을 참조하여 보면, NOD.B10.H2b 마우스의 베이스라인에서 눈물의 양은 0.16 ± 0.02 μL로 측정되었고, 건조 스트레스에 의해 눈물의 양이 0.02 ± 0.01 μL로 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 카테킨 및 CP10 처리군에서 치료 5일 후에는 눈물 양이 각각 0.13 ± 0.01 μL 및 0.15 ± 0.03 μL로 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 카테킨/PEG 나노복합체의 처리는 농도 의존적으로 눈물의 생성을 증가시켰다. DS 10일째와 비교하였을 때, 카테킨 처리군은 치료 3일(0.08 ± 0.03 μL) 후부터 시간 의존적으로 눈물 생성을 증가시켰으며, 치료 5일 후에는 베이스라인 수준까지 회복되는 것을 확인하였다. 또한, DS 10일째와 비교하였을 때, CP1 처리군은 치료 5일 후부터 눈물 생성을 유의하게 증가시켰으며, 치료 10일(0.16 ± 0.03 μL) 후에는 베이스라인 수준까지 회복되는 것을 확인하였다. 또한, DS 10일째와 비교하였을 때, CP5 처리군은 치료 3일(0.10 ± 0.02 μL) 후부터 눈물 생성을 현저하게 증가시켰으며, 치료 7일(0.13 ± 0.01 μL) 후에는 베이스라인 수준까지 회복되는 것을 확인하였다. CP10 처리군의 눈물 양은 처리 후 3일(0.07 ± 0.02 μL) 후에 통계적으로 유의하였고, 치료 5일 후에는 베이스라인 수준까지 회복되는 것을 확인하였다. 그러나 PEG 처리군에서 눈물 생성이 증가하는 경향을 보였으나, 비히클과 비교하였을 때 유의한 차이를 보이지 않았다.
실시예 4 : 각막 이상(corneal irregularities) 분석
각막의 이상은 이전에 보고된 논문(Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006;47:2847-2856)을 참고하여 측정하였다. 10일째에 마지막 스코폴라민 하이드로브로마이드 주사 후 2시간째와 카테킨과 카테킨/PEG 나노복합체 점안액의 마지막 점적 후 1시간째에 각막 표면의 백색 링(ring) 이미지를 입체 줌 현미경을 이용하여 광섬유링 조명으로부터 획득하였다. 각막 매끄러움을 디지털 이미지의 백색 링에 반사된 각막 상피세포의 불규칙성을 등급화하여 평가하였다. 반사된 링을 4등분으로 나누었고, 각막 이상 점수는 반사된 링에서 왜곡된 분기의 수를 기준으로 5점 척도를 이용하여 계산하였다: 0, 왜곡 없음; 1, 1/4등분의 왜곡; 2, 2/4등분 왜곡; 3, 3/4등분 왜곡; 4, 4/4등분 왜곡; 5, 심한 왜곡.
그 결과, 도 2A를 참조하여 보면, 건조 스트레스는 모든 군에서 각막 이상을 점차적으로 증가시켰다. 그러나 카테킨/PEG 나노복합체 및 카테킨 처리군은 치료 7일 및 10일 후에 각각 백색 링이 관찰되었다. 비히클 및 PEG 처리군은 치료 10일 후에도 왜곡된 백색 링이 개선되지 않는 것을 확인하였다. 각막 이상 점수 및 군 내, 군 사이의 비교 데이터는 도 2B에 나타내었다. 베이스라인(0.44 ± 0.55)과 비교하였을 때, 건조 스트레스에 의해 각막 이상 점수가 4.44 ± 0.62까지 점차적으로 증가하는 것을 확인하였다. 비히클 처리군(3.63 ± 0.48)과 비교하였을 때, CP1 처리군, CP5 처리군 및 CP10 처리군은 치료 7일 후에 각막 이상 점수가 각각 2.75 ± 0.29, 2.38 ± 0.25 및 2.25 ± 0.30으로 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 그러나 카테킨 처리군은 치료 7일(2.88 ± 0.48) 후, 비히클 처리군과 비교하였을 때 통계적으로 차이가 없었으며, 치료 10일(2.38 ± 0.47) 후에서 각막 이상을 현저하게 감소시켰다. PEG 처리군은 각막 이상을 감소시키는 경향을 보였으나, 비히클과 비교하였을 때 유의한 차이를 보이지 않았다. 또한, 비히클 처리군의 각막 이상은 DS 10일째와 비교하였을 때 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다.
