CN106975081B - 一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物及其制备方法并应用 - Google Patents
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Abstract
一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物及其制备方法并应用，涉及一种生物医药偶联物及其制备方法并应用，本发明通过细胞穿膜肽介导胰岛素的口服吸收，提高生物利用度。本发明所述的细胞穿膜肽（CPPs），是穿膜肽Tat（序列GRKKRRQRRRPPQC）、多聚精氨酸R8（序列RRRRRRRRC）、穿膜素Penetratin（序列RQIKIWFQNRRMKWKKC）和低分子量鱼精蛋白LMWP（序列VSRRRRRRGGRRRRC）中的一种或几种。本发明所需的穿膜肽是通过固相合成的方法得到的，并与胰岛素通过交联剂共价连接得到偶联物。本发明还提供了偶联物在治疗糖尿病方面的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物医药偶联物及其制备方法并应用，特别是涉及一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物及其制备方法并应用。
背景技术
胰岛素是临床治疗糖尿病的首选药物，以皮下注射为主。频繁地注射胰岛素不仅给患者带来极大痛苦，还可能导致皮下脂肪萎缩、外周高胰岛素引起的高血压和动脉粥样硬化等。口服胰岛素是一种理想的给药方式，不仅患者顺应性好，而且模仿胰岛素的生理途径，减少副作用产生。然而，一般情况下由于药物的分子尺寸较大以及化学稳定性较差导致直接口服胰岛素的生物利用度很低。
目前，关于改善胰岛素口服吸收的研究有很多，包括将胰岛素装载入纳米载体（Eur. J. Pharm.Biopharm. 2009, 73:25-33.）或互穿式水凝胶（Biomaterials. 2010,31:3347-56），或者用肠溶材料包衣（Biomaterials. 2010, 31:3384-94.），以及联合酶抑制剂（Biomaterials. 2012, 33:2801-11.）等。理论上，这些策略可以减少药物被消化酶降解，打开肠道上皮细胞的紧密连接，大大促进药物的跨膜吸收。然而事实上，胰岛素的口服生物利用度还远远达不到理想程度。最主要的问题还是出在药物的跨膜吸收与递送这一步，如何高效安全地促进药物的跨膜转运成为研究的重点。
细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides, CPPs）是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽，为大分子药物跨膜吸收提供了一条新途径。其穿膜作用不依赖经典的胞吞作用，具有细胞膜亲和性高、穿膜速度快、可迅速被降解等优势。此外，它们有一些共性：
具有静正电荷和两亲性；
具有很强的跨膜转运能力，能够携带比其相对分子质量大100倍的外源性大分子进入细胞；
可以携带多种活性物质进入细胞，导入近乎所有的细胞；
可以通过固相合成或原核表达制备，方法成熟简便。由于细胞穿膜肽具有很强的跨膜转运能力，无刺激性，并且在一定浓度范围内对宿主细胞无毒害作用，因此作为一种新型的药物递送工具受到越来越多的关注。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物及其制备方法并应用，本发明用二甲基马来酸酐（DMMA）对CPPs上的氨基进行保护，使其巯基与交联剂的MAL基团反应，然后NHS基团再与INS上的氨基反应，最后脱氨基保护得偶联物。整个合成过程简单易行，不涉及剧烈条件，对于蛋白药物活性保留十分有利。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物，所述偶联物的结构如下所示：
其中，n为15～220；INS代表胰岛素分子；CPPs代表细胞穿膜肽分子。
所述的一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物，所述细胞穿膜肽为穿膜肽Tat（序列GRKKRRQRRRPPQC）、多聚精氨酸R8（序列RRRRRRRRC）、穿膜素Penetratin（序列RQIKIWFQNRRMKWKKC）和低分子量鱼精蛋白LMWP（序列VSRRRRRRGGRRRRC）中的一种或几种（端基均为半胱氨酸）。
