CN117919430A - 一种细胞膜仿生纳米材料及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细胞膜仿生纳米材料及其制备和应用,将亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子先通过静电力、氢键、阳离子‑Π、疏水作用等物理间相互作用力与纤连蛋白结合,再通过物理负载依达拉奉形成纳米复合物;提取巨噬细胞膜,对该纳米复合物进行包覆,构建细胞膜仿生纳米药物。制备的细胞膜仿生纳米药物可穿透血脑屏障快速靶向病灶部位,提高药物的递送效率,可改善依达拉奉水溶性差、半衰期短、生物利用率低等缺点,从而高效发挥依达拉奉抗氧化的能力。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,特别涉及一种细胞膜仿生纳米材料及其制备和应用。
背景技术
缺血再灌注损伤(IRI)是一个复杂的病理生理过程,可对脑功能造成严重损害。IRI的机制复杂,涉及氧化应激、炎症反应失衡、细胞内钙超载、线粒体功能障碍、能量代谢紊乱、凋亡相关基因异常激活等(Front.Mol.Neurosci.2020,13,28;ActaNeuropathol.2019,137,693-714;Oxid.Med.Cell.Longev.2018,3804979;JAMA,2015,313,1451-1462)。其中炎症反应异常活化和氧化应激在脑IRI的发生发展中起重要作用,可通过级联反应最终导致不可逆的神经元损伤(Int.J.Mol.Sci.2017,18,1599;Neurotherapeutics,2016,13,661-670;Lancet Neurol.2019,18,1058-1066;Nature,2014,515,431;Nat.Rev.Immunol.2019,19,473-473)。因此,降低氧化应激、调节促炎微环境、保护神经元和促进血管再生的联合治疗是有效预防和控制缺血性脑卒中的重要策略。
为减少药物的毒副作用和提高其生物利用度,高效输送药物到炎症病灶部位是实现缺血性脑卒中精准高效治疗的必要条件。此外,单一的治疗药物很难应对脑卒中复杂的致病机制,因而通常需要两种或多种手段联合,发挥高效协同治疗的效果,例如抗炎、抗氧化、抗凋亡和促再生协同治疗。已有文献报道恶性肿瘤细胞(如乳腺癌,4T1细胞)容易透过BBB形成脑转移,研究者将4T1细胞膜包裹在琥珀酰氯负载的pH敏感聚合物纳米载体内部(MPP/SCB),发现MPP/SCB可优先输送至短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)大鼠模型的缺血部位(比正常脑组织高4.79倍)(Nano Lett.2021,21,3033-3043.)。该治疗产生了显著的行为恢复、梗死体积减少和明显的神经保护作用。然而,使用4T1癌细胞膜穿透BBB这一设计是否会产生自身免疫原性仍需进一步验证。
检索国内外相关文献和专利结果表明:尚未发现以亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子作为载体同时负载FN和EDV并包覆细胞膜用于缺血再灌注引发脑部损伤的抗氧化、抗炎、抗凋亡和促再生的协同治疗的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种细胞膜仿生纳米材料及其制备和应用。本发明利用亚磷酸酯钠盐封端的含磷树状大分子为载体,通过静电力、氢键、阳离子-Π、疏水作用等物理间相互作用力与FN结合自组装形成纳米复合物,进一步通过物理负载依达拉奉;提取巨噬细胞膜,对该纳米复合物进行包覆,构建细胞膜仿生纳米药物。制备的细胞膜仿生纳米药物可穿透BBB快速靶向病灶部位,提高药物的递送效率,一方面可改善依达拉奉水溶性差、半衰期短、不易透过BBB、生物利用度低等缺点,从而高效发挥依达拉奉的抗氧化能力;另一方面,纳米药物可有效发挥含磷树状大分子和FN自身的抗炎活性,通过缓解氧化应激、小胶质细胞M2极化转型和降低促炎细胞因子水平从而减轻炎症反应并抑制细胞凋亡。设计的细胞膜仿生的纳米平台可实现对缺血再灌注引发的脑部损伤疾病的抗氧化、抗炎、抗凋亡和促再生的协同联合治疗。
本发明提供一种含磷树状大分子纳米复合材料,其特征在于,所述复合材料以亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子为载体,表面修饰纤连蛋白FN,并负载药物EDV。
优选地,所述药物为依达拉奉。
本发明提供一种细胞膜仿生纳米材料,所述细胞膜仿生纳米材料为巨噬细胞膜包覆所述含磷树状大分子纳米复合材料。
进一步地,将亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子先通过静电力、氢键、阳离子-Π、疏水作用等物理间相互作用力与纤连蛋白(FN)结合,再通过物理负载依达拉奉形成纳米复合物;提取巨噬细胞膜,对该纳米复合物进行包覆,构建细胞膜仿生纳米药物。
优选地,所述细胞膜为RAW细胞膜,进一步地为RAW264.7细胞膜。
进一步地,所述RAW细胞膜的制备,包括:将苯甲基磺酰氯PMSF与低渗细胞裂解液混合均匀,然后将该细胞裂解混合液加入到RAW264.7沉淀中,冰浴,反复冻融破碎细胞,梯度离心,沉淀为RAW细胞膜,重悬于1×PBS溶液得RAW细胞膜悬液。
所述PMSF与低渗细胞裂解液的体积比为1:100-150;RAW细胞沉淀与细胞裂解混合液的比例为1-2×107个:1-2mL;冰浴时间为15-30min;反复冻融破碎的参数为:液氮冷冻,37-40℃水浴融化,反复3-5次;梯度离心的参数为:离心温度为4-10℃,先以700-1000g离心力离心10-15min,去沉淀,再以12000-14000g离心力离心30-35min,去上清,将沉淀重悬于100-120μL的1×PBS溶液。
