CN116370633A - 一种包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂及其制备方法与制备治疗心肌梗死药物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了一种包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂，纳米脂质制剂为核壳结构，核壳结构以磷脂脂质体膜层为外壳，以外壳包载的全氟己烷和抗氧化剂为内核；磷脂脂质体膜层由氢化卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇2000和胆固醇制成的。本发明公开了所述的包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂在制备治疗心肌梗死药物中的应用。本发明纳米脂质制剂具有合适的粒径，可以被动靶向并富集到心肌梗死部位；纳米脂质制剂稳定，包封率高，给药方式简单；脂质制剂被心肌细胞摄取后，释放氧气和抗氧化剂，可以缓解心肌缺血部位的乏氧情况，同时减少ROS的损伤，两者发挥协同作用，提高缺血心肌细胞成活率，提高心功能。

Description

一种包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂及其制备方法 与制备治疗心肌梗死药物的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂及其制备方法与制备治疗心肌梗死药物的应用。
背景技术
急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI)是一种严重的缺血性心脏病，具有极高的致病率和致死率，且发病人数呈逐年增加的趋势。其发病机理主要是冠状动脉病变、堵塞导致血流急剧减少或中断，导致心肌出现严重而持久的急性缺血缺氧，最终造成心肌不可逆的损伤。心肌缺血缺氧后ATP快速消耗，在数秒内收缩功能被抑制，几分钟内可见早期心肌细胞超微结构改变，随着缺血时间延长，心内膜下区心肌细胞凋亡和坏死数量增加。目前，冠状动脉搭桥手术和经皮冠状动脉介入治疗等再灌注干预是标准的临床治疗方法。而当通过再灌注方法治疗恢复心肌血流时，长时间处于缺血状态的心肌会产生氧化应激异常，灌注瞬间爆发的大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS)会损伤线粒体并使心肌细胞凋亡，导致更严重的心肌缺血再灌注损伤。由于成熟的心肌细胞属于高度分化的终末细胞，再灌注损伤会永久损害心脏功能。因此寻找新的策略减少心肌细胞的死亡和心功能损伤变得尤为重要。
氧气疗法是治疗缺血性疾病的常规治疗手段之一，氧被认为可以增加缺血心肌的供氧量，从而改善心脏代谢，提高动脉血氧张力，从而减少心肌细胞凋亡和梗死面积。然而，吸入式供氧缺乏靶向性，会导致全身血氧浓度升高，刺激血管内皮细胞产生更多ROS，进一步加重梗死部位损伤。全氟己烷(Perfluorohexane,PFH)是一种短链全氟碳化合物，具有生物惰性和化学稳定性的特性。PFH对氧气有很高的氧键合能力，大约是水溶解氧气的20倍，能实现氧气的靶向递送。目前，PFH常被研究用来作为光动力疗法中的氧气供体以达到抗肿瘤和抗菌的作用，很少用于治疗心肌梗死。如果能通过对缺血心肌实现靶向供氧，则能减少氧气疗法副作用，缓解心肌缺氧，恢复能力代谢。心肌细胞缺血缺氧后产生过量的ROS会导致心肌顿抑、心肌细胞核和线粒体DNA损伤，细胞内蛋白质变性、脂质过氧化、炎症反应。因此，减轻受损心肌部位的氧化应激有利于提高心肌细胞存活和恢复心功能。若能将携氧PFH和抗氧化剂联合给药，一方面可以缓解缺血心肌乏氧微环境和减轻氧化应激，另一方面抗氧化剂可以消除缺血部位产生的ROS。
纳米递送系统在药物的靶向递送领域有着广泛的研究。心肌梗死后，血管内皮细胞紊乱，通透性增加，使纳米材料可通过增强渗透滞留(Enhanced permibility andretention,EPR)效应被动靶向梗死的心肌。脂质体通常由磷脂、胆固醇、磷脂衍生物等在水相中组装成的类似细胞膜的双分子层结构，因其制备简单、生物相容性良好，被作用重要的纳米载药系统广泛用于癌症治疗。
发明内容
本发明的目的是提供一种包载携氧PFH和抗氧化剂的纳米脂质制剂，该纳米脂质制剂采用薄膜分散法制备而成，制备方法简单、生物相容性好，向受损心肌细胞输送氧气和抗氧化性药物，有助于促进心肌细胞的恢复，提高心肌梗死的治疗效果。
