CN112341524A - 一种富含正电荷的环抗菌肽类似物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种富含正电荷的环抗菌肽类似物，所述环抗菌肽类似物是基于天然抗菌肽短杆菌酪肽A骨架的衍生物，在其骨架中引入氨基酸所得，其结构通式为：cyclo‑(DFPFDFXXXZXZ)，本发明还公开了环抗菌肽类似物的合成方法以及其在制备临床抗菌药物中的应用。本发明设计简单、生产成本低、代谢稳定性高、抗菌活性强、溶血毒性低和不易诱导细菌耐药性。

Description

一种富含正电荷的环抗菌肽类似物及其应用
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，更具体地，涉及一种富含正电荷的环抗菌肽类似物及其应用。
背景技术
据世界卫生组织统计，每年全球有数百万人感染耐药性金黄色葡萄球菌（MRSA），其中约30%的人会不治身亡。由于抗生素的不当与过度使用，造成了大量的多重与广泛耐药菌甚至超级细菌的出现，不断增多的细菌耐药性是每位国民必须面对的严峻现实。
在科研人员积极寻求新型抗菌药物的进程中，抗菌肽因其作用机制独特、抗菌谱广且不易引起耐药性等诸多特点而备受关注。抗菌肽种类繁多，然而结构高度统一，多具有正电荷及由α-螺旋或β-折叠等二级结构维系的两亲性等特点。抗菌肽主要是通过破坏细菌细胞膜而杀灭细菌，其作用机制可以简要分为三个步骤：第一步，富含正电荷的抗菌肽通过静电作用附着于负电性的细菌细胞膜表面；第二步，抗菌肽在膜表面形成两亲性结构，利用疏水基团与磷脂双分子层非极性尾部之间的亲脂作用插入细胞膜内部；第三步，抗菌肽或自身聚合或与磷脂双分子层协同作用形成离子通道，造成K+、Na+等胞质流失，诱导细胞死亡。但也有证据表明，部分抗菌肽亦可影响细胞膜跨膜蛋白的位置及功能。从作用机制不难看出，抗菌肽的正电性、疏水性及两亲性对保证其抗菌活性至关重要。值得强调的是，由于抗菌肽靶向于整个细胞膜，该独特作用机制使得细菌很难产生耐药性，原因在于细菌几乎不可能在保持细胞膜结构功能完整的情况下改变整个细胞膜的拓扑结构。
相较于传统小分子抗生素，抗菌肽虽有不易引起细菌耐药性的独特作用机制，但其存在的溶血毒性和不耐酶解等缺点严重影响着它的运用前景。例如，环抗菌肽短杆菌酪肽A（Tyrocidine A，Tyrc A）和短杆菌肽S（Gramicidin S，GS）因其对革兰氏阳性菌具有强大的抗菌活性而备受关注，然而其同时容易引起高溶血毒副作用，这使它目前只能作为表面涂剂、滴剂等局部使用药物。此外，它们还具有抗革兰氏阴性菌能力较弱等缺点，而临床细菌感染70%是由于阴性菌引起的，所以研发具有强抗阴性菌作用的抗菌肽具有很好的现实意义。为了降低环抗菌肽Tyrc A的溶血毒副作用并增强其阴性菌抑制作用，已有不少相关合成类似物的报道。然而，现有的类似物或未能实现在保留其抗菌活性的同时大幅降低其溶血副作用，或未能增强其抗阴性菌作用。因此，目前尚未有基于Tyrc A骨架的类似物成功运用于动物体内实验的报道。
多粘菌素B（Polymyxin B）是一类富含正电荷的脂肽，其被认为是临床上抗击阴性耐药菌的最后一道防线。然而，多粘菌素B肾脏毒副作用较强且长时间使用会产生细菌耐药性，所以临床上对其的使用限制较为严格。多粘菌素B杀死阴性菌主要依赖其富集的正电荷与阴性菌外膜脂多糖（LPS）之间的强静电作用，从而破坏脂多糖的结构。受此启发，我们可以通过系统性地在TyrcA分子骨架中引入额外的鸟氨酸、赖氨酸或精氨酸等具有带正电荷侧链的氨基酸，富集其区域正电荷以提高其与阴性菌外膜的作用，从而提高该类抗菌肽的抗阴性菌作用并降低其溶血毒副作用。