进一步地,载药纳米平台是通过静电力、氢键、阳离子-Π、疏水相互作用等作用力将亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子与FN结合,然后通过物理负载药物EDV,形成纳米复合物,并进一步通过物理挤压的方式在纳米复合物表面包覆RAW264.7巨噬细胞膜,构建细胞膜仿生纳米药物A-F/E@M用于缺血性脑卒中的抗炎/抗氧化/促再生的联合治疗。
本发明提供一种细胞膜仿生纳米材料的制备方法,包括:
(1)将亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子AK137溶液、纤连蛋白FN溶液混合,室温剧烈搅拌反应,搅拌至溶液呈乳白色,离心,得到AK137-FN复合物(A-F NPs);其中AK137结构式:
(2)将药物、AK137-FN复合物溶液混合,室温搅拌,离心取上清,得到含磷树状大分子复合材料;
(3)含磷树状大分子纳米复合材料、细胞膜悬液混合,挤出器挤出、离心,得到细胞膜仿生纳米材料。
上述制备方法的优选方式如下:
所述步骤(1)中AK137与FN的质量比为12:1-2;所述FN溶液、AK137溶液的溶剂均为水。
所述步骤(1)中AK137溶液的浓度为30-35mg/mL;FN溶液的浓度为1.5-3.5mg/mL。
所述步骤(1)中混合为FN溶液逐滴加入AK137溶液中;室温搅拌反应时间为4-8h;所述离心为离心温度为4-10℃,以12000-14000g离心力离心10-15min,收集沉淀;离心后纯化,纯化的工艺条件为:冷冻干燥。
所述步骤(2)中AK137-FN复合物、药物的质量比为2-3:1;所述药物为依达拉奉EDV。
所述步骤(2)中混合为药物逐滴滴加到A-F NPs复合物溶液中,其中药物浓度为1-2mg/mL;所述药物的助溶剂为甲醇;所述室温搅拌反应时间为20-24h;所述离心温度为4-10℃,以1000-1500g离心力离心10-15min,去除沉淀;所述离心后纯化,纯化的工艺条件为:冷冻干燥。
所述步骤(2)中药物为EDV,则含磷树状大分子复合材料为共负载EDV和FN的纳米复合物(A-F/E NPs);
所述步骤(3)中含磷树状大分子纳米复合材料、细胞膜的质量比为1:1-2;所述细胞膜为RAW细胞膜;所述挤出:使用滤膜孔径为400-600nm的Avanti微型挤出器反复挤压11-15次。
所述步骤(3)中细胞膜仿生纳米材料为A-F/E@M。
本发明提供一种所述细胞膜仿生纳米材料在制备抗氧化、抗炎、抗凋亡和促再生的联合协同治疗药物中的应用。
本发明还提供了一种细胞膜仿生的纳米材料在缺血性脑卒中的抗炎/抗氧化/促再生的联合治疗应用方法。
本发明提供一种所述细胞膜仿生纳米材料在制备预防或治疗脑梗死、脑卒、脑细胞损伤药物中的应用。
本发明提供一种细胞膜仿生的含磷树状大分子负载FN/EDV纳米药物的制备和应用。以亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子与FN结合并物理负载EDV,并包裹巨噬细胞膜,构建细胞膜仿生的复合纳米药物。该纳米药物可穿透血脑屏障(BBB)快速靶向病灶部位,提高药物的递送效率,一方面可改善依达拉奉水溶性差、半衰期短、不易透过BBB、生物利用度低等缺点,从而高效发挥依达拉奉EDV的抗氧化能力;另一方面,纳米药物可有效发挥含磷树状大分子和纤连蛋白FN自身的抗炎活性,通过缓解氧化应激、小胶质细胞M2极化转型和降低促炎细胞因子水平减轻炎症反应并抑制细胞凋亡,同时缺血再灌注后纤连蛋白可以促进缺血区域内的血管内皮细胞生长,有助于恢复病灶部位的血流量,从而实现脑卒中抗氧化、抗炎、抗凋亡和促再生的协同治疗。因此,设计的细胞膜仿生的纳米平台可实现对缺血再灌注引发的脑部损伤疾病的抗氧化、抗炎、抗凋亡和促再生的联合治疗。
本发明首先通过静电力、氢键、阳离子-Π、疏水相互作用等作用力将亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子与FN结合,然后通过物理吸附将EDV负载在纳米复合物疏水空腔,并进一步通过物理挤压的方式在纳米复合物表面包覆RAW264.7巨噬细胞膜,构建细胞膜仿生纳米药物得到A-F/E@M用于缺血性脑卒中的抗炎/抗氧化/促再生的联合治疗。
本发明使用Zeta电势及动态光散射分析(DLS)、紫外可见吸收光谱(UV-vis)、透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)等手段表征制备的细胞膜仿生的A-F/E@M纳米药物的物理化学性质。然后利用CCK-8法分析评价A-F/E@M及相关对照材料的细胞毒性;利用激光共聚焦显微镜及流式细胞术检测小胶质细胞BV2对材料的吞噬情况;通过糖氧剥夺(OGD)离体脑缺血模型处理SY5Y细胞,利用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测材料对细胞凋亡水平的影响;通过transwell模拟体外血脑屏障,利用流式细胞术检测BV2细胞向M2极化的情况;利用激光共聚焦显微镜及流式细胞术评价材料对细胞内ROS水平的影响;利用ELISA试剂盒检测炎症相关因子TNF-α、Il-1β和IL-6的表达水平;利用流式细胞术评价了材料对细胞内线粒体膜电位的影响;利用流式细胞术评价了材料对细胞内钙离子浓度的影响;建立脑缺血再灌注(tMCAO)模型,利用Zea-Longa评分实验评价材料对大鼠神经功能恢复的影响;利用TTC染色实验评价材料对大鼠脑梗死面积的影响;利用H&E染色实验评价材料对大鼠脑细胞的影响;利用T2磁共振(MR)成像系统评价材料对大鼠脑细胞的影响。
有益效果
(1)本发明工艺简单,所需反应条件简单,易于操作分离,具有良好的发展前景。
(2)本发明制备的纳米药物具有良好的稳定性、水溶性及生物相容性,为构建安全、高效的纳米药物提供了新思路。
