CN114209663A - 预防糖尿病的负载根皮素的大豆卵磷脂-壳聚糖纳米粒子的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种负载根皮素的大豆卵磷脂‑壳聚糖纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：将壳聚糖溶解于醋酸水溶液，配制成壳聚糖母液；取壳聚糖母液加入去离子水进行稀释，作为水相；称取根皮素使其溶解于大豆卵磷脂乙醇溶液中，作为乙醇相；在磁力搅拌条件下，将乙醇相注入水相；磁力搅拌后，调节pH，得到负载根皮素的大豆卵磷脂‑壳聚糖纳米粒子溶液。该负载根皮素的大豆卵磷脂‑壳聚糖纳米粒子溶液或进一步制备而得的根皮素纳米粒子能用于制备治疗糖尿病肾脏的药物。

Description

预防糖尿病的负载根皮素的大豆卵磷脂-壳聚糖纳米粒子的 制备及应用
技术领域
本发明涉及负载根皮素的大豆卵磷脂-壳聚糖纳米粒子在糖尿病肾脏保护方面的应用。
背景技术
根皮素(Phloretin，Pht)属于二氢查耳酮类化合物，主要存在于多穗柯叶、山茶、山荆子、草莓、枸杞等植物中。根皮素已经在美国食用香料与提取物制造者协会中被列为公认安全物质(#4390)；在食品添加剂联合专家委员会中被评价为无安全性问题(#2022)，在大鼠中的半数致死量(Median Lethal Dose,LD50)＞2000mg/kg bw；在《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》(GB 2760-2014)中被允许作为香料添加使用(#N376)，且无明确剂量规定。根皮素不仅安全无毒，还具有抑菌、抗氧化、抑制酪氨酸酶、降血糖、抗癌等生理功能，在食品、医药品、化妆品等领域中都有很大的应用前景，但是根皮素的分子结构使其分子间存在强烈的氢键作用，从而导致其水溶性较差，生物利用度低，这些问题使得其应用受到限制。
糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症之一，其临床特征为蛋白尿、渐进性肾功能损害，高血压，水肿，是导致终末期肾病的主要原因，也是糖尿病患者死亡的主要原因之一。糖尿病及其并发症不仅给患者带来沉重的经济压力，更严重威胁了糖尿病患者的生命健康。SGLT2抑制剂是一种新型降血糖药物，它被证实可以在降血糖的同时具有一定的心肾保护作用。根据文献显示，根皮素也是一种SGLT2抑制剂，其作为天然活性小分子，具有安全无毒、作用效果显著、多通路多靶点等特点。
根据IDF于2019年统计的全球糖尿病患病人数，我国成人糖尿病患者数量位居世界第一，已达1.164亿。随着糖尿病的发生与进展，可能会引发微血管、大血管等损伤，据统计，糖尿病并发症超过100种，是现今各类疾病中并发症最多的，其中心脑血管病变、肾脏病变分别是引起糖尿病患者死亡的第一、第二原因。糖尿病并发症一旦发生，很难通过药物治疗逆转，因此尽早预防糖尿病及其并发症非常重要。
目前临床上常用的降糖药物为胰岛素及其类似物、磺酰脲类促泌剂、二甲双胍类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类衍生物促敏剂、苯茴酸类衍生物促泌剂、GLP-1受体激动剂、DPP-4酶抑制剂、SGLT2抑制剂等。绝大多数降血糖药物是直接或间接通过胰岛素来起到降低血糖的作用，而SGLT2抑制剂降糖机制独立于胰岛素。
作为大多数国家首选的降血糖药物，研究表明二甲双胍可用过多重机制降低血糖，其优点为成本低、不良反应小、降糖高效等，但其在预防糖尿病并发症如心血管疾病等方面的作用仍存在争议。SGLT2抑制剂可通过增加尿糖排泄来降低血糖，除降低血糖外，大量研究表明恩格列净、卡格列净等SGLT2抑制剂对动脉粥样硬化性心血管疾病高风险患者有心肾保护作用。除此之外，CANVAS以及DECLARE-TIMI 58等研究数据也显示出SGLT2抑制剂对肾功能有益。美国糖尿病协会发布的《糖尿病医学诊疗标准》2020版中强调了对糖尿病患者心肾保护的重要性，SGLT2抑制剂因而成为重要的优选药物之一。