所述的一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物，所述胰岛素和细胞穿膜肽是通过交联剂NHS-PEG-MAL完成的偶联。
所述的一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物，所述交联剂NHS-PEG-MAL中PEG分子量为1000～10000。
一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物制备方法，所述方法包括以下过程：
（1）将CPPs与二甲基马来酸酐（DMMA）反应，以保护CPPs上的氨基，暴露巯基；
（2）将氨基保护的CPPs与交联剂NHS-PEG-MAL发生反应，生成NHS-PEG-CPPs；
（3）将NHS-PEG-CPPs与胰岛素发生反应，脱氨基保护，得到细胞穿膜肽胰岛素偶联物。
所述的一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物制备方法，所述方法具体步骤如下：
（1）将CPPs溶于pH 8.5的PBS溶液中，加入DMMA，室温下反应2～4 h，优选3 h；然后采用透析法除去未反应的DMMA，得到溶液A；DMMA与CPPs的摩尔比为20～100 : 1，优选为40～60 : 1；
（2）向溶液A中加入交联剂NHS-PEG-MAL，室温孵育0.5～2 h，优选1 h，使CPPs分子上的巯基与MAL发生反应，得到NHS-PEG-CPPs；CPPs与NHS-PEG-MAL的摩尔比为1 ：1～10，优选为1 : 5；
（3）将胰岛素溶于pH 7.4的PBS溶液中，滴加入NHS-PEG-CPPs中，室温孵育1～2 h，使胰岛素的氨基与NHS基团发生反应，然后将反应物在37℃，pH 5.5条件下脱掉DMMA，透析，冻干，得到偶联物；胰岛素与NHS-PEG-CPPs的摩尔比为1 : 1～10，优选为1 : 5。
所述的一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物制备方法，所述步骤（1）和（3）中的透析是在2%（m/v）的氯化钠溶液（含20 mM的EDTA）中室温条件下进行，透析时间为24～48 h。
所述的一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物制备方法，所述步骤（3）的冻干起始温度在零下40℃。
一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物的应用，所述细胞穿膜肽胰岛素偶联物应用于治疗糖尿病。
本发明的优点与效果是：
本发明细胞穿膜肽是穿膜肽Tat（序列GRKKRRQRRRPPQC），多聚精氨酸R8（序列RRRRRRRRC），穿膜素Penetratin（序列RQIKIWFQNRRMKWKKC）和低分子量鱼精蛋白LMWP（序列VSRRRRRRGGRRRRC）中的一种或几种。本发明穿膜肽是通过固相合成的方法得到，在每种穿膜肽的端基修饰半胱氨酸（C）以提供巯基，然后通过交联剂NHS-PEG-MAL（PEG分子量1000～10000 Da）将insulin（INS）与CPPs进行偶联。由于穿膜肽和胰岛素分子中均有氨基和巯基，交联剂的两端与两种物质都能进行反应，如果直接混合，反应位点多，产物较杂。在本发明中，首先用二甲基马来酸酐（DMMA）对CPPs上的氨基进行保护，使其巯基与交联剂的MAL基团反应，然后NHS基团再与INS上的氨基反应，最后脱氨基保护，即得偶联物。整个合成过程简单易行，不涉及剧烈条件，对于蛋白药物活性保留十分有利。
本发明通过细胞穿膜肽介导可以大大提高胰岛素的跨膜吸收和转运，为解决现有口服胰岛素制剂吸收效率低的问题提供了可能的办法。本发明提供的偶联物的合成方法简单，条件温和，所用试剂无毒无害，对蛋白药物的活性保留十分有利，也为后续的药效学实验打下了基础。
附图说明
图1为本发明制备的细胞穿膜肽胰岛素偶联物的合成路线图；
图2为本发明制备的细胞穿膜肽胰岛素偶联物用于大鼠回肠给药降血糖试验。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
