CN111484568A - 一种壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种壳聚糖‑抗菌性多肽接枝聚合物及其制备方法和应用，涉及抗菌材料技术领域，该壳聚糖‑抗菌性多肽接枝聚合物包括壳聚糖以及接枝在壳聚糖上的抗菌性多肽。本发明提供的制备方法简单，可以获得通过聚乙二醇(PEG)连接的壳聚糖和抗菌性多肽接枝聚合物。本发明提供的壳聚糖‑抗菌性多肽接枝聚合物可以维持并提升抗菌性多肽的抗菌功能；同时，把抗菌性多肽接枝到壳聚糖上，可以降低抗菌性多肽的溶血性，提高其生物相容性，也可以提高壳聚糖的水溶性，发挥天然高分子的作用。

Description

一种壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及抗菌材料技术领域。更具体地，涉及一种壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，越来越多的致病菌对抗生素产生了耐药性，急需发展新型的抗菌剂。抗菌性多肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是生物体内存在的一种具有抗菌活性的肽类物质，氨基酸数目通常10-50个，常带正电荷，并具有广谱抗菌活性。AMPs是大多数生物对入侵病原体的先天性非特异性防御系统的重要组成部分，其具有独特的抗菌作用机制，迅速杀菌且不易引发细菌的耐药性，可单独或与抗生素联合使用杀伤病原体。传统的抗生素通常是针对单一的酶来控制代谢途径(例如脱氧核糖核酸、蛋白质及细胞壁的合成)，容易引起细菌的耐药性。与传统抗生素相比，大部分的抗菌性多肽显示出了多种生物活性，主要通过影响病原体的细胞质膜来发挥作用。因此，细菌必须要改变它们膜的组成和结构来对抗菌性多肽产生抗药性，但这对菌体本身也会造成严重的伤害，所以抗菌性多肽不容易引起细菌的耐药性。
抗菌性多肽的抗菌机理尚不明确，但普遍认同的一种机制是大多数抗菌性多肽所带的正电荷可以与细菌细胞膜表面的负电荷通过静电相互作用相结合，抗菌性多肽的疏水区域可以与细胞膜磷脂双分子层的疏水区通过疏水相互作用结合，再结合肽链的α螺旋结构来破坏细菌的细胞膜从而达到杀菌目的。尽管天然抗菌性多肽(蜂毒肽、蛙皮素等)抗菌效果非常好，但同时其对血液和哺乳动物细胞的毒性也非常高，蛋白酶稳定性低，提取困难等缺点也都限制了天然抗菌性多肽的应用。
壳聚糖作为自然界中广泛存在的甲壳素的脱乙酰化产物，是唯一的一种碱性阳离子多糖，其自身具有良好的生物相容性，且对真菌、细菌、寄生虫、甚至病毒有抑制和杀灭作用。目前，普遍认为壳聚糖的抗菌活性主要来自于它自身所带的正电荷，细菌细胞膜中一些膜脂成分如磷脂酰肌醇也带负电荷，壳聚糖与膜上的磷脂膜结合能导致膜蛋白变性，细菌细胞膜的通透性发生变化从而发挥其抗菌作用。但由于壳聚糖分子内以及分子间的作用，使其难溶于水以及一般的有机溶剂中，另外，其本身的抑菌性能不理想，限制了其作为抗菌制剂的应用。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物，以维持并提升抗菌性多肽的抑菌性能。
本发明的另一个目的在于提供一种壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物的制备方法。
为达到上述第一个目的，本发明采用下述技术方案：
一种壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物，包括壳聚糖以及接枝在壳聚糖上的抗菌性多肽。
优选地，所述壳聚糖与抗菌性多肽通过聚乙二醇链连接；所述聚乙二醇的分子量为 0～20000；其中，所述聚乙二醇的分子量不为0。
优选地，所述聚乙二醇链包括聚乙二醇，以及分别位于聚乙二醇两端的第一基团和第二基团；
所述聚乙二醇链通过第一基团与壳聚糖反应连接，所述聚乙二醇链通过第二基团与抗菌性多肽连接。
优选地，所述第一基团为-N-羟基琥珀酰亚胺基团、-羧基、-叠氮基、-炔基、-双键、- 马来酰亚胺、-巯基和-酰氯中的任意一种；所述第二基团为-N-羟基琥珀酰亚胺基团、-羧基、-叠氮基、-炔基、-双键、-马来酰亚胺、-巯基和-酰氯中的任意一种。
优选地，所述抗菌性多肽的端基修饰有-巯基、-叠氮基、-炔基、-双键或-马来酰亚胺。
优选地，所述抗菌性多肽从N端到C端的氨基酸序列为(LKLLKKLLKKLKKLLKKL) 4中连续的4-72个氨基酸序列，或者为(KKLL)n+K；其中，n＝1～30。
优选地，所述抗菌性多肽从N端到C端的氨基酸序列为(LKKLLKKLKKLLKKLLKL) 4中连续的4-72个氨基酸序列，或者为K+(LLKK)n；其中，n＝1～30。
本发明还提供一种如上任一所述的壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物在制备抑菌、抗菌、杀菌消毒、修复、消炎、镇痛、止痒、凝血、止血、伤口愈合药物中的应用。
根据本发明的第二个目的，本发明提供一种壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物的制备方法，至少包括以下步骤：
将聚乙二醇链的一端与壳聚糖反应连接，将抗菌性多肽通过点击化学反应接枝到连接有聚乙二醇链的壳聚糖上，得到壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物；
其中，所述聚乙二醇链包括聚乙二醇，以及分别位于聚乙二醇两端的第一基团和第二基团；所述聚乙二醇链通过第一基团与壳聚糖反应连接，所述聚乙二醇链通过第二基团与抗菌性多肽连接。
优选地，所述第一基团为-N-羟基琥珀酰亚胺基团、-羧基、-叠氮基、-炔基、-双键、- 马来酰亚胺、-巯基和-酰氯中的任意一种；
所述第二基团为-N-羟基琥珀酰亚胺基团、-羧基、-叠氮基、-炔基、-双键、-马来酰亚胺、-巯基和-酰氯中的任意一种；
所述抗菌性多肽的端基修饰有-巯基、-叠氮基、-炔基、-双键或-马来酰亚胺。
优选地，当第一基团为-羧基时，聚乙二醇链与壳聚糖反应连接的具体步骤为：
