CN103467579B - 一类阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽及其应用，其序列的通式如下:Cn-Trp-Ile-Leu-(Ala)a-(Gly)b-X-Y，其中氨基酸全为L型氨基酸；X为阳离子寡肽部分；Y为蛋白转导结构域；Cn为碳原子个数为10～20的的脂肪酸链；a和b代表氨基酸的数目。本发明多肽序列N端修饰加上的脂肪酸长链可以增强自组装过程的疏水相互作用，促进自组装。发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌作用，可用于研制新型纳米抗菌药物。本发明所述的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽制备工艺简单可行、成本相对较低，其应用能丰富现有的抗菌药物种类。
Description
技术领域
本发明属于自组装纳米多肽领域，具体涉及一类阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽及其作为抑制金黄色葡萄球菌纳米抗菌药物的应用。
背景技术
自张曙光博士（S.Zhang）第一条自组装多肽EAK16的发现后，多肽自组装被广泛研究，成为生物医学和材料学等领域的研究热点，应用包括在载药、止血、生物支架、抗菌等多个方面。由天然氨基酸（L-型）组成的自组装多肽的细胞毒性低，降解性可控，运载效率及细胞摄取率高，同时还具有降低药物毒副作用等优点。在多肽自组装研究中，新型自组装纳米抗菌肽通过自组装形成的纳米材料由于具有广谱的抗菌活性、不易导致细菌耐药性，有望替代传统抗生素作为一种新型的抗菌剂，因此，它在抗菌药物开发方面有着巨大的发展前景。
目前，已知抗菌肽作用机制主要是通过与细菌的细胞膜相互作用、破坏其细胞膜而达到杀菌效果的。在这个过程中，阳离子电荷与疏水性扮演着极其重要的角色。如中国专利CN101054409A和CN102766196A公开了不同序列的阳离子两亲性短肽，并筛选出具有较好抗菌活性的短肽。本发明进一步研究阳离子电荷与两亲性在抗菌肽设计中的重要性，设计出了一类阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽，不仅具有抗菌作用，而且还可以通过不同的脂肪酸修饰来调节其抗菌活性。本发明的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽对于金黄色葡萄球菌具有较好的抗菌效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一类阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽，以增加自组装多肽的类型，促进自组装多肽的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一类阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽，其特征在于，其序列的通式如下：Cn-Trp-Ile-Leu-(Ala)a-(Gly)b-X-Y，其中氨基酸全为L型氨基酸；X为阳离子寡肽部分；Y为蛋白转导结构域；Cn为碳原子个数为10～20的脂肪酸链；a和b代表氨基酸的数目。
所述Cn为花生酸（C20）、硬脂酸（C18）、棕榈酸（C16）、肉豆蔻酸（C14）或月桂酸（C12）。
所述(Ala)a-(Gly)b作为疏水部分与亲水部分的间隔区，其中a和b的取值范围为2～12。所述a优选为2、4、6，b优选为3、6、9。
所述的阳离子寡肽X为4～12个赖氨酸、精氨酸或组氨酸。
所述的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽，其特征在于，所述的阳离子寡肽X为9个赖氨酸或9个组氨酸。
所述Y为TAT（人类免疫缺陷病毒1型反式转录激活因子氨基酸序列47～57）、VP22(单纯疱疹病毒转录调节蛋白)、ANTP43-58（黑腹果蝇触足肽）或富含精氨酸的细胞穿膜肽。
所述蛋白转导结构域Y优选为TAT（YGRKKRRQRRR），是一种来自人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的转录激活物Tat蛋白的蛋白转导结构域。
所述阳离子自组装纳米多肽序列为①C16-W-I-L-A2-G3-K9-TAT-NH2、②C16-W-I-L-A2-G6-K9-TAT-NH2、③C16-W-I-L-A4-G3-K9-TAT-NH2、④C16-W-I-L-A2-G6-H9-TAT-NH2、⑤C16-W-I-L-A4-G3-H9-TAT-NH2、⑥C18-W-I-L-A4-G3-H9-TAT-NH2、⑦C18-W-I-L-A2-G3-K9-TAT-NH2、⑧C18-W-I-L-A2-G6-K9-TAT-NH2、⑨C18-W-I-L-A4-G3-K9-TAT-NH2或⑩C18-W-I-L-A2-G6-H9-TAT-NH2。
所述的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽在制备抑制金黄色葡萄球菌的纳米抗菌药物中的应用。