(3)本发明制备的纳米药物具有较高的载药率,可穿越BBB,在脑缺血部位靶向聚集,高效发挥抗炎抗氧化功效并提高EDV的生物利用度,为构建安全、智能、高效的药物载体提供了新思路。
(4)本发明制备的纳米药物一方面可以作用于小胶质细胞使其从促炎M1型转变为抗炎M2型,减少缺血再灌注后脑部氧化损伤,另一方面可以保护神经细胞线粒体恢复稳态。同时促进血管再生进一步减少缺血部位面积,从而增强治疗效果,可以实现抗氧化、抗炎、抗凋亡和促再生的联合治疗,具有潜在的临床应用价值。
附图说明
图1为本发明中纳米材料A-F/E@M的合成及应用示意图;
图2为亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子AK137的分子结构式;
图3为实施例1中制备的AK137、FN、A-F、A-F/E及A-F/E@M的水合粒径(A)及表面电势(B);
图4为实施例1中制备的A-F/E@M在水、PBS以及DMEM培养基中稳定24小时后的水动力学直径;
图5为实施例1中制备的A-F/E(A)的SEM图像及其粒径分布直方图(B)以及A-F/E@M(C)的TEM图像;
图6为实施例1中制备的A-F、巨噬细胞细胞膜悬液(MM)及A-F/E@M的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图;
图7为实施例1中制备的A-F/E@M在不同条件下的药物释放动力学曲线;
图8为实施例1中制备的A-F/E@M与BV2细胞(A)及SY5Y细胞(B)共孵育24h后的细胞活力图;
图9为实施例1中制备的A-F/E(A)、A-F/E@M(B)与BV2细胞共孵育2、4、8、12h后细胞内Cy5.5荧光强度的分析图;
图10为实施例1中制备的A-F/E及A-F/E@M与BV2细胞共孵育8h后细胞内Cy5.5荧光强度分析图,PBS与FN为对照,所有涉及FN的实验采用标记了Cy5.5的FN;
图11为细胞经OGD处理后,PBS、AK137、A-F、EDV、A-F/E、A-F/E@M与SY5Y细胞共孵育24h后细胞凋亡水平流式细胞分析图及定量分析图;
图12为细胞经OGD处理后,体外血脑屏障渗透实验的Transwell装置示意图(A),渗透前后内皮细胞层TEER电阻变化(B)及PBS、AK137、FN、A-F、EDV、A-F/E、A-F/E@M与BV2细胞共孵育24h后细胞中CD86、CD206表达水平的流式细胞分析图(C)、M1型BV2细胞(D)和M2型BV2细胞(E)的含量图以及M2/M1型BV2细胞的定量图(F);
图13为细胞经OGD处理后,PBS、AK137、FN、A-F、EDV、A-F/E、A-F/E@M与BV2细胞共孵育24h后细胞内ROS水平激光共聚焦显微镜分析图(A)及流式细胞定量分析图(B);
图14为细胞经OGD处理后,PBS、AK137、FN、A-F、EDV、A-F/E、A-F/E@M与BV2细胞共孵育24h后,细胞分泌炎性细胞因子IL-1β(A)、TNF-α(B)、IL-6(C)定量分析图;
图15为细胞经OGD处理后,PBS、AK137、FN、A-F、EDV、A-F/E、A-F/E@M与SY5Y细胞共孵育24h后细胞内线粒体膜电位流式细胞分析图(A)和红/绿荧光比值定量分析图(B);
图16为细胞经OGD处理后,PBS、AK137、FN、A-F、EDV、A-F/E、A-F/E@M与SY5Y细胞共孵育24h后细胞内钙离子浓度流式细胞定量分析图;
图17为SD大鼠经tMCAO手术后,尾静脉注射生理盐水、A-F/E、A-F/E@M药物24h后大鼠的Zea-Longa评分图。
图18为SD大鼠经tMCAO手术后,尾静脉注射生理盐水、A-F/E、A-F/E@M药物24h后大鼠脑组织的TTC染色图(A)和脑梗死面积定量分析图(B);
图19为SD大鼠经tMCAO手术后,尾静脉注射生理盐水、A-F/E、A-F/E@M药物24h后大鼠脑组织的H&E染色结果图;
图20为SD大鼠经tMCAO手术后,尾静脉注射生理盐水、A-F/E、A-F/E@M药物4、8、24h后大鼠脑组织的T2加权MR冠状图像。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
除非特殊说明,否则所有化学试剂都是可商购的,无需进一步纯化即可直接使用。EDV购买自Sigma-Aldrich(美国)。FN来自上海纤连生物科技有限公司(中国上海)。RAW264.7、BV2、SY5Y、bEnd3.细胞来自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗和胰蛋白酶购自杭州吉诺生物医学技术有限公司(中国杭州)。Cell Counting Kit-8(CCK-8)、ROS检测试剂盒、增强型线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、Fluo-4AM(钙离子荧光探针)购买自上海碧云天生物科技有限公司(中国上海)。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司。Anti-CD86-PE、Anti-CD206-FITC、单克隆抗体购自Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA)。SD大鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国上海)。
实施例1
(1)将6.0mg的亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子AK137(如图2)溶解在200μL超纯水中,同时将0.5mg的FN溶解在300μL超纯水中,然后将AK137溶液加入到高速搅拌的FN溶液中,室温搅拌4~8h至溶液呈现乳白色。对复合物溶液离心,离心温度为4℃,以14000g离心力离心10min,收集沉淀。冷冻干燥。得到AK137-FN复合物(A-F NPs)。
