CN118078776A - 一种共递送多核酸药物的聚合物囊泡及其制备方法与治疗ra的应用 - Google Patents
一种共递送多核酸药物的聚合物囊泡及其制备方法与治疗ra的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种共递送多核酸药物的聚合物囊泡及其制备方法与治疗RA的应用，具体为聚合物囊泡共递送siIRF5和siTNFα用于类风湿性关节炎的联合靶向治疗。体外和体内实验结果支持共载囊泡中siTNFα对siIRF5功能（复极化）的增强作用以及siIRF5导致的M1M减少作用对siTNFα功能（下调炎性蛋白）的促进作用。这一共载siRNA囊泡能把目标基因迥异的多种siRNA递送到同一目标细胞中，再利用各自的作用机制从不同途径切断致病进程，有望对其他复杂的多种通路控制的自身免疫疾病的靶向治疗有所启发。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术，涉及治疗类风湿性关节炎（RA）的药物，具体涉及一种共递送多核酸药物的聚合物囊泡及其制备方法与治疗RA的应用。
背景技术
针对类风湿性关节炎（RA）这种复杂的多基因控制的自身免疫疾病，现有技术公开了多种免疫抑制剂[Guo, K.; et al., Treatment effects of the second-generationtyrosine kinase inhibitor dasatinib on autoimmune arthritis. Frontiers inImmunology 2018, 9, 3133. Liu, S.; et al., Recent advances on signalingpathways and their inhibitors in rheumatoid arthritis. Clinical Immunology2021, 230, 108793. Tenshin, H.; et al., TGF-beta-activated kinase-1 inhibitorLL-Z1640-2 reduces joint inflammation and bone destruction in mouse models ofrheumatoid arthritis by inhibiting NLRP3 inflammasome, TACE, TNF-alpha andRANKL expression. Clinical Pharmacology and Therapeutics 2022, 11, e1371.]。但临床结果表明，持续用免疫抑制治疗RA容易削弱免疫系统功能，增加病患感染风险[Chen,H. K.; et al., Risk of heart failure in rheumatoid arthritis patients treatedwith tumor necrosis factor-alpha inhibitors. Clinical Pharmacology andTherapeutics 2021, 110, 1595-1603.]。RA的发病机制涉及到复杂的基因通路和炎症网络，包括多种细胞因子和炎症细胞之间的串联[Chen, X.; et al., Restoringimmunological tolerance in established experimental arthritis bycombinatorial citrullinated peptides and immunomodulatory signals. Nano Today2021, 41, 101307. ]；最重要的炎症细胞之一巨噬细胞能通过分泌多种促炎细胞因子调节RA免疫微环境[Chen, Z.; et al., Anti-inflammatory and immune-regulatorycytokines in rheumatoid arthritis. Nature Reviews Rheumatology 2019, 15, 9-17. ]。甲氨蝶呤（MTX）是最常用的RA临床一线用药，主要通过切断叶酸转变成四氢叶酸来选择性作用于DNA合成期，以抑制免疫细胞增值及作用于腺苷通路来达到抗炎作用；但长期用药导致肠胃不适和肝功能损伤等。基于RA发病机制的复杂性，临床常采用多药联用，研究者也设计了多种纳米药物的联合治疗。虽然理论上，设计合适的药物联用可能从不同机制协同地阻断RA病程，但是现有联合药物相对于单药的改善还需提升，药物剂量还需下降。
发明内容
本发明设计了四个甘露糖配体簇修饰的共载双核酸药物（siTNFα和siIRF5）的囊泡（4Man-PS-siIT），通过抑制病变部位巨噬细胞内经典炎症TNF-α通路和TLR通路来改善RA免疫微环境，实现高效协同抑制RA进程、治疗RA。
本发明采用如下技术方案：
一种共递送多核酸药物的聚合物囊泡，包括聚合物及其装载的核酸药物；所述多核酸药物包括TNF-α小干扰RNA（siTNFα）和Toll样受体（TLR）小干扰RNA（siIRF5）；所述聚合物为亲水链段-P(酯-DTC)-阳离子片段，或者所述聚合物为亲水链段-P(酯-DTC)-阳离子片段、靶向分子-亲水链段-P(酯-DTC)的混合物。
本发明公开了上述共递送多核酸药物的聚合物囊泡的制备方法，以聚合物、核酸药物为原料，组装得到共递送多核酸药物的聚合物囊泡。
本发明公开了上述共递送多核酸药物的聚合物囊泡在制备抗炎药物中的应用。优选的，抗炎中，炎症包括体内炎症、体外炎症，优选的，炎症包括风湿性关节炎、炎症性肠病、红斑狼疮，进一步优选的，炎症包括风湿性关节炎。