本多肽自组装原理是其分子间通过非共价键相互作用自发组合形成一种结构明确、构造稳定、具有某种理化性能的分子聚集体或超分子结构。设计合成和构建纳米生物医药材料如纳米自组装肽通常是以一种“自下而上”的方式完成。分子自组装的关键因素是分子间通过非共价键相互作用的化学互补性和结构兼容性。在适当条件下，肽分子间依靠非共价键力作用自发地形成具有特定结构、复杂有序且具有某种功能的稳定结构。只要肽分子之间或其中某一片段与另一片段之间存在非共价键相互协同作用力，而且肽分子能够在空间尺寸和方向上实现重排和堆积的导向作用，就能产生肽分子的自组装。亲疏水作用、氢键和范德华力等分子间作用力虽然较弱，但其相互协同仍能形成稳定的高级结构。调节亲疏水氨基酸的种类、数量和位置等可以得到不同形貌的自组装体。多肽序列N端修饰加上的脂肪酸长链可以增强自组装过程的疏水相互作用，促进自组装。
相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
（1）本发明所述的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽对金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性细菌）具有较好的抑菌作用，因此，可以用于研制适于临床上使用的新型纳米抗菌药物，有利于细菌感染疾病的预防和治疗。
（2）本发明所述的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽中带有疏水性氨基酸W、I、L，其中疏水性W＞I＞L，疏水性的渐变使得肽链相邻氨基酸之间相互作用力减弱，在形成空间结构时稳定性更好。
（3）本发明所述的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽加入蛋白质转导结构域，可以增加细胞膜的通透性，有助于多肽穿过血脑屏障。因此，可以增强该类多肽应用在治疗脑部细菌感染疾病的可能性。
（4）本发明所述的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽的N端以脂肪酸修饰，可以提高肽的疏水性，相比单用疏水性氨基酸修饰效果会更好。用脂肪酸修饰多肽的N端可以使多肽能够在水性基质中形成胶团，无需实质上的机械作用(例如无需剧烈搅拌，超声处理等等)，胶团或纳米颗粒可以在水性基质中自发形成。
（5）本发明提供了一类新型结构的自组装纳米多肽，增加了自组装纳米多肽的类型。
附图说明
图1是本发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽的三维分子结构示意图。
图2是本发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽的高效液相色谱图，结果显示它的纯度是95.27%。
图3是本发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽的质谱图，结果显示它的分子量为3677.71。
图4是本发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽在超纯水溶液中的原子力显微镜纳米形貌图，其中阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①样品的浓度是0.4mg/ml。
图5是本发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽在超纯水溶液中的原子力显微镜纳米形貌图，其中阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①样品的浓度是0.5mg/ml。
图6是本发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽在超纯水溶液中的原子力显微镜纳米形貌图，其中阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①样品的浓度是1.0mg/ml。
图7是本发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽圆二色谱图，该图表明不同肽浓度对阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①的二级结构的影响。
图8是本发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽圆二色谱图，该图表明温度对阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①的二级结构的影响。
图9是本发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽的圆二色谱图，该图表明不同NaCl浓度对阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①的二级结构的影响。
