CN112679576A - 抗菌脂肽、抗菌脂肽水凝胶制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗菌生物材料领域，涉及一种锚状阳离子抗菌脂肽水凝胶的制备方法及其在抑菌和组织损伤修复中的应用。所述抗菌脂肽具有以下结构：从N端到C端的氨基酸序列为KKAAA(K)nAAAKK，其中，n为1～4的整数；所述氨基酸序列中，分子链两端之外的赖氨酸侧链上的氨基与脂肪族烃基酸偶联。本发明制备的锚状阳离子抗菌脂肽拥有天然抗菌脂肽发挥抗菌作用的关键因素：正电荷、疏水域、两亲性、β折叠二级构象等。除此之外，疏水烃基链的引入进一步增加了抗菌脂肽与细菌细胞膜的相互作用。因此，本发明制备的锚状阳离子抗菌脂肽表现出广谱和优异的抗菌性能，可用于组织损伤(尤其是慢性伤口)修复和抗菌材料，具有良好的应用前景和价值。

Description

抗菌脂肽、抗菌脂肽水凝胶制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及抗菌生物材料领域，特别是涉及一种抗菌脂肽、抗菌脂肽水凝胶制备方法及其应用。

背景技术

人类与疾病斗争的历史中，很重要的一个方面就是不断跟各种病菌做斗争的历史。通常采用阳离子抗菌脂肽或者脂肽进行抗菌，抑制感染。其中，阳离子抗菌脂肽抗菌活性高，抗菌谱较广，种类较多，并且安全不易变质。然而也存在提取难度大，化学合成价格较高的问题。因此，亟需发展一种具有较高抗菌活性的小分子抗菌脂肽，降低合成成本。

脂肽是一类多肽衍生物，其结构特征为在多肽末端或侧链修饰烃基链。传统上，脂肽一般来源于植物、动物和微生物，当然大多数来源于微生物。由于来自于生物的脂肽也存在种类繁多和结构复杂的问题，纯化较为困难，人们也倾向于直接进行人工合成。天然脂肽的人工合成也较为困难，成本仍旧较高。

发明内容

基于此，有必要针对上述提到的至少一个问题，提供一种抗菌脂肽、抗菌脂肽水凝胶制备方法及其应用。

第一个方面，本申请提供了一种抗菌脂肽水凝胶，包括抗菌脂肽，所述抗菌脂肽具有以下结构：

从N端到C端的氨基酸序列为KKAAA(K)nAAAKK，其中，n为1～4的整数；所述氨基酸序列中，分子链两端之外的赖氨酸侧链上的氨基与脂肪族烃基酸偶联。

在第一个方面的某些实现方式中，所述脂肪族烃基酸选自正辛酸、十二酸、十八酸、二十二酸或油酸之一。

第二个方面，本申请提供了一种抗菌脂肽的制备方法，包括如下步骤：

采用Fmoc固相多肽合成法，从树脂出发，根据所述抗菌脂肽的氨基酸序列，从C端到N端依次偶联氨基酸；

将脂肪族烃基酸与分子链两端之外的赖氨酸侧链上的氨基偶联，得到多肽树脂；

将所述多肽树脂经过TFA切割后，即得到锚状阳离子抗菌脂肽。

第三个方面，本申请提供了一种抗菌脂肽水凝胶的制备方法，所述抗菌脂肽水凝胶包括如本申请第一个方面描述的抗菌脂肽；所述抗菌脂肽水凝胶的制备方法包括：

配制质量分数为2％～5％，并且pH值范围为7～9的缓冲溶液；

将所述抗菌脂肽溶于缓冲溶液，得到水凝胶。

在第三个方面的某些实现方式中，所述缓冲溶液可选择磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、磷酸盐-氢氧化钠缓冲溶液、巴比妥酸-盐酸缓冲溶液、Tris-盐酸缓冲溶液、硼酸-硼砂缓冲溶液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液、PBS缓冲溶液或HBSS缓冲溶液中的一种。

第四个方面，本申请提供了一种抗菌脂肽的应用方法，包括如本申请第一个方面描述的抗菌脂肽，所述抗菌脂肽水凝胶用于抑制细菌生长。

在第四个方面的某些实现方式中，所述抗菌脂肽用于制备组织损伤修复药物。

本发明的实施例中提供的技术方案带来如下有益技术效果：

本发明提供的抗菌脂肽表现出广谱和优异的抗菌性能，可用于组织损伤修复和抗菌材料，具有良好的应用前景和价值；另外，由于采用Fmoc固相多肽合成法，并且将形成的多肽树脂经TFA切割，就能得到锚状阳离子抗菌脂肽，该化学合成的方式较为简单，合成成本较低，适合于工业生产。