本发明中，多核酸药物为双核酸药物，具体为TNF-α小干扰RNA（siTNFα）和Toll样受体（TLR）小干扰RNA；优选的，双核酸药物为siTNFα和siIRF5，通过抑制病变部位巨噬细胞内经典炎症TNF-α通路和TLR通路来改善RA免疫微环境，实现高效协同抑制RA进程、治疗RA。进一步优选的，siTNFα、siIRF5的质量比为1∶（0.2～5），优选的，siTNFα、siIRF5的质量比为1∶（0.3～2.5），进一步优选的，siTNFα、siIRF5的质量比为1∶（0.5～1.5）。
本发明中，所述亲水链段-P(酯-DTC)-阳离子片段由亲水链段、疏水链段以及阳离子片段组成，靶向分子-亲水链段-P(酯-DTC)由靶向分子、亲水链段、疏水链段组成。疏水链段是酯、DTC无规共聚链段，称为P(酯-DTC)；其中酯为常规药学上可接受的酯单体、碳酸酯单体等，包括直链结构、支链结构以及环结构，比如三亚甲基碳酸酯单体TMC、丙交酯单体LA、己内酯单体CL等。
本发明中，亲水链段为聚乙二醇链段（PEG）；疏水链段的分子量为亲水链段分子量的2～10倍，优选2～6倍；PDTC链段的分子量为疏水链段总分子量的5%～30%，优选10～20%，PDTC链段是指DTC单元组成的链段。优选的，PEG的分子量为2000～12000 Da，优选的分子量为3000～8000 Da。
本发明中，阳离子片段包括精胺、聚乙烯亚胺，优选为聚乙烯亚胺。优选的，聚乙烯亚胺的分子量为亲水链段分子量的10%～30%，优选20～27%。
本发明中，所述聚合物为亲水链段-P(酯-DTC)-阳离子片段、靶向分子-亲水链段-P(酯-DTC)的混合物时，靶向分子-亲水链段-P(酯-DTC)、亲水链段-P(酯-DTC)-阳离子片段的摩尔比为1∶（5～15），优选1∶（7～10）。
本发明，靶向分子包括多肽、糖，优选的，靶向分子为甘露糖。
优选的，本发明将PEG-P(TMC-DTC)-PEI和4Man-PEG-P(TMC-DTC) 按照比例混合，加入到含核酸药物的缓冲液中自组装、自交联即可得到共递送多核酸药物的聚合物囊泡。
本发明设计制备了由四个甘露糖簇修饰的共载siTNFα和siIRF5聚合物囊泡（4Man-PS-siIT），研究了其在体外和RA小鼠体内的抗炎能力和联合靶向治疗。得到的4Man-PS-siIT粒径约为50 nm，siRNA的装载稳定高效（载药量为9.0 wt.%），在模拟炎症的巨噬细胞中能同时有效沉默TNF-α和IRF5基因，并将巨噬细胞诱导成M2型；其通过腹腔注射进入CIA小鼠体内后能有效富集到病患关节病释放siRNA。在ZIA和CIA小鼠中，4Man-PS-siIT能通过siTNFα阻断TNF-α炎性通路降低RA部位TNF-α表达，通过siIRF5抑制TLR-IRF5通路来调控RA部位炎性巨噬细胞，使其诱导为M2型，比单载囊泡显示了更显著抗炎作用和软骨和骨保护作用。体外和体内实验结果支持共载囊泡中siTNFα对siIRF5功能（复极化）的增强作用以及siIRF5导致的M1M减少作用对siTNFα功能（下调炎性蛋白）的促进作用。这一共载siRNA囊泡能把目标基因迥异的多种siRNA递送到同一目标细胞中，再利用各自的作用机制从不同途径切断致病进程，有望对其他复杂的多种通路控制的自身免疫疾病的靶向治疗有所启发。
附图说明
图1为共载siTNF-α和siIRF5的甘露糖簇修饰的囊泡4Man-PS-siIT能靶向RA炎症部位富集的炎性巨噬细胞，协同抑制RA炎症的进展。
图2为4Man-PS-siTNFα、4Man-PS-siIRF5和4Man-PS-siIT的（A）的粒径和粒径分布及在4 ℃保存14天（B）和在含10%FBS的PB中24 h的粒径分布。
图3为BMDM和4Man-PS-siTNFα、4Man-PS-siIRF5和4Man-PS-siIT（siRNA：100 nM，n= 3）孵育24 h后培养基中（A）TNF-α mRNA和（B）IRF5 mRNA的表达（相对于PBS组）。
图4为流式细胞仪检测LPS刺激的RAW264.7细胞在与4Man-PS-siTNFα、4Man-PS-siIRF5、PS-siIT和4Man-PS-siIT（siRNA：100 nM，n = 3）孵育24 h后复极化为M2M的含量（CD206+）（A）及半定量分析（B）。
图5为4Man-PS-siTNFα、4Man-PS-siIRF5或4Man-PS-siIT与巨噬细胞孵育24 h后分泌的细胞因子浓度（siRNA：100 nM）。LPS刺激的RAW264.7细胞培养基中（A）TNF-α、（B）IL-1β和（C）IL-10的浓度（n = 3）。LPS和IFN-γ共刺激的BMDM培养基中（D）IL-6和（E）IL-1β的浓度（n = 4）。
图6为双荧光标记（Cy5标记的囊泡装载Cy3标记的siNC）的PS-siRNA和4Man-PS-siRNA在CIA小鼠体内通过Cy5通道测定的（A）活体荧光成像和单爪平均荧光半定量分析以及（B）注射24 h后小鼠四肢的离体Cy5荧光图像和半定量分析（Cy5：0.3 µg/只，n = 3）。
图7为双荧光标记（Cy5标记的囊泡装载Cy3标记的siNC）的PS-siRNA和4Man-PS-siRNA在CIA小鼠体内通过Cy3通道测定的（A）在体荧光成像和平均单爪荧光半定量分析以及（C）注射24 h后小鼠四肢的离体Cy3荧光图像和半定量分析（Cy3：1 µg/只，n = 3）。
图8为4Man-PS-siTNFα、4Man-PS-siIRF5和4Man-PS-siIT（siRNA：1 mg/kg，共载囊泡中siTNFα/siIRF5 = 1/1；n = 6）腹腔注射治疗ZIA小鼠。（A）实验安排和（B）小鼠炎症膝关节宽度和围度的变化；治疗后第1天（C）、第3天（D）和第5天（E）血浆中IL-6的浓度。