将壳聚糖溶于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中形成溶液1，将带有-羧基基团的聚乙二醇链加入缓冲液中形成溶液2，在溶液2中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺活化羧基，振荡5-120分钟后将溶液1与溶液2混匀，振荡6-72小时，将样品透析、冻干得到连接有聚乙二醇的壳聚糖。
优选地，当第一基团为-N-羟基琥珀酰亚胺时，聚乙二醇链与壳聚糖反应连接的具体步骤为：
将壳聚糖与带有-N-羟基琥珀酰亚胺基团的聚乙二醇链溶于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES) 缓冲液中，振荡30分钟到72小时，将样品透析、冻干得到连接有聚乙二醇的壳聚糖。
优选地，当第一基团为-酰氯时，聚乙二醇链与壳聚糖反应连接的具体步骤为：
将壳聚糖溶于甲磺酸中，一端修饰酰氯基团的聚乙二醇也溶于甲磺酸中然后逐滴加入壳聚糖溶液中，反应1-72小时，反应结束后溶液用过量的丙酮沉淀和洗涤，然后透析、冻干得到连接有聚乙二醇的壳聚糖。
优选地，当第二基团为-叠氮或-炔基、抗菌性多肽的端基修饰有-炔基或叠氮时，将抗菌性多肽通过点击化学反应接枝到连接有聚乙二醇的壳聚糖上的步骤具体为：
将连接有叠氮或炔基的聚乙二醇修饰的壳聚糖和修饰有炔基或叠氮的抗菌性多肽共同溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，加入催化剂溶液，振荡反应10分钟到48小时，反应完成后，加入过量的乙二胺四乙酸，振荡、透析、冻干得最终样品；
其中，所述催化剂溶液包括0.5M的硫酸铜、1M的抗坏血酸钠和1M的氨基胍。
优选地，当第二基团为-巯基或者-马来酰亚胺、所述抗菌性多肽的端基修饰有-马来酰亚胺或巯基时，将抗菌性多肽通过点击化学反应接枝到连接有聚乙二醇的壳聚糖上的步骤具体为：
将连接有-巯基或-马来酰亚胺基团的聚乙二醇修饰的壳聚糖和修饰有马来酰亚胺基团或巯基的抗菌性多肽共同溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，氩气置换一段时间得到无氧反应环境，搅拌10分钟到48小时，反应完成后透析、冻干得最终样品。
优选地，当第二基团为-巯基或-双键、所述抗菌性多肽的端基修饰有-双键或-巯基时，将抗菌性多肽通过点击化学反应接枝到连接有聚乙二醇的壳聚糖上的步骤具体为：
将连接有-巯基或-双键基团的聚乙二醇修饰的壳聚糖和修饰有-双键或-巯基的抗菌性多肽共同溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，氩气置换一段时间得到无氧反应环境，加入一定量DMPA催化剂，在365nm波长紫外的照射下搅拌10分钟到48小时，反应完成后透析、冻干得最终样品。
本发明的有益效果如下：
本发明制备了一种壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物，可以解决天然抗菌性多肽提取困难的问题，又能维持并提升抗菌性多肽的抗菌功能；同时，把抗菌性多肽接枝到壳聚糖上可以降低抗菌性多肽的溶血性，提高其生物相容性，也可以提高壳聚糖的水溶性，发挥天然高分子的作用。此外，本发明中通过PEG柔性链连接抗菌性多肽和壳聚糖，不仅可以提高接枝物的水溶性，还可以使抗菌性多肽的两端自由折叠，从而维持抗菌性多肽在溶液中的α螺旋二级构象，进而充分发挥接枝物中抗菌性多肽的抗菌作用。
另一方面，本发明还提供一种壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物的制备方法，利用该方法制备壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物，不仅可以提高接枝物的水溶性，还能维持抗菌性多肽在溶液中的α螺旋二级构象，提升接枝聚合物的抗菌性能。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出本发明实施例22中抗菌性多肽LKLLKKLLKKLKKLLKKL-NH2的圆二色谱图。
图2示出本发明实施例22中抗菌性多肽(KKLL)3K-NH2的圆二色谱图。
图3示出本发明实施例22中抗菌性多肽LKLLKKLLKKLKKC-NH2的圆二色谱图。
图4示出本发明实施例33中壳聚糖-抗菌性多肽的核磁谱图。
图5示出本发明实施例34中抗菌性多肽接枝前后的圆二色谱图
图6示出本发明实施例36中抗菌性多肽接枝前后的溶血率。
图7(a)示出本发明实施例37中对照组的绿脓杆菌扫描电镜图；(b)示出本发明实施例37中实验组的绿脓杆菌扫描电镜图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
第一方面，本发明提供一种壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物，包括壳聚糖以及接枝在壳聚糖上的抗菌性多肽。该接枝聚合物可以解决天然抗菌性多肽提取困难的问题，又能维持并提升抗菌性多肽的抗菌功能；同时，把抗菌性多肽接枝到壳聚糖上可以降低抗菌性多肽的溶血性，提高其生物相容性，也可以提高壳聚糖的水溶性，发挥天然高分子的作用。
优选地，所述壳聚糖与抗菌性多肽通过聚乙二醇链连接；所述聚乙二醇的分子量为 0～20000；其中，所述聚乙二醇的分子量不为0。通过聚乙二醇(PEG)柔性链连接抗菌性多肽和壳聚糖，不仅可以提高接枝物的水溶性，还可以使抗菌性多肽的两端自由折叠，从而维持抗菌性多肽在溶液中的α螺旋二级构象，进而充分发挥接枝物中抗菌性多肽的抗菌作用。
优选地，所述聚乙二醇链包括聚乙二醇，以及分别位于聚乙二醇两端的第一基团和第二基团；所述聚乙二醇链通过第一基团与壳聚糖反应连接，所述聚乙二醇链通过第二基团与抗菌性多肽连接。
进一步优选地，所述第一基团为-N-羟基琥珀酰亚胺基团、-羧基、-叠氮基、-炔基、- 双键、-马来酰亚胺、-巯基和-酰氯中的任意一种；所述第二基团为-N-羟基琥珀酰亚胺基团、-羧基、-叠氮基、-炔基、-双键、-马来酰亚胺、-巯基和-酰氯中的任意一种。
优选地，所述抗菌性多肽的端基修饰有-巯基、-叠氮基、-炔基、-双键或-马来酰亚胺，便于通过酰化反应将该抗菌性多肽接枝到壳聚糖上发挥作用。