为了实现上述的发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂，所述的纳米脂质制剂为核壳结构，核壳结构以磷脂脂质体膜层为外壳，以外壳包载的全氟己烷和抗氧化剂为内核；所述的磷脂脂质体膜层由氢化卵磷脂(HSPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和胆固醇(Cho)制成的。
所述的氢化卵磷脂选自氢化大豆卵磷脂。
所述的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(延长血液循环的脂材)选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000-马来酰亚胺中的任意一种或多种。
所述的氢化卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇的摩尔比为65:(4～8):(27～31)，优选为13:1:6。
氢化卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇的总质量与全氟己烷的质量之比为1:6～1:20，优选为1:20。
所述的抗氧化剂选自白藜芦醇、紫檀芪、槲皮素、叶黄素等中的任意一种。
氢化卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇的总质量与抗氧化剂的物质的量之比≤25:0.002mg/mmol，优选为25:0.002mg/mmol。
具体的，所述的抗氧化剂为白藜芦醇时，氢化卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇的总质量与抗氧化剂的物质的量之比可以为25:0.002mg/mmol。
本发明纳米脂质制剂负载携氧全氟己烷和抗氧化剂，所述的包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂的粒径为50～300nm，优选为110～130nm。该纳米脂质制剂可以被动靶向富集到心肌梗死部位释放氧气和药物。
本发明的另一个目的是提供一种包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)、将氢化卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000溶于有机溶剂形成脂质溶液，将抗氧化剂溶于甲醇形成溶液；
步骤(2)、将脂质溶液和抗氧化剂溶液混合，通过旋蒸去除溶剂，得到脂质薄膜；
步骤(3)、加入纯水，通过超声水合得到粗脂质体，再加入全氟己烷，通过超声波细胞破碎仪超声得到均一的纳米脂质制剂。
步骤(1)中，所述的有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷中的一种。
有机溶剂和甲醇的用量关系对脂质体的粒径没有显著影响，一般的，所述的有机溶剂和甲醇的体积比为8:1～10:1，优选为10:1。
步骤(2)中，旋蒸的温度为37～40℃，旋蒸的时间为5～10min。
步骤(3)中，水合时，氢化卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇的总质量与纯水的体积之比为25mg:2～8mL，优选为25mg:2.7mL。
超声波细胞破碎仪的超声功率为350W，超声的时间为2～8min。
本发明的另一个目的是提供所述的包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂在制备治疗心肌梗死药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明纳米脂质制剂具有合适的粒径，可以被动靶向并富集到心肌梗死部位；该纳米脂质制剂稳定，包封率高，给药方式简单；脂质制剂被心肌细胞摄取后，释放氧气和抗氧化剂，可以缓解心肌缺血部位的乏氧情况同时减少ROS的损伤，两者发挥协同作用，提高缺血心肌细胞成活率，提高心功能。
附图说明
图1为包载全氟己烷和白藜芦醇的纳米脂质制剂的制备流程图。
图2为不同超声功率下制备的纳米脂质制剂的粒径。
图3为水合时不同纯水用量下制备的纳米脂质制剂的粒径。
图4为不同全氟己烷用量下制备的纳米脂质制剂的粒径。
图5为氢化卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇用量比对纳米脂质制剂粒径的影响。
图6为实施例5制备的纳米脂质制剂Lip(PFH,Res)的粒径图(a)和稳定性图(b)。