图9为4Man-PS-siTNFα、4Man-PS-siIRF5、PS-siIT和4Man-PS-siIT对CIA小鼠的治疗（siRNA：1 mg/kg；共载囊泡中siTNFα/siIRF5 = 1/1；n = 8）。（A）实验安排。治疗过程中小鼠的（B）关节炎评分、（C）前爪厚度、（D）后爪厚度；及在第16天后三个相应参数（E-G）和统计学分析。数据以平均值±标准误差（SEM）表示。
图10为按图9中A治疗第16天的CIA小鼠的前爪和后爪的典型照片。
图11为按图9中A治疗第16天的小鼠主要脏器的H&E染色图。比例尺：100 µm。
图12为按照图9中A给药治疗CIA小鼠第16天RA关节的（A）TNF-α mRNA和（B）IRF-5mRNA的相对表达量（siRNA：1 mg/kg；n = 6）。
图13为按图9中A治疗CIA小鼠第16天时（A）血浆中的TNF-α和IL-6的浓度（n = 6）以及（B）RA关节中的TNF-α、IL-6和IL-10的表达（n = 4）。
图14为按图9中A治疗第16天CIA小鼠后膝关节及其滑膜放大的H&E图和膝关节及其软骨放大的番红固绿染色图（红色箭头指向免疫细胞浸润）。比例尺：200 µm。
图15为按图9中A治疗第16天后踝关节的TNF-α免疫组化图。比例尺：200 µm。
图16为按图9中A给药治疗第16天小鼠后踝关节的巨噬细胞标记物免疫荧光染色图，其中三种颜色分别代表：F4/80（绿色，巨噬细胞），iNOS（红色，M1型巨噬细胞），DAPI（蓝色，细胞核）。比例尺：50 µm。
图17为PEG-P(TMC-DTC)-PEI的合成路线图。
图18为聚合物（A）PEG-P(TMC-DTC)-CDI（400 MHz，CDCl3）和（B）PEG-P(TMC-DTC)-PEI的1H NMR谱图（400 MHz，CDCl3/CD3OD-d4（v:v = 4:1））。
图19为4Man-PEG-P(TMC-DTC)的合成路线图。
图20为聚合物4Man-PEG-P(TMC-DTC)的'HNMR 谱图(600 MHz，DMSO-d 6)。
具体实施方式
本发明设计了四个甘露糖配体簇修饰的共载双核酸药物（siTNFα和siIRF5）的囊泡（4Man-PS-siIT），通过抑制病变部位巨噬细胞内经典炎症TNF-α通路和TLR通路来改善RA免疫微环境，实现高效协同抑制RA进程、治疗RA（图1）。主要研究了4Man-PS-siIT在体外和RA小鼠体内的抗炎能力和联合靶向治疗能力，由于长期使用MTX治疗可能导致RA患者出现耐药和毒副作用的问题，本发明设计的siRNA联用的治疗方案有望能解决这部分RA患者的治疗问题。
亲水链段-P(酯-DTC)-阳离子片段、靶向分子-亲水链段-P(酯-DTC)中，亲水链段、疏水链段可以相同也可以不同，优选相同。
本发明中，siIRF5和siTNFα两者联用共递送具有协同抑制炎症的能力，设计的双硫交联的聚合物囊泡具有对siRNA稳定装载、防止突释的能力以及甘露糖簇的显著靶向性。
siIRF5（正义链序列：5'-cuGcAGAGAAuAAcccuGAdTsdT-3'、反义链序列：5'-UcAGGGUuAUUCUCUGcAGdTsdT-3'，其中小写字母为甲氧基修饰，s为硫代修饰，d为后面的碱基是DNA碱基，正义链3端用胆固醇修饰）和Cy3-siNC从吉玛基因公司采购。IRF5 mRNA的引物（序列：IRF5-F：5’-TTCTATACGAACCAGCTGCTAG-3’; IRF5-R：5’-ACAGGATGAGCTCATTGAGAAA-3’）由上海生工生物合成。siTNFα（正义链序列：5'-GUCUCAGCCUCUUCUCAUUCCUGdCdT-/ 3'、反义链序列：5'-AGCAGGAAmUGmAGmAAmGAmGGmCUmGAmGA mCmAmU-3'，其中正义链3'端胆固醇修饰；d表示后面的碱基为DNA碱基；反义链中m为后面的碱基为 2’-O-methyl修饰）和Cy5 标记的 siNC（Cy5-siNC）从吉玛基因公司采购。支化聚乙烯亚胺（PEI，M w = 1200 kg/mol，纯度≥99%，Alfa Aesar）在手套箱保存。N,N'-羰基二咪唑（CDI，纯度≥98%）购自J&K。弗氏不完全佐剂购自北京博蕾德（Chondrex，USA）。CIA模型小鼠建立所用胶原和佐剂混合液的乳化使用S10手提式高速分散器（新芝生物，宁波）。siRNA载药量通过微量分光光度计（NanoDrop One/OneC）测定。蛋白免疫印迹后凝胶用SuperSignal EC系统检测蛋白信号。本发明试剂、仪器及制备、测试方法的具体操作为常规技术。
本发明数据除特殊标注的部分外，其余呈现都用平均值±标准偏差（SD）。组间的统计学差异分析用单因素方差分析（One way ANOVA）。*p <0.05表示有显著性差异，**p <0.01和***p <0.001表示有高度显著性差异。
实施例一 含四个甘露糖的配体修饰的共载囊泡（4Man-PS-siIT）的制备