根皮素也被证实是一种有效的SGLT2抑制剂，但由于其水溶性差、光照稳定性差、生物利用度低等问题使得根皮素在食品、医药、化妆品等的应用与发展受到极大的阻碍。因此，使用像大豆卵磷脂、壳聚糖这样天然安全无毒的原料，通过物理结合的方式，在不改变物质本身结构性质的基础上，提高根皮素的水溶性、光稳定性、贮藏稳定性及生物利用度等，对根皮素的开发利用具有重要意义。
CN106236711A的发明《根皮素脂质体及其制备方法》告知了一种改性根皮素脂质体，包括根皮素0.2～20mg/mL，4％～95％磷脂，2％～60％胆固醇，0～90％其他辅料。采用搅拌法、超声波分散法、高压均质法、微射流分散法、薄膜分散法、注入法、二次乳化法制备。制备的脂质体包封率高，稳定性好，可改善根皮素的溶解性、促进根皮素吸收、靶向递送，能更好的提升其生物活性，扩大其开发应用范围，具有较好的社会和经济价值。
目前已知的一种根皮素纳米粒子的制备方法为：Arokia等以壳聚糖、TPP(三聚磷酸钠)为原料采用离子凝胶法制备了负载根皮素的壳聚糖纳米粒子(PhCsNPs)。将壳聚糖溶解于1％(v/v)的醋酸溶液配置成1mg/mL的壳聚糖醋酸溶液，将根皮素(0.1％DMSO)与其混合，使得根皮素浓度为8mg/mL。在将18mL水溶液(1mg/mL)滴入35mL壳聚糖与根皮素的混合溶液中，用0.1M的NaOH调节pH至5，磁力搅拌过夜(350rpm)后，在4℃，10000rpm条件下离心，弃上清，下层用10％乙醇清洗后4℃保存备用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种负载根皮素的大豆卵磷脂-壳聚糖纳米粒子的制备及其在糖尿病肾脏保护方面的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种负载根皮素的大豆卵磷脂-壳聚糖纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
1)、将壳聚糖溶解于醋酸水溶液，配制成壳聚糖浓度为(1±0.05)g/100ml的壳聚糖母液；醋酸水溶液中，醋酸的体积浓度为1％；
取2mL壳聚糖母液加入16.4mL去离子水进行稀释，作为水相；
2)、称取(50±2.5)mg大豆卵磷脂溶解于1.6mL无水乙醇中充分溶解，得大豆卵磷脂乙醇溶液；称取根皮素(5±0.25)mg使其充分溶解于所述大豆卵磷脂乙醇溶液中，作为乙醇相；
3)、在磁力搅拌条件下，将步骤2)所得的乙醇相注入步骤1)所得的水相；磁力搅拌(2±0.5)h后，调节pH至(4±0.2)，得到负载根皮素的大豆卵磷脂-壳聚糖纳米粒子溶液。
作为本发明的负载根皮素的大豆卵磷脂-壳聚糖纳米粒子的制备方法的改进：
在100ml负载根皮素的大豆卵磷脂-壳聚糖纳米粒子溶液中加入(4±0.2)g的甘油作为冻干保护剂，得到根皮素纳米粒子溶液(Phloretin-loaded Soybean Lecithin-Chitosan Nanoparticles with 4％(w/v)Glycerol，简称Pht NPs)，然后真空冷冻干燥(真空条件下于-50℃干燥36小时)，得根皮素纳米粒子。
本发明还同时提供了上述负载根皮素的大豆卵磷脂-壳聚糖纳米粒子溶液或者根皮素纳米粒子在制备治疗糖尿病肾脏(糖尿病肾脏的保护)药物中的应用。
本发明以大豆卵磷脂、壳聚糖、甘油等作为原材料，合成的根皮素纳米粒子与根皮素相比，改善了根皮素的水溶性、贮藏稳定性、光照稳定性、生物可及度等，且仍具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制作用，并将其与糖尿病肾病联系在一起，探究了根皮素对糖尿病肾脏的保护作用，探索其在保健品、医药品等领域作为功能配料的可能，从而扩大根皮素的应用前景。