图7为对比例3制备的Lip(PFH,Res)-d1的粒径图(a)和在心肌梗死部位的被动靶向的能力(b)。
图8为实施例5制备的纳米脂质制剂Lip(PFH,Res)在心肌梗死部位的被动靶向的能力。
图9为实施例5制备的纳米脂质制剂Lip(PFH,Res)在心肌梗死部位的抗氧化能力的评价图。
图10为实施例5制备的纳米脂质制剂Lip(PFH,Res)在心肌梗死部位缓解缺氧能力的评价图。
图11为实施例5制备的纳米脂质制剂Lip(PFH,Res)在心肌梗死部位减轻心肌梗死指标的评价图。
图12为实施例5制备的纳米脂质制剂Lip(PFH,Res)在改善心肌梗死的心功能图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步的阐述，其目的仅在于更好地理解本发明的内容。因此，所列举的实施例并不限制本发明的保护范围。
实施例中室温是：25～28℃；所用原料及试剂均为市售品。
实施例1
考察超声功率对纳米脂质制剂粒径的影响
如图1所示，在不同超声功率下，制备包载全氟己烷和白藜芦醇(Res)的纳米脂质制剂，制备方法如下：
步骤(1)、称取16.6mg氢化大豆卵磷脂、4.6mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、3.8mg胆固醇(氢化卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇的摩尔比为13:1:6)溶于5mL氯仿形成脂质溶液，0.5mg白藜芦醇溶于0.5mL甲醇形成白藜芦醇溶液；
步骤(2)、将上述脂质溶液和白藜芦醇溶液置于25mL茄形瓶中，超声15s混匀，将茄形瓶置于旋转蒸发仪上，在温度37℃下旋转蒸发5min去除溶剂，得到脂质薄膜；
步骤(3)、在茄形瓶中加入2.7mL纯水，通过超声水合剥离脂膜得到粗脂质体，加入0.3mL PFH，将超声波细胞破碎仪的探头伸入液面之下，超声5min(超声功率分别为150W、250W、350W)，得到均一的纳米脂质制剂。
由图2可知，超声功率分别为150W、250W、350W时，对应的纳米脂质制剂的粒径分别为267nm、174nm、127nm。
实施例2
考察水合时纯水用量对纳米脂质制剂粒径的影响
在不同纯水用量下，制备包载全氟己烷和白藜芦醇的纳米脂质制剂，制备方法如下：
步骤(1)、称取三份16.6mg氢化大豆卵磷脂、4.6mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、3.8mg胆固醇(氢化卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇的摩尔比为13:1:6)溶于5mL氯仿形成脂质溶液，0.5mg白藜芦醇溶于0.5mL甲醇形成白藜芦醇溶液；
步骤(2)、将上述脂质溶液和白藜芦醇溶液置于25mL茄形瓶中，超声15s混匀，将茄形瓶置于旋转蒸发仪上，在温度37℃下旋转蒸发5min去除溶剂，得到脂质薄膜；
步骤(3)、在茄形瓶中加入纯水(用量分别为1.7mL、2.7mL、7.7mL)，通过超声水合剥离脂膜得到粗脂质体，加入0.3mL PFH，将超声波细胞破碎仪的探头伸入液面之下，在功率为350W下超声5min，得到均一的纳米脂质制剂。
由图3可知，水合时纯水用量分别为1.7mL、2.7mL、7.7mL时，对应的纳米脂质制剂的粒径分别为214nm、127nm、120nm。
实施例3
考察全氟己烷的用量对纳米脂质制剂粒径的影响
在不同全氟己烷的用量下，制备包载全氟己烷和白藜芦醇(Res)的纳米脂质制剂，制备方法如下：
步骤(1)、称取16.6mg氢化大豆卵磷脂、4.6mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、3.8mg胆固醇(氢化卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇的摩尔比为13:1:6)溶于5mL氯仿形成脂质溶液，0.5mg白藜芦醇溶于0.5mL甲醇形成白藜芦醇溶液；
步骤(2)、将上述脂质溶液和白藜芦醇溶液置于25mL茄形瓶中，超声15s混匀，将茄形瓶置于旋转蒸发仪上，在温度37℃下旋转蒸发5min去除溶剂，得到脂质薄膜；
步骤(3)、在茄形瓶中分别加入2.9、2.7、2.6mL纯水，通过超声水合剥离脂膜得到粗脂质体，分别加入0.1、0.3、0.4mL PFH使纳米脂质制剂的终体积相同，将超声波细胞破碎仪的探头伸入液面之下，在功率为350W下超声5min，得到均一的纳米脂质制剂。