共载siIRF5和siTNF-α的囊泡4Man-PS-siIT的制备方法如下：配制4Man-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)-PEI的DMF溶液（10 mg/mL），按摩尔比为1:9混合待用。用25 µL DEPC水分别溶解 siTNFα和siIRF5（1 mg/mL），加入到400 µL的HEPES缓冲溶液（5 mM，pH：6.0）中，然后取50 µL上述聚合物溶液加入其中，磁力搅拌（280 rpm）15 min后用HEPES透析4 h、PB（pH 7.4）透析2 h，每一小时换一次透析液，得到共载囊泡4Man-PS-siIT（siTNFα/siIRF5 = 1/1）。单载囊泡4Man-PS-siTNFα和4Man-PS-siIRF5的制备是按照上述方法但只加一种siRNA；无靶囊泡PS-siIT的制备则是聚合物中不加4Man-PEG-P(TMC-DTC)。研究生物分布用的荧光标记的囊泡由Cy5标记的聚合物和Cy3标记siRNA组成，即将聚合物为Cy5标记PEG-P(TMC-DTC)-Cy5、4Man-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)-PEI按1/10/89混合，加入到含5 µg的Cy3-siNC的HEPES中制备得到。荧光标记的PS-siRNA是PEG-P(TMC-DTC)-Cy5和PEG-P(TMC-DTC)-PEI按1/99混合后加入到含5 µg的Cy3-siNC的HEPES中制备。囊泡的粒径和粒径分布以及长期稳定性和在FBS中的稳定性用DLS测定，siTNFα和siIRF5的载药量和包封率通过Nano-drop测定。
得到的囊泡通过DLS测得粒径（Size）和分布（PDI），其中4Man-PS-siTNFα的粒径为54±3 nm，PDI为0.18±0.04； 4Man-PS-siIRF5为59±2 nm，PDI为0.12±0.02；共载非靶囊泡PS-siIT为60±1 nm，PDI为0.15±0.01；共载靶向囊泡4Man-PS-siIT为50±1 nm，PDI为0.10±0.02（图2中A）。
通过NanoDrop可测得囊泡中siRNA载药量为9.0 wt%（包封率可达90%），siTNFα是25个碱基对，siIRF5是21个碱基对，二者皆可实现接近投料比的高效装载。此外，通过监测共载囊泡在4 ℃冰箱储存14天、在含10% FBS的PB溶液中的粒径变化，发现其粒径均基本不变，表现出较好的稳定性（图2中B&C）。
实施例二 4Man-PS-siIT的体外基因沉默实验
BMDM（1×106个细胞/孔）在12孔板培养24 h。加入PBS、4Man-PS-siTNFα、4Man-PS-siIRF5或4Man-PS-siIT（siRNA：100 nM）孵育（n = 4）。设置不加任何刺激试剂组作为对照（Control）。24 h后移去培养基，加入LPS（100 ng/mL）和IFN-γ（20 ng/mL）孵育4 h。随后，取上层培养基，用PBS洗一次后加入TRIzol裂解细胞，再向裂解液中加入2/5体积的无核酸酶的二次水，离心后取出水相，再加入等体积异丙醇混合均匀，室温离心后弃去上清，再用75%乙醇洗两次后，按照发明人之前公开了的现有常规方法用RT-PCR测定TNF-α mRNA和IRF5 mRNA的表达并相对PBS组做归一化处理。
探索了囊泡纳米药物是否能沉默原代巨噬细胞BMDM中特定的靶基因，用RT-PCR技术测定其中TNF-α和IRF5 mRNA相对表达量。BMDM是预先用LPS和IFN-γ刺激成M1型为主来模拟炎症微环境，然后加入囊泡样品孵育。图3中A显示，4Man-PS-siIRF5基本不沉默TNF-αmRNA，4Man-PS-siTNFα组则具有显著降低的TNF-α mRNA（***p），沉默效率约为60%；而共载囊泡4Man-PS-siIT的TNF-α mRNA的沉默效率与之相比有下降，但无显著性差异。对于IRF5mRNA的沉默（图3中B），4Man-PS-siTNFα基本不能沉默IRF5 mRNA，但4Man-PS-siIRF5和4Man-PS- siIT均可明显下调IRF5 mRNA的表达（**p）。该结果表明，4Man修饰的囊泡能把siRNA有效递送到免疫细胞BMDM中，并造成靶基因中TNF-α和IRF5 mRNA表达的明显下调。文献报道，M1型巨噬细胞有显著上调的IRF5表达的特征。
实施例三 4Man-PS-siIT的体外抗炎实验
RAW 264.7细胞（5×105个细胞/孔）铺在12孔板中过夜贴壁。加入PBS、4Man-PS-siTNFα、4Man-PS-siIRF5或4Man-PS-siIT（siRNA：100 nM）孵育（n = 3）。设置不加任何刺激试剂组作为对照（Control）。24 h后移去培养基，加入LPS（100 ng/mL）孵育4 h。随后，收集培养基，用ELISA试剂盒测定其中IL-1β、IL-6和IL-10的浓度。另外，细胞用PBS清洗后，用细胞刮刀刮下来收集在EP管中，用PBS洗两次后，加入APC-anti-CD206抗体4 ℃孵育30分钟后，再用PBS洗三次后上流式细胞仪测定，再用FlowJo V10分析其细胞表型。
BMDM（1×106个细胞/孔）铺在12孔板培养24 h。加入PBS、4Man-PS-siTNFα、4Man-PS-siIRF5或4Man-PS-siIT（siRNA：100 nM）孵育（n = 4）。设置不加任何刺激试剂组作为对照（Control）。24 h后移去培养基，加入LPS （100 ng/mL）和IFN-γ（20 ng/mL）孵育4 h。随后，取上层培养基用ELISA测定IL-6和IL-1β的浓度。
向LPS刺激的RAW 264.7细胞中分别加入4Man-PS-siTNFα、4Man-PS-siIRF5、PS-siIT或4Man-PS-siIT孵育，通过流式细胞仪测定巨噬细胞的复极化情况。结果显示，所有组别RAW 264.7细胞中促炎性M1M的比例都减少，抑炎性M2M的比例则显著增加（***p）。其中4Man-PS-siIRF5在M2M比例增加（48.8%）的能力方面强于4Man-PS-siTNFα（39.5%），而令人惊喜的是，4Man-PS-siIT处理则进一步更显著地把M2M比例增加到96.5%（***p；图4），显示了明显的协同效果。通过聚合物囊泡把siTNFα和siIRF5共递送到同一个巨噬细胞中，可以同时抑制I型干扰素基因和TNF-α信号通路，协同性抑制TNF-α的形成，从上游抑制促炎型NF-κB信号通路的表达，从而显著增加巨噬细胞向M2型的转变，使M2M比例增加，从而达到抑炎和骨保护的效果。