실시예 5 : 각막 형광 염색 분석
각막의 형광 염색은 이전에 보고된 논문(CLAO J. 1995;21: 221-232)을 참고하여 수행하였다. 5% 플루오레세인 1 μL를 마우스의 측면 결막낭(conjunctival sac)에 처리하고, 눈은 코발트 블루(cobalt blue) 조명 하에 생체 현미경(slit lamp biomicroscopy, SL-D7; Topcon Medical Systems, Inc., Oakland, NJ)을 이용하여 분석하였다. 점상(punctate) 염색은 표준 NEI(national eye institute) 등급 시스템을 이용하여 각막의 5개 영역을 각각 0 내지 3점의 점수로 평가하였다.
그 결과, 도 3을 참조하여 보면, 각막의 형광 염색은 건조 스트레스에 의해 10.61 ± 0.91로 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 그러나 카테킨 처리군(6.67 ± 0.58) 및 CP10 처리군(7.33 ± 0.57)은 치료 7일 후에 현저하게 감소하였으며, 비히클 처리군(10.00 ± 1.00)과 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 치료 10일 후, 카테킨 처리군(3.67 ± 0.58)과 CP10 처리군(4.33 ± 0.58)사이의 각막 형광 염색 점수는 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 카테킨 처리군과 CP10 처리군을 제외한 모든 처리군은 비히클 처리군과 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다.
실시예 6 : 조직병리학적 분석
외과적으로 절제된 마우스의 안와(orbits)는 10% 포르말린(formalin)에 고정시키고 파라핀(paraffin)으로 포매(embedding)하였다. 파라핀 조직은 마이크로톰 (RM2245, Leica Biosystems, Nussloch, Germany)으로 미세 절단하여 5 μm의 각막 절편을 제조한 후, 헤마톡실린 & 에오신 염색을 수행하였다. 또한, 결막 배상 세포의 PAS 염색은 상업적 키트(Merck, Darmstadt, Germany)를 이용하여 제공된 프로토콜에 따라 수행하였다. 염색된 부분은 가상 현미경(NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu, Japan)을 이용하여 촬영하였다.
도 4A는 베이스라인, DS 10일째 및 치료 후 10일째의 마우스 각막 절편을 헤마톡실린 & 에오신으로 염색한 결과이다. DS 10일째에서 박리된 상피 세포가 더 빈번히 관찰된 반면, CP10 처리군은 박리된 상피 세포의 수를 감소시키는 것을 확인하였다. 도 4B는 0.1 mm2 당 박리된 각막 상피 세포 수로 정량화하여 나타낸 것이다. 건조 스트레스는 각막 상피 세포의 박리를 1.60 ± 0.35 / 0.1 mm2로 현저하게 증가시킨 반면, CP10 처리군(0.48 ± 0.12)은 각막 상피 세포의 박리를 베이스라인 수준까지 유의하게 감소시켰다. CP10 군을 제외한 모두 처리군은 DS 10째와 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다.