本发明提供了一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物，该偶联物的结构如下所示：
其中，n为15～220；INS代表胰岛素分子；CPPs代表细胞穿膜肽分子。
优选地，所述的细胞穿膜肽为穿膜肽Tat（序列GRKKRRQRRRPPQC），多聚精氨酸R8（序列RRRRRRRRC），穿膜素Penetratin（序列RQIKIWFQNRRMKWKKC）和低分子量鱼精蛋白LMWP（序列VSRRRRRRGGRRRRC）中的一种或几种（端基均为半胱氨酸）。
本发明所述的药物胰岛素和细胞穿膜肽是通过交联剂NHS-PEG-MAL完成的偶联。
优选地，其中NHS-PEG-MAL中PEG分子量为1000～10000。
按照本发明的另一方面，提供了一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将CPPs与二甲基马来酸酐（DMMA）反应，以保护CPPs上的氨基，暴露巯基；
（2）将氨基保护的CPPs与交联剂NHS-PEG-MAL发生反应，生成NHS-PEG-CPPs；
（3）将NHS-PEG-CPPs与胰岛素发生反应，脱氨基保护，得到细胞穿膜肽胰岛素偶联物。
优选地，所述的细胞穿膜肽胰岛素偶联物的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将适量的CPPs溶于pH 8.5的PBS溶液中，加入DMMA，室温下反应2～4 h；然后采用透析法除去未反应的DMMA，得到溶液A；所述的DMMA与CPPs的摩尔比为20～100 : 1；
（2）向溶液A中加入适量交联剂NHS-PEG-MAL，室温孵育0.5～2 h，使CPPs分子上的巯基与MAL发生反应，得到NHS-PEG-CPPs；所述的CPPs与NHS-PEG-MAL的摩尔比为1 ：1～10；
（3）将适量胰岛素溶于pH 7.4的PBS溶液中，滴加入NHS-PEG-CPPs中，室温孵育1～2 h，使胰岛素的氨基与NHS基团发生反应，然后将反应物在37℃，pH 5.5条件下脱掉DMMA，透析，冻干，得到偶联物。所述的胰岛素与NHS-PEG-CPPs的摩尔比为1 : 1～10。
优选地，步骤（1）所述的室温下反应时间为3 h。
优选地，步骤（1）所述的DMMA与CPPs的摩尔比为40～60 : 1。
优选地，步骤（2）所述的室温孵育时间为1 h。
优选地，步骤（2）所述的CPPs与NHS-PEG-MAL的摩尔比为1 : 5。
优选地，步骤（3）所述的胰岛素与NHS-PEG-CPPs的摩尔比为1 : 5。
优选地，所述的步骤（1）和（3）中的透析是在2%（m/v）的氯化钠溶液（含20 mM的EDTA）中室温条件下进行,透析时间为24～48 h；
优选地，步骤（3）所述的冻干起始温度在零下40℃。
按照本发明的另一方面，提供了一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物的应用，应用于治疗糖尿病。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明的各个实施方式所涉及的技术特征只要彼此间未构成冲突就可以相互组合。
本发明供了一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物，该偶联物的结构如下所示：
其中，n为15～220；INS代表胰岛素分子；CPPs代表细胞穿膜肽分子。
该偶联物结构中包括胰岛素，细胞穿膜肽和交联剂。其中细胞穿膜肽为穿膜肽Tat（序列GRKKRRQRRRPPQC），多聚精氨酸R8（序列RRRRRRRRC），穿膜素Penetratin（序列RQIKIWFQNRRMKWKKC）和低分子量鱼精蛋白LMWP（序列VSRRRRRRGGRRRRC）中的一种或几种，交联剂为NHS-PEG-MAL，其中PEG分子量为1000～10000。
按照图1所示，细胞穿膜肽胰岛素偶联物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将CPPs与二甲基马来酸酐（DMMA）反应，以保护CPPs上的氨基，暴露巯基；
（2）将氨基保护的CPPs与交联剂NHS-PEG-MAL发生反应，生成NHS-PEG-CPPs；
（3）将NHS-PEG-CPPs与胰岛素发生反应，脱氨基保护，得到细胞穿膜肽胰岛素偶联物。