由图4可知，全氟己烷的用量分别为0.1、0.3、0.4mL时，对应的纳米脂质制剂的粒径分别为113nm、127nm、236nm。
实施例4
考察氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇用量比对纳米脂质制剂粒径的影响
在不同氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇用量下(a：氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇摩尔百分比为65％、2％、33％；b：氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇摩尔百分比为65％、5％、30％；氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇摩尔百分比为65％、10％、25％；氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇摩尔百分比为65％、15％、20％)，制备包载全氟己烷和白藜芦醇的纳米脂质制剂，制备方法如下：
步骤(1)、称取氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇，分别为：
用量a：18.4mg氢化大豆卵磷脂、2mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、4.6mg胆固醇；
用量b：16.6mg氢化大豆卵磷脂、4.6mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、3.8mg胆固醇；
用量c：14.4mg氢化大豆卵磷脂、7.9mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、2.7mg胆固醇；
用量d：12.6mg氢化大豆卵磷脂、10.4mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、1.9mg胆固醇；
分别溶于5mL氯仿形成脂质溶液，0.5mg白藜芦醇溶于0.5mL甲醇形成白藜芦醇溶液；
步骤(2)、将上述脂质溶液和白藜芦醇溶液置于25mL茄形瓶中，超声15s混匀，将茄形瓶置于旋转蒸发仪上，在温度37℃下旋转蒸发5min去除溶剂，得到脂质薄膜；
步骤(3)、在茄形瓶中加入2.7mL纯水，通过超声水合剥离脂膜得到粗脂质体，加入0.3mL PFH，将超声波细胞破碎仪的探头伸入液面之下，在功率为350W下超声5min，得到均一的纳米脂质制剂。
由图5可知，用量a、b、c、d制得的粒径纳米脂质制剂分别为147nm、127nm、193nm和157nm。
实施例5
一种包载全氟己烷和白藜芦醇的纳米脂质制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)、称取16.6mg氢化大豆卵磷脂、4.6mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、3.8mg胆固醇(氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇的摩尔比为13:1:6)，溶于5mL氯仿形成脂质溶液，0.5mg白藜芦醇溶于0.5mL甲醇形成白藜芦醇溶液；
步骤(2)、将上述脂质溶液和白藜芦醇溶液置于25mL茄形瓶中，超声15s混匀，将茄形瓶置于旋转蒸发仪上，在温度37℃下旋转蒸发5min去除溶剂，得到脂质薄膜；
步骤(3)、在茄形瓶中加入2.7mL纯水，通过超声水合剥离脂膜得到粗脂质体，加入0.3mL PFH，将超声波细胞破碎仪的探头伸入液面之下，在功率为350W下超声5min，得到均一的纳米脂质制剂Lip(PFH,Res)。
对本实施例制备的Lip(PFH,Res)进行材料表征，由Lip(PFH,Res)的TEM(图6a)可知，Lip(PFH,Res)的形貌为类球形，粒径约127nm，由于脂质负载了PFH和Res，因此脂质中心的颜色相比于脂质膜颜色更深，表明成功合成了Lip(PFH,Res)。利用激光粒度仪检测Lip(PFH,Res)的水合粒径，见图6b，Lip(PFH,Res)的纳米离子的尺寸约为127nm。连续七天检测Lip(PFH,Res)在PBS(pH＝7.4)或者DMEM+10％FBS中的稳定性，结果见图6c，Lip(PFH,Res)在PBS和DMEM+10％ FBS中的粒径变化均不大，说明Lip(PFH,Res)的体外稳定性良好。