本发明在负载根皮素大豆卵磷脂-壳聚糖纳米粒子的过程中，发现CS浓度、CS/SL质量比、乙醇含量、pH和磁力搅拌时间时间这五个因素对构建SL-CS NPs的性质有较大的影响，因此以包封率(Encapsulation Efficiency,EE)为单一指标，拟通过五因素四水平(L16，45)正交设计，探求在包埋Pht过程中(各组Pht的添加量均为3mg)自变量因素的最优搭配，进一步优化纳米粒子的制备工艺，正交实验因素与水平设计如表1所示。
表1、正交实验因素与水平设计表
Figure BDA0003433582220000031
采用正交实验比较各组Pht的EE，用SPSS 20.0软件进行数据分析，结果如表2所示。
表2、正交实验结果直观分析表
Figure BDA0003433582220000041
注：Kn(n＝1,2,3,4)代表各因素在同一水平条件下Pht的EE的总和，R代表极差。
由表2中的极差(R值)可以看出，对SL-CS NPs对Pht的包封能力影响最大的因素是CS浓度，其次为CS/SL质量比与磁力搅拌时间。根据各因素相同水平条件下的EE总和(K值)可知，SL-CS NPs的制备工艺的最优组合为A4B4C2D2E4，即CS浓度为0.10mg/mL，CS/SL质量比1：25，乙醇含量为8％，pH值为4，磁力搅拌时间为2h，经验证，在该制备工艺条件下，EE为98.12％±0.10％，高于正交优化实验中任意一组的EE。
说明：根皮素纳米粒子包封率的测定采用如下方法：
使用HPLC-超滤离心法，测定负载根皮素的纳米粒中所包封的Pht含量。吸取1mL待测样品到超滤离心管中，在4000r/min条件下离心60min，取超滤液，适当稀释后，参考GB1886.261-2016中Pht含量的测定方法，进行HPLC分析，计算所测样品中游离Pht的质量(Wfree)。准确吸取1mL待测样品在10000r/min下离心60min，取上清，适当稀释后进行HPLC分析，计算所测样品中Pht的总质量(WPht)。
每个待测样品取三个平行。按如下公式，对EE进行计算。
Figure BDA0003433582220000051
注：Wload＝WPht-Wfree。其中WPht表示样品中Pht的总质量；Wfree表示样品中游离的Pht质量。
本发明的根皮素纳米粒子的用法和用量为：口服：3g/天(以根皮素的量计：100mg/天)。
综上，本发明为了解决这些问题，利用大豆卵磷脂与壳聚糖之间存在静电吸附作用，构建了负载根皮素大豆卵磷脂-壳聚糖纳米粒子，提高了根皮素的水溶性、生物可及度、稳定性等，从而扩大根皮素的应用前景。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1对糖尿病大鼠肾脏系数的影响；
注：***p<0.001,与CN组比较；#p<0.05与DM组比较。
图2对糖尿病大鼠24h尿蛋白定量的影响；
注：*p<0.05,与CN组比较；#p<0.05,与DM组比较。
图3对糖尿病大鼠血清中肌酐含量的影响；
注：**p<0.01,与CN组比较；#p<0.05,##p<0.01与DM组比较。
图4对糖尿病大鼠血清中尿素氮含量的影响；
注：***p<0.001,与CN组比较；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001,与DM组比较。
图5对糖尿病大鼠肾脏病理的影响(200×)；
注，图中：椭圆形表示肾小管上皮细胞空泡变性；长方形表示肾间质炎症细胞浸润；圆形表示肾小管上皮细胞脱离；三角形表示肾小管管腔内脱落的上皮细胞及细胞碎片。
图6对糖尿病大鼠肾脏纤维化的影响(200×)；
注：箭头表示胶原纤维。
图7对糖尿病大鼠肾脏SOD活力(A)、CAT活力(B)及MDA含量(C)的影响；
注：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,与CN组比较；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001,与DM比较。
图8对糖尿病大鼠肾脏组织TGF-β1、Smad2蛋白表达的影响；