优选地，所述抗菌性多肽从N端到C端的氨基酸序列为基础序列SEQ ID NO.1的4次重复序列中连续的4-72个氨基酸序列，即为(LKLLKKLLKKLKKLLKKL)4中连续的 4-72个氨基酸序列；或者为基础序列SEQ ID NO.2的n次重复序列末端加K，即为(KKLL) n+K；其中，n＝1～30。本领域技术人员可以理解的是，所述氨基酸序列可以是 (LKLLKKLLKKLKKLLKKL)4中任意连续的4-72个氨基酸序列，或者为(KKLL)n+K，且n可以为1～30中的任意整数。
本发明提供的这些氨基酸序列，虽然只包括两种氨基酸，即亲水的赖氨酸(K)和疏水的亮氨酸(L)，但是却拥有天然抗菌性多肽发挥抗菌作用的关键因素：带有正电荷、有疏水域、两亲性、α螺旋二级构象等。所以此简易序列的抗菌性多肽可以代表多数天然抗菌性多肽作为一种模板肽使用。
据上所述，本发明中抗菌性多肽的氨基酸序列可以根据需要进行选择。例如，所述抗菌性多肽的氨基酸序列可以为：KLLK(4肽)，KKLL(4肽)，LKLLKKLLK(9肽)， KLLKKLLKK(9肽)，LKLLKKLLKKLKK(13肽)，KKLLKKLKKLLKK(13肽)， LKLLKKLLKKLKKLLKKL(18肽)，KKLKKLLKKLLKLLKKLL(18肽)， LKLLKKLLKKLKKLLKKLLKLLKK(24肽)，KKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKK(24 肽)，LKLLKKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKKLK(30肽)，KKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKKLKKLLK(30肽)， LKLLKKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKKLKKLLKKL(36肽)， (LKLLKKLLKKLKKLLKKL)3(54肽)，(LKLLKKLLKKLKKLLKKL)4(72肽),KKLLK,KKLLKKLLKKLLK。
在本发明的另一种优选实施方式中，所述抗菌性多肽从N端到C端的氨基酸序列为基础序列SEQ ID NO.3的4次重复序列中连续的4-72个氨基酸序列，即为(LKKLLKKLKKLLKKLLKL)4中连续的4-72个氨基酸序列，或者为基础序列SEQ ID NO.4的n次重复序列前端加K，即K+(LLKK)n；其中，n＝1～30。该技术方案是将实施方式中的抗菌性多肽氨基酸序列倒置得到的序列。通过研究发现，序列倒置之后得到的抗菌性多肽可以具备相似的结构和功能，也带有正电荷、有疏水域、两亲性、α螺旋二级构象等，可以作为抗菌性多肽使用。
本发明还提供一种如上任一所述的壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物在制备抑菌、抗菌、杀菌消毒、修复、消炎、镇痛、止痒、凝血、止血、伤口愈合药物中的应用。
根据本发明的第二个目的，本发明提供一种壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物的制备方法，至少包括以下步骤：
将聚乙二醇链的一端与壳聚糖反应连接，将抗菌性多肽通过点击化学反应接枝到连接有聚乙二醇链的壳聚糖上，得到壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物；
其中，所述聚乙二醇链包括聚乙二醇，以及分别位于聚乙二醇两端的第一基团和第二基团；所述聚乙二醇链通过第一基团与壳聚糖反应连接，所述聚乙二醇链通过第二基团与抗菌性多肽连接。
优选地，所述第一基团为-N-羟基琥珀酰亚胺基团、-羧基、-叠氮基、-炔基、-双键、- 马来酰亚胺、-巯基和-酰氯中的任意一种；
所述第二基团为-N-羟基琥珀酰亚胺基团、-羧基、-叠氮基、-炔基、-双键、-马来酰亚胺、-巯基和-酰氯中的任意一种；
所述抗菌性多肽的端基修饰有-巯基、-叠氮基、-炔基、-双键或-马来酰亚胺。
优选地，当第一基团为-羧基时，聚乙二醇链与壳聚糖反应连接的具体步骤为：
将壳聚糖溶于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中形成溶液1，将带有-羧基基团的聚乙二醇链加入缓冲液中形成溶液2，在溶液2中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺活化羧基，振荡5-120分钟后将溶液1与溶液2混匀，振荡6-72小时，此处的反应温度优选为室温或4℃，将样品透析、冻干得到连接有聚乙二醇的壳聚糖。
优选地，当第一基团为-N-羟基琥珀酰亚胺时，聚乙二醇链与壳聚糖反应连接的具体步骤为：
将壳聚糖与带有-N-羟基琥珀酰亚胺基团的聚乙二醇链溶于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES) 缓冲液中，振荡30分钟到72小时，此处的反应温度优选为室温或4℃，将样品透析、冻干得到连接有聚乙二醇的壳聚糖。
优选地，当第一基团为-酰氯时，聚乙二醇链与壳聚糖反应连接的具体步骤为：
将壳聚糖溶于甲磺酸中，一端修饰酰氯基团的聚乙二醇也溶于甲磺酸中然后逐滴加入壳聚糖溶液中，反应1-72小时，反应结束后溶液用过量的丙酮沉淀和洗涤，然后透析、冻干得到连接有聚乙二醇的壳聚糖。
优选地，当第二基团为-叠氮或-炔基、抗菌性多肽的端基修饰有-炔基或叠氮时，将抗菌性多肽通过点击化学反应接枝到连接有聚乙二醇的壳聚糖上的步骤具体为：
将连接有叠氮或炔基的聚乙二醇修饰的壳聚糖和修饰有炔基或叠氮的抗菌性多肽共同溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，加入催化剂溶液，振荡反应10分钟到48小时，此处的反应温度优选为室温或4℃，反应完成后，加入过量的乙二胺四乙酸，振荡、透析、冻干得最终样品；
其中，所述催化剂溶液包括0.5M的硫酸铜、1M的抗坏血酸钠和1M的氨基胍。
优选地，当第二基团为-巯基或者-马来酰亚胺、所述抗菌性多肽的端基修饰有-马来酰亚胺或巯基时，将抗菌性多肽通过点击化学反应接枝到连接有聚乙二醇的壳聚糖上的步骤具体为：