综上所述，如何设计一种富含正电荷的环抗菌肽类似物，能够提高该类抗菌肽的抗阴性菌作用并降低其溶血毒副作用，是目前急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于为了解决上述技术问题，而提供一种富含正电荷的环抗菌肽类似物及其应用，设计简单、生产成本低、代谢稳定性高、抗菌活性强、溶血毒性低和不易诱导细菌耐药性。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种富含正电荷的环抗菌肽类似物，所述环抗菌肽类似物是基于天然抗菌肽短杆菌酪肽A骨架的衍生物，在其骨架中引入氨基酸所得，其结构通式为：cyclo-(DFPFDFXXXZXZ)，其中F= Phe，P = Pro，X = Gln、Orn、Lys、Arg 、Tyr或Asn，Z = Val、Leu、Orn、Lys或Arg，左上标D表示为D型氨基酸。
进一步地，所述环抗菌肽类似物的结构式如下：
cyclo-(DFPFDFNOOVOL)，标记为化合物1；
cyclo-(DFPFDFOOYVOL)，标记为化合物2；
cyclo-(DFPFDFOQOVOL)，标记为化合物3；
cyclo-(DFPFDFOOOVOL)，标记为化合物4；
cyclo-(DFPFDFOOOOOL)，标记为化合物5；
cyclo-(DFPFDFOOOVOO)，标记为化合物6；
cyclo-(DFPFDFOOOOOO)，标记为化合物7；
cyclo-(DFPFDFKKKVKL)，标记为化合物8；
cyclo-(DFPFDFKRYVKL)，标记为化合物9；
cyclo-(DFPFDFKKYKKL)，标记为化合物10；
cyclo-(DFPFDFKKKKKL)，标记为化合物11；
cyclo-(DFPFDFKRYVRL)，标记为化合物12；
cyclo-(DFPFDFRRYVKL)，标记为化合物13；
cyclo-(DFPFDFKRYKKL)，标记为化合物14；
cyclo-(DFPFDFKKYKRL)，标记为化合物15；
cyclo-(DFPFDFKKYRKL)，标记为化合物16；
cyclo-(DFPFDFRRYVRL)，标记为化合物17；
cyclo-(DFPFDFKRYKRL)，标记为化合物18；
其中Q= Gln，O= Orn，K=Lys，R=Arg，Y=Tyr，V= Val ，L= Leu，N=Asn。作为本发明技术方案的优选，上述化合物3、4、5、10和11的治疗潜力最佳。
进一步地，所述氨基酸（Orn、Lys和Arg）的侧链在生理条件下带正电荷。
本发明还提供了一种富含正电荷的环抗菌肽类似物在制备临床抗菌药物中的应用。
进一步地，所述环抗菌肽类似物的合成方法为：
（1）树脂的溶胀
将210mg的Fmoc-Pro-2-CTC树脂（取代值为0.476 mmol/g）置于多肽合成管中，经DCM溶液溶胀15 min；
（2）线性多肽的合成
对上述溶胀的Fmoc-Pro-2 CTC，经含有体积分数20％哌啶的DMF溶液振荡2次，每次15min，脱去Fmoc保护基；然后用DMF洗涤2次，MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次，DMF洗涤1次，将Fmoc-DPhe-OH、HOBT、HBTU、DIEA于5 mL DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的Fmoc-Pro-2-CTC混合，振荡缩合1 h，得到Fmoc-DPhe-Pro-2-CTC；然后再次用DMF洗涤2次，MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次，DMF洗涤1次，重复前述步骤，依次缩合反应后续氨基酸，其中HOBT、HBTU和DIEA用量与前述步骤相同，最后将得到的产物用含有20％哌啶的DMF溶液振荡2次，每次15 min，脱除末端Fmoc保护基；
（3）多肽切割
以1%TFA/DCM混合溶液为切割试剂，将步骤（2）得到的产物进行切割，切割4次，每次10min，然后加入等体积甲苯进行旋干，得到线性多肽；
（4）多肽环化
将合成的线性肽溶解于2 mg/mL的DCM溶液中，加入PyBOP（5 eq）、HOBT（5 eq）和DIEA（15 eq），常温搅拌15h，减压除去溶剂，得到环化肽；
（5）脱保护
将环化肽溶于体积比为9.5/0.25/0.25的TFA/三异丙基硅烷/水中，常温搅拌3 h，减压移除大部分TFA后，通过乙醚沉淀，收集沉淀产物；
（6）多肽纯化