LPS刺激的RAW 264.7细胞在加入4Man-PS-siTNFα、4Man-PS-siIRF5或4Man-PS-siIT后，分泌的促炎性细胞因子IL-6和IL-1β均明显下降（图5中A&B）。尤其是4Man-PS-siIT处理分别显著下调IL-6和IL-1β到2066和 5838 pg/mL。4Man-PS-siIT处理的BMDM下调IL6和IL-1β分泌的情况更显著（图5中D&E）。作为M2型巨噬细胞的一个典型标志物，IL-10的分泌也在4Man-PS-siTNFα和4Man-PS-siIRF5刺激下和PBS组相比明显提高（图5中C），而4Man-PS-siIT则进一步使IL-10的分泌高达261 pg/mL（**p）。
IL-1β和IL-6是M1型巨噬细胞的主要标记物而IL-10是M2M的标志物，IL-6和IL-1β的显著下降和IL-10的显著提高表明，4Man-PS-siIT在巨噬细胞中比单载囊泡兼具两者的抗RA作用，从而更有效地调控巨噬细胞表型，抑制分泌促炎细胞因子和促进分泌抑炎细胞因子。众所周知，TNF-α为炎症反应的主要调节因子，参与一些炎症和自免疫性疾病的发病机制；siTNFα是一种TNF-α小干扰RNA，可以在基因水平上直接沉默TNF-α。而IRF5则将巨噬细胞从M1型复极化到M2型，M1M是分泌TNF-α的最重要细胞。因此，共递送两种siRNA到同一巨噬细胞能协同性地降低TNF-α的分泌，协同降低炎症。
实施例四 4Man-PS-siIT在CIA模型小鼠体内的生物分布实验
利用CIA小鼠模型，为了应用近红外活体成像体系来探究共载囊泡和siRNA在小鼠体内的分布，采用双荧光标记的囊泡PS-siRNA和4Man-PS-siRNA，即Cy5标记的囊泡和Cy3标记siRNA。
CIA小鼠模型的建立为常规技术，简言之，一次免疫采用II型胶原和弗氏完全佐剂按1/1（v/v）混合后，用S10手提式高速分散器乳化5 min直到乳液滴在水中不会分散，将该乳液（1 mL）在小鼠尾根部的三分之一处左侧避开尾静脉皮下注射。21天后实施二次加强免疫，采用II型胶原和弗氏不完全佐剂的1/1（v/v）混合乳液（1 mL），在小鼠尾根部三分之一处右侧皮下注射。为研究共载囊泡在小鼠体内的分布，待到二次免疫小鼠四肢发病后，通过腹腔注射200 µL的Cy5/Cy3双荧光标记的囊泡（Cy5：0.3 µg/只，Cy3：1 µg/只，n = 3），然后在特定时间点用IVIS活体成像仪，分别用Cy5通道和Cy3通道扫描小鼠全身，获得Cy5和Cy3的在体荧光图像。在注射24 h后处死小鼠，取出四肢，分别用Cy5通道和Cy3通道进行离体荧光成像。荧光图像用Living image软件进行半定量分析。
分别用Cy5标记聚合物和用Cy3标记siRNA，制备了Cy5标记的囊泡装载Cy3标记的siNC，即PS-siRNA和4Man-PS-siRNA，以便用于近红外活体成像系统跟踪二者的分布以及在患病关节的富集。待CIA小鼠四肢显著发病后，该囊泡通过腹腔注射到小鼠体内（Cy5：0.3 µg/只，Cy3：1 µg/只，n = 3）。近红外活体成像结果显示，在注射2 h后，两组小鼠四肢尚未出现明显富集，4 h后，4Man-PS-siRNA在四肢关节出现明显富集，到12 h富集显著提高，达到峰值，直到24 h，其荧光强度维持在很高的水平。相比之下，PS-siRNA组在四肢的富集量明显更低，尤其是在12和24 h（***p，图6中A）。
注射后24 h牺牲小鼠，取四肢用于Cy5离体荧光成像以及定量分析。结果显示，4Man-PS-siRNA组三只小鼠的四肢的平均荧光强度明显高于PS-siRNA组（*p，图6中B），该结果和活体成像中囊泡的分布结果相吻合。
用活体荧光成像Cy3通道对siRNA药物的Cy3荧光在CIA小鼠中的生物分布进行了监测。结果显示，4Man-PS-siRNA组的siRNA在4 h开始在小鼠RA部位出现富集，4到24 h的siRNA的富集量都明显高于PS-siRNA组，24 h依然维持较高（图7中A）。24 h离体成像结果也表明，4Man-PS-siRNA组在四肢中的siRNA富集量明显高于PS-siRNA组（*p，图7中B）。该结果表明，siRNA能被表面为甘露糖簇的囊泡靶向递送到CIA小鼠的病变关节。此外，siRNA和囊泡的分布并没有完全同步，2 h siRNA在腹股沟淋巴结富集，而囊泡在12 h出现在腹股沟淋巴结的富集，腹腔大量的巨噬细胞很快内吞这些囊泡，囊泡和siRNA会和巨噬细胞一起分布到淋巴结，siRNA在细胞中快速释放，且Cy3给药量也明显高于Cy5，因此Cy3荧光强度显得很高。后期这样的巨噬细胞像炎症四肢聚集，起到抗炎作用。
实施例五 4Man-PS-siIT对ZIA模型小鼠初步治疗实验
ZIA小鼠模型的建立方法为常规技术，参见CN116327700A。在模型建立24 h后，第一次给药记为第0天，在第0天和第2天分别通过腹腔注射PBS、4Man-PS-siTNFα、4Man-PS-siIRF5或4Man-PS-siIT（siRNA：1 mg/kg，共载囊泡中siTNFα/siIRF5 = 1/1，n = 6）。每天用游标卡尺监测小鼠膝关节的宽度和和长度，膝关节围度计算参见CN116327700A。分别在给药后第1、3、5天取血浆用ELISA测定其中IL-6的浓度（n = 6）。