도 5A는 NOD.B10.H2b 마우스의 하부 원개 결막(inferior fornix conjunctivae)을 PAS로 염색한 결과로 결막 배상 세포가 강한 보라색을 띠는 것을 확인할 수 있다. 도 5B에 나타낸 바와 같이, 대조군 마우스에서 결막 배상 세포의 수는 12.86 ± 0.76 / 0.1 mm2 이었지만, 건조 스트레스에 의해 6.19 ± 0.16 / 0.1 mm2로 점차적으로 감소하는 것을 확인하였다. 그러나 카테킨 처리군, CP1 처리군 및 CP5 처리군은 결막 배상 세포의 수를 각각 9.71 ± 1.25 / 0.1 mm2, 8.00 ± 0.29 / 0.1 mm2 및 9.24 ± 0.87 / 0.1 mm2로 유의하게 증가시켰다. 그러나 이들 군 간에 결막 배상 세포의 수는 통계적으로 차이가 없었으며, 대조군 수준까지는 회복되지 못하였다. PEG 처리군은 CP1 처리군의 수준과 유사하게 결막 배상 세포의 수를 8.29 ± 0.28 / 0.1 mm2로 증가시켰다. CP10 처리군은 대조군의 수준과 유사하게 결막 배상 세포의 수를 13.52 ± 1.67 / 0.1 mm2로 현저하게 증가시켰다(DS 10일). 비히클 처리군의 결막 배상 세포 수는 DS 10일째와 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다.
실시예 7 : 면역조직화학( Immunohistochemistry ; IHC) 분석
외과적으로 절제된 마우스의 눈물샘은 10% 포르말린에 고정시키고 파라핀으로 포매하였다. 파라핀 조직은 마이크로톰으로 미세 절단하여 5 μm의 절편을 제조하였다. 파라핀 절편은 탈파라핀화(deparaffinized) 하고, 재수화(rehydrated)하여 항원 부활 완충용액(antigen retrieval solution)에서 열처리한 다음, 30분 동안 3% 과산화수소 용액에 침지시켰다. 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 파라핀 절편을 특정 1차 항체와 실온에서 1시간 동안 반응시킨 다음 세척하고, 2차 항체(Dako Corp., Glostrup, Denmark)와 40분 동안 반응시켰다. 파라핀 절편은 발색제(chromogen)으로 3-3'-다이아미노벤지딘(3-3'-diaminobenzidine; DAB)으로 시각화하고 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin, Sigma, St. Louis, MO, USA)으로 30초 동안 대조염색 하였다. 섹션의 이미지는 가상 현미경을 이용하여 촬영하였다.
[표 1]
Figure 112017044345035-pat00004
그 결과, 도 6A는 눈물샘 절편을 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 항체로 면역 염색한 결과이다. 도 6B를 참조하여 보면, 대조군과 비교하였을 때, 건조 스트레스에 의한 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현이 각각 2.04배, 3.55배 및 4.02배로 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. CP10 처리군은 상기 전염증성 사이토카인의 발현을 대조군 수준으로 억제하는 것을 확인하였다. 대조적으로 카테킨 처리군은 DS 10일째와 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. CP1 처리군 및 PEG 처리군 또한 전염증성 사이토카인의 발현에 영향을 미치지 않았다.
또한, 도 7을 참조하여 보면, 눈물샘 절편에서 건조 스트레스에 의한 IL-17 발현이 대조군에 비해 15.35배 증가한 것을 확인할 수 있었다. 그러나 카테킨 처리군과 카테킨/PEG 나노복합체의 모든 처리군은 PEG 농도에 의존적으로 IL-17의 발현을 유의하게 감소시켰다. CP10 처리군은 눈물샘 절편에서 IL-6의 발현을 68% 현저하게 감소시켰으며, IL-6 발현은 비히클 처리군 및 PEG 처리군에 의해 영향을 받지 않는 것을 확인하였다.
또한, 도 8을 참조하여 보면, 대조군과 비교하였을 때, 건조 스트레스에 의한 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1) 및 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)과 같은 부착 분자의 발현이 각각 2.36배 및 6.98배로 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 카테킨 처리군, CP1 처리군 및 CP5 처리군에서 상기 부착 분자의 발현은 DS 10일째 및 비히클 처리군과 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 그러나 CP10 처리군은 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 대조군 수준으로 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다(대조군의 각각 1.20배 및 1.26배). 또한, 건조 스트레스는 눈물샘 절편에서 기질금속단백분해효소(matrix metalloproteinase; MMP)인 MMP-2 및 MMP-9의 발현을 점차적으로 증가시켰다(대조군의 각각 4.27배 및 4.61배). CP10 처리군을 제외한 모든 처리군은 MMP-2의 발현에 영향을 미치지 않았고, 오직 CP10 처리군만이 MMP-2의 발현을 대조군 수준(DS 10일째의 62.76%)으로 유의하게 감소시켰다. CP10 처리군은 MMP-9의 발현 또한 대조군 수준(DS 10일째의 72%)으로 현저하게 감소시켰으며, 비히클 처리군과 PEG 처리군은 영향을 미치지 않았다. DS 10일째와 비교하였을 때, 카테킨 처리군, CP1 처리군 및 CP5 처리군은 MMP-9의 발현을 유의하게 감소시켰으나, 대조군 수준까지 회복되지는 못하였다.