(2)将3.0mg EDV溶解在20μL甲醇中,逐滴滴加到含有A-F NPs(3mg/mL)的溶液中,室温敞口搅拌反应24h,反应结束后将混合物溶液移入离心管中,以1000g离心力离心10min,离心温度为4℃,得到共负载EDV和FN的纳米复合物(A-F/E NPs),沉淀为未载上的EDV。同时,通过紫外测量未载上的EDV在245nm处的吸光度,计算出未载上的EDV的量,从而计算出EDV的上载率为54.73wt%,包封率为60.46wt%。
(3)将30μL苯甲基磺酰氯PMSF与3mL低渗细胞裂解液混合均匀,取对数生长期的RAW264.7细胞1×107个,1000g离心5min,得细胞沉淀,然后向细胞沉淀中加入混合好的低渗细胞裂解液,冰浴15min,采用反复冻融法(液氮冷冻,37℃融化,重复三次)。以700g离心力离心10min,离心温度为4℃,去除沉淀;以14000g离心力离心30min,去除上清,将沉淀重悬于1mL 1×PBS溶液中,可得细胞膜悬液。
(4)将200μgA-F/E NPs与0.5mL细胞膜悬液(0.4mg/mL)混合,A-F/E与细胞膜的质量比为1:1,使用滤膜孔径为400nm的AvantiAvanti微型挤出器将溶液挤出11次,10000g离心6min,除去多余的细胞膜,得到A-F/E@M。
实施例2
取适量实施例1中制备的A-F NPs、A-F/E NPs、A-F/E@M用超纯水稀释,分别配制成浓度为1mg/mL的溶液,用于测定水合粒径和表面电势。结果如图3所示,AK137的水合粒径为66.75nm,电势为-73.57mV,负载FN后,水合粒径增至217.63nm,电势变为-46.43mV,水合粒径及电势的变化证明了A-F NPs的成功合成。当A-F NPs负载化疗药物EDV后,水合粒径增加至241.77nm,电势升高为-43.67mV,说明负载EDV后纳米复合物变得更加致密。进一步通过物理挤压的方式在A-F/E NPs包覆巨噬细胞膜后,A-F/E@M的水合粒径增加至330.73nm,电势升高至与纯细胞膜(MM)近似的-9.47mV,证明了细胞膜的成功包覆。A-F/E@M在各种溶液(水、PBS、DMEM培养基)中静置一周后的水合粒径几乎不变(图4),证明了A-F/E@M具有良好的稳定性。
实施例3
取实施例1中制备的A-F/E进行材料载药率的表征。通过紫外可见分光光度法测定,EDV在240nm波长处有最大吸收,通过甲醇溶解配置EDV标准曲线,浓度分别为1、2、4、6、8、10、12、20μg/mL,通过紫外测量沉淀中未上载的EDV,利用公式(1,2)计算得出(表1)当A-F与EDV质量比为2:1时,EDV有较高的上载率(30.50%)以及较高的包封率(87.76%),后续以该比例合成A-F NPs。
包封率(%)=(A0-A1)/A0 (1)
上载率(%)=(A0-A1)/A2 (2)
其中A0是药物的初始量,A1是未上载的药物量,A2是纳米材料的总量。
表1
A-F:EDV(质量) | 上载率 | 包封率 |
1:1 | 35.43% | 54.86% |
2:1 | 30.50% | 87.76% |
3:1 | 22.96% | 89.40% |
实施例4
取实施例1中制备的A-F/E和A-F/E@M NPs进行尺寸和形貌的表征。A-F/E的SEM图片如图5(A)所示,A-F/E呈均匀的球形,通过粒径分布直方图5(B)计算尺寸约为94.6nm。包裹细胞膜后,通过TEM图片如图5(C)所示,细胞膜厚度为29.7nm。
实施例5
取实施例1中制备的A-F/E@M进行SDS-PAGE表征以验证细胞膜的包覆及细胞膜蛋白的保留。通过BCA蛋白定量试剂盒测定实施例1中制备的巨噬细胞膜悬液及A-F/E@M中的蛋白含量,并用PBS溶液调节各样品中蛋白含量为1mg/mL。将5μL蛋白Marker加入第一条蛋白泳道,再分别将15μL的AK137 NPs(浓度为A-F/E@M中蛋白浓度为1mg/mL时对应的A137NPs浓度)、FN、A-F NPs、巨噬细胞膜悬液(MM)及A-F/E@M加入蛋白泳道,电流设为100A,时间设为30min。如图6所示,AK137组没蛋白条带,而A-F/E@M组与巨噬细胞膜悬液组跑出了相似的蛋白条带,证明了巨噬细胞膜在A-F/E NPs表面的成功包覆及巨噬细胞膜蛋白的保留。
实施例6
推测纳米颗粒被细胞内化并转移到酸性溶酶体后会释放负载的药物,因此鉴于血液中的特定pH值(7.3-7.4)、细胞内初级内体pH值(6.3)、次级内体pH值(5.5)和溶酶体pH值(4.7),并且缺氧缺血性脑的体内pH通常为pH 6.4,因此分别配置pH=7.4、pH=6.3、pH=5.5、pH=4.7的PBS缓冲溶液,用于分析A-F/E@M中EDV的pH响应性释放性能。将制备的A-F/E@M用1mL上述不同缓冲溶液溶解为1mg/mL的溶液并置于透析袋(分子截留量为3500Da)中,然后将透析袋置于含有9mL不同缓冲溶液的容器中,于37℃恒温摇床中振荡。在不同时间点吸取透析袋外液1mL,再向容器中补充1mL对应的缓冲溶液,测量取出的液体在240nm处的吸光值。缓释结束后,绘制A-F/E@M在不同条件下的药物释放曲线。如图7所示,A-F/E@M在pH=7.4的缓冲液中药物释放缓慢,72小时药物释放率仅为7.75%,而在pH=4.7的缓冲液中,EDV的释放率为91.32%,这些结果表明,A-F/E@M纳米颗粒酸性pH敏感的EDV释放性能。
实施例7