将连接有-巯基或-马来酰亚胺基团的聚乙二醇修饰的壳聚糖和修饰有马来酰亚胺基团或巯基的抗菌性多肽共同溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，氩气置换一段时间得到无氧反应环境，搅拌10分钟到48小时，反应完成后透析、冻干得最终样品。
优选地，当第二基团为-巯基或-双键、所述抗菌性多肽的端基修饰有-双键或-巯基时，将抗菌性多肽通过点击化学反应接枝到连接有聚乙二醇的壳聚糖上的步骤具体为：
将连接有-巯基或-双键基团的聚乙二醇修饰的壳聚糖和修饰有-双键或-巯基的抗菌性多肽共同溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，氩气置换一段时间得到无氧反应环境，加入一定量DMPA催化剂，在365nm波长紫外的照射下搅拌10分钟到48小时，反应完成后透析、冻干得最终样品。
实施例1
抗菌性多肽的氨基酸序列为LKLLKKLLKKLKKLLKKL(18肽)，抗菌性多肽结构式为LKLLKKLLKKLKKLLKKL-NH2。
注：在抗菌性多肽的结构式中C端含有-NH2，本领域技术人员可以理解的是，抗菌性多肽的羧基酰胺化属于抗菌性多肽的常规处理方法。
上述抗菌性多肽的制备方法：
一.树脂溶胀
将一定量树脂放入反应管中，加DCM(二氯甲烷)，振荡30min溶胀树脂。
二.脱保护
将树脂用DMF(二甲基甲酰胺)洗三遍，用脱保护液DBLK(哌啶与DMF的混合液) 去保护15分钟，再用DMF洗六遍。
三.接第一个氨基酸
滤掉溶剂后加入3倍摩尔过量的Fmoc-Leu-OH氨基酸，3倍摩尔过量的缩合剂TBTU/DIEA/DMF(TBTU：O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸；DIEA：N,N-二异丙基乙胺)，反应半小时后进行检测，溶液亮黄，树脂淡黄即检测合格。
四.脱保护
将样品用DMF(二甲基甲酰胺)洗三遍，用脱保护液DBLK(哌啶与DMF的混合液) 去保护15分钟，再用DMF洗六遍。
五.缩合
重复第三步骤偶联下一个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH，反应半小时后进行检测，检测合格(溶液亮黄，树脂淡黄)后重复第四步骤脱保护，从右到左依次连接序列中的氨基酸。
六.最后一个氨基酸连接后，DBLK溶液去保护15分钟。
七.用DMF、DCM、甲醇各洗3遍，收缩，用切割液切割后将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚层析出来，再用乙醚洗六次，然后常温挥干，即得粗品肽序。处理氧化后用HPLC 纯化抗菌性多肽。
需要说明的是，抗菌性多肽的制备方法属于本领域常规实验方法，以上实验步骤只是能够实现抗菌性多肽制备的一种常用步骤。本领域技术人员也可以对该方法中的某些参数进行替换，能够得到本发明保护的抗菌性多肽即可，本发明对此不作进一步限制。
实施例2
抗菌性多肽氨基酸序列为KKLL(4肽)以及倒序LLKK(4肽)，抗菌性多肽结构式为KKLL-NH2和LLKK-NH2。
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的氨基酸序列来进行。
实施例3
抗菌性多肽氨基酸序列为LKLLKKLLK(9肽)以及倒序KLLKKLLKL，抗菌性多肽结构式为LKLLKKLLK-NH2和KLLKKLLKL-NH2
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的氨基酸序列来进行。
实施例4
抗菌性多肽氨基酸序列为LKLLKKLLKKLKK(13肽)，以及倒序KKLKKLLKKLLKL，抗菌性多肽结构式为LKLLKKLLKKLKK-NH2和KKLKKLLKKLLKL-NH2
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的氨基酸序列来进行。
实施例5
抗菌性多肽氨基酸序列为KKLKKLLKKLLKLLKKLL(18肽)以及倒序LLKKLLKLLKKLLKKLKK，抗菌性多肽结构式为KKLKKLLKKLLKLLKKLL-NH2和LLKKLLKLLKKLLKKLKK-NH2
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的氨基酸序列来进行。
实施例6
抗菌性多肽氨基酸序列为LKLLKKLLKKLKKLLKKLLKLLKK(24肽)以及倒序KKLLKLLKKLLKKLKKLLKKLLKL，抗菌性多肽结构式为 LKLLKKLLKKLKKLLKKLLKLLKK-NH2和KKLLKLLKKLLKKLKKLLKKLLKL-NH2。
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的氨基酸序列来进行。
实施例7
抗菌性多肽氨基酸序列为LKLLKKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKKLK(30肽)以及倒序KLKKLLKKLLKLLKKLLKKLKKLLKKLLKL，抗菌性多肽结构式为LKLLKKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKKLK-NH2和 KLKKLLKKLLKLLKKLLKKLKKLLKKLLKL-NH2
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的氨基酸序列来进行。
实施例8
抗菌性多肽氨基酸序列为LKLLKKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKKLKKLLKKL(36 肽)，以及倒序LKKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKKLKKLLKKLLKL，抗菌性多肽结构式为LKLLKKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKKLKKLLKKL-NH2和 LKKLLKKLKKLLKKLLKLLKKLLKKLKKLLKKLLKL-NH2。