图10是本发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①针对金黄色葡萄球菌的抑菌试验的酶标仪数据使用Origin8.5软件作的图，该图表明阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①针对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为17μM。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。
实施例1
当X为K9，Y为TAT，Cn为棕榈酸长链，a为2，b为3时，序列如下：C16-W-I-L-A2-G3-K9-TAT-NH2
阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①的合成：
1、材料
Fmoc-Arg(pbf)-OH(N-芴甲氧羰酰基-2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-精氨酸)、Fmoc-Leu-OH（N-芴甲氧羰酰基-亮氨酸）、Fmoc-Ile-OH（N-芴甲氧羰酰基-异亮氨酸）、Fmoc-Ala-OH（N-芴甲氧羰酰基-丙氨酸）、Fmoc-Gly-OH（N-芴甲氧羰酰基-甘氨酸）、Fmoc-Tyr-OH（N-芴甲氧羰酰基-酪氨酸）、Fmoc-Gln-OH（N-芴甲氧羰酰基-谷氨酰胺）、Fmoc-Lys(Boc)-OH(N-芴甲氧羰酰基-N'-叔丁氧羰酰基-赖氨酸)、Fmoc-Trp-OH（N-芴甲氧羰酰基-色氨酸）、棕榈酸、Fomc-Arg（pbf）Wang-Resin（树脂）、DBLK（六氢吡啶+DMF）、
HBTU（O-苯并三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂）和HOBT（1-羟基苯并三氮唑）购自上海吉尔生化有限公司；哌啶、醋酸酐、DMF（N、N-二甲基甲酰胺）、TFA（三氟乙酸）、NMM（N-甲基吗啉）、乙醚、甲醇、DCM（二氯甲烷）购自天津市富宇精细化工有限公司。
2、制备方法
采用Fmoc（芴甲氧羰酰基）保护的固相合成法，其工艺步骤如下：
（1）称取20g0.5mmol/g的Fomc-Arg（pbf）Wang-Resin于肽合成器皿中，取200mlDCM溶涨树脂30min，然后抽滤，再取用300mlDMF洗涤树脂，分三次进行，每次的洗涤时间为2min，抽滤干洗涤液后向肽合成器中加入100ml哌啶/DBLK（体积比1:5）震荡反应30min，反应结束后，再抽滤出反应液，再用400mlDMF分四次洗涤树脂，洗毕后取少量树脂做茚三酮检测试验，树脂呈阳性，向肽合成器皿中加入以下原料：
上述原料加完后，震荡反应30min，反应结束后，用300ml DMF分四次洗涤树脂，每次洗涤时间2分钟，取少许树脂做茚三酮试验检测，树脂呈阴性。
（2）向肽合成器皿中加入5ml哌啶/DBLK（体积比1:5）震荡反应30min，反应结束后抽滤出反应液，再用40ml DMF分四次洗涤树脂，洗毕取少许树脂做茚三酮试验检测，结果树脂呈阳性，向反应器皿中加入以下原料：
上述原料加完后，震荡反应40min，反应结束后，用40ml DMF分四次洗涤树脂，每次洗涤时间为2min，取少许树脂做茚三酮检测，树脂呈阴性。
（3）变换步骤（2）中的（a）原料，（b）（c）（d）（e）原料及加入量不变，重复步骤（2）的操作；（a）原料依次替换为Fmoc-Arg-OH（25.95g）、Fmoc-Gln-OH（18.65g）、Fmoc-Arg-OH（25.95g）、Fmoc-Arg-OH（25.95g）、Fmoc-Lys-OH（18.74g）、Fmoc-Lys-OH（18.74g）、Fmoc-Arg-OH（25.95g）、Fmoc-Gly-OH（9.37g）、Fmoc-Tyr-OH（27.92g）、Fmoc-Lys-OH（18.74g）、Fmoc-Lys-OH（18.74g）、Fmoc-Lys-OH（18.74g）、Fmoc-Lys-OH（18.74g）、Fmoc-Lys-OH（18.74g）、Fmoc-Lys-OH（18.74g）、Fmoc-Lys-OH（18.74g）、Fmoc-Lys-OH（18.74g）、Fmoc-Lys-OH（18.74g）、Fmoc-Gly-OH（9.37g）、Fmoc-Gly-OH（9.37g）、Fmoc-Gly-OH（9.37g）、Fmoc-Ala-OH（12.54g）、Fmoc-Ala-OH（12.54g）、Fmoc-Leu-OH（14.14g）、Fmoc-Ile-OH（14.14g）、Fmoc-Trp-OH（29.17g）。即每重复一次步骤（2）的操作，变换一种（a）原料，直至将上述原料都使用一次为止，接着加入棕榈酸（51.23g），完成N端修饰；
（4）再重复一次（1）（2）（3）步骤的操作，各步骤的原料及所用原料的量均不变；最后加入5ml哌啶/DBLK（体积比1:5）反应30min，洗净树脂，加入160ml醋酸酐/DMF（体积比1:2）反应30min，用40ml DMF洗净树脂，再用甲醇洗涤树脂8次，除去DMF。氮气吹干后，用TFA（三氟乙酸）/DCM强酸裂解液（体积比1:1），裂解3小时，将合成多肽从树脂上裂解下来，同时脱去所有保护基团，收集溶有合成肽的裂解液，然后减压过滤，收集滤液，用冷乙醚沉淀溶解在滤液中的多肽，再抽滤得到白色固体，即得合成肽的粗品。合成肽粗品经高效液相色谱纯化，收集主峰，经过冷冻干燥后，即得到目标合成肽①。