以BV2和SY5Y细胞为细胞模型检测实施例1中制备的A-F/E@M及相关材料的细胞毒性。收集对数生长期的BV2细胞或SY5Y细胞,按照每孔1×104个细胞的密度种在96孔板中,所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10%FBS的DMEM完全培养基,置于5%CO2、37℃条件下孵育12h。弃掉原培养基,每个孔板分别加入含不同浓度的AK137、A-F、EDV、A-F/E或A-F/E@M(EDV浓度为8、10、12、14、16、18μM)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下共培养24h。之后取出孔板,弃掉原培养基,用PBS洗三遍,加入含10%(v/v)CCK-8的新鲜培养基,在培养箱继续孵育3h。最后用多功能酶标仪于波长450nm处测试各孔的吸光值,以PBS处理的细胞为空白对照。结果如图8所示,在实验浓度范围内,随着EDV浓度的增加,EDV对BV2细胞(图8(A))和SY5Y细胞(图8(B))的细胞毒性均逐渐增强,而其它材料组细胞毒性没有明显增强。值得注意的是,与单独的EDV相比,A-F/E@M处理后BV2细胞和SY5Y细胞活力降低不明显,这可能是由于包覆了细胞膜的材料可以减弱高浓度EDV对细胞产生的毒害作用。
实施例8
以BV2细胞为细胞模型评价细胞对A-F/E和A-F/E@M的吞噬能力。将BV2细胞按照2×105个细胞每孔的密度分别接种在6孔板中,所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10%FBS的DMEM完全培养基,置于5%CO2、37℃条件下孵育24h。弃去原培养基,分别加入含有荧光Cy5.5标记的A-F-Cy5.5/E和A-F-Cy5.5/E@M([EDV]=12μg/mL)的培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下分别共孵育2、4、8、12h,正常组用PBS处理。弃去培养基,用PBS洗涤3次,每孔加入0.5mL胰酶消化细胞,终止消化后,离心洗涤收集细胞。向收集的细胞中分别加入300μLPBS重悬细胞沉淀,并转移到流式管中,通过流式细胞仪检测各组的荧光强度。结果如图9所示,A-F-Cy5.5/E@M比未包裹细胞膜的材料有更高的荧光强度,证明包裹巨噬细胞膜后可以增强BV2细胞对材料的摄取,并且A-F/E@M组的荧光强度随时间延长逐渐增加,说明A-F/E@M可以被小胶质细胞有效吞噬进而发挥药物功效。
以BV2细胞为细胞模型通过激光共聚焦显微镜观察细胞对A-F/E及A-F/E@M的吞噬能力,并以此来评价A-F/E@M的同源靶向能力。收集对数生长期的BV2细胞,以1×105个细胞每孔的密度将BV2细胞种于激光共聚焦专用培养皿中,置于5%CO2、37℃条件下孵育24h。弃去原培养基,分别加入含有FN-Cy5.5、A-F-Cy5.5/E及A-F-Cy5.5/E@M([EDV]=12μg/mL)的培养基,正常组用PBS处理,与细胞在5%CO2、37℃条件下分别共培养8h。弃去培养基,PBS洗涤三遍,加入1mL 2.5%戊二醛室温固定15min,PBS洗涤三遍,加入1mL DAPI与细胞共孵育5min,PBS洗涤三遍后,于激光共聚焦显微镜下观察细胞荧光强度变化。结果如图10所示,A-F-Cy5.5/E@M组的荧光强度显著高于FN-Cy5.5组及A-F-Cy5.5/E,说明巨噬细胞膜使A-F/E@M具备了同源靶向能力,从而促进纳米材料在小胶质细胞内的递送。
实施例9
以SY5Y细胞为细胞模型来评价不同材料对抑制细胞凋亡水平的影响。将细胞以每孔2×105个细胞的密度接种到6孔板中,所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10%FBS的DMEM完全培养基,置于5%CO2、37℃条件下孵育24h。弃去原培养基,用PBS洗涤细胞,加入无糖培养基,所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10%FBS的DMEM无糖培养基,置于1%O2、99%N2、37℃条件下缺氧孵育4h。复氧后弃去无糖培养基,用PBS洗涤细胞,分别加入含10%PBS的培养基、AK137、A-F、EDV、A-F/E、A-F/E@M(浓度为A-F/E@M中含[EDV]=12μg/mL时对应的浓度);培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下孵育24h。之后将6孔板中的细胞消化、离心收集洗涤,按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(凯基生物,中国)的说明,检测细胞经OGD处理后材料对其凋亡的抑制情况。结果如图11所示,相比于单纯EDV组,制备的A-F/E@M可以更好的抑制细胞凋亡,这主要是因为巨噬细胞膜的包裹增加了细胞的摄取,同时发挥AK137、FN以及EDV三者的抗炎抗氧化效果,抑制缺氧引发的细胞凋亡。
实施例10
为了验证A-F/E@M纳米复合物穿透BBB的能力以及对小胶质细胞极化的影响,以Transwell模型模拟体外BBB验证材料穿透BBB的能力。将bEnd.3细胞以2.5×104个/孔的密度接种于Transwell板(12孔板)的上层小室中,上层小室底部带有0.4μm孔径的聚碳酸酯膜,然后将上层小室置于Transwell板中,所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10%FBS的DMEM完全培养基,置于5%CO2、37℃条件下孵育5-7天,直至其跨内皮电阻(TEER)大于220Ω.cm2,形成类似于BBB紧密连接的单细胞层,作为体外BBB模型。另外将BV2细胞以每孔1×105个细胞的密度接种到另一Transwell板的下层小室中,所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10%FBS的DMEM完全培养基,置于5%CO2、37℃条件下孵育24h。