将上述得到的沉淀产物经RP-HPLC分离纯化，收集流出液，再冷冻干燥，即得目标产物。
进一步地，所述步骤（6）中RP-HPLC的纯化条件为：流动相A：0.1％TFA/水；流动相B：乙腈；线性梯度洗脱，收集主要吸收峰的流出液。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明提供的环抗菌肽类似物，具有很强的抗菌活性，且具有低溶血毒性、高代谢稳定性和不易诱导细菌产生耐药性等优点，具有良好的临床应用前景；
（2）本发明提供的环抗菌肽类似物，均通过经典多肽固相合成获得，均有合成简单，制造成本低等优点。
附图说明
图1为本发明提供的一种富含正电荷的环抗菌肽类似物以及环抗菌肽短杆菌酪肽A（Tyrc A）的结构式；
图2为本发明提供的一种富含正电荷的环抗菌肽类似物的溶血副作用评价示意图；
图3为本发明提供的化合物5的细菌耐药性诱导实验数据图；
图4为本发明提供的化合物5的血清稳定性实验数据图；
图5为本发明提供的化合物5的治疗小鼠组织载菌量评价示意图；
图6为本发明提供的化合物5的治疗小鼠组织病理切片示意图；
图7为本发明提供的化合物3的质谱分析图谱；
图8为本发明提供的化合物4的质谱分析图谱；
图9为本发明提供的化合物5的质谱分析图谱；
图10为本发明提供的化合物10的质谱分析图谱；
图11为本发明提供的化合物11的质谱分析图谱。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了一种富含正电荷的环抗菌肽类似物，所述环抗菌肽类似物是基于天然抗菌肽短杆菌酪肽A骨架的衍生物，在其骨架中引入氨基酸所得，其结构通式为：cyclo-(DFPFDFXXXZXZ)，其中F= Phe，P = Pro，X = Gln、Orn、Lys、Arg 、Tyr或Asn，Z = Val、Leu、Orn、Lys或Arg，左上标D表示为D型氨基酸。
所述环抗菌肽类似物的结构式如下：
cyclo-(DFPFDFNOOVOL)，标记为化合物1；
cyclo-(DFPFDFOOYVOL)，标记为化合物2；
cyclo-(DFPFDFOQOVOL)，标记为化合物3；
cyclo-(DFPFDFOOOVOL)，标记为化合物4；
cyclo-(DFPFDFOOOOOL)，标记为化合物5；
cyclo-(DFPFDFOOOVOO)，标记为化合物6；
cyclo-(DFPFDFOOOOOO)，标记为化合物7；
cyclo-(DFPFDFKKKVKL)，标记为化合物8；
cyclo-(DFPFDFKRYVKL)，标记为化合物9；
cyclo-(DFPFDFKKYKKL)，标记为化合物10；
cyclo-(DFPFDFKKKKKL)，标记为化合物11；
cyclo-(DFPFDFKRYVRL)，标记为化合物12；
cyclo-(DFPFDFRRYVKL)，标记为化合物13；
cyclo-(DFPFDFKRYKKL)，标记为化合物14；
cyclo-(DFPFDFKKYKRL)，标记为化合物15；
cyclo-(DFPFDFKKYRKL)，标记为化合物16；
cyclo-(DFPFDFRRYVRL)，标记为化合物17；
cyclo-(DFPFDFKRYKRL)，标记为化合物18；
其中Q= Gln，O= Orn，K=Lys，R=Arg，Y=Tyr，V= Val ，L= Leu，N=Asn。作为本发明技术方案的优选，上述化合物3、4、5、10和11的治疗潜力最佳。
所述氨基酸（Orn、 Lys和Arg）的侧链在生理条件下带正电荷。
本发明合成的环抗菌肽类似物以及环抗菌肽短杆菌酪肽A（Tyrc A）的理化性质如下表1所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例2
本实施例提供了化合物3的合成方法，具体步骤为：
（1）树脂的溶胀
将210mg的Fmoc-Pro-2-CTC树脂（取代值为0.476 mmol/g）置于多肽合成管中，经DCM溶液溶胀15 min；
（2）线性多肽的合成