注：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,与CN组比较；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001,与DM组比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、根皮素纳米粒子的制备，包括以下步骤：
1)、取1g壳聚糖用1％(v/v)醋酸水溶液定容至100mL，并使得壳聚糖溶解，配制成1％(w/v，即1g/100ml)壳聚糖母液，量取2mL壳聚糖母液并加入16.4mL去离子水进行稀释，作为水相；
2)、称取50mg大豆卵磷脂溶解于1.6mL无水乙醇中充分溶解，得大豆卵磷脂乙醇溶液；精准称取根皮素5mg使其充分溶解于大豆卵磷脂乙醇溶液中，作为乙醇相；
3)、在磁力搅拌条件下，将步骤2)所得的乙醇相注入步骤1)所得的水相，因此，固定体系20mL。
于400r/min的转速下，磁力搅拌2h后，用1mol/L的HCl和NaOH调节pH至4，得到负载根皮素的大豆卵磷脂-壳聚糖自组装纳米粒子溶液。
在100ml负载根皮素的大豆卵磷脂-壳聚糖自组装纳米粒子溶液中加入4g的甘油作为冻干保护剂，得到根皮素纳米粒子溶液(Phloretin-loaded Soybean Lecithin-Chitosan Nanoparticles with 4％(w/v)Glycerol，简称Pht NPs)，所制备的根皮素纳米粒子溶液后真空冷冻干燥(于-50℃干燥36小时)成根皮素纳米粒子，备用。
即，此步骤中，甘油用量的4％(w/v)。
实验1：根皮素纳米粒子的粒径、多分散系数与电位的测定
测定纳米粒子粒径、多分散系数(PDI)：取样品1mL～1.5mL放入样品池中设定测定温度25℃，平衡时间2min，每次循环扫描10次～100次，重复测定3次。
测定Zeta电位方法：取0.75mL～1mL放入样品池中，插入电极，设定测定温度25℃，每次循环扫描10次～100次，重复测定3次。
以空载大豆卵磷脂-壳聚糖纳米粒子为对照(取消实施例1中“根皮素5mg”的使用，其余同实施例1，简称SL-CS+4％G NPs)。
表3、纳米粒子的粒径、多分散系数与电位
Figure BDA0003433582220000071
由表3可知Pht NPs以及SL-CS+4％G NPs的粒径均维持在160nm以下，具有良好的纳米颗粒形态，且PDI均不大于0.250，这表明粒径分布较均匀，且Zeta电位大于25mV，电位绝对值大于15mV的纳米粒子体系比较稳定，且粒子之间不易团聚。因此通过该方法制备的纳米粒子粒径较小且分布均匀。
实验2、根皮素纳米粒子对糖尿病大鼠肾脏功能的影响
实验动物：SPF级SD大鼠(约8周龄)，雄性，共51只，体重为(190±10)g。动物合格证号：20201217Aazz0100018627，由杭州医学院提供；实验动物使用许可证号：SCXK(浙)2019-0002；实验动物均饲养于浙江中医药研究院25±2℃的屏障实验室内，许可证号：SYXK(浙)2019-0010。SD大鼠是研究糖尿病大鼠的肾脏功能的理想模型，可通过腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)构建糖尿病模型。
造模方法：SPF级健康雄性SD大鼠51只，将大鼠随机分为正常对照组7只和模型组44只，适应性喂养1周，禁食6h后，模型组一次性腹腔注射STZ(60mg/kg，将STZ避光溶解于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，配制成1％STZ溶液)，注射量为60mg/kg；正常对照组一次性腹腔注射等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/L,pH 4.4)，自由饮水进食72h后，取大鼠尾静脉全血，利用血糖测试条测定血糖值，若血糖≥16.7mmol/L，则糖尿病模型造模成功。