实施例6
为了考察实施例5Lip(PFH,Res)的被动靶向性能，引入琥珀酰亚胺酯(Cyanine5.5NHS ester,Cy5.5)制成带有荧光染料的Lip(PFH,Res,Cy5.5)，制备方法如下：
步骤(1)、称取16.6mg氢化大豆卵磷脂、4.6mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、3.8mg胆固醇(氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇的摩尔比为13:1:6)溶于5mL氯仿形成脂质溶液，0.5mg白藜芦醇溶于0.5mL甲醇形成白藜芦醇溶液，2mg Cy5.5溶于1mL DMSO中形成浓度约2mg/mL的Cy5.5溶液；
步骤(2)、将上述的脂质溶液、白藜芦醇溶液和20μL Cy5.5溶液置于25mL茄形瓶中，超声15s混匀，将茄形瓶置于旋转蒸发仪上，在温度37℃下旋转蒸发5min去除溶剂，得到脂质薄膜；
步骤(3)、在茄形瓶中加入2.7mL纯水，通过超声水合剥离脂膜得到粗脂质体，加入0.3mL PFH，将超声波细胞破碎仪的探头伸入液面之下，在功率为350W下超声5min，得到均一的纳米脂质制剂Lip(PFH,Res,Cy5.5)。
对比例1
一种包载全氟己烷的纳米脂质制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)、称取16.6mg氢化大豆卵磷脂，4.6mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，3.8mg胆固醇溶于5mL氯仿形成脂质溶液；
步骤(2)、将上述的脂质溶液置于25mL茄形瓶中，超声15s混匀，将茄形瓶置于旋转蒸发仪上，在温度37℃下旋转蒸发5min，得到脂质薄膜；
步骤(3)、在茄形瓶中加入2.7mL纯水，通过超声水合剥离脂膜得到粗脂质体后，加入0.3mL PFH，将超声波细胞破碎仪的探头伸入液面之下，在功率为350W下超声5min，得到纳米脂质制剂Lip(PFH)。
对比例2
一种包载白藜芦醇的纳米脂质制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)、称取16.6mg氢化大豆卵磷脂，4.6mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，3.8mg胆固醇溶于5mL氯仿形成脂质溶液，0.5mg Res白藜芦醇溶于0.5mL甲醇形成白藜芦醇溶液；
步骤(2)、将上述的脂质溶液和白藜芦醇溶液置于25mL茄形瓶中，超声15s混匀，将茄形瓶置于旋转蒸发仪上，在37℃下旋转蒸发5min得到脂质薄膜。
步骤(3)、在茄形瓶中加入2.7mL纯水通过超声水合剥离脂膜得到粗脂质体后，加入0.3mL纯水，将超声细胞破碎仪的探头伸入液面之下，在功率为350W下超声5min，得到纳米脂质制剂Lip(Res)。
对比例3
一种包载全氟己烷和白藜芦醇的纳米脂质制剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)、称取14.4mg氢化大豆卵磷脂、7.9mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、2.7mg胆固醇(氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇的摩尔比为13:2:5)溶于5mL氯仿形成脂质溶液，0.5mg白藜芦醇溶于0.5mL甲醇形成白藜芦醇溶液；
步骤(2)、将上述脂质溶液和白藜芦醇溶液置于25mL茄形瓶中，超声15s混匀，将茄形瓶置于旋转蒸发仪上，在温度37℃下旋转蒸发5min去除溶剂，得到脂质薄膜；
步骤(3)、在茄形瓶中加入2.7mL纯水，通过超声水合剥离脂膜得到粗脂质体，加入0.3mL PFH，将超声波细胞破碎仪的探头伸入液面之下，在功率为350W下超声5min，得到均一的纳米脂质制剂，记为Lip(PFH,Res)-d1，粒径为193nm(图7a)。
对比例4
为了考察对比例3Lip(PFH,Res)-d1的被动靶向性，引入琥珀酰亚胺酯(Cyanine5.5 NHS ester,Cy5.5)制成带有荧光染料的Lip(PFH,Res,Cy5.5)-d1。制备方法如下：
步骤(1)、称取14.4mg氢化大豆卵磷脂、7.9mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、2.7mg胆固醇(氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇的摩尔比为13:2:5)溶于5mL氯仿形成脂质溶液，0.5mg白藜芦醇溶于0.5mL甲醇形成白藜芦醇溶液；