对上述溶胀的Fmoc-Pro-2-CTC树脂，经含有体积分数20％哌啶的DMF溶液振荡2次，每次15min，脱去Fmoc保护基；然后用DMF洗涤2次，MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次，DMF洗涤1次，将Fmoc-DPhe-OH (194 mg)、HOBT(67.6 mg)、HBTU (189 mg)、DIEA (0.25 mL)于5 mL DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的Fmoc-Pro-2-CTC树脂混合，振荡缩合1 h，得到Fmoc-DPhe-Pro-2-CTC；然后再次用DMF洗涤2次，MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次，DMF洗涤1次。方法同上，依次缩合反应后续氨基酸：Fmoc-Leu-OH (177 mg)、Fmoc-Orn(Boc)-OH (227 mg)、Fmoc-Val-OH (170 mg)、Fmoc-Orn(Boc)-OH (227 mg)、Fmoc-Gln(Trt)-OH (305 mg)、Fmoc-Orn(Boc)-OH (227 mg)、Fmoc-DPhe-OH (194 mg)、Fmoc-Phe-OH (194 mg)，其中HOBT、HBTU和DIEA用量同上，得到Fmoc-Phe-DPhe-Orn-Gln-Orn-Val-Orn-Leu-DPhe-Pro-2-CTC；最后将得到的产物用含有20％哌啶的DMF溶液振荡2次，每次15 min，脱除末端Fmoc保护基。
（3）多肽切割
以1%TFA/DCM混合溶液为切割试剂，将步骤（2）得到的产物进行切割，切割4次，每次10min，然后加入等体积甲苯进行旋干，得到线性多肽；
（4）多肽环化
将合成的线性肽溶解于2 mg/mL的 DCM溶液中，加入PyBOP（5 eq）、HOBT（5 eq）和DIEA（15 eq），常温搅拌15h，减压除去溶剂，得到环化肽；
（5）脱保护
将环化肽溶于体积比为9.5/0.25/0.25的TFA/三异丙基硅烷/水中，常温搅拌3 h，减压移除大部分TFA后，通过乙醚沉淀，收集沉淀产物；
（6）多肽纯化
将上述得到的沉淀产物经RP-HPLC分离纯化，收集流出液，再冷冻干燥，即得目标产物。
所述步骤（6）中RP-HPLC的纯化条件为：流动相A：0.1％TFA/水；流动相B：乙腈；线性梯度洗脱，收集主要吸收峰的流出液。
经质谱鉴定得产物为化合物3，分子量为1221.49，结构式如图1所示，质谱图见图7，氨基酸序列为 cyclo-(DFPFDFOQOVOL)。
实施例3
本实施例提供了化合物4的合成方法，与实施例2的不同之处在于，线性多肽的合成步骤为：
对上述溶胀的Fmoc-Pro-2 CTC，经含有体积分数20％哌啶的DMF溶液振荡2次，每次15min，脱去Fmoc保护基；然后用DMF洗涤2次，MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次，DMF洗涤1次，将Fmoc-DPhe-OH (194 mg)、HOBT(67.6 mg)、HBTU (189 mg)、DIEA (0.25 mL)于5 mL DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的Fmoc-Pro-2 CTC树脂混合，振荡缩合1 h，得到Fmoc-DPhe-Pro-2 CTC；然后再次用DMF洗涤2次，MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次，DMF洗涤1次。方法同上，依次缩合反应后续氨基酸：Fmoc-Leu-OH (177 mg)、Fmoc-Orn(Boc)-OH (227 mg)、Fmoc-Val-OH(170mg)、Fmoc-Orn(Boc)-OH (227 mg)、Fmoc-Orn(Boc)-OH (227 mg)、Fmoc-Orn(Boc)-OH (227 mg)、Fmoc-DPhe-OH (194 mg)、Fmoc-Phe-OH (194 mg)，其中HOBT、HBTU和DIEA用量同上，得到Fmoc-Phe-DPhe-Orn-Orn-Orn-Val-Orn-Leu-DPhe-Pro-2-CTC；同样用含有20％哌啶的DMF溶液振荡2次，每次15min ，脱除末端Fmoc保护基。