分组与给药方式：本次实验造模的44只大鼠中，有40只大鼠造模成功，造模成功率约为90％。正常大鼠与造模成功的大鼠均喂以基础饲料(参照GB14924.3-2010生产)，分为正常对照组，模型对照组，根皮素纳米粒子低剂量组，根皮素纳米粒子高剂量组，纳米粒子空壳对照组(以4％(w/v)的甘油为冻干保护剂的空载大豆卵磷脂-壳聚糖纳米粒子，简称SL-CS+4％G NPs)，根皮素对照组，阳性对照组(以新型降血糖药物SGLT2抑制剂恩格列净作为阳性对照，简称Emg)，各组的给药方式与剂量如表4所示。
表4实验大鼠的饲养与灌胃情况
Figure BDA0003433582220000081
注：根皮素纳米粒子低、高剂量组的浓度以其中含有Pht(根皮素)的量计。
“与低剂量组中壁材浓度相同”是指：与根皮素纳米粒子低剂量相比，除了不含根皮素，其余大豆卵磷脂、壳聚糖等壁材的浓度相等。
(1)肾脏系数
脏器系数可表示各器官的变化，糖尿病进程中可能会引起器官功能衰竭。肾脏在生成尿液的同时，还能维持内环境的稳态，糖尿病肾病是终末期肾衰竭的主要原因。因此，测定实验大鼠的肾脏系数有助于评估灌胃药物对糖尿病大鼠肾脏的保护作用。灌胃4周后，称取大鼠体质量，处死大鼠后取出双侧肾脏，并用生理盐水清洗，滤纸吸干残留的水分后称重记录，肾脏系数计算公式如下：
Figure BDA0003433582220000082
各组大鼠的肾脏系数如图1所示。
各组糖尿病大鼠的肾脏系数极显著上升(p<0.001)，说明长期的高血糖已经造成糖尿病大鼠不同程度的肾脏病变。Pht-NPs-L组、Pht-NPs-H组以及Emg组对糖尿病的大鼠的肾脏有一定保护作用，但是与Pht NPs无显著的剂量相关性(p>0.05)。上述结果表明，PhtNPs在一定程度上能缓解肾脏病变，效果与阳性药物Emg相当。
(2)尿蛋白定量
灌胃4周后，检测各组大鼠24h尿蛋白含量，即，收集24小时的全部尿液，来测定其中的蛋白质的含量，进而计算出24小时内的蛋白总量，结果如图2所示。
尿蛋白(Urinary protein，Upro)是评定糖尿病肾病的重要指标，尿液中蛋白含量能够较准确地反映肾脏损伤的程度。与CN组相比，DM组大鼠的尿液中24h尿蛋白显著升高(p<0.05)。Pht-NPs-L组及Emg组大鼠尿液中24h尿蛋白与DM组相比显著降低(p<0.05)，说明Pht NPs及Emg在一定程度上能缓解由高糖引起的肾功能损伤。
(3)血肌酐
血肌酐(Serum Creatinine,Scr)是评估肾功能的指标之一，临床实践证明，当患者处于糖尿病肾病早期，肾脏体积明显增大，肾小球内高压以及肾小球肥大等原因会导致患者肾小球持续高滤过，使得Scr下降。此外，肌肉量减少、多尿等也能导致Scr降低。随着糖尿病肾病病情的进展，当肾小球滤过能力降低至正常的50％以下，无法及时将Scr排出到体外时，Scr浓度则会明显升高。
灌胃4周后，检测各组大鼠血清中肌酐含量，结果如图3所示。DM组大鼠的Scr与CN组相比极显著降低(p<0.01)，说明糖尿病大鼠的肾脏病变仍处于早期，肾脏滤过功能未明显减退，而糖尿病大鼠的多尿以及肾小球持续高滤过引起了肌酐值下降，这种情况在Pht-NPs-L组、Pht-NPs-H组及Emg组中明显缓解(p<0.05、p<0.01、p<0.05)。
(4)尿素氮
BUN的排泄受到肾小球滤过率以及肾小管功能的影响，因此BUN也是反映肾脏功能的重要指标，血尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)升高程度与肾脏损伤呈正相关。灌胃4周后，检测各组大鼠血清中尿素氮含量，结果如图4所示。
与CN组相比，DM组大鼠的BUN极显著升高(p<0.001)，其余给药组的BUN与CN组相比无显著差异(p>0.05)。与DM组相比，各给药组的血清BUN有不同程度的降低，Pht-NPs-L组及Emg组大鼠血清BUN含量与DM组相比极显著降低(p<0.01)，Pht-NPs-H组大鼠血清BUN与DM组相比降低极显著(p<0.001)。Pht组大鼠BUN也有下降趋势，但是与DM组和CN组相比差异均无统计学意义(p>0.05)。这说明Pht NPs对肾脏功能有改善作用，作用效果与剂量相关。
实验3、对糖尿病大鼠肾脏组织病理学的影响