3、本发明所述其他的脂肪酸修饰两亲性阳离子自组装纳米多肽可以通过替换上述1中的氨基酸及脂肪酸，按照上述2所述制备方法合成纯化得到。在此过程中不同的合成实验参数如下表1所示：
表1本发明所述部分阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽的不同合成实验参数
| 修饰的多肽（单字母缩写） | 甲醇洗涤树脂次数 | 裂解时间（h） |
| ①C16-W-I-L-A2-G3-K9-TAT-NH2 | 8 | 3 |
| ②C16-W-I-L-A2-G6-K9-TAT-NH2 | 7 | 3.5 |
| ③C16-W-I-L-A4-G3-K9-TAT-NH2 | 8 | 2.5 |
| ④C16-W-I-L-A2-G6-H9-TAT-NH2 | 7 | 3 |
| ⑤C16-W-I-L-A4-G3-H9-TAT-NH2 | 7 | 2.5 |
| ⑥C18-W-I-L-A4-G3-H9-TAT-NH2 | 8 | 3.5 |
| ⑦C18-W-I-L-A2-G3-K9-TAT-NH2 | 7 | 3.5 |
| ⑧C18-W-I-L-A2-G6-K9-TAT-NH2 | 8 | 3 |
| ⑨C18-W-I-L-A4-G3-K9-TAT-NH2 | 9 | 3.5 |
| ⑩C18-W-I-L-A2-G6-H9-TAT-NH2 | 9 | 4 |
实施例2
阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①C16-W-I-L-A2-G3-K9-TAT-NH2的高效液相色谱和质谱检测与三维分子模型绘制
将实施例1制备的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①采用高效液相色谱检测，检测结果见图2，根据图2中的结果确定其纯度达到95.27%。
将实施例1制备的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①采用质谱检测，检测结果见图3，结果显示其分子量为3677.71。
对实施例1制备的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①采用分子模拟软件基于能量最低原则绘制三维分子模型示意图，所绘制的示意图如图1所示，通过该图可知其氨基酸及脂肪酸链的空间分布。图中可见，多肽N端为棕榈酸修饰，C端氨基化。
本发明所述部分阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①的高效液相色谱和质谱检测数据见表2：
表2本发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽的纯度和分子量
| 修饰的多肽（单字母缩写） | 纯度 | 分子量 |
| ①C16-W-I-L-A2-G3-K9-TAT-NH2 | 95.27% | 3677.7 |
| ②C16-W-I-L-A2-G6-K9-TAT-NH2 | 95.26% | 3701.3 |
| ③C16-W-I-L-A4-G3-K9-TAT-NH2 | 96.46% | 3902.8 |
| ④C16-W-I-L-A2-G6-H9-TAT-NH2 | 95.56% | 3855.1 |
| ⑤C16-W-I-L-A4-G3-H9-TAT-NH2 | 95.23% | 3983.2 |
| ⑥C18-W-I-L-A4-G3-H9-TAT-NH2 | 95.14% | 3936.2 |
| ⑦C18-W-I-L-A2-G3-K9-TAT-NH2 | 96.11% | 3926.7 |
| ⑧C18-W-I-L-A2-G6-K9-TAT-NH2 | 96.34% | 3879.1 |
| ⑨C18-W-I-L-A4-G3-K9-TAT-NH2 | 95.24% | 4007.2 |
| ⑩C18-W-I-L-A2-G6-H9-TAT-NH2 | 95.56% | 3960.2 |
实施例3
原子力显微镜检测阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①的纳米结构
1、原子力显微镜检测阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①在超纯水溶液中形成的纳米结构
取储存于4℃的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①样品制备成浓度为1.0mg/ml的溶液，用Milli-Q超纯水(18.2MΩ)稀释至0.4mg/ml，进行原子力显微镜检测。
（1）取10μl样品溶液均匀置于新揭云母片上；
（2）每个样品在云母片表面停留约30～60s以便吸附；
（3）使用100μl Milli-Q超纯水冲洗云母片表面以除去未吸附样品；
（4）置于有盖培养皿中空气干燥，同时避免污染，放置过夜；
（5）在室温下，使用Nanoscope IIIa(Digital Instruments,USA)在轻敲模式下扫描云母表面观察样品的纳米形貌。
原子力显微镜的形貌图见图4，表明本发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①在水溶液中可以形成球形聚集体。