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的氨基酸序列来进行。
实施例9
抗菌性多肽氨基酸序列为(KKLKKLLKKLLKLLKKLL)3(54肽)以及倒序(LLKKLLKLLKKLLKKLKK)3，抗菌性多肽结构式为(KKLKKLLKKLLKLLKKLL)3-NH2和(LLKKLLKLLKKLLKKLKK)3-NH2
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的氨基酸序列来进行。
实施例10
抗菌性多肽氨基酸序列为(KKLKKLLKKLLKLLKKLL)4(72肽)以及倒序(LLKKLLKLLKKLLKKLKK)4，抗菌性多肽结构式为(KKLKKLLKKLLKLLKKLL)4-NH2和(LLKKLLKLLKKLLKKLKK)4-NH2
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的氨基酸序列来进行。
实施例11
抗菌性多肽氨基酸序列为KKLLK，以及倒序KLLKK，抗菌性多肽结构式为 KKLLK-NH2和KLLKK-NH2。
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的序列来进行。
实施例12
抗菌性多肽氨基酸序列为(KKLL)3K，以及倒序KLLKKLLKKLLKK，抗菌性多肽结构式为(KKLL)3K-NH2和KLLKKLLKKLLKK-NH2。
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按本实施例的序列来进行。
实施例13
抗菌性多肽氨基酸序列为(KKLL)10K，以及倒序K(LLKK)10，抗菌性多肽结构式为(KKLL)10K-NH2和K(LLKK)10-NH2。
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按本实施例的序列来进行。
实施例14
抗菌性多肽氨基酸序列为(KKLL)20K，以及倒序K(LLKK)20，抗菌性多肽结构式为(KKLL)20K-NH2和K(LLKK)20-NH2。
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按本实施例的序列来进行。
实施例15
抗菌性多肽氨基酸序列为(KKLL)30K，以及倒序K(LLKK)30，抗菌性多肽结构式为(KKLL)30K-NH2和K(LLKK)30-NH2。
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按本实施例的序列来进行。
实施例16
抗菌性多肽氨基酸序列为LKLLKKLLKKLKK(13肽)，在抗菌性多肽C端或N端添加炔丙基甘氨酸(PRA)来使抗菌性多肽端基修饰上炔基，增加抗菌性多肽的功能性和抗菌性，抗菌性多肽结构式为LKLLKKLLKKLKK-PRA-NH2(C端)； NH2-PRA-LKLLKKLLKKLKK(N端)
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的序列来进行。
实施例17
抗菌性多肽氨基酸序列为(KKLL)3K，在抗菌性多肽C端或N端添加炔丙基甘氨酸(PRA)来使抗菌性多肽端基修饰上炔基，增加抗菌性多肽的功能性和抗菌性，抗菌性多肽结构式为(KKLL)3K-PRA-NH2(C端)；NH2-PRA-(KKLL)3K(N端)。
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的序列来进行。
实施例18
抗菌性多肽氨基酸序列为LKLLKKLLKKLKK(13肽)，在抗菌性多肽C端或N端添加半胱氨酸来使抗菌性多肽端基修饰上巯基，增加抗菌性多肽的功能性和抗菌性，抗菌性多肽结构式为LKLLKKLLKKLKK-C-NH2(C端)；NH2-C-LKLLKKLLKKLKK(N端)
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的序列来进行。
实施例19
抗菌性多肽氨基酸序列为(KKLL)3K，在抗菌性多肽C端或N端添加半胱氨酸来使抗菌性多肽端基修饰上巯基，增加抗菌性多肽的功能性和抗菌性，抗菌性多肽结构式为(KKLL)3K-C-NH2(C端)；NH2-C-(KKLL)3K(N端)。
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的序列来进行。
实施例20
抗菌性多肽氨基酸序列为LKLLKKLLKKLKK(13肽)，在抗菌性多肽C端或N端添加叠氮赖氨酸来使抗菌性多肽端基修饰上叠氮基团，增加抗菌性多肽的功能性和抗菌性，抗菌性多肽结构式为LKLLKKLLKKLKK-Lys(N3)-NH2(C端)；NH2- Lys(N3)-LKLLKKLLKKLKK(N端)
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的序列来进行。
实施例21
抗菌性多肽氨基酸序列为(KKLL)3K，在抗菌性多肽C端或N端添加叠氮赖氨酸来使抗菌性多肽端基修饰上巯基，增加抗菌性多肽的功能性和抗菌性，抗菌性多肽结构式为(KKLL)3K-Lys(N3)-NH2(C端)；NH2-Lys(N3)-(KKLL)3K(N端)。
上述抗菌性多肽的制备步骤与实施例1基本相同，不同之处在于偶联氨基酸的顺序要按照本实施例的序列来进行。
实施例22
对本发明制备得到的抗菌性多肽进行二级结构测定：
以LKLLKKLLKKLKKLLKKL-NH2、(KKLL)3K-NH2、LKLLKKLLKKLKK-C-NH2为例，采用圆二色谱法，检测抗菌性多肽在十二烷基磺酸钠(SDS)中的二级结构。将上述三种抗菌性多肽分别稀释到25mM的SDS溶液中，使抗菌性多肽终浓度固定在0.1mM，测量选取光程为1mm的石英样品池，扫描范围为190nm-250nm。在室温下进行所有实验，测量结果如图1、-图3所示。从图中看出，α螺旋在208nm和222nm存在两个负峰。
实施例23
壳聚糖2位氨基与聚乙二醇链连接，以第一基团为羧基基团的聚乙二醇(分子量100) 链为例