本发明通过对CPPs的氨基进行保护，减少了CPPs与NHS基团反应的概率，进而减少了副产物的生成，提高了交联反应的效率和目标产物的含量。
以下各实施例中所用原料均为从市场上购得，细胞穿膜肽为委托合成。
实施例1
按照如下步骤制备细胞穿膜肽胰岛素偶联物：
（1）将10 mg的穿膜肽Tat（序列GRKKRRQRRRPPQC）溶于1mL pH 8.5的PBS溶液中，加入35mg的DMMA，室温下反应3 h；然后在室温下在2%（m/v）的氯化钠溶液（含20 mM的EDTA）中透析48 h，除去未反应的DMMA，得到溶液A；
（2）向溶液A中加入65 mg的交联剂NHS-PEG-MAL（其中PEG分子量为2000），室温孵育2 h，使CPPs分子上的巯基与MAL发生反应，得到NHS-PEG-CPPs；
（3）取胰岛素8 mg溶于1 mL的pH 7.4的PBS溶液中，滴加入NHS-PEG-CPPs中，室温孵育1 h，使胰岛素的氨基与NHS基团发生反应，然后将反应物在37℃，pH 5.5条件下脱掉DMMA，在室温下在2%（m/v）的氯化钠溶液（含20 mM的EDTA）中透析48 h，冻干，得到偶联物INS-PEG2000-Tat。
实施例2
按照如下步骤制备细胞穿膜肽胰岛素偶联物：
（1）将10 mg的穿膜肽Tat（序列GRKKRRQRRRPPQC）溶于1mL pH 8.5的PBS溶液中，加入40 mg的DMMA，室温下反应3 h；然后在室温下在2%（m/v）的氯化钠溶液（含20 mM的EDTA）中透析48 h，除去未反应的DMMA，得到溶液A；
（2）向溶液A中加入140 mg的交联剂NHS-PEG-MAL（其中PEG分子量为5000），室温孵育2 h，使CPPs分子上的巯基与MAL发生反应，得到NHS-PEG-CPPs；
（3）取胰岛素10 mg溶于1 mL的pH 7.4的PBS溶液中，滴加入NHS-PEG-CPPs中，室温孵育1 h，使胰岛素的氨基与NHS基团发生反应，然后将反应物在37℃，pH 5.5条件下脱掉DMMA，在室温下在2%（m/v）的氯化钠溶液（含20 mM的EDTA）中透析48 h，冻干，得到偶联物INS-PEG5000-Tat。
实施例3
按照如下步骤制备细胞穿膜肽胰岛素偶联物：
（1）将10 mg的多聚精氨酸R8（序列RRRRRRRRC）溶于1mL pH 8.5的PBS溶液中，加入45 mg的DMMA，室温下反应3 h；然后在室温下在2%（m/v）的氯化钠溶液（含20 mM的EDTA）中透析48 h，除去未反应的DMMA，得到溶液A；
（2）向溶液A中加入84 mg的交联剂NHS-PEG-MAL（其中PEG分子量为2000），室温孵育2 h，使CPPs分子上的巯基与MAL发生反应，得到NHS-PEG-CPPs；
（3）取胰岛素8 mg溶于1 mL的pH 7.4的PBS溶液中，滴加入NHS-PEG-CPPs中，室温孵育1 h，使胰岛素的氨基与NHS基团发生反应，然后将反应物在37℃，pH 5.5条件下脱掉DMMA，在室温下在2%（m/v）的氯化钠溶液（含20 mM的EDTA）中透析48 h，冻干，得到偶联物INS-PEG2000-R8。
实施例4
按照如下步骤制备细胞穿膜肽胰岛素偶联物：
（1）将10 mg的多聚精氨酸R8（序列RRRRRRRRC）溶于1mL pH 8.5的PBS溶液中，加入45 mg的DMMA，室温下反应3 h；然后在室温下在2%（m/v）的氯化钠溶液（含20 mM的EDTA）中透析48 h，除去未反应的DMMA，得到溶液A；
（2）向溶液A中加入193 mg的交联剂NHS-PEG-MAL（其中PEG分子量为5000），室温孵育2 h，使CPPs分子上的巯基与MAL发生反应，得到NHS-PEG-CPPs；
（3）取胰岛素10 mg溶于1 mL的pH 7.4的PBS溶液中，滴加入NHS-PEG-CPPs中，室温孵育1 h，使胰岛素的氨基与NHS基团发生反应，然后将反应物在37℃，pH 5.5条件下脱掉DMMA，在室温下在2%（m/v）的氯化钠溶液（含20 mM的EDTA）中透析48 h，冻干，得到偶联物INS-PEG5000-R8。
实施例5
按照如下步骤制备细胞穿膜肽胰岛素偶联物：
（1）将20 mg的穿膜素Penetratin（序列RQIKIWFQNRRMKWKKC）溶于1mL pH 8.5的PBS溶液中，加入56 mg的DMMA，室温下反应3 h；然后在室温下在2%（m/v）的氯化钠溶液（含20 mM的EDTA）中透析48 h，除去未反应的DMMA，得到溶液A；