用ZIA小鼠研究，将其分为四组，通过腹腔注射PBS、4Man-PS-siTNFα、4Man-PS-siIRF5或4Man-PS-siIT（siRNA：1 mg/kg），监测小鼠的膝关节宽度、围度以及血浆中IL-6的浓度（图8中A）。结果显示，小鼠膝关节宽度和围度在治疗后明显减小，膝关节的肿胀得到缓解，其中4Man-PS-siIT组小鼠膝关节的肿胀在第四天时消退最显著，4Man-PS-siIRF5次之（图8中B）。血浆中IL-6浓度在注射第一天各组均没有明显差别（图8中C），而在第三天、第五天时4Man-PS-siTNFα、4Man-PS-siIRF5和4Man-PS-siIT的治疗均能下调IL-6，尤其是和4Man-PS-siTNFα组相比，4Man-PS-siIRF5（*p）和4Man-PS-siIT（***p）组IL-6浓度降低最显著（10 pg/mL，图8中D,E），显示了二者在体内的潜在的协同效应。该结果说明，siTNFα与siIRF5共载囊泡比单载囊泡在ZIA模型治疗中能更显著地降低炎症，有效治疗RA。
实施例六 4Man-PS-siIT对CIA模型小鼠的治疗实验和疗效评价
为了系统地探究双核酸共载囊泡对于RA的治疗效果，选择了CIA模型作为研究的RA模型。胶原诱导的类风关小鼠CIA模型因其与人类的类风湿关节炎具有类似的免疫学和病理学特征，而常常作为RA动物模型，CIA模型建立方法同实施例四。CIA模型小鼠的评分按单爪评分、再全部加和来计算。单爪评分标准如下：正常：0分，脚掌变红：1分，脚掌红肿并无脚趾肿胀：2分，脚掌红肿并伴随1-3个脚趾肿胀：3分，脚掌红肿并伴随4-5 个脚趾肿胀或整个爪子变形：4分。
为了更系统和全面地探究siTNFα和siIRF5共载囊泡对于CIA小鼠的治疗效果，在二次免疫的3-7天后，按标准进行关节炎评分，选择关节炎评分在2-3分的小鼠分组（第0天），通过腹腔注射PBS、4Man-PS-siTNFα、4Man-PS-siIRF5或4Man-PS-siIT（siRNA：1 mg/kg，共载囊泡中siTNFα/siIRF5 = 1/1，n = 8）。每4天注射一针，一共注射4针。记录小鼠体重、关节炎评分，用游标卡尺测量小鼠前爪和后爪脚掌的厚度（n = 8）。
进一步研究了4Man-PS-siIT对CIA小鼠的疗效，并探索了药物联用机制。在小鼠关节炎评分为2-3分时开始通过腹腔注射给药（记为第0天），在第0、4、8、12天注射PBS、4Man-PS-siTNFα、4Man-PS-siIRF5、PS-siIT或是4Man-PS-siIT（siRNA：1 mg/kg），第16天处死小鼠（图9中A）。通过跟踪关节炎评分、前后爪掌厚、细胞因子的分泌、mRNA的沉默、骨形态及关节腔滑膜处免疫微环境来综合评估治疗效果。关节炎评分结果显示，虽然4Man-PS-siIRF5在体外具有较好的抗炎作用，但该组小鼠评分增长迅速，与PBS组很接近（图9中B），前后爪炎症变化不大，表明单载siIRF5囊泡无法有效抑制CIA小鼠的RA进程。4Man-PS-siTNF组和PS-siIT组小鼠的RA评分比前面两组有所降低，前后爪肿胀有缓解，显示了有限的抑炎作用（图9中C,D）。而4Man-PS-siIT治疗可以极大程度抑制关节炎评分的增长（**p,图9中E）和RA进展，减轻前后爪的肿胀到和健康小鼠接近的水平（**p, ***p，图9中F,G）。第16天时小鼠后肢和前肢照片可见，4Man-PS-siIRF5和PS-siIL组和PBS组小鼠的前后爪垫都有相近的明显红肿变形，4Man-PS-siTNFα组的红肿更轻，而4Man-PS-siIT组无红肿情况，与健康组相近（图10）。这些实验结果表明，共载囊泡对于CIA模型的治疗在降低炎症、抑制关节红肿具有优异效果。
第16天时处死小鼠，收集血浆，将其四肢拍照记录肿胀情况。每组随机取1只小鼠的主要脏器浸泡在4%多聚甲醛中固定用于切片H&E染色。每组取3只小鼠的6根后腿骨，剔除肌肉组织后固定；将其中三根用EDTA脱钙，将膝关节和踝关节部位包埋、切片，其中膝关节部位切片用于H&E染色和番红固绿染色，踝关节部位切片用TNF-α免疫组化染色和F4/80和iNOS免疫荧光染色。染色图用光学显微镜观察来分析滑膜软骨部位的炎性细胞的浸润、软骨的完整性和厚度变化（n = 3）、踝关节微环境中TNF-α的表达和巨噬细胞表型及数量。结果显示，除了小鼠由于年龄较大有脂肪肝的情况发生，其余心肝脾肺肾主要结构完整没有损伤，表明腹腔注射4Man-PS-siIT治疗RA小鼠对其主要脏器没有明显毒性（图11）。
每组取四只小鼠踝关节组织用PBS浸泡匀浆后，离心取上清，用ELISA试剂检测其中和血浆中的细胞因子浓度。再用BCA试剂测定上清中蛋白质浓度，以进行细胞因子浓度的归一化，得到单位蛋白质量的细胞因子质量（pg/mg protein）。每组取六只小鼠的踝关节组织用TRIzol提取液提取滑膜软骨的总RNA，用RT-PCR技术测定关节中TNF-α mRNA和IRF5mRNA的水平（n = 6）。PCR的测试方法为现有技术，参见CN116327700A。
将膝关节和踝关节研磨成浆后，通过检测TNF-α mRNA和IRF5 mRNA的表达来研究囊泡药物的体内转染能力。RT-PCR结果表明，PS-siIT和4Man-PS-siIT组比4Man-PS-siIRF5和PBS组的TNF-α mRNA表达明显降低（***p），而4Man-PS-siTNFα的TNF-α沉默效果最佳，与健康小鼠组接近（图12中A）。有意思的是，4Man-PS-siIRF5能在体内显著沉默IRF5 mRNA，但尽管siIRF5的剂量只有一半，4Man-PS-siIT却能进一步增加IRF5 mRNA的沉默效率（图12中B），显示了siTNFα对siIRF5功能的增强作用。这些结果印证了甘露糖簇修饰的共载囊泡能在小鼠体内靶向RA部位释放siIRF5和siTNFα，比单载囊泡更有效降低炎性相关基因的表达，起到更好的治疗效果。