步骤(2)、2mg Cy5.5溶于1mL DMSO中形成约2mg/mL的Cy5.5溶液；将上述脂质溶液、白藜芦醇溶液和20μL Cy5.5溶液置于25mL茄形瓶中，超声15s混匀，将茄形瓶置于旋转蒸发仪上，在温度37℃下旋转蒸发5min去除溶剂，得到脂质薄膜；
步骤(3)、在茄形瓶中加入2.7mL纯水，通过超声水合剥离脂膜得到粗脂质体，加入0.3mL PFH，将超声波细胞破碎仪的探头伸入液面之下，在功率为350W下超声5min，得到均一的纳米脂质制剂，记为Lip(PFH,Res,Cy5.5)-d1。
实施例7
(1)实验分组：正常对照组(Healthy/Control)、心肌梗死模型组(MI组)、MI+Lip(PFH)组(Lip(PFH)组，666.7mg/kg)，MI+Lip(Res)组(Lip(Res)组，0.67mg/kg)，MI+Lip(PFH,Res)组(Lip(PFH,Res)组，PFH：666.7mg/kg，Res：0.67mg/kg)，MI+Lip(PFH,Res)-d1组(Lip(PFH,Res)-d1组，PFH：333.3mg/kg，Res：0.67mg/kg)，采用生理盐水配制，各组大鼠通过尾静脉给药。
被动靶向的实验(生物分布)，使用实施例6制备的带有荧光染料的Lip(PFH,Res,Cy5.5)、对比例4制备的Lip(PFH,Res,Cy5.5)-d1，其余实验使用实施例5制备的Lip(PFH,Res)。
(2)心肌梗死模型的建立：
所有SD大鼠进行1周适应性喂养后，实验前所有实验动物禁食12h。麻醉后将大鼠以仰卧位固定在鼠板上。大鼠颈部和左侧胸部去毛，75％酒精棉球消毒，用手术剪居中剪开颈部皮肤并钝性分离出气管，仔细剪开气管后连接小动物人工呼吸机(呼吸频率80次/分，呼吸比5:4，潮气量8毫升)并对大鼠进行气管插管。用手术剪剪开左侧胸部皮肤并钝性分离肌肉，在大鼠左侧第三肋间开胸，用手术钳扩大肋间开口，充分暴露大鼠的心脏，找到左心耳，剥开心包膜并确定左冠状动脉前降支，在左心耳下缘2mm处用6-0手术缝合线结扎诱导心肌缺血。此时结扎部位以下可以观察到左室前壁表现为苍白色，则表示MI造模成功。之后小心将肌肉，皮缝合，将大鼠放在电热毯上并观察大鼠的状态直到醒来。造模45min后，大鼠尾静脉注射给药，MI组注射等量的生理盐水。
(3)进行被动靶向能力的评价：造模45min后，MI+Lip(PFH,Res)组大鼠通过尾静脉注射给予实施例6制备的Lip(PFH,Res,Cy5.5)、MI+Lip(PFH,Res)-d1组大鼠通过尾静脉注射给予对比例4制备的Lip(PFH,Res,Cy5.5)-d1，Control组大鼠尾静脉注射等量生理盐水，心梗24h后解剖大鼠，取出主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)洗净，拭干，对其用小动物活体成像进行成像。
实验结果：如图7b所示，Lip(PFH,Res)-d1组大鼠的心脏强度和Control组大鼠的心脏荧光强度相差不大，说明粒径为193nm的Lip(PFH,Res)-d1难以靶向到心肌梗死部位。如图8所示，相比于Control组，Lip(PFH,Res)组大鼠的心脏显示出更强的荧光信号，说明Lip(PFH,Res)组大鼠心脏内有更多的Lip(PFH,Res)分布，说明Lip(PFH,Res)可以通过被动靶向富集在心肌梗死部位。Lip(PFH,Res)组大鼠的其它器官和Control组大鼠类似，其中Lip(PFH,Res)组和Control组大鼠肝脏分布较多，这与Lip(PFH,Res)可能是经过肝脏代谢有关。
(4)分别进行心肌梗死部位ROS清除能力和缓解氧气能力的评价：
造模成功45min后，通过尾静脉注射给药：Lip(PFH)组给予对比例1制备的Lip(PFH)，666.7mg/kg；Lip(Res)组给予对比例2制备的Lip(Res)，0.67mg/kg；Lip(PFH,Res)组给予实施例5制备的Lip(PFH,Res)，PFH：666.7mg/kg，Res：0.67mg/kg；Control组健康大鼠和心肌梗死模型组(MI组)大鼠给予等量的生理盐水。心梗24h后，处死大鼠，分别进行心肌梗死部位ROS清除能力和缓解氧气能力的评价。