2、原子力显微镜检测阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①在不同浓度下自组装形成的纳米结构
实验操作如上述1，只是把测试溶液配成不同的浓度，多肽的浓度为0.4mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml。
原子力显微镜的形貌图见图4、5和6，表明本发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①不同的肽浓度下可以自组装形成不同形貌的纳米结构。
实施例4
阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①二级结构的探究
通过圆二色性检测发现，本发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽的结构，在不同的条件下会发生不同的结构变化。不同条件下的圆二色性检测步骤及其结果如下：
1、利用圆二色性检测阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①在不同肽浓度溶液中的结构变化
采用圆二色光谱仪对实施例1制备的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①C16-W-I-L-A2-G3-K9-TAT-NH2进行圆二色性检测，步骤如下：
(1)取储存于4℃的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①样品制备成浓度为1.0mg/ml的溶液，用Milli-Q超纯水(18.2MΩ)稀释至不同的浓度，浓度范围0.01～1.0mg/ml；
(2)每次测定时向石英杯中加入300μl步骤(1)配制的样品溶液，测试样品之前先扫空比色皿的背景及同一条件下只含缓冲液的基线谱，以减去基线；
(3)在25℃条件下进行圆二色光谱仪扫描，数据采集范围190-260nm。使用1mm比色皿，带宽0.5nm，步长1.0nm，使用3次扫描平均值。
测定结果如图7所示，表明随着肽浓度的升高，阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①的二级结构没有显著变化，均为无规则卷曲结构。
2、利用圆二色性检测阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①在不同温度下的结构变化
采用圆二色光谱仪对实施例1制备的阳离子两亲性自组装抗菌肽①C16-W-I-L-A2-G3-K9-TAT-NH2进行圆二色性检测，步骤如下：
(1)取储存于4℃的脂肪酸修饰自组装多肽①样品制备成浓度为1.0mg/ml的溶液，用Milli-Q超纯水(18.2MΩ)稀释至0.4mg/ml；
(2)每次测定时向石英杯中加入300μl步骤(1)配制的样品溶液，测试样品之前先扫空比色皿的背景及同一条件下只含缓冲液的基线谱，以减去基线；
(3)圆二色光谱仪扫描的数据采集范围是190-260nm。使用1mm比色皿，带宽0.5nm，步长1.0nm，以2℃/min的速率升温，在25～85℃温度范围内进行扫描，每10℃扫描一次，在每一温度下允许30s的平衡时间，误差0.1℃。
测定结果如图8所示，表明随着温度的升高，阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①二级结构没有明显变化，仍为无规则卷曲。
3、利用圆二色性检测阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①在不同NaCl浓度溶液中的结构变化
采用圆二色光谱仪对实施例1制备的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①C16-W-I-L-A2-G3-K9-TAT-NH2进行圆二色性检测，步骤如下：
(1)取储存于4℃的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①样品制备成浓度为1.0mg/ml的溶液；
(2)先用容量瓶配制成2mol/l的NaCl溶液，再加Milli-Q超纯水(18.2MΩ)进行稀释，与多肽样品溶液混合，配成如下的浓度:10mM，20mM，40mM，60mM，80mM、100mM和200mM，不同NaCl浓度的溶液中多肽样品的浓度均为0.4mg/ml；
(3)每次测定时向石英杯中加入300μl步骤(2)配制的样品溶液，测试样品之前先扫空比色皿的背景及同一条件下只含缓冲液的基线谱，以减去基线；
(4)在25℃条件下进行圆二色性扫描，数据采集范围190-260nm。使用1mm比色皿，带宽0.5nm，步长1.0nm，使用3次扫描平均值。
测定结果如图9所示，表明随着NaCl浓度的升高，本发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①的二级结构不随NaCl浓度的变化而变化，仍为无规则卷曲，说明本发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①的构象变化对NaCl不敏感。
实施例5