在第16天测定的小鼠血浆中炎性细胞因子TNF-α和IL-6的浓度结果显示，和PBS组小鼠相比，除4Man-PS-siIRF5 组外，其他组TNF-α都呈现下降态势（图13中A），这是由于这些组中都含有的siTNFα能下调TNF-α通路[33]。所有组的IL-6均比PBS组有显著下降（图13中B）。膝关节部位提取物中测定的TNF-α浓度在4Man-PS-siIT组中最低（图13中C），而IL-6浓度在4Man-PS-siIT组中也很低，但是各组间没有显著性差异（图13中D）。此外，4Man-PS-siIT组膝关节中产生的具有骨保护作用的IL-10显著高于PBS组，但和其他组也没有显著性差异（图13中E）。该结果证实，4Man-PS-siIT能降低促炎细胞因子的分泌，调控炎症微环境。
骨组织和软骨组织的破坏是RA的重要临床表现。为了评估4Man-PS-siIT治疗对CIA小鼠关节骨组织和软骨组织的影响，取治疗后小鼠的膝关节制备切片，通过用H&E、番红固绿染色拍照，来研究免疫细胞在其中的浸润和骨组织/软骨组织的破坏。H&E染色图片显示，PBS组膝关节滑膜间质部位浸润大量免疫细胞（图中虚线方框内部分为滑膜部位，右图为其放大图），4Man-PS-siTNFα、4Man-PS-siIRF5和PS-siIT组小鼠的膝关节的炎症情况依然不乐观，炎症细胞仍大量浸润，关节软骨组织的损伤较大。而4Man-PS-siIT组的滑膜光滑、完整，没有炎症细胞浸润（图14），其形态与健康组接近。番红固绿染色图显示，PBS组关节的软骨中有明显的糖胺聚糖（染成红色部分为软骨中带阴离子的糖蛋白）丢失，骨关节面出现损伤呈不完整的状态，是相当严重的关节软骨退化和损伤。4Man-PS-siTNFα、4Man-PS-siIRF5和PS-siIT组的关节虽然表面依然光滑，但也呈现软骨丢失现象。只有4Man-PS-siIT组小鼠关节显示了光滑和完整的软骨，保持了其中糖胺聚糖的含量，与健康小鼠情况很接近。
为探究共载囊泡治疗对踝关节的炎症微环境的调节能力，取踝关节切片通过TNF-α免疫组化染色以及F4/80、iNOS免疫荧光染色来拍照研究。在免疫组化图中，蓝色代表细胞核，褐色代表TNF-α阳性。40倍放大的图片显示，PBS组关节完整性不好，滑膜和关节间质里充斥大量的免疫细胞和TNF-α阳性区，4Man-PS-siIRF5组的滑膜间质处TNF-α阳性区依然很大。4Man-PS-siTNFα组和PS-siIT组的褐色TNF-α阳性区明显要小很多，而4Man-PS-siIT组与健康组相类似，只有非常少的规则排列的TNF-α阳性区（图15）。该结果和mRNA沉默的结果吻合（图12中A）。虚线方框部分放大的软骨滑膜间质处的图片显示，TNF-α的分布在PBS组、两个单载组和无靶组的较类似，而4Man-PS-siIT组具有显著降低的TNF-α表达和间质处免疫细胞的浸润，极大地改善RA的炎症微环境，证实了4Man-PS-siIT靶向递送的两种siRNA具有明显的协同抗RA效应。
文献报道，F4/80是巨噬细胞的标志物，CD163和iNOS分别是M2型和M1型巨噬细胞的标志物，因此可以用其免疫荧光标记炎症微环境中巨噬细胞的表型。用F4/80染所有巨噬细胞（绿色）、iNOS染M1M（红色）、DAPI染细胞核（蓝色）。图16后踝关节切片的CLSM图像显示，PBS组的细胞间质中有绿色荧光和较高占比的iNOS红色荧光，说明该组炎性M1M占主导。4Man-PS-siTNFα、4Man-PS-siIRF5和PS-siIT组切片中有大量iNOS红色和F4/80绿色共定位的M1M巨噬细胞。可喜的是，4Man-PS-siIT组切片中染M1M的iNOS红色荧光非常少，而F4/80荧光较强，证实了该靶向囊泡共递送的两种siRNA能凭借siTNF-α对于促炎性蛋白的抑制和siIRF5对微环境的调控使RA关节M1M减少。这样就能更有效地控制炎症，更好地保护软骨的结构和厚度以及保持和修复骨结构。
制备例 聚合物制备和表征
与发明人之前提交的申请相同，PEG-P(TMC-DTC)-PEI（M n = 5.0-(14.9-2.2)-1.2kg/mol）的合成分为两步，第一步用CDI活化PEG-P(TMC-DTC) （M n = 5.0-(14.9-2.2) kg/mol）的末端羟基得到PEG-P(TMC-DTC)-CDI，再与支化PEI（M w = 1200 kg/mol）酰胺化反应得到PEG-P(TMC-DTC)-PEI（图17）。简述如下：首先PEG-P(TMC-DTC)（1.5 g，0.064 mmol）用无水DCM溶解成400 mg/mL溶液，3.75 mL该溶液加入0.66 mL的CDI（33.1 mg，0.21 mmol）溶液中，磁力搅拌30 ℃反应4 h，用冷无水乙醚沉淀3次、抽滤、真空干燥后得到PEG-P(DTC-TMC)-CDI，产率89.2%。氢核磁谱图（CDCl3，400 MHz，ppm）：δ 2.05（d, -OCOCH2C H 2 CH2CO-）、3.04（f，-C(C H 2 SSC H 2 )C-）、3.38（a，C H 3 O-CH2CH2-OCH2CH2）、3.64（b，-C H 2 C H 2 O-）、4.23（c，-OCOC H 2 CH2CH2O-）、4.25（e，-OCOC H 2 (CH2SSCH2)C H 2 O-），以及δ 7.08（i，-CHC H NCH-）、7.42（h，-CHNC H CH-）和8.14（g，-OCNC H NCH-）。根据3.38处PEG特征峰与8.14处CDI特征峰的积分比值可计算出该聚合物中CDI的功能化度为98%。