（2）向溶液A中加入102 mg的交联剂NHS-PEG-MAL（其中PEG分子量为2000），室温孵育2 h，使CPPs分子上的巯基与MAL发生反应，得到NHS-PEG-CPPs；
（3）取胰岛素10 mg溶于1 mL的pH 7.4的PBS溶液中，滴加入NHS-PEG-CPPs中，室温孵育1 h，使胰岛素的氨基与NHS基团发生反应，然后将反应物在37℃，pH 5.5条件下脱掉DMMA，在室温下在2%（m/v）的氯化钠溶液（含20 mM的EDTA）中透析48 h，冻干，得到偶联物INS-PEG2000-Penetratin。
实施例6
按照如下步骤制备细胞穿膜肽胰岛素偶联物：
（1）将20 mg的穿膜素Penetratin（序列RQIKIWFQNRRMKWKKC）溶于1mL pH 8.5的PBS溶液中，加入56 mg的DMMA，室温下反应3 h；然后在室温下在2%（m/v）的氯化钠溶液（含20 mM的EDTA）中透析48 h，除去未反应的DMMA，得到溶液A；
（2）向溶液A中加入235 mg的交联剂NHS-PEG-MAL（其中PEG分子量为5000），室温孵育2 h，使CPPs分子上的巯基与MAL发生反应，得到NHS-PEG-CPPs；
（3）取胰岛素10 mg溶于1 mL的pH 7.4的PBS溶液中，滴加入NHS-PEG-CPPs中，室温孵育1 h，使胰岛素的氨基与NHS基团发生反应，然后将反应物在37℃，pH 5.5条件下脱掉DMMA，在室温下在2%（m/v）的氯化钠溶液（含20 mM的EDTA）中透析48 h，冻干，得到偶联物INS-PEG5000-Penetratin。
实施例7
按照如下步骤制备细胞穿膜肽胰岛素偶联物：
（1）将15 mg的低分子量鱼精蛋白LMWP（序列VSRRRRRRGGRRRRC）溶于1mL pH 8.5的PBS溶液中，加入48 mg的DMMA，室温下反应3 h；然后在室温下在2%（m/v）的氯化钠溶液（含20 mM的EDTA）中透析48 h，除去未反应的DMMA，得到溶液A；
（2）向溶液A中加入87 mg的交联剂NHS-PEG-MAL（其中PEG分子量为2000），室温孵育2 h，使CPPs分子上的巯基与MAL发生反应，得到NHS-PEG-CPPs；
（3）取胰岛素10 mg溶于1 mL的pH 7.4的PBS溶液中，滴加入NHS-PEG-CPPs中，室温孵育1 h，使胰岛素的氨基与NHS基团发生反应，然后将反应物在37℃，pH 5.5条件下脱掉DMMA，在室温下在2%（m/v）的氯化钠溶液（含20 mM的EDTA）中透析48 h，冻干，得到偶联物INS-PEG2000-LMWP。
实施例8
按照如下步骤制备细胞穿膜肽胰岛素偶联物：
（1）将15 mg的低分子量鱼精蛋白LMWP（序列VSRRRRRRGGRRRRC）溶于1mL pH 8.5的PBS溶液中，加入48 mg的DMMA，室温下反应3 h；然后在室温下在2%（m/v）的氯化钠溶液（含20 mM的EDTA）中透析48 h，除去未反应的DMMA，得到溶液A；
（2）向溶液A中加入200 mg的交联剂NHS-PEG-MAL（其中PEG分子量为2000），室温孵育2 h，使CPPs分子上的巯基与MAL发生反应，得到NHS-PEG-CPPs；
（3）取胰岛素10 mg溶于1 mL的pH 7.4的PBS溶液中，滴加入NHS-PEG-CPPs中，室温孵育1 h，使胰岛素的氨基与NHS基团发生反应，然后将反应物在37℃，pH 5.5条件下脱掉DMMA，在室温下在2%（m/v）的氯化钠溶液（含20 mM的EDTA）中透析48 h，冻干，得到偶联物INS-PEG5000-LMWP。
实施例9
正常大鼠回肠给药降血糖试验
取SD大鼠（体重180～220 g），实验前12小时禁食，随机分组，每组5只。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，沿腹中线打开腹腔，取出10 cm左右的回肠段，用37℃预热的PBS清洗内容物，然后两端用线结扎成封闭肠环。待手术1 h血糖水平平稳后给药，向肠环内分别注入生理盐水、胰岛素PBS溶液（pH 7.4）、细胞穿膜肽胰岛素偶联物（INS-PEG2000-Tat、INS-PEG2000-R8、INS-PEG2000-Penetratin和INS-PEG2000-LMWP）的PBS溶液，给药剂量按胰岛素计为50 IU/kg。分别于给药前和给药后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8和10 h大鼠尾静脉取血，用血糖仪测定血糖值，观察降血糖效果。另取大鼠5只皮下注射胰岛素溶液（5 IU/kg），按上述时间点采血测血糖，计算相对药理生物利用度。