将一定量壳聚糖溶于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中形成溶液1，将带有羧基基团的聚乙二醇链加入缓冲液中形成溶液2，在溶液2中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺活化羧基，室温或4℃振荡5-120分钟后将溶液1与溶液2混匀，室温或4℃振荡6-72小时，将样品透析、冻干得到连接有聚乙二醇的壳聚糖。
实施例24
壳聚糖2位氨基与聚乙二醇链连接，以第一基团为羧基基团的聚乙二醇(分子量1000) 链为例
将一定量壳聚糖溶于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中形成溶液1，将带有羧基基团的聚乙二醇链加入缓冲液中形成溶液2，在溶液2中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺活化羧基，室温或4℃振荡5-120分钟后将溶液1与溶液2混匀，室温或4℃振荡6-72小时，将样品透析、冻干得到连接有聚乙二醇的壳聚糖。
实施例25
壳聚糖2位氨基与聚乙二醇链连接，以第一基团为羧基基团的聚乙二醇(分子量5000) 为例
将一定量壳聚糖溶于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中形成溶液1，将带有羧基基团的聚乙二醇链加入缓冲液中形成溶液2，在溶液2中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺活化羧基，室温或4℃振荡5-120分钟后将溶液1与溶液2混匀，室温或4℃振荡6-72小时，将样品透析、冻干得到连接有聚乙二醇的壳聚糖。
实施例26
壳聚糖2位氨基与聚乙二醇链连接，以第一基团为羧基基团的聚乙二醇(分子量10000) 链为例
将一定量壳聚糖溶于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中形成溶液1，将带有羧基基团的聚乙二醇链加入缓冲液中形成溶液2，在溶液2中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺活化羧基，室温或4℃振荡5-120分钟后将溶液1与溶液2混匀，室温或4℃振荡6-72小时，将样品透析、冻干得到连接有聚乙二醇的壳聚糖。
实施例27
壳聚糖2位氨基与聚乙二醇连接，以第一基团为羧基基团的聚乙二醇(分子量20000) 链为例
将一定量壳聚糖溶于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中形成溶液1，将带有羧基基团的聚乙二醇链加入缓冲液中形成溶液2，在溶液2中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺活化羧基，室温或4℃振荡5-120分钟后将溶液1与溶液2混匀，室温或4℃振荡6-72小时，将样品透析、冻干得到连接有聚乙二醇的壳聚糖；
实施例28
壳聚糖2位氨基与聚乙二醇连接，以第一基团为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团的聚乙二醇(分子量1000)链为例
将壳聚糖与带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团的聚乙二醇链溶于2-(N-吗啉)乙磺酸 (MES)缓冲液中，室温或4℃振荡30分钟到72小时，将样品透析、冻干得到连接有聚乙二醇的壳聚糖。
实施例29
壳聚糖6位氨基与聚乙二醇连接，以第一基团为酰氯基团的聚乙二醇(分子量1000) 链为例
将一定量壳聚糖溶于甲磺酸中，一端修饰酰氯基团的聚乙二醇链也溶于甲磺酸中然后逐滴加入壳聚糖溶液中，室温反应1-72小时，反应结束后溶液用过量的丙酮沉淀和洗涤，然后透析、冻干得到连接有聚乙二醇的壳聚糖。
实施例30
将抗菌性多肽通过点击化学反应接枝到带有修饰基团的聚乙二醇修饰的壳聚糖上
以LKLLKKLLKKLKK-NH2抗菌性多肽为例；
以第二基团为叠氮或者炔基、所述抗菌性多肽的端基修饰有-炔基或者叠氮为例，将抗菌性多肽通过点击化学反应接枝到连接有聚乙二醇的壳聚糖上的步骤具体为：
将连接有叠氮或炔基的聚乙二醇修饰的壳聚糖和修饰有炔基或叠氮的抗菌性多肽共同溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，加入催化剂溶液，室温或者4度振荡反应10分钟到48小时，反应完成后，加入过量的乙二胺四乙酸，振荡、透析、冻干得最终样品；
其中，所述催化剂溶液包括0.5M的硫酸铜、1M的抗坏血酸钠和1M的氨基胍。
实施例31
将抗菌性多肽通过点击化学反应接枝到带有修饰基团的聚乙二醇修饰的壳聚糖上；
以LKLLKKLLKKLKK-NH2为例；
以第二基团为巯基或者马来酰亚胺基团、所述抗菌性多肽的端基修饰有马来酰亚胺基团或者巯基为例，将抗菌性多肽通过点击化学反应接枝到连接有聚乙二醇的壳聚糖上的步骤具体为：
将连接有巯基或马来酰亚胺基团的聚乙二醇修饰的壳聚糖和修饰有马来酰亚胺基团或巯基的抗菌性多肽共同溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，氩气置换一段时间得到无氧反应环境，室温搅拌10分钟到48小时，反应完成后透析、冻干得最终样品。
实施例32
将抗菌性多肽通过点击化学反应接枝到带有修饰基团的聚乙二醇修饰的壳聚糖上；
以LKLLKKLLKKLKK-NH2为例；
以第二基团为巯基或者双键基团、所述抗菌性多肽的端基修饰有双键基团或者巯基为例，将抗菌性多肽通过点击化学反应接枝到连接有聚乙二醇的壳聚糖上的步骤具体为：
将连接有巯基或双键基团的聚乙二醇修饰的壳聚糖和修饰有双键基团或巯基的抗菌性多肽共同溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，氩气置换一段时间得到无氧反应环境，加入一定量DMPA催化剂，在365nm波长紫外的照射下室温搅拌10分钟到48小时，反应完成后透析、冻干得最终样品。
实施例33
抗菌性多肽接枝壳聚糖的核磁(以LKLLKKLLKKLKK-NH2为例，以多肽C端修饰炔基和壳聚糖上修饰叠氮为例)