灌胃4周后，采用HE染色观察实验大鼠肾脏组织的病理学的影响(如图5)。
结果显示，CN组大鼠肾脏结构完整，无明显病变且组织结构清晰，而DM组大鼠肾脏出现一系列严重的病理学改变，例如肾小管上皮细胞空泡变性、肾小管管腔内上皮细胞脱落、肾间质炎症细胞浸润、肾间质水肿等等。其余各给药组大鼠肾脏的病理病变程度均有不同程度减轻。在Pht-NPs-L组、Pht-NPs-H组、SL-CS+4％G NPs组及Emg组中，肾小管上皮细胞空泡变性以及炎性细胞的浸润明显减少，在Pht-NPs-L组及Emg组中，肾小管管腔内脱落的上皮细胞及细胞碎片也明显减少。
实验4、对糖尿病大鼠肾脏纤维化的影响
灌胃4周后，采用Masson染色对肾脏组织纤维化情况进行观察，结果如图6所示。
CN组的胶原纤维排列整齐，没有明显蓝染区域。与CN组相比，DM组胶原纤维排列紊乱，肾小球周围出现大量蓝染区域。在Pht-NPs-L组、Pht-NPs-H组、SL-CS+4％G NPs组及Emg组中蓝染区域减少，提示肾脏纤维化减轻。Pht组仍存在大量蓝染区域，证明低剂量的Pht不能有效预防糖尿病大鼠肾脏纤维化发展。
实验5、根皮素纳米粒子对糖尿病大鼠肾脏组织生化指标影响
在4周实验结束后，采用Elisa试剂盒法和Western blot等技术，研究Pht NPs对SD大鼠肾脏组织氧化应激(SOD、CAT活力以及MDA含量)、TGF-β1以及Smad2蛋白表达的影响。
(1)氧化应激指标
临床研究表明，糖尿病者体内氧化应激水平的提高会使得肾脏易受到氧化应激带来的损伤，从而加快糖尿病肾病发展进程。MDA是机体内的一种重要的脂质过氧化产物，其含量的高低可以反映机体氧化应激的水平，而SOD和CAT等超氧化物酶能够有效清除体内的ROS，其活性的高低能反应机体清除自由基的能力。
各组大鼠肾脏SOD活性、CAT活性如图7A和7B所示。相较于DM组，Pht-NPs-L组与Emg组大鼠肾脏SOD活性、CAT活力有不同程度的提升，其中Pht-NPs-L组及Emg组大鼠肾脏SOD活性明显提升(p<0.05,p<0.01)，且与CN组无显著差异(p>0.05)，Pht-NPs-L组及Emg组大鼠肾脏CAT活性明显提升(p<0.05,p<0.001)。
各组大鼠肾脏MDA含量如图7C所示。与CN组相比，DM组的MDA含量极显著增加(p<0.001)，说明糖尿病大鼠肾脏发生了脂质过氧化。与DM组相比，Pht-NPs-L组、Pht-NPs-H组大鼠肾脏组织的MDA含量均显著下降(p<0.05)，Emg组大鼠肾脏组织的MDA含量也极显著下降(p<0.01)，说明Pht-NPs-L组、Pht-NPs-H组及Emg组在一定程度上能够减轻肾脏发生的脂质过氧化反应。
(2)TGF-β1、Smad2蛋白表达
糖尿病大鼠肾脏病变早期即可出现肾间质纤维化的改变，肾纤维化改变是肾衰竭发生的主要病理基础。转化生长因子-β(Trandfroming Growth Factor-β,TGF-β)是促进肾脏纤维化、慢性肾脏疾病发展的重要因子之一。TGF-β可通过激活下游Smad蛋白(Sma andMad homologue,Smad)依赖或非依赖途径诱导胶原等细胞外基质的合成，并抑制胶原的降解。临床数据显示，在肾脏疾病患者的肾脏标本中，TGF-β1含量明显上升，且与肾脏纤维化呈明显正相关。TGF-β1可直接触发肾小球基底膜增厚、系膜增生、细胞外基质过度积累，并导致肾小球硬化和肾间质纤维化。Smad2蛋白是TGF-β1信号传导的下游蛋白，在人体和动物模型的糖尿病肾病及高血压肾病肾脏组织中，Smad2表达明显增加，TGF-β1/Smad2信号通路在肾脏纤维化的发展中起重要作用，本研究探究了各组大鼠肾脏组织TGF-β1、Smad2蛋白的表达水平，结果如图8所示。