心肌梗死部位ROS清除能力的评价：处死大鼠后，立即取新鲜的心脏，切取左心室部分，放入预冷的PBS中清洗直到没有残留的血液，将组织块置入含有OCT包埋剂的包埋盒中，再滴加适量OCT包埋剂直到完全包埋组织块，液氮冷冻约30s将组织块进行冷冻包埋，切片，滴加适量的10μM DCFH-DA染液，37℃避光孵育30min，用PBS清洗3次，滴加DAPI染液，避光室温孵育10min，用PBS清洗3次后加入滴加抗荧光淬灭封片液封片，最后在共聚焦荧光显微镜下观察拍照。并用image J统计，得出统计图。
实验结果如图9所示：注射生理盐水的MI组大鼠心脏呈大面积的强的绿色荧光，说明心肌梗死后产生了大量的ROS。注射Lip(PFH)后，荧光强度进一步增加，说明Lip(PFH)中的携氧PFH的存在能够使梗死的心肌组织产生更多的ROS，经过Lip(Res)和Lip(PFH,Res)处理后，荧光强度明显减弱且和Control组健康大鼠的荧光强度相近，说明负载有Res的脂质纳米制剂能有效的清除心肌梗死部位的氧化应激，并且可以消除由于携氧PFH产生的ROS。因此Lip(PFH,Res)可以有效的减少心肌梗死部位的ROS含量，并且可以减少单独给予Lip(PFH)产生的副作用。
心肌梗死部位缓解氧气能力的评价：处死大鼠后，立即取新鲜的心脏，切取左心室部分，清洗、组织固定、脱水、石蜡包埋、组织切片。将石蜡切片脱蜡至水后，置于0.5％Triton X-100溶液进行抗原修复，将切片转入牛血清白蛋白(BSA)液中封闭1h。封闭结束后，将稀释好的鼠源HIF-1α抗体和组织切片在4℃孵育过夜，用PBS清洗3次后加入带有FITC荧光标记的二抗溶液在37℃下孵育2h，用PBS清洗多余的染液，滴加抗荧光淬灭封片液封片，最后在共聚荧光焦显微镜下观察拍照。并用image J统计，得出统计图。
实验结果如图10所示：Lip(Res)给药后，HIF-1α的表达量和MI组相近。但是注射Lip(PFH)和Lip(PFH,Res)后的心肌组织表达HIF-1α的量和Control组健康大鼠相差不大，说明Lip(PFH)和Lip(PFH,Res)可以改善心肌组织的乏氧环境。
(5)进行心肌梗死组织中减少心肌梗死指标的评价和心脏超声检测：
分别在造模成功45min后、第2天、第4天通过尾静脉注射给药：Lip(PFH)组给予对比例1制备的Lip(PFH)，666.7mg/kg；Lip(Res)组给予对比例2制备的Lip(Res)，0.67mg/kg；Lip(PFH,Res)组给予实施例5制备的Lip(PFH,Res)，PFH：666.7mg/kg，Res：0.67mg/kg；Control组健康大鼠和心肌梗死模型组(MI组)大鼠给予等量的生理盐水。
心肌梗死组织中减少心肌梗死指标的评价：第4天大鼠眼眦取血，室温放置1h后，4℃，3000rpm离心10min，取上清，按照相应检测试剂盒CKMB，LDH进行检测。
实验结果如图11所示：相比于模型组，给予Lip(PFH)和Lip(Res)降低了CKMB和LDH水平，且两组降低的程度相近。然而用Lip(PFH,Res)处理后，显著降低了CKMB和LDH的含量且和Control组相近，说明Lip(PFH,Res)中的PFH和Res发挥协同作用，共同减轻了心肌梗死的程度。
心脏超声检测：在MI损伤后，用超高分辨率小动物超声成像系统检测心脏功能，用Vevo LAB 3.2.0软件计算大鼠心脏功能，包括左心室缩短分数、左心室射血分数、以及心输出量。
实验结果如图12所示：从心脏M超图像(a)可知，相比于健康大鼠Control组，MI损伤后左心室前壁变薄，左心室室腔增大，心跳振幅减少。而给予Lip(PFH)，Lip(Res)均从第3天开始改善梗死大鼠的收缩功能，缓解心室腔扩大。而给予Lip(PFH,Res)从第3天开始显著提高大鼠的收缩功能，心跳振幅增大，且明显减少左心室腔扩大。从数据统计图(b)可知，分析各组从第1天到第14天大鼠的左心室射血分数(Ejection fraction,EF)，左心室缩短分数(Shortening fraction,FS)和心输出量(Cardiac output,CO)，结果表明Lip(PFH)和Lip(Res)在第3天开始提高了心功能，在第7天维持心功能，但在14天两者进一步改善心功能且两者的改善程度相近，然而Lip(PFH,Res)在第3天能显著改善心功能，在第14天心功能达到的正常组相似程度。
结果
小动物活体成像检测结果显示，相比于Control组，MI造模成功的大鼠给予Lip(PFH,Res,Cy5.5)后的心脏荧光强度明显增强，说明Lip(PFH,Res)可以被动靶向到梗死心脏中；DCFH-DA检测结果显示，Lip(PFH,Res)显著降低心肌梗死后产生的ROS；HIF-1α检测结果显示，Lip(PFH,Res)缓解心肌梗死后的缺氧微环境；CKMB，LDH试剂盒检测结果显示，Lip(PFH,Res)显著降低心肌梗死后的心梗指标CKMB和LDH；心脏超声检测结果显示，Lip(PFH,Res)显著改善心肌梗死后的收缩功能，射血分数和提高心肌梗死后的心输出量。