结果如图2所示，给予胰岛素溶液与生理盐水组0～10 h血糖水平没有降低，反而升高，这主要是手术引起的动物应激性反应。皮下注射组胰岛素降低程度最大，4 h后血糖回升速度也最快。而给予四种穿膜肽胰岛素偶联物组的大鼠血糖水平在0～4 h持续降低，4h后血糖水平缓慢升高。其中INS-PEG2000-Penetratin组效果最好，INS-PEG2000-Tat组次之，INS-PEG2000-R8和INS-PEG2000-LMWP组再次。经计算，Tat、R8、Penetratin和LMWP组的相对药理学生物利用度分别为9.6%、7.8%、10.9%和8.2%。药效实验结果表明，本发明提供的穿膜肽胰岛素偶联物肠道给药后均可显著地降低大鼠的血糖水平，这说明该偶联物可以促进胰岛素的经肠道吸收，提高药物的口服生物利用度。
Claims (5)
1.一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物制备方法，所述偶联物的结构如下所示：
其中，n 为 15～220；INS 代表胰岛素分子；CPPs 代表细胞穿膜肽分子；
其特征在于，细胞穿膜肽胰岛素偶联物制备方法具体步骤如下：所述细胞穿膜肽为穿膜素 Penetratin，序列 RQIKIWFQNRRMKWKKC，端基为半胱氨酸；
（1）将 CPPs 溶于 pH 8.5 的 PBS 溶液中，加入 DMMA，室温下反应 2～4 h；然后采用透析法除去未反应的 DMMA，得到溶液 A；DMMA 与 CPPs 的摩尔比为 20～100 : 1；（2）向溶液 A 中加入交联剂 NHS-PEG-MAL，室温孵育 0.5～2 h，使 CPPs 分子上的巯基与MAL发生反应，得到 NHS-PEG-CPPs；CPPs 与 NHS-PEG-MAL 的摩尔比为 1 ：1～10；
（3）将胰岛素溶于 pH 7.4 的 PBS 溶液中，滴加入 NHS-PEG-CPPs 中，室温孵育 1～2h，使胰岛素的氨基与 NHS 基团发生反应，然后将反应物在 37℃，pH 5.5 条件下脱掉DMMA，透析，冻干，得到偶联物；胰岛素与 NHS-PEG-CPPs 的摩尔比为 1 : 1～10。
2.根据权利要求 1 所述的一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物制备方法，其特征在于，所述交联剂 NHS-PEG-MAL 中 PEG 分子量为 1000～10000。
3.根据权利要求 1 所述的一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物制备方法，其特征在于，所述骤（1）和（3）中的透析是在含 20 mM EDTA 的 2% m/v 的氯化钠溶液中室温条件下进行，透析时间为 24～48 h。
4.根据权利要求 3 所述的一种细胞穿膜肽胰岛素偶联物制备方法，其特征在于，所述步骤（3）的冻干起始温度在零下 40℃。
5.一种如权利要求 1 所述的细胞穿膜肽胰岛素偶联物制备方法在制备糖尿病药物中的用。
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Patent Citations (1)
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|---|
| CPP Mediated Insulin Delivery: Current Status and Promising Future;Ergang Liu et al.;《Current Pharmaceutical Biotechnology》;20141231;第15卷;第240-255页 * |
| The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption;Huining He et al.;《Biomaterials》;20130714;第34卷;第7733-7743页 * |
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