经质谱鉴定得产物为化合物4，分子量为1207.51，结构式如图1所示，质谱图见图8，氨基酸序列为cyclo-(DFPFDFOOOVOL)。
实施例4
本实施例提供了化合物5的合成方法，与实施例2的不同之处在于，线性多肽的合成步骤为：
对上述溶胀的Fmoc-Pro-2-CTC树脂，经含有体积分数20％哌啶的DMF溶液振荡2次，每次15min，脱去Fmoc保护基；然后用DMF洗涤2次，MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次，DMF洗涤1次，将Fmoc-DPhe-OH (194 mg)、HOBT(67.6 mg)、HBTU (189 mg)、DIEA (0.25 mL)于5 mL DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的Fmoc-Pro-2 CTC树脂混合，振荡缩合1 h，得到Fmoc-DPhe-Pro-2-CTC；然后再次用DMF洗涤2次，MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次，DMF洗涤1次。方法同上，依次缩合反应后续氨基酸：Fmoc-Leu-OH (177 mg)、Fmoc-Orn(Boc)-OH (227 mg)、Fmoc-Orn(Boc)-OH (227 mg)、Fmoc-Orn(Boc)-OH (227 mg)、Fmoc-Orn(Boc)-OH (227mg)、Fmoc-Orn(Boc)-OH (227 mg)、Fmoc-DPhe-OH (194 mg)、Fmoc-Phe-OH (194 mg)，其中HOBT、HBTU和DIEA用量同上，得到Fmoc-Phe-DPhe-Orn-Orn-Orn-Orn-Orn-Leu-DPhe-Pro-2-CTC；同样用含有20％哌啶的DMF溶液振荡2次，每次15min ，脱除末端Fmoc保护基。
经质谱鉴定得产物为化合物5，分子量为1222.52，结构式如图1所示，质谱图见图9，氨基酸序列为cyclo-(DFPFDFOOOOOL)。
实施例5
本实施例提供了化合物10的合成方法，与实施例2的不同之处在于，线性多肽的合成步骤为：
对上述溶胀的Fmoc-Pro-2 CTC，经含有体积分数20％哌啶的DMF溶液振荡2次，每次15min，脱去Fmoc保护基；然后用DMF洗涤2次，MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次，DMF洗涤1次，将Fmoc-DPhe-OH (194 mg)、HOBT(67.6 mg)、HBTU (189 mg)、DIEA (0.25 mL)于5 mL DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的Fmoc-Pro-2 CTC树脂混合，振荡缩合1 h，得到Fmoc-DPhe-Pro-2 CTC；然后再次用DMF洗涤2次，MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次，DMF洗涤1次。方法同上，依次缩合反应后续氨基酸：Fmoc-Leu-OH (177 mg)、Fmoc-Lys(Boc)-OH (234 mg)、Fmoc-Lys(Boc)-OH (234 mg)、Fmoc-Tyr(OtBu)-OH (249 mg)、Fmoc-Lys(Boc)-OH (234mg)、Fmoc-Lys(Boc)-OH (234 mg)、Fmoc-DPhe-OH (194 mg)、Fmoc-Phe-OH (194 mg)，其中HOBT、HBTU和DIEA用量同上，得到Fmoc-Phe-DPhe-Lys-Lys-Tyr-Lys-Lys-Leu-DPhe-Pro-2CTC；同样用含有20％哌啶的DMF溶液振荡2次，每次15 min ，脱除末端Fmoc保护基。