本申请附加的方面和优点将在后续部分中给出，并将从后续的描述中详细得到理解，或通过对本发明的具体实施了解到。

附图说明

图1为本发明申请一实施例中一种抗菌脂肽的分子结构图；

图2为本发明申请一实施例中抗菌脂肽的制备方法的方法流程图；

图3为本发明申请一实施例中抗菌脂肽水凝胶的制备方法的方法流程图；

图4为本发明申请一实施例中抗菌脂肽的原子力显微镜样貌图；

图5为本发明申请一实施例中抗菌脂肽水凝胶的扫描电镜样貌及水凝胶产品外观图；

图6为本发明申请一实施例中抑菌实验结果对比图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的可能的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文已经通过附图描述的实施例。通过参考附图描述的实施例是示例性的，用于使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面，而不能解释为对本发明的限制。此外，如果已知技术的详细描述对于示出的本发明的特征是非必要技术的，则可能将这些技术细节予以省略。

相关领域的技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。

本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本申请的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。应该理解，这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的全部或任一单元和全部组合。

下面以具体地实施例对本发明的技术方案以及该技术方案如何解决背景技术中提及的技术问题进行详细说明。

本申请第一个方面的实施例提供了一种抗菌脂肽水凝胶，包括抗菌脂肽，抗菌脂肽具有以下结构：从N端到C端的氨基酸序列为KKAAA(K)nAAAKK，其中，n为1～4的整数；氨基酸序列中，分子链两端之外的赖氨酸侧链上的氨基与脂肪族烃基酸偶联。如图1所示的是一种实施例中的抗菌脂肽的分子式。

可选的，在本申请第一个方面实施例的一种具体实现方式中，脂肪族烃基酸选自正辛酸、十二酸、十八酸、二十二酸或油酸之一。

本发明提供的抗菌脂肽表现出广谱和优异的抗菌性能，可用于组织损伤修复和抗菌材料，具有良好的应用前景和价值。

本申请第二个方面的实施例提供了一种抗菌脂肽的制备方法，如图2所示，包括如下步骤：

S110：采用Fmoc固相多肽合成法，从树脂出发，根据抗菌脂肽的氨基酸序列，从C端到N端依次偶联氨基酸。

S120：将脂肪族烃基酸与分子链两端之外的赖氨酸侧链上的氨基偶联，得到多肽树脂。

S130：将多肽树脂经过TFA切割后，即得到锚状阳离子抗菌脂肽。

本申请提供的抗菌脂肽的制备方法采用Fmoc固相多肽合成法，基于树脂进行生产制备，将形成的多肽树脂经TFA切割，就能得到锚状阳离子抗菌脂肽，该人工化学合成的方式较为简单，合成成本较低，适合于工业生产。

可选的，在第三个方面实施例的某些实现方式中，缓冲溶液可选择磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、磷酸盐-氢氧化钠缓冲溶液、巴比妥酸-盐酸缓冲溶液、Tris-盐酸缓冲溶液、硼酸-硼砂缓冲溶液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液、PBS缓冲溶液或HBSS缓冲溶液中的一种。

以下是具体的实施例：

实施例1：

称取0.3克Rink Amide-AM树脂，并添加到多肽合成装置中。在多肽合成装置中加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)振荡2小时溶胀树脂。然后用10mL含有20％哌啶(体积分数)的DMF溶液进行树脂的保护基的脱除。上述过程重复操作两次，每次持续20分钟左右。再用10mL DMF重复洗涤树脂3次，每次持续5分钟左右。取少许树脂加入到含有茚三酮和苯酚的乙醇溶液中，加热至沸腾，观察树脂颜色变化。若树脂变蓝甚至发黑，表明树脂的保护基成功得到脱除，可以进入氨基酸的偶联操作；若树脂颜色无明显变化，则需要继续树脂的保护基的脱除操作。

称取0.3克Fmoc-Lys(BOC)-OH和0.35克六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP，化学式C18H28F6N6OP2)，溶于10mL DMF。然后将该溶液转入到前述步骤中含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入216μL二异丙基乙胺(DIPEA)。室温下将混合物振荡4小时，然后用10mL DMF冲洗上述处理过的树脂3次，每次5分钟。

取少许清洗过的树脂加入到茚三酮和苯酚的乙醇溶液中，加热至沸腾，观察树脂颜色变化，若树脂颜色无明显变化，则说明分子链两端之外的赖氨酸侧链上的第一个氨基酸已完全偶联上了树脂，若树脂变蓝甚至发黑，则说明第一个氨基酸没有与树脂完全反应，需要重复上述过程实现连接。本申请中的树脂是固相载体，上面键合多肽的伯胺可以用Kaiser test检测。