当上层小室的TEER大于220Ω.cm2后弃去原培养基,用PBS洗涤细胞,将培养bEnd.3细胞的上层小室放入培养BV2细胞的下层小室中如图12(A)所示,加入无糖培养基,所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10%FBS的DMEM无糖培养基,置于1%O2、99%N2、37℃条件下缺氧孵育4h。复氧后弃去无糖培养基,用PBS洗涤细胞,分别加入含10%PBS的培养基、AK137、FN、A-F、EDV、A-F/E、A-F/E@M(浓度为A-F/E@M中含[EDV]=12μg/mL时对应的浓度)纳米材料分别添加到Transwell系统的上层小室中,下室补充1mL DMEM完全培养基。上下室合并孵育24小时后,分析上层电阻值,结果如图12(B)所示,材料穿透bEnd.3单细胞层前后TEER电阻值变化较小,表明bEnd.3单细胞层的完整性。对下层BV2细胞弃去培养基,PBS洗涤两遍,胰酶消化收集细胞后,用200μL PBS重悬细胞沉淀,分别加入Anti-CD206-FITC和Anti-CD86-PE抗体与细胞在4℃避光条件下共孵育30min。用PBS洗涤三遍,以去除未与细胞结合的抗体后,用300μLPBS重悬细胞沉淀,并转移至流式管中,通过检测细胞中CD86和CD206的表达水平变化评价纳米材料对BV2巨噬细胞极化的影响。如图12所示,与阳性对照OGD组相比,AK-137组中CD86的表达水平降低,CD206表达升高,其M2小胶质细胞的数量高于OGD组,而M1巨噬细胞的数量低于OGD组,这表明AK-137自身能够抑制OGD处理后小胶质细胞向M1型极化的趋势。相比于A-F/E组,A-F/E@M组表现出最高水平的CD206/CD86比值结果,其M2/M1比例是A-F/E组的1.23倍,这表明巨噬细胞膜可增加小胶质细胞的摄取,递送进入胞内后诱导小胶质细胞向M2型极化的能力进一步增强,展现出载体、蛋白及药物的协同增强的生物功能。同时表明A-F/E@M具有更高的穿透效率,表明巨噬细胞膜的包覆赋予了纳米材料穿透BBB的能力。
实施例11
以BV2细胞为细胞模型来评价不同材料对ROS的抑制效果。收集对数生长期的BV2细胞,以1×105个细胞每孔的密度将BV2细胞种于激光共聚焦专用培养皿中,所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10%FBS的DMEM完全培养基,置于5%CO2、37℃条件下孵育24h。弃去原培养基,用PBS洗涤细胞,加入无糖培养基,所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10%FBS的DMEM无糖培养基,置于1%O2、99%N2、37℃条件下缺氧孵育4h。复氧后弃去无糖培养基,用PBS洗涤细胞,分别加入含10%PBS的培养基、AK137、FN、A-F、EDV、A-F/E、A-F/E@M(浓度为A-F/E@M中含[EDV]=12μg/mL时对应的浓度);培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下孵育24h。弃去原培养基,将细胞与用无血清培养基稀释的DCFH-DA探针共孵育30min,无色的DCFH-DA探针在细胞内能够被ROS氧化成具有绿色荧光的DCF。孵育结束后,弃去原培养基,用PBS清洗三次,PBS洗涤三遍后加入200μLPBS于激光共聚焦显微镜下观察细胞荧光强度变化。结果如图13(A)所示,OGD处理后可以产生大量ROS使细胞内绿色荧光强度增强,在药物AK137、FN、A-F、EDV、A-F/E、A-F/E@M处理后,细胞内绿色荧光强度均有所减低,表明了细胞内ROS水平的降低。治疗组中A-F/E@M组细胞显示出最弱的绿色荧光,表明A-F/E@M具有最优异的抗氧化效果。
以BV2细胞为细胞模型通过流式细胞术来评价不同材料对ROS抑制的能力。将细胞以每孔2×105个细胞的密度接种到6孔板中,所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10%FBS的DMEM完全培养基,置于5%CO2、37℃条件下孵育24h。弃去原培养基,用PBS洗涤细胞,加入无糖培养基,所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10%FBS的DMEM无糖培养基,置于1%O2、99%N2、37℃条件下缺氧孵育4h。复氧后弃去无糖培养基,用PBS洗涤细胞,分别加入含10%PBS的培养基、AK137、FN、A-F、EDV、A-F/E、A-F/E@M(浓度为A-F/E@M中含[EDV]=12μg/mL时对应的浓度),培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下孵育24h。胰酶消化收集细胞后,用1mLPBS重悬细胞沉淀,加入ROS荧光探针DCFH-DA(碧云天,上海)与细胞在37℃共孵育20min。用PBS洗涤三遍以去除未与细胞结合的探针后,用300μLPBS重悬细胞沉淀并转移至流式管中,通过流式细胞仪评价纳米材料对BV2细胞内ROS清除的效果。基于不同材料对细胞内ROS水平影响的实验结果如图13(B),缺氧预处理使细胞产生大量ROS,而在药物AK137、FN、A-F、EDV、A-F/E、A-F/E@M处理后,ROS的荧光强度均有所减低,而A-F/E@M的处理显著降低ROS水平,表明了其优异的缓解氧化应激能力。
实施例12