综上所述，本发明纳米脂质制剂体外稳定性良好。本发明以SD大鼠为实验对象，通过结扎冠状动脉左前降支进行心肌梗死模型的建立。心肌梗死大鼠给予Lip(PFH,Res)治疗，表现出良好的被动靶向性，且纳米脂质制剂可以通过释氧和抗氧化性药物分别缓解心肌梗死部位的乏氧和氧化应激微环境，显著降低心肌梗死指标并且改善心肌梗死心功能，即Lip(PFH,Res)能够对心肌梗死起保护作用，可作为制备缓解或治疗心肌梗死的纳米脂质制剂。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂，其特征在于：所述的纳米脂质制剂为核壳结构，核壳结构以磷脂脂质体膜层为外壳，以外壳包载的全氟己烷和抗氧化剂为内核；所述的磷脂脂质体膜层由氢化卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇制成的。
2.根据权利要求1所述的包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂，其特征在于：所述的氢化卵磷脂选自氢化大豆卵磷脂；所述的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000-马来酰亚胺中的任意一种或多种。
3.根据权利要求1所述的包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂，其特征在于：所述的氢化卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇的摩尔比为65:(4～8):(27～31)，优选为13:1:6；
氢化卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇的总质量与全氟己烷的质量之比为1:6～1:20，优选为1:20；
氢化卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇的总质量与抗氧化剂的物质的量之比≤25:0.002mg/mmol，优选为25:0.002mg/mmol。
4.根据权利要求1所述的包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂，其特征在于：所述的抗氧化剂选自白藜芦醇、紫檀芪、槲皮素、叶黄素中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂，其特征在于：所述的包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂的粒径为110～130nm。
6.一种权利要求1所述的包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤(1)、将氢化卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000溶于有机溶剂形成脂质溶液，将抗氧化剂溶于甲醇形成溶液；
步骤(2)、将脂质溶液和抗氧化剂溶液混合，通过旋蒸去除溶剂，得到脂质薄膜；
步骤(3)、加入纯水，通过超声水合得到粗脂质体，再加入全氟己烷，通过超声波细胞破碎仪超声得到均一的纳米脂质制剂。
7.根据权利要求6所述的包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷中的一种。
8.根据权利要求6所述的包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，旋蒸的温度为37～40℃。
9.根据权利要求6所述的包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，水合时，氢化卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和胆固醇的总质量与纯水的体积之比为25mg:2～8mL，优选为25mg:2.7mL。
10.权利要求1所述的包载全氟己烷和抗氧化剂的纳米脂质制剂在制备治疗心肌梗死药物中的应用。
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