与CN组相比，DM组肾组织TGF-β1、Smad2表达升高(p<0.001)。与DM组相比，其余给药组大鼠肾组织TGF-β1、Smad2蛋白的表达明显下降(p<0.001)。Pht-NPs-L组、Pht-NPs-H组及Emg组中大鼠肾组织TGF-β1、Smad2蛋白的表达均低于CN组中相应蛋白的表达或无显著性差异，这说明Pht NPs及Emg可能通过调控TGF-β1/Smad2信号通路来改善糖尿病大鼠肾脏纤维化，进而发挥其肾脏保护作用，而Pht组的TGF-β1、Smad2蛋白的表达水平虽较DM组显著降低(p<0.001)，但仍显著高于CN组(p<0.001)，这表明Pht经过包埋后对TGF-β1、Smad2蛋白表达的抑制作用增强。以上结果表明，Pht NPs对糖尿病大鼠肾脏组织纤维化的减缓作用与抑制TGF-β1、Smad2蛋白的表达有关。
结论：Pht NPs不仅能显著改善Pht的水溶性、稳定性，并且能够有效缓解肾脏病变并减轻纤维化程度，具体机制涉及改善肾脏组织氧化应激，抑制TGF-β1/Smad2信号通路。与纳米粒子空壳以及未包埋的根皮素相比，根皮素纳米粒子更能在体内发挥有效作用，为根皮素纳米粒子应用在糖尿病肾脏保护的相关保健及医药品等领域中提供理论依据。除此之外，考虑到根皮素所具有抗肿瘤、肝脏保护、改善记忆力、延长寿命以及改善肠道炎症等生理功能，因此解决根皮素水溶性差、稳定性差等问题后，根皮素纳米粒子具有广阔的市场应用前景。
对比例1-1、将实施例1的步骤1)壳聚糖母液的浓度由“1g/100ml”改成“2g/100ml”，其余等同于实施例1。所得产物称为H-CS-Pht。
对比例1-2、将实施例1的步骤1)壳聚糖母液的浓度由“1g/100ml”改成“0.5g/100ml”，其余等同于实施例1。所得产物称为L-CS-Pht。
对比例2-1、将实施例1步骤2)中“大豆卵磷脂”的用量由“50mg”改为“100mg”，其余等同于实施例1。所得产物称为H-SL-Pht。
对比例2-2、将实施例1步骤2)中“大豆卵磷脂”的用量由“50mg”改为“25mg”，其余等同于实施例1。所得产物称为L-SL-Pht。
上述4个对比例所得产物的粒径、多分散系数、Zeta电位与本发明的比较如下表4；
表4、不同样品的粒径、多分散系数、Zeta电位的比较
Figure BDA0003433582220000121
根据表4可得知：与H-CS-Pht、L-CS-Pht、H-SL-Pht、L-SL-Pht相比，Pht NPs的粒径在200nm以下，且PDI不大于0.250，这表明Pht NPs具有良好的纳米粒子形态且粒径分布较均匀。Zeta电位可用来判断分散体系的稳定性。Zeta电位(正或负)越高，体系越稳定，即溶解或分散，可以抵抗聚集，反之，则越倾向于凝结或凝聚。
综上，Pht NPs的粒径较小且分布均匀，体系比较稳定且包封率高，因此选择其作为动物实验的样品。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.负载根皮素的大豆卵磷脂-壳聚糖纳米粒子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)、将壳聚糖溶解于醋酸水溶液，配制成壳聚糖浓度为(1±0.05)g/100ml的壳聚糖母液；醋酸水溶液中，醋酸的体积浓度为1％；
取2mL壳聚糖母液加入16.4mL去离子水进行稀释，作为水相；
2)、称取(50±2.5)mg大豆卵磷脂溶解于1.6mL无水乙醇中，得大豆卵磷脂乙醇溶液；称取根皮素(5±0.25)mg使其溶解于所述大豆卵磷脂乙醇溶液中，作为乙醇相；
3)、在磁力搅拌条件下，将步骤2)所得的乙醇相注入步骤1)所得的水相；磁力搅拌(2±0.5)h后，调节pH至(4±0.2)，得到负载根皮素的大豆卵磷脂-壳聚糖纳米粒子溶液。
2.根据权利要求1所述的负载根皮素的大豆卵磷脂-壳聚糖纳米粒子的制备方法，其特征在于：
在100ml负载根皮素的大豆卵磷脂-壳聚糖纳米粒子溶液中加入(4±0.2)g的甘油作为冻干保护剂，得到根皮素纳米粒子溶液，然后真空冷冻干燥，得根皮素纳米粒子。
3.如权利要求1所述的负载根皮素的大豆卵磷脂-壳聚糖纳米粒子溶液或如权利要求2所述的根皮素纳米粒子在制备治疗糖尿病肾脏药物中的应用。
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