用10mL含有20％哌啶(体积分数)的DMF溶液脱除保护基团Fmoc，反应两次，每次持续20分钟。之后再用10mL N,N-二甲基甲酰胺重复洗涤树脂3次，每次持续5分钟。取少许洗涤后的树脂加入到茚三酮和苯酚的乙醇溶液中，加热至沸腾，观察树脂颜色变化，若树脂变蓝甚至发黑，说明分子链两端之外的赖氨酸侧链上的第一个氨基酸的保护基成功脱除，可以进行分子链两端之外的赖氨酸侧链上的第二个氨基酸的偶联，若树脂颜色无明显变化，则需要继续第一个氨基酸的保护基的脱除操作。

按照前述步骤，依次缩合Fmoc-Lys(BOC)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Lys(Alloc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Lys(BOC)-OH，Fmoc-Lys(BOC)-OH。得到的氨基酸序列为KKAAAKAAAKK。

称取0.02克四(三苯基膦)钯，用10毫升二氯甲烷溶解，然后将得到的溶液转入到前述步骤中含有处理过的树脂的多肽合成装置中。再加入250μL苯硅烷，脱除树脂上赖氨酸的保护基，反应两次，每次持续30分钟，之后再用10mL的DMF重复洗涤树脂3次，每次持续5分钟。称取0.14克盐酸多巴胺，0.17克PyBOP，溶于10mL DMF。然后将该含PyBOP溶液转入到前述步骤中含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入100μL二异丙基乙胺(DIPEA)，室温下振荡24小时，然后用10mL DMF冲洗树脂3次，每次5分钟。

用10mL二氯甲烷冲洗经过上述步骤处理后的树脂3次，每次5分钟，再用10mL甲醇冲洗树脂3次，每次5分钟，接着用10mL二氯甲烷冲洗树脂3次，每次5分钟。

将多肽从已经反应生成抗菌脂肽的树脂上裂解下来，具体过程如下：

首先配置裂解液：9.5mL TFA(三氟乙酸，化学式CF3COOH)+0.25mL三异丙基硅烷+0.25mL去离子水。将裂解液加入到前述的含有处理过的树脂的多肽合成装置中，振荡反应3小时，用圆底烧瓶收集滤液。然后用10mL二氯甲烷冲洗树脂2次，合并滤液，并旋蒸除去溶剂。接着在圆底烧瓶中加入乙醚，立即出现白色沉淀。然后离心分离上述悬浊液，转速可选择为5000rpm，离心时间为10分钟，离心两次，除去上清液，加入甲醇溶解，通过制备型MPLC(中低压制备色谱系统，Medium Pressure Preparative Liquid Chromatography System)纯化产物。最后在纯化产物中加入去离子水进行溶解，然后冷冻干燥，收集白色粉末，即得本申请提供的锚状阳离子抗菌脂肽。如图4所示，通过原子力显微镜可观察到抗菌脂肽的部分微观结构。

本申请上述实施例提供了一种锚状阳离子抗菌脂肽的制备过程，其中的反应物用量只是一种例举，并非仅有上述一种方案，根据上述组分进行的任何同比例扩展，均应认为是本申请保护的范围。

本申请第三个方面的实施例提供了一种抗菌脂肽水凝胶的制备方法，抗菌脂肽水凝胶包括如本申请第一个方面描述的抗菌脂肽水凝胶。如图3所示，抗菌脂肽水凝胶的制备方法具体包括如下步骤：

S210：配制质量分数为2％～5％，并且pH值范围为7～9的缓冲溶液。

S220：将抗菌脂肽溶于缓冲溶液，得到水凝胶。

实施例2

将实施例1中制备的抗菌脂肽配制成质量分数为2％的pH值为7.4的HBSS缓冲溶液，即得抗菌脂肽水凝胶，如图5所示的是扫描电镜下抗菌脂肽水凝胶的微观结构，瓶中所装载的透明物即为抗菌脂肽水凝胶。

实施例3

将实施例1中制备的抗菌脂肽配制成质量分数为2％的pH＝7.4的PBS缓冲溶液，即得抗菌脂肽水凝胶。

实施例4

将实施例1中制备的抗菌脂肽配制成质量分数为2％的pH＝7.4的Tris-盐酸缓冲溶液，即得抗菌脂肽水凝胶。

本申请第四个方面的实施例则提供了一种抗菌脂肽的应用方法，包括如本申请第一个方面实施例中描述的抗菌脂肽，所述抗菌脂肽用于制备组织损伤修复药物。实施例5

抗菌脂肽水凝胶抑菌活性的测定：将实施例2中制备的抗菌脂肽水凝胶与大肠杆菌溶液共孵育1～3小时后，取2～5μL溶液用PBS缓冲溶液稀释后，均匀涂抹在含有琼脂的LB固体培养平板，37℃孵育16～18小时后，观察细菌菌落生长情况。如图6所示，当抗菌脂肽水凝胶与大肠杆菌溶液，没有大肠杆菌菌落出现，表明抗菌脂肽水凝胶具有优异的抗革兰氏阴性菌活性。