经质谱鉴定得产物为化合物10，分子量为1327.66，结构式如图1所示，质谱图见图10，氨基酸序列为cyclo-(DFPFDFKKYKKL)。
实施例6
本实施例提供了化合物11的合成方法，与实施例2的不同之处在于，线性多肽的合成步骤为：
对上述溶胀的Fmoc-Pro-2-CTC树脂，经含有体积分数20％哌啶的DMF溶液振荡2次，每次15min，脱去Fmoc保护基；然后用DMF洗涤2次，MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次，DMF洗涤1次，将Fmoc-DPhe-OH (194 mg)、HOBT(67.6 mg)、HBTU (189 mg)、DIEA (0.25 mL)于5 mL DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的Fmoc-Pro-2 CTC树脂混合，振荡缩合1 h，得到Fmoc-DPhe-Pro-2 CTC；然后再次用DMF洗涤2次，MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次，DMF洗涤1次。方法同上，依次缩合反应后续氨基酸：Fmoc-Leu-OH (177 mg)、Fmoc-Lys(Boc)-OH (234 mg)、Fmoc-Lys(Boc)-OH (234 mg)、Fmoc-Lys(Boc)-OH (234 mg)、Fmoc-Lys(Boc)-OH (234mg)、Fmoc-Lys(Boc)-OH (234 mg)、Fmoc-DPhe-OH (194 mg)、Fmoc-Phe-OH (194 mg)，其中HOBT、HBTU和DIEA用量同上，得到Fmoc-Phe-DPhe-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Leu-DPhe-Pro-2-CTC；同样用含有20％哌啶的DMF溶液振荡2次，每次15 min ，脱除末端Fmoc保护基。
经质谱鉴定得产物为化合物11，分子量为1292.66，结构式如图1所示，质谱图见图11，氨基酸序列为cyclo-(DFPFDFKKKKKL)。
本发明还提供了一种富含正电荷的环抗菌肽类似物在制备临床抗菌药物中的应用。
1、体外抗菌实验
采用微量二倍稀释法测定样品（本发明环抗菌肽类似物）对实验菌株的最低抑菌浓度(MIC)，评估其抗菌活性。所选用的实验菌株包括：大肠杆菌ATCC8739、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC6538和粪肠球菌ATCC29212。具体实验方法为：将细菌在LB培养基中，培养至对数生长期（OD620 =0.4-0.6），用PB培养基稀释至OD620 =0.02。将样品溶解于DMSO中，经二倍稀释至一系列不同浓度，取10 μL稀释后的样品和90 μL细菌悬浮液混合，加入96孔培养板中37 ℃摇床孵育24 h观察，通过测定酶标仪在 620nm 波长下的浊度获得样品的最小抑菌浓度。该实验以Tyrc A作阳性对照，DMSO为阴性对照。每个样品平行重复三次，结果如表2。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表2结果表明，对比于Tyrc A而言，本发明环抗菌肽类似物对常见实验菌株均具有较强的抗菌活性。虽然抗阳性菌活性略有下降，但是大部分抗菌肽类似物抗阴性菌作用大幅增强。例如化合物5，其抗大肠杆菌活性增强了4倍，抗铜绿假单胞菌活性增强了8倍。
2、溶血实验
选取新鲜人血，用PBS（0.01M pH 7.2-7.4）洗涤后，在用PBS稀释至5×105个红细胞。将样品（本发明环抗菌肽类似物）溶于DMSO，终浓度最大值为400 μM，并用半倍稀释法稀释5次，获得共6个浓度溶液（12.5 – 400 μM）。向96孔板中加入5 μL样品，50 μL血液，45 μLPBS，一式三份。DMSO为阴性对照，2% SDS为阳性对照。混合液于37 ℃孵育30 min，后转移至EP管中，300 r/min离心10min，吸取50 μL上层清液。将上清液加至96孔板中，在酶标仪450nm波长下测其吸光值。根据公式：溶血百分比(％)＝[(OD 450nm 多肽 -OD450nm空白)/(OD450nm阳性 - OD450nm空白)]×100％，计算溶血率。50%溶血浓度（HC50）见表3，详细结果见图2。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表3结果表明，本发明环抗菌肽类似物的溶血毒性HC50数值均高于Tyrc A，说明环抗菌肽类似物具有低溶血毒性。