准备好C端修饰炔基的抗菌性多肽、修饰叠氮基团的壳聚糖和最终抗菌性多肽接枝的壳聚糖，然后每种样品取3-5mg溶于氘代水中做核磁分析，获得表征结构的核磁谱图，如图4所示，壳聚糖接枝抗菌性多肽(CS-LK)的核磁谱图上既有抗菌性多肽的特征峰也有壳聚糖特征峰，说明抗菌性多肽成功地接枝到了壳聚糖分子上。
实施例34
壳聚糖通过聚乙二醇(分子量1000为例)与抗菌性多肽(以LKLLKKLLKKLKK-NH2为例)相连前后抗菌性多肽二级构象的变化。
采用圆二色谱法，检测抗菌性多肽和接枝物在十二烷基磺酸钠(SDS)中的二级结构。将样品分别稀释到25mM的SDS溶液中，使抗菌性多肽终浓度固定在0.1mM，测量选取光程为1mm的石英样品池，扫描范围为190nm-250nm。在室温下进行所有实验，测量结果如图5所示。从图5中看出，接枝前后α螺旋在208nm和222nm均存在两个负峰，且α螺旋程度基本不变。
实施例35
抗菌性多肽接枝壳聚糖的抗菌效果(以LKLLKKLLKKLKK-NH2为例)
将样品用微量肉汤稀释法测试其抗菌效果，具体方法为：先配浓度为4mg/ml的样品，在96孔板中的每个孔板预先加上100ul肉汤，然后第一列孔加100ul样品原液，将第一列溶液混匀，然后取出100ul加入到第二列孔，再混匀，再从第二列取出100ul加入到第三列，以此类推，到第十列混匀后把多余的100ul吸出弃掉，样品逐级稀释完后在每个孔里加入浓度为105CFU/ml的菌液，菌液预先用肉汤稀释，第11列只加肉汤200ul作阴性对照，第12 列加100ul肉汤和100ul菌液而不加样品做阳性对照。将加完菌液的96孔板放入37℃恒温培养箱培养12-16个小时后，在每个孔板中加入20ul浓度为0.625mg/ml的刃天青指示剂，加入后放回培养箱，培养2-4小时后有明显颜色变化时就可以得到最小抑菌浓度(minimuminhibitory concentration，MIC)。测量结果如下表1所示：表格中数据表明抗菌性多肽在接枝到壳聚糖上之后依然保持优异的抗菌性能。
表1抗菌性多肽接枝到壳聚糖前后的最小抑菌浓度(MIC)
Figure BDA0001957824230000131
实施例36
抗菌性多肽接枝壳聚糖的红细胞溶血性表征(以LKLLKKLLKKLKK-NH2为例)
取新鲜兔血5ml，通过1000g的离心力离心10min得到红细胞，用三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液(10mM Tris,150mM NaCl，pH＝7.2)将红细胞洗三次，直到上清液澄清，再将红细胞用缓冲液稀释到5％(v/v)的体积浓度，取500ul不同浓度梯度的样品与500ul红细胞溶液混合，37℃培养1小时，然后用1000g离心10min，取100ul上清液转移到新的96孔板中，再加入100ul缓冲液，再用酶标仪测定每孔540nm的吸光度，纯水完全溶血做阳性对照，缓冲液做阴性对照。然后根据公式溶血率＝(H-H0)/(H100-H0) *100％(H为与样品作用后的吸光度，H0为阴性对照，H100为阳性对照)算得样品的红细胞溶血率。如图6所示，抗菌性多肽接枝到壳聚糖上之后溶血性得到了降低。
实施例37
抗菌性多肽接枝壳聚糖的抗菌机理表征-扫描电镜图。
绿脓杆菌37度培养过夜，取菌液离心，3000g，5min离心完去上清，再加磷酸盐缓冲液清洗细菌沉淀，将菌液分为对照组和实验组，实验组与一定浓度的抗菌性多肽接枝的壳聚糖相互作用1小时，对照组与等量的缓冲液相互作用1小时，然后加入2.5％戊二醛溶液 4度过夜固定，固定结束后再离心去上清，再加磷酸盐缓冲液清洗两次，然后收集的细菌用梯度酒精(20％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，100％)进行连续脱水，每个梯度洗10分钟，离心5分钟，最后取10ul菌液滴到铜台上的硅片上，自然晾干，喷金，看电镜。结果如图7所示，空白菌体相对光滑完整；与样品作用后的菌体褶皱塌缩并伴有囊泡状突起，说明样品通过破坏细菌细胞膜来起到抗菌效果。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
<110> 中国科学院理化技术研究所
<120> 一种壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物及其制备方法和应用
<130> JLC19I0013E
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Lys Lys Leu Leu Lys
1 5 10 15
Lys Leu
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Lys Lys Leu Leu
1
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu
1 5 10 15
Lys Leu
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Leu Leu Lys Lys
1

Claims (16)

1.一种壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物，其特征在于，包括壳聚糖以及接枝在壳聚糖上的抗菌性多肽。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物，其特征在于，所述壳聚糖与抗菌性多肽通过聚乙二醇链连接；所述聚乙二醇的分子量为0～20000；其中，所述聚乙二醇的分子量不为0。
3.根据权利要求2所述的壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物，其特征在于，所述聚乙二醇链包括聚乙二醇，以及分别位于聚乙二醇两端的第一基团和第二基团；
所述聚乙二醇链通过第一基团与壳聚糖反应连接，所述聚乙二醇链通过第二基团与抗菌性多肽连接。
4.根据权利要求3所述的壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物，其特征在于，所述第一基团为-N-羟基琥珀酰亚胺基团、-羧基、-叠氮基、-炔基、-双键、-马来酰亚胺、-巯基和-酰氯中的任意一种；所述第二基团为-N-羟基琥珀酰亚胺基团、-羧基、-叠氮基、-炔基、-双键、-马来酰亚胺、-巯基和-酰氯中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物，其特征在于，所述抗菌性多肽的端基修饰有-巯基、-叠氮基、-炔基、-双键或-马来酰亚胺。