실시예 8 : 통계 분석
데이터는 SPSS 버전 22.0(SPSS, Chicago, IL, USA)을 이용하여 분석하였고 평균 ± 표준 편차(SD)로 나타내었다. 군 간의 차이는 one-way ANOVA를 이용하여 분석하였고, Tukey's test로 P 값이 0.05 미만일 때, 통계적으로 유의한 것으로 정의하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. 카테킨 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 나노복합체를 유효성분으로 함유하며, 상기 나노복합체는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 안구 건조증 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112017091800011-pat00015

    상기 R1 내지 R4는 각각 동일하거나 다를 수 있고, 수소 또는 카테킨이며, 상기 m은 8 내지 460 중 어느 하나의 정수임.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 나노복합체는 카테킨 용액과 폴리에틸렌 글리콜 용액을 1:1 내지 15의 중량비로 혼합하여 제조하는 것을 특징으로 하는 안구 건조증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 나노복합체의 평균 직경은 100 내지 200 nm인 것을 특징으로 하는 안구 건조증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 나노복합체는 눈물 생성 및 결막 배상 세포의 밀도를 증가시키는 것을 특징으로 하는 안구 건조증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 나노복합체는 각막 상피 세포의 박리, 부착 분자, 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 및 기질금속단백분해효소(matrix metalloproteinase; MMP)를 감소시키는 것을 특징으로 하는 안구 건조증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 부착 분자는 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1) 및 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)이고, 상기 전염증성 사이토카인은 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-17이며, 상기 기질금속단백분해효소는 MMP-2 및 MMP-9인 것을 특징으로 하는 안구 건조증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 상기 나노복합체와 약제학적으로 허용 가능한 담체를 혼합하여 점안제 형태의 안약이나 주사제, 또는 젤 형태의 안연고나 주사제로 제공되는 것을 특징으로 하는 안구 건조증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 카테킨을 메탄올에 용해시켜 카테킨 용액을 제조하는 제 1단계;
    폴리에틸렌 글리콜을 물에 용해시켜 폴리에틸렌 글리콜 용액을 제조하는 제 2단계;
    상기 제 1단계의 카테킨 용액과 상기 제 2단계의 폴리에틸렌 글리콜 용액을 혼합하여 혼합물을 제조하는 제 3단계;
    상기 혼합물에서 메탄올을 제거하는 제 4단계; 및
    상기 메탄올이 제거된 혼합물을 필터로 여과하는 제 5단계;를 포함하는 카테킨 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 나노복합체의 제조방법으로서,
    상기 나노복합체는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 카테킨 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 나노복합체의 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure 112017091800011-pat00006

    상기 R1 내지 R4는 각각 동일하거나 다를 수 있고, 수소 또는 카테킨이며, 상기 m은 8 내지 460 중 어느 하나의 정수임.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제 10항에 있어서, 상기 제 3단계는 카테킨 용액과 폴리에틸렌 글리콜 용액을 1:1 내지 15의 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 카테킨 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 나노복합체의 제조방법.
  14. 제 10항에 있어서, 상기 제 4단계는 40 내지 60℃에서 1시간 내지 3시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 카테킨 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 나노복합체의 제조방법.
  15. 제 10항에 있어서, 상기 나노복합체의 평균 직경은 100 내지 200 nm인 것을 특징으로 하는 카테킨 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 나노복합체의 제조방법.
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