以BV2细胞为细胞模型来评价不同材料的抗炎能力。将细胞以每孔2×105个细胞的密度接种到6孔板中,所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10%FBS的DMEM完全培养基,置于5%CO2、37℃条件下孵育24h。弃去原培养基,用PBS洗涤细胞,加入无糖培养基,所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10%FBS的DMEM无糖培养基,置于1%O2、99%N2、37℃条件下缺氧孵育4h。复氧后弃去无糖培养基,用PBS洗涤细胞,分别加入含10%PBS的培养基、AK137、FN、A-F、EDV、A-F/E、A-F/E@M(浓度为A-F/E@M中含[EDV]=12μg/mL时对应的浓度),培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下孵育24h。孵育结束后,吸出原培养基,离心去除沉淀保留上清,测定上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6含量。结果如图14所示,促炎性细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达经各组材料处理后均有不同程度的下降。经过A-F/E@M的处理,IL-1β、TNF-α、IL-6细胞因子水平相比于OGD组降至最低,表明材料具有最优异的抗炎效果,能够极大减轻细胞的炎症状态。
实施例13
以SY5Y细胞为细胞模型来评价不同材料对线粒体功能的影响。将细胞以每孔2×105个细胞的密度接种到6孔板中,所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10%FBS的DMEM完全培养基,置于5%CO2、37℃条件下孵育24h。弃去原培养基,用PBS洗涤细胞,加入无糖培养基,所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10%FBS的DMEM无糖培养基,置于1%O2、99%N2、37℃条件下缺氧孵育4h。复氧后弃去无糖培养基,用PBS洗涤细胞,分别加入含10%PBS的培养基、AK137、FN、A-F、EDV、A-F/E、A-F/E@M(浓度为A-F/E@M中含[EDV]=12μg/mL时对应的浓度),培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下孵育24h。弃去原培养基,用PBS清洗三次,与线粒体膜电位检测探针(JC-1)染色工作液(碧云天,上海)共孵育20min。孵育结束后,吸除上清,用JC-1染色缓冲液清洗三次,加入1mL培养基,然后通过流式细胞仪评价细胞内的红色/绿色荧光变化。荧光探针JC-1在线粒体膜电位较高时,聚集在线粒体的基质中,显示红色荧光;在线粒体膜电位较低时,JC-1不能聚集在线粒体的基质中,此时JC-1为单体,显示绿色荧光。如图15所示,经OGD处理后的细胞显示较强的绿色荧光及较低的红/绿荧光比,这可能是由于缺氧处理后使细胞内ROS水平上调,从而降低线粒体膜电位。而经A-F/E@M等药物处理后的细胞中绿色荧光显著降低且红/绿荧光比显著增加,表明包覆细胞膜后,细胞对A-F/E@M的吞噬能力增加,A-F/E@M可显著恢复线粒体膜电位,保持线粒体正常功能。
实施例14
以SY5Y细胞为细胞模型来评价不同材料降低细胞内钙离子水平的能力。将细胞以每孔2×105个细胞的密度接种到6孔板中,所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10%FBS的DMEM完全培养基,置于5%CO2、37℃条件下孵育24h。弃去原培养基,用PBS洗涤细胞,加入无糖培养基,所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10%FBS的DMEM无糖培养基,置于1%O2、99%N2、37℃条件下缺氧孵育4h。复氧后弃去无糖培养基,用PBS洗涤细胞,分别加入含10%PBS的培养基、AK137、FN、A-F、EDV、A-F/E、A-F/E@M(浓度为A-F/E@M中含[EDV]=12μg/mL时对应的浓度),培养基与细胞在5%CO2、37℃条件下孵育24h。弃去原培养基,用PBS清洗三次,用Fluo-4 AM染色,用PBS洗涤三遍以去除未与细胞结合的探针后,用300μL PBS重悬细胞沉淀并转移至流式管中,通过流式细胞仪评价纳米材料对细胞内钙离子的清除效果。由于线粒体和内质网是细胞中储存钙离子的主要细胞器,线粒体和内质网上的损伤通常伴随着显著的钙超载。因此,细胞内钙浓度被认为是反映氧化应激的重要现象之一。如图16所示,结果表明,OGD的处理显著诱导细胞中的钙超载,而A-F/E和A-F/E@M处理分别使钙超载荧光强度从71.20%分别下降为49.40%和38.23%,说明材料可通过抑制氧化应激从而逆转钙超载以保护细胞免受损伤。
实施例15
所有动物实验均严格按照动物保护协会标准进行。实验用的250g-280g雄性SPF级SD大鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国,上海)。大鼠脑缺血再灌注模型(tMCAO)12h光/12h暗交替,自由摄食水,室温20℃。脑缺血再灌注改良模型的建立采用longa法,略有改良。手术前12h禁水禁食,1%戊巴比妥钠(40mg/kg)经腹腔注射,仰卧位,固定,75%酒精消毒,沿颈中线切开,暴露并游离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)。动脉夹临时阻断CCA和ICA,在ECA从CCA分叉后约5mm处,用血管剪剪一个小口,将250g-280g规格大鼠适用的tMCAO线栓(瑞沃德,深圳)插入ECA的向心端,并经过CCA分叉处插入ICA,插入深度至线栓尾部黑色标记处,可以感受到略有阻力时立即停止进线栓。术中将体温维持在37.0±0.5℃。术后两小时,轻轻拔退线栓,缝合手术切口,涂抹碘伏。假手术组除不进行血管内线栓插入,其他步骤同模型组。大鼠完全清醒后,模型组评价造模是否成功,采用Zea-Longa评分法(表2),评分为1-3分者表明造模成功,可以入组。具体分组如下:生理盐水(1mL)、A-F/E、A-F/E@M([EDV]=3.5mg/kg,1.5mL),注射方式为尾静脉注射。建模完成后30min时注射药物,治疗观察周期为24h。各组选取10只大鼠进行Zea-Longa评分如图17所示,生理盐水组大鼠的Zea-Longa评分主要分布于2分,A-F/E组和A-F/E@M组大鼠治疗24h后神经功能得到恢复。其中A-F/E@M相比于A-F/E组,A-F/E@M组的神经恢复效果更好,这是由于包覆了细胞膜的A-F/E@M具有延长的血液循环时间,可以穿越BBB,显示出增强的治疗效果。