接着，在氮气保护的配有滴液漏斗的两颈瓶中加入PEI（300 mg，0.5 mmol）和600µL DCM，溶解后移入在冰浴中。将溶于6 mL无水DCM的新制备的PEG-P(DTC-TMC)-CDI（1.1g，0.05 mmol）装入滴液漏斗，在持续搅拌下逐滴加入到PEI溶液中，30分钟滴完后移到30℃油浴反应4 h后，用乙醚与乙醇（v/v = 3/1）混合溶剂沉淀3次、抽滤、真空干燥48 h，得到PEG-P(TMC-DTC)-PEI。产率70.1%。氢核磁谱图（CDCl3/CD3OD-d 4，400 MHz，ppm）：δ 2.06（d，-OCOCH2C H 2 CH2CO-）、3.03（f，-C(C H 2 SSC H 2 )C-）、3.36（a，C H 3 O-CH2CH2-OCH2CH2）、3.66（b，-C H 2 C H 2 O-）、4.21（c，-OCOC H 2 CH2CH2O-）、4.25（e，-OCOC H 2 (CH2SSCH2)C H 2 O-）及2.49-2.94（PEI）。根据PEI和PEG特征峰的积分比值以及CDI特征峰消失，可计算PEI在聚合物上的功能化度约为95%，聚合物的分子量为M n = 5.0-(14.9-2.2)-1.2 kg/mol（图18）。
含四个甘露糖的配体（4Man）修饰的聚合物按照两步法合成。以合成4Man-PEG-P(TMC-DTC)为例，参见图19，首先，将1mL 溶有 Ma-PEG-P(TMC-DTC)（158 mg；0.0064 mmol）的DMSO溶液滴加入搅拌的Ac-CGGEGEGE（10mg；0.013 mmol）的DMSO溶液中，室温搅拌反应2h。然后反应液在DMSO中透析16 h、DCM 中透析8 h，旋蒸浓缩后在冰乙醚沉淀、抽滤、真空干燥，得到多肽Ac-CGGEGEGE修饰的聚合物；然后将该聚合物（140mg；5.75 μmol）溶解在12mLDMSO中，加入NHS（53mg，0.046mmol）和DCC（9.5mg:0.046 mmol)，在室温反应12h来活化羧基；之后在搅拌下将其滴加入三乙胺脱过盐的甘露糖(102mg)中；反应过夜后，将反应液在DMSO 中透析、DCM 中透析，浓缩后在无水冰乙醚中沉淀、抽真空干燥，得到含四个甘露糖的配体修饰的聚合物 4Man-PEG-P(TMC-DTC)。参见图20，甘露糖的特征峰在δ 4.7-4.9ppm，根据该特征峰积分面积和PEG主链亚甲基特征峰 δ 3.62 ppm积分面积的比值，计算出甘露糖的功能化度 >90%，即得到每条链是有四个甘露糖的4Man-PEG-P(TMC-DTC)。
本发明设计制备了由四个甘露糖簇修饰的共载siTNFα和siIRF5聚合物囊泡（4Man-PS-siIT），研究了其在体外和RA小鼠体内的抗炎能力和联合靶向治疗。得到的4Man-PS-siIT粒径约为50 nm，siRNA的装载稳定高效（载药量为9.0 wt.%），在模拟炎症的巨噬细胞中能同时有效沉默TNF-α和IRF5基因，并将巨噬细胞诱导成M2型；其通过腹腔注射进入CIA小鼠体内后能有效富集到病患关节病释放siRNA。在ZIA和CIA小鼠中，4Man-PS-siIT能通过siTNFα阻断TNF-α炎性通路降低RA部位TNF-α表达，通过siIRF5抑制TLR-IRF5通路来调控RA部位炎性巨噬细胞，使其诱导为M2型，比单载囊泡显示了更显著抗炎作用和软骨和骨保护作用。体外和体内实验结果支持共载囊泡中siTNFα对siIRF5功能（复极化）的增强作用以及siIRF5导致的M1M减少作用对siTNFα功能（下调炎性蛋白）的促进作用。这一共载siRNA囊泡能把目标基因迥异的多种siRNA递送到同一目标细胞中，再利用各自的作用机制从不同途径切断致病进程，有望对其他复杂的多种通路控制的自身免疫疾病的靶向治疗有所启发。
Claims (10)
1.一种共递送多核酸药物的聚合物囊泡，包括聚合物及其装载的核酸药物，其特征在于，所述多核酸药物包括TNF-α小干扰RNA和Toll样受体小干扰RNA；所述聚合物为亲水链段-P(酯-DTC)-阳离子片段，或者所述聚合物为亲水链段-P(酯-DTC)-阳离子片段、靶向分子-亲水链段-P(酯-DTC)的混合物。
2.根据权利要求1所述共递送多核酸药物的聚合物囊泡，其特征在于，多核酸药物为双核酸药物。
3.根据权利要求2所述共递送多核酸药物的聚合物囊泡，其特征在于，双核酸药物为TNF-α小干扰RNA和Toll样受体小干扰RNA。
4.根据权利要求1所述共递送多核酸药物的聚合物囊泡，其特征在于，酯为常规药学上可接受的酯单体或者碳酸酯单体；阳离子片段包括精胺、聚乙烯亚胺；亲水链段为聚乙二醇链段；靶向分子包括多肽、糖。
5.根据权利要求1所述共递送多核酸药物的聚合物囊泡，其特征在于，疏水链段的分子量为亲水链段分子量的2～10倍；PDTC链段的分子量为疏水链段总分子量的5%～30%。
6.权利要求1所述共递送多核酸药物的聚合物囊泡在制备抗炎药物中的应用。
7.权利要求1所述共递送多核酸药物的聚合物囊泡在制备体内炎症和/或体外炎症治疗药物中的应用。
8.权利要求1所述共递送多核酸药物的聚合物囊泡在制备关节炎治疗药物中的应用。
9.权利要求1所述共递送多核酸药物的聚合物囊泡的制备方法，以聚合物、核酸药物为原料，组装得到共递送多核酸药物的聚合物囊泡。
10. TNF-α小干扰RNA和Toll样受体小干扰RNA在制备治疗关节炎的药物中的应用。
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