实施例6

抗菌脂肽水凝胶抑菌活性的测定：将实施例2中制备的抗菌脂肽水凝胶与金黄色葡萄球菌溶液共孵育1～3小时后，取2～5μL溶液用PBS缓冲溶液稀释后，均匀涂抹在含有琼脂的LB固体培养平板，37℃孵育16～18小时后，观察细菌菌落生长情况。如图6所示，当抗菌脂肽水凝胶与金黄色葡萄球菌溶液，没有金黄色葡萄球菌菌落出现，表明抗菌脂肽水凝胶具有优异的抗革兰氏阳性菌活性。

本发明的实施例中提供的技术方案带来如下有益技术效果：

本发明提供的抗菌脂肽表现出广谱和优异的抗菌性能，可用于组织损伤修复和抗菌材料，具有良好的应用前景和价值；另外，由于采用Fmoc固相多肽合成法，并且将形成的多肽树脂经TFA切割，就能得到锚状阳离子抗菌脂肽，该化学合成的方式较为简单，合成成本较低，适合于工业生产。

本技术领域技术人员可以理解，本申请中已经讨论过的各种操作、方法、流程中的步骤、措施、方案可以被交替、更改、组合或删除。进一步地，具有本申请中已经讨论过的各种操作、方法、流程中的其他步骤、措施、方案也可以被交替、更改、重排、分解、组合或删除。进一步地，现有技术中的具有与本申请中公开的各种操作、方法、流程中的步骤、措施、方案也可以被交替、更改、重排、分解、组合或删除。

术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本申请的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

在本申请的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。

在本说明书的描述中，具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

应该理解的是，虽然附图的流程图中的各个步骤按照箭头的指示依次显示，但是这些步骤并不是必然按照箭头指示的顺序依次执行。除非本文中有明确的说明，这些步骤的执行并没有严格的顺序限制，其可以以其他的顺序执行。而且，附图的流程图中的至少一部分步骤可以包括多个子步骤或者多个阶段，这些子步骤或者阶段并不必然是在同一时刻执行完成，而是可以在不同的时刻执行，其执行顺序也不必然是依次进行，而是可以与其他步骤或者其他步骤的子步骤或者阶段的至少一部分轮流或者交替地执行。

以上所述仅是本申请的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

<110> 黄石瀚海新材料科技有限公司

<120> 抗菌脂肽、抗菌脂肽水凝胶制备方法及其应用

<160> 4

<210> 1

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

KKAAAKAAAK K 11

<210> 2

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

KKAAAKKAAA KK 12

<210> 3

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

KKAAAKKAA AKK 13

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

KKAAAKKKKA AAKK 14

Claims (7)

1.一种抗菌脂肽，其特征在于，所述抗菌脂肽具有以下结构：

从N端到C端的氨基酸序列为KKAAA(K)nAAAKK，其中，n为1～4的整数；所述氨基酸序列中，分子链两端之外的赖氨酸侧链上的氨基与脂肪族烃基酸偶联。

2.根据权利要求1所述的抗菌脂肽，其特征在于，所述脂肪族烃基酸选自正辛酸、十二酸、十八酸、二十二酸或油酸之一。

3.一种抗菌脂肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

采用Fmoc固相多肽合成法，从树脂出发，根据所述抗菌脂肽的氨基酸序列，从C端到N端依次偶联氨基酸；

将脂肪族烃基酸与分子链两端之外的赖氨酸侧链上的氨基偶联，得到多肽树脂；

将所述多肽树脂经过TFA切割后，即得到锚状阳离子抗菌脂肽。

4.一种抗菌脂肽水凝胶的制备方法，其特征在于，所述抗菌脂肽水凝胶包括如权利要求1或2所述的抗菌脂肽；所述抗菌脂肽水凝胶的制备方法包括：

配制质量分数为2％～5％，并且pH值范围为7～9的缓冲溶液；

将所述抗菌脂肽溶于缓冲溶液，得到水凝胶。

5.根据权利要求4所述的抗菌脂肽水凝胶的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液可选择磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、磷酸盐-氢氧化钠缓冲溶液、巴比妥酸-盐酸缓冲溶液、Tris-盐酸缓冲溶液、硼酸-硼砂缓冲溶液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液、PBS缓冲溶液或HBSS缓冲溶液中的一种。

6.一种抗菌脂肽水凝胶的应用方法，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的抗菌脂肽，所述抗菌脂肽水凝胶用于抑制细菌生长。

7.根据权利要求6所述的抗菌脂肽水凝胶的应用方法，其特征在于，所述抗菌脂肽水凝胶用于制备组织损伤修复药物。

Images