本发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽在制备新型纳米抗菌药物中的应用
阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①～⑩在制备新型纳米抗菌药物中的应用
1、试验菌株
金黄色葡萄球菌CMCC26003（广东微生物种质资源库）。
2、试验方法
采用微量肉汤稀释法测定本发明所述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽对受试菌的最低抑菌浓度。
3、试验步骤
（1）抗菌药物贮存液制备：
使用无菌Milli-Q超纯水精确配制浓度为270μM的上述阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①～⑩和阳性对照品短杆菌肽，配制好的各贮存液置于-20℃环境中保存备用。
（2）培养基的配制：
称取水解酪蛋白培养基21g，溶于蒸馏水中并定容至1L，121℃高温灭菌30min。
（3）接种物的制备：
用接种环挑取形态相似待检菌落3～5个，接种于4～5mL的水解酪蛋白中，37℃孵育4～8h增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或水解酪蛋白培养基校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1～2×108CFU/mL用水解酪蛋白培养基将上述菌悬液进行1:100稀释后备用。
（4）稀释抗菌药物的制备及菌液接种：
取步骤（1）配制的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①～⑩的浓度为270μM溶液，稀释成浓度分别为4μM、8μM、17μM、34μM、54μM、67μM、108μM和135μM。
将50μl浓度为4到135μM的肽和肽纳米颗粒溶液置于96孔板的每个孔中。再相同体积的将受试菌液添加到每个孔中已得到600nm处0.1到0.2的光密度读数。只含有水解酪蛋白培养基的被用作对照。试验重复三次。
（5）孵育：将接种好的96孔板盖上盖子，密封，放置37℃的振荡培养箱中温育10～16h。
（6）结果：每隔2小时在酶标仪测量600nm处的光密度值，温育10～16小时后，以观察不到细菌生长的最低药物浓度即为该样品的最低抑菌浓度。图10展示了不同浓度自组装纳米多肽①随着时间的变化对金黄色葡萄球菌的生长抑制作用，得到自组装纳米多肽①的对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度。阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽②～⑩的实验结果统计方法与自组装纳米多肽①类似。
阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①～⑩以及阳性对照短杆菌肽的最低抑菌浓度测定结果如表3所示。
4、试验结果
表3阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①～⑩的最低抑菌浓度测定结果
本发明所述的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽①～⑩针对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均小于或等于54μM，对于抑制金黄色葡萄球菌增殖的作用效果比阳性对照短杆菌肽好。结果表明，本发明所述的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽可发展成为一类有效的抑制金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性细菌增殖的抗菌药物。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一类阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽，其特征在于，其序列的通式如下：Cn-Trp-Ile-Leu-(Ala)a-(Gly)b-X-Y，其中氨基酸全为L型氨基酸；X为阳离子寡肽部分；Y为蛋白转导结构域；Cn为碳原子个数为10～20的脂肪酸链；a和b代表氨基酸的数目；具体序列为①C16-W-I-L-A2-G3-K9-TAT-NH2、②C16-W-I-L-A2-G6-K9-TAT-NH2、③C16-W-I-L-A4-G3-K9-TAT-NH2、④C16-W-I-L-A2-G6-H9-TAT-NH2、⑤C16-W-I-L-A4-G3-H9-TAT-NH2、⑥C18-W-I-L-A4-G3-H9-TAT-NH2、⑦C18-W-I-L-A2-G3-K9-TAT-NH2、⑧C18-W-I-L-A2-G6-K9-TAT-NH2、⑨C18-W-I-L-A4-G3-K9-TAT-NH2或⑩C18-W-I-L-A2-G6-H9-TAT-NH2。
2.权利要求1所述的阳离子两亲性自组装纳米抗菌肽在制备抑制金黄色葡萄球菌的纳米抗菌药物中的应用。
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