图2和表1物理性质结果表明，环抗菌肽类似物的电荷数量及含正电荷残基数量均对溶血副作用有较大影响。整体而言，除了极少数环抗菌肽类似物，大部分环抗菌肽类似物的溶血毒副作用均有不同程度的降低。其中，最好的化合物5，在测试的浓度范围内（400 μM）其溶血毒副作用几乎被全部抑制。
3、诱导细菌耐药实验
选取最具潜力的化合物5进行细菌耐药性诱导实验，测试菌株为大肠杆菌ATCC8739和金黄色葡萄球菌ATCC6538，阳性对照为市售抗生素环丙沙星。
首先测定化合物5和环丙沙星对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌浓度（MIC）。测定方式和上述抑菌实验方法相同。吸取96孔板中0.5× MIC 浓度下的细菌接种到含有0.5×MIC化合物5或环丙沙星的LB培养基中，生长至对数生长期。吸取菌液，在PB培养基中稀释至OD620 0.02。再重复测定其MIC值，如此重复多次，以诱导细菌产生耐药性。实验结果见图3。
图3结果表明，环丙沙星容易诱导细菌产生耐药性，而本发明化合物5抗菌肽不易诱导细菌产生耐药性。具体而言，其在重复了17个诱导耐药周期之后，抑菌浓度并未改变，而环丙沙星的抑菌浓度已大幅提高。
4、血清稳定性
由于体内用药要求必须有良好的代谢稳定性，在此对化合物5进行了体外血清稳定性评估。
将化合物5溶于纯血清溶液（1 mg/mL），在37°C下培养。在0h，1h，2h，4h，8h，24h时间点分别吸取10 μL药物血清混合液加入190 μ的血清沉淀剂中（12% TFA,水/乙腈 = 1/3），并于4°C孵育15min。孵育完毕，将样品在离心15min（4000 rpm）。上清液用RP-HPLC分析(A：水0.1%TFA，B：乙腈10-90%，60min，1.0 mL/min，221nm)。结果如图4。
图4结果表明，化合物5在体内代谢稳定，具有较强抗酶水解能力，可以在体内进一步运用。
5、细菌感染动物的治疗试验
动物：正常6-8周龄的C57BL/6雌性小鼠，平均体重18-20克，实验选用腹膜炎-脓毒症模型实验。
将18只小鼠随机分为三组，即对照组（生理盐水）、感染（大肠杆菌）和治疗组(大肠杆菌+化合物5，10 mg/kg)。 预喂养3天后，将100 μL大肠杆菌 (约1 ×108 CFU/mL)注入小鼠腹腔，100μL生理盐水为正常组对照。感染1h后，治疗组采用化合物5(10mg/kg)进行腹腔注射治疗，其余治疗组均接受相同体积的生理盐水注射。治疗12 h后，处死小鼠，取出小鼠肝、脾、肾、肺， 器官被称重和研磨以计算组织载菌量。 同时，部分器官固定在4%多聚甲醛中，石蜡包埋，用苏木精-伊红染色，以进行组织病理学检查。结果如图5和6。
图5结果表明，经过化合物5注射治疗后，相较于感染组，治疗组的肝、肾、脾、肺的平均载菌量显著降低，显示出了其良好的抑菌活性。图6病理切片显示，和感染组对比，治疗组的的组织形态明显改善，恢复到与正常组相近的水平。
本发明的有益效果在于：本发明提供的环抗菌肽类似物，具有很强的抗菌活性，且具有低溶血毒性、高代谢稳定性和不易诱导细菌产生耐药性等优点，具有良好的临床应用前景。
最后应说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种富含正电荷的环抗菌肽类似物，其特征在于：所述环抗菌肽类似物是基于天然抗菌肽短杆菌酪肽A骨架的衍生物，在其骨架中引入氨基酸所得，其结构通式为：cyclo-(DFPFDFXXXZXZ)，其中F= Phe，P = Pro，X = Gln、Orn、Lys、Arg 、Tyr或Asn，Z = Val、Leu、Orn、Lys或Arg，左上标D表示为D型氨基酸。