表2
实施例16
为验证A-F/E和A-F/E@M对tMCAO大鼠的治疗效果,选择用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法观察脑梗死灶。各组造模大鼠尾静脉注射生理盐水(1mL)、A-F/E、A-F/E@M([EDV]=3.5mg/kg,1.5mL)。24h后脱颈椎处死大鼠,剪开皮肤暴露头及颈段,从颈椎处剪断颈髓,去除肌肉和颅骨上的膜,剪刀伸进去0.8cm~1cm,沿正中以及两侧45度分别剪一刀,用大号弯头止血钳去除颅骨眼科镊拉断硬脑膜,取出脑组织,脑组织用生理盐水冲洗净表面的毛和血迹,-20℃速冻10min后切片,置于1%的TTC染色液中,避光60℃烘箱中染色10-20min,TTC染色后,未缺血部分呈玫瑰红色,而脑梗死灶呈苍白色。结果如图18显示,tMCAO模型组大鼠24h后脑梗死面积为45.87%,A-F/E@M治疗24h后大鼠脑梗死面积有显著减小,梗死面积仅为8.94%,证实了A-F/E@M可有效预防tMCAO引发的脑梗死。
实施例17
为验证A-F/E和A-F/E@M对tMCAO大鼠的治疗效果,通过苏木精-伊红(H&E)染色的组织学检查来确定。各组造模大鼠尾静脉注射生理盐水(1mL)、A-F/E、A-F/E@M([EDV]=3.5mg/kg,1.5mL)。24h后脱颈椎处死大鼠,剪开皮肤暴露头及颈段,从颈椎处剪断颈髓,去除肌肉和颅骨上的膜,剪刀伸进去0.8cm~1cm,沿正中以及两侧45度分别剪一刀,用大号弯头止血钳去除颅骨眼科镊拉断硬脑膜,取出脑组织进行切片染色。在缺氧后生理盐水处理的缺血区域,脑细胞的形态发生了明显变化,细胞体积减少,细胞核缩小,表明脑细胞受到了严重损伤。然而,在A-F/E@M组中,缺血区域的脑细胞显示出正常形态,与假手术组相当(图19),证明A-F/E@M可以有效抑制tMCAO期间造成的细胞损伤。
实施例18
为验证A-F/E和A-F/E@M对tMCAO大鼠的治疗效果,通过MR成像评估A-F/E@M在减少tMCAO大鼠模型梗死体积方面的疗效。各组造模大鼠尾静脉注射生理盐水(1mL)、A-F/E、A-F/E@M([EDV]=3.5mg/kg,1.5mL)。在4、8、24h时将大鼠麻醉,进行T2加权MR冠状成像以检测脑梗塞面积(图20)。T2 MR图像显示,在假手术组中未检测到梗死区,但在生理盐水处理的tMCAO大鼠中观察到较强的信号,并随着时间的推移信号逐渐增强。同时,A-F/E@M组的处理下,脑部梗死区信号远低于生理盐水组和A-F/E组,进一步证明了A-F/E@M的治疗可通过发挥抗炎/抗氧化/抗凋亡的功能,高效治疗脑卒中。
Claims (10)
1.一种含磷树状大分子纳米复合材料,其特征在于,所述复合材料以亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子为载体,表面修饰纤连蛋白FN,并负载药物。
2.一种细胞膜仿生纳米材料,其特征在于,所述细胞膜仿生纳米材料包括巨噬细胞膜包覆权利要求1所述含磷树状大分子纳米复合材料。
3.一种细胞膜仿生纳米材料的制备方法,包括:
(1)将亚磷酸钠盐修饰的含磷树状大分子AK137溶液、纤连蛋白FN溶液混合,室温搅拌反应,离心,得到AK137-FN复合物;其中AK137结构式:
(2)将药物、AK137-FN复合物溶液混合,室温搅拌,离心取上清,得到含磷树状大分子复合材料;
(3)含磷树状大分子纳米复合材料、细胞膜悬液混合,挤出、离心,得到细胞膜仿生纳米材料。
4.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中AK137与FN的质量比为12:1-2;所述FN溶液、AK137溶液的溶剂均为水;FN溶液浓度为1.5-3.5mg/mL、AK137溶液30-35mg/mL。
5.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中混合为FN溶液逐滴加入AK137溶液中;室温搅拌反应时间为4-8h;所述离心为离心温度为4-10℃,以12000-14000g离心力离心10-15min,收集沉淀。
6.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中AK137-FN复合物、药物的质量比为2-3:1;所述药物为依达拉奉EDV。
7.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中混合为药物逐滴滴加到AK137-FN复合物溶液中,其中药物浓度为1-2mg/mL;所述药物的助溶剂为甲醇;所述室温搅拌反应时间为20-24h;所述离心为离心温度4-10℃,以1000-1500g离心力离心10-15min,去除沉淀。
8.根据权利要求3所述制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中含磷树状大分子纳米复合材料、细胞膜的质量比为1:1-2;所述细胞膜为RAW细胞膜;所述挤出:使用滤膜孔径为400-600nm的Avanti微型挤出器反复挤压11-15次。
9.一种权利要求2所述细胞膜仿生纳米材料在制备抗氧化、抗炎、抗凋亡和促再生的联合治疗药物中的应用。
10.一种权利要求2所述细胞膜仿生纳米材料在制备预防或治疗脑梗死、脑卒、脑细胞损伤药物中的应用。
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