6.根据权利要求1所述的壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物，其特征在于，所述抗菌性多肽从N端到C端的氨基酸序列为(LKLLKKLLKKLKKLLKKL)4中连续的4-72个氨基酸序列，或者为(KKLL)n+K；其中，n＝1～30。
7.根据权利要求1所述的壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物，其特征在于，所述抗菌性多肽从N端到C端的氨基酸序列为(LKKLLKKLKKLLKKLLKL)4中连续的4-72个氨基酸序列，或者为K+(LLKK)n；其中，n＝1～30。
8.一种如权利要求1-7任一所述的壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物在制备抑菌、抗菌、杀菌消毒、修复、消炎、镇痛、止痒、凝血、止血、伤口愈合药物中的应用。
9.一种壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物的制备方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
将聚乙二醇链的一端与壳聚糖反应连接，将抗菌性多肽通过点击化学反应接枝到连接有聚乙二醇链的壳聚糖上，得到壳聚糖-抗菌性多肽接枝聚合物；
其中，所述聚乙二醇链包括聚乙二醇，以及分别位于聚乙二醇两端的第一基团和第二基团；所述聚乙二醇链通过第一基团与壳聚糖反应连接，所述聚乙二醇链通过第二基团与抗菌性多肽连接。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，
所述第一基团为-N-羟基琥珀酰亚胺基团、-羧基、-叠氮基、-炔基、-双键、-马来酰亚胺、-巯基和-酰氯中的任意一种；
所述第二基团为-N-羟基琥珀酰亚胺基团、-羧基、-叠氮基、-炔基、-双键、-马来酰亚胺、-巯基和-酰氯中的任意一种；
所述抗菌性多肽的端基修饰有-巯基、-叠氮基、-炔基、-双键或-马来酰亚胺。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，当第一基团为-羧基时，聚乙二醇链与壳聚糖反应连接的具体步骤为：
将壳聚糖溶于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中形成溶液1，将带有-羧基基团的聚乙二醇链加入缓冲液中形成溶液2，在溶液2中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺活化羧基，振荡5-120分钟后将溶液1与溶液2混匀，振荡6-72小时，将样品透析、冻干得到连接有聚乙二醇的壳聚糖。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，当第一基团为-N-羟基琥珀酰亚胺时，聚乙二醇链与壳聚糖反应连接的具体步骤为：
将壳聚糖与带有-N-羟基琥珀酰亚胺基团的聚乙二醇链溶于2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液中，振荡30分钟到72小时，将样品透析、冻干得到连接有聚乙二醇的壳聚糖。
13.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，当第一基团为-酰氯时，聚乙二醇链与壳聚糖反应连接的具体步骤为：
将壳聚糖溶于甲磺酸中，一端修饰酰氯基团的聚乙二醇也溶于甲磺酸中然后逐滴加入壳聚糖溶液中，反应1-72小时，反应结束后溶液用过量的丙酮沉淀和洗涤，然后透析、冻干得到连接有聚乙二醇的壳聚糖。
14.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，当第二基团为-叠氮或-炔基、抗菌性多肽的端基修饰有-炔基或叠氮时，将抗菌性多肽通过点击化学反应接枝到连接有聚乙二醇的壳聚糖上的步骤具体为：
将连接有叠氮或炔基的聚乙二醇修饰的壳聚糖和修饰有炔基或叠氮的抗菌性多肽共同溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，加入催化剂溶液，振荡反应10分钟到48小时，反应完成后，加入过量的乙二胺四乙酸，振荡、透析、冻干得最终样品；
其中，所述催化剂溶液包括0.5M的硫酸铜、1M的抗坏血酸钠和1M的氨基胍。
15.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，当第二基团为-巯基或者-马来酰亚胺、所述抗菌性多肽的端基修饰有-马来酰亚胺或巯基时，将抗菌性多肽通过点击化学反应接枝到连接有聚乙二醇的壳聚糖上的步骤具体为：
将连接有-巯基或-马来酰亚胺基团的聚乙二醇修饰的壳聚糖和修饰有马来酰亚胺基团或巯基的抗菌性多肽共同溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，氩气置换一段时间得到无氧反应环境，搅拌10分钟到48小时，反应完成后透析、冻干得最终样品。
16.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，当第二基团为-巯基或-双键、所述抗菌性多肽的端基修饰有-双键或-巯基时，将抗菌性多肽通过点击化学反应接枝到连接有聚乙二醇的壳聚糖上的步骤具体为：
将连接有-巯基或-双键基团的聚乙二醇修饰的壳聚糖和修饰有-双键或-巯基的抗菌性多肽共同溶解于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，氩气置换一段时间得到无氧反应环境，加入一定量安息香双甲醚(DMPA)催化剂，在365nm波长紫外的照射下搅拌10分钟到48小时，反应完成后透析、冻干得最终样品。
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