2.根据权利要求1所述的富含正电荷的环抗菌肽类似物，其特征在于：所述环抗菌肽类似物的结构式如下：
cyclo-(DFPFDFNOOVOL)，标记为化合物1；
cyclo-(DFPFDFOOYVOL)，标记为化合物2；
cyclo-(DFPFDFOQOVOL)，标记为化合物3；
cyclo-(DFPFDFOOOVOL)，标记为化合物4；
cyclo-(DFPFDFOOOOOL)，标记为化合物5；
cyclo-(DFPFDFOOOVOO)，标记为化合物6；
cyclo-(DFPFDFOOOOOO)，标记为化合物7；
cyclo-(DFPFDFKKKVKL)，标记为化合物8；
cyclo-(DFPFDFKRYVKL)，标记为化合物9；
cyclo-(DFPFDFKKYKKL)，标记为化合物10；
cyclo-(DFPFDFKKKKKL)，标记为化合物11；
cyclo-(DFPFDFKRYVRL)，标记为化合物12；
cyclo-(DFPFDFRRYVKL)，标记为化合物13；
cyclo-(DFPFDFKRYKKL)，标记为化合物14；
cyclo-(DFPFDFKKYKRL)，标记为化合物15；
cyclo-(DFPFDFKKYRKL)，标记为化合物16；
cyclo-(DFPFDFRRYVRL)，标记为化合物17；
cyclo-(DFPFDFKRYKRL)，标记为化合物18；
其中Q= Gln，O= Orn，K=Lys，R=Arg，Y=Tyr，V= Val ，L= Leu，N=Asn。
3.根据权利要求1所述的富含正电荷的环抗菌肽类似物，其特征在于：所述Orn、Lys和Arg的侧链在生理条件下带正电荷。
4.一种如权利要求1～3任一所述的富含正电荷的环抗菌肽类似物在制备临床抗菌药物中的应用。
5.根据权利要求1所述的富含正电荷的环抗菌肽类似物，其特征在于：所述环抗菌肽类似物的合成方法为：
（1）树脂的溶胀
称取210 mg取代值为0.476 mmol/g的Fmoc-Pro-CTC树脂置于多肽合成管中，经DCM溶液溶胀15 min；
（2）线性多肽的合成
对上述溶胀的Fmoc-Pro-2 CTC树脂，经含有体积分数20％哌啶的DMF溶液振荡2次，每次15min，脱去Fmoc保护基；然后用DMF洗涤2次，MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次，DMF洗涤1次，将Fmoc-DPhe-OH、HOBT、HBTU、DIEA于5 mL DMF中溶解混匀，并与上述脱去Fmoc保护基的Fmoc-Pro-2 CTC树脂混合，振荡缩合1 h，得到Fmoc-DPhe-Pro-2 CTC；然后再次用DMF洗涤2次，MeOH洗涤2次，DCM洗涤2次，DMF洗涤1次，重复前述步骤，依次缩合反应后续氨基酸，其中HOBT、HBTU和DIEA用量与前述步骤相同，最后将得到的产物用含有20％哌啶的DMF溶液振荡2次，每次15 min，脱除末端Fmoc保护基；
（3）多肽切割
以1%TFA/DCM混合溶液为切割试剂，将步骤（2）得到的产物进行切割，切割4次，每次10min，然后加入等体积甲苯进行旋干，得到线性多肽；
（4）多肽环化
将合成的线性肽溶解于2 mg/mL的 DCM溶液中，加入5 eq的 PyBOP、5 eq 的HOBT和15eq的 DIEA，常温搅拌15h，减压除去溶剂，得到环化肽；
（5）脱保护
将环化肽溶于体积比为9.5/0.25/0.25的TFA/三异丙基硅烷/水中，常温搅拌3 h，减压移除大部分TFA后，通过乙醚沉淀，收集沉淀产物；
（6）多肽纯化
将上述得到的沉淀产物经RP-HPLC分离纯化，收集流出液，再冷冻干燥，即得目标产物。
6.根据权利要求5所述的富含正电荷的环抗菌肽类似物，其特征在于：所述步骤（6）中RP-HPLC的纯化条件为：流动相A：0.1％TFA/水；流动相B：乙腈；线性梯度洗脱，收集主要吸收峰的流出液。
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