CN106511966A - 一种具有靶向功能的抗菌脂肽复合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的一种具有靶向功能的抗菌脂肽复合物及其制备方法，由结构相似的脂肽和拟糖脂在溶液中自组装而成，其中，脂肽包含活性肽和疏水链段，拟糖脂包含寡糖和相似的疏水链段。本发明具有靶向功能的抗菌脂肽复合物由拟糖脂中糖基单元为趋化剂靶定细菌细胞膜，由抗菌脂肽发挥抗菌作用，具有抗菌活性高、作用时间长、剂量低、不易产生耐药性等特点。

Description

一种具有靶向功能的抗菌脂肽复合物及其制备方法
技术领域
本发明是一种具有靶向功能的抗菌脂肽复合物，涉及一种可用于生物医药等方面的材料，属于生物医用材料领域。
背景技术
近年来，随着抗生素的泛用和滥用，致使多重耐药菌的产生，而多重耐药菌引起的感染对人类健康造成了严重的威胁。更重要地是，抗生素的研发速度远远赶不上细菌耐药特性产生的速度。为了解决这一难题，研究者采取的主要措施有研制开发新型抗生素、寻找新的药物靶点、利用药物载体系统等。
抗菌肽是宿主防御体系中天然免疫系统所产生的具有一定杀菌效果的短肽类物质，具有广谱抗菌性。很多抗菌肽不仅对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌具有杀灭作用，而且对某些真菌、原生生物、甚至肿瘤细胞和病毒也具有一定的抑制作用。由于抗菌肽的作用主要针对细胞膜结构，普遍认为具有较低的抗药性，具有广泛的应用前景。基于脂质体作为载体在药物研发和分子生物学等领域研究中取得的进展，目前已有多种抗生素药物制成脂质体药物传输系统用于细胞内微生物感染，并取得了较好效果。脂质体作为抗生素载体具有缓释药物、延长药物作用时间、通过修饰靶向分子可将药物输送到病变部位、增强药物对细胞内、外病原体的抗菌活性，减少药物剂量，避免耐药性发生，降低对正常组织的损伤等优点。因此，利用抗菌脂肽靶向载体可能是一种有效并且不易产生耐药性的治疗手段，有望辅助或者替代传统的抗生素治疗。
目前基于载体对细菌细胞膜的靶向研究甚少，Neoh等研究表明以葡萄糖、甘露糖单元为趋化剂，在细菌细胞膜糖转运过程中能有效靶定细菌。(Pharm.Res.,2016,33:1161-1174.)拟糖脂技术在1985年开始发展起来，目的是为了进行糖蛋白中寡糖结合活性研究。拟糖脂，即人工合成的糖脂，将寡糖结合到脂分子而不是蛋白质上，使寡糖以簇的形式展示成为可能。通过还原胺化将寡糖与含有磷酸乙醇铵的氨基脂进行化学结合，最为常用的氨基脂是二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺。研究者常常以拟糖脂作为生物探针，研究它们与抗体、植物凝集素等蛋白之间的相互作用。然而，究其本源，拟糖脂技术是将寡糖与脂分子偶联的高效技术，为制备及应用含糖基单元的脂质体提供了一种新的途径。
发明内容
技术问题：本发明的目的是提供一种具有靶向功能的抗菌脂肽复合物及其制备方法和应用。本
发明采用抗菌脂肽和拟糖脂复合脂质体提供一种低剂量、高效抗菌且不易产生耐药性的治疗手
段，有望辅助或者替代传统的抗生素治疗。
技术方案：一种具有靶向功能的抗菌脂肽复合物，抗菌脂肽复合物由脂肽和拟糖脂在溶液中自组装而成，其中，所述的脂肽包含活性肽和疏水链段，所述的拟糖脂包含寡糖和疏水链段，所述的疏水链段均为C12以上饱和脂肪酸脂质部分。
所述活性肽的序列为RLARIVVIRVAR、RIWVIWRR、KRWWKWWRR、IRWRIRVWVRRI、KRWRIRVRVIRK、KKWKIVVIKWKK、WIVVIWRRKRRR中的任意一种。
所述寡糖的单糖单元为葡萄糖、甘露糖中的一种。
所述脂肽的疏水链段为月桂酸、肉豆蔻酸、或棕榈酸脂质部分的一种。
所述拟糖脂的疏水链段为棕榈酸脂质部分。
制备所述的具有靶向功能的抗菌脂肽复合物的方法，
第一步，合成活性肽：采用Fmoc固相合成法合成活性肽；
第二步，合成脂肽：采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺偶联活性肽和疏水链段得到脂肽；
第三步，还原胺化制备拟糖脂：采用NaCNBH3为还原剂使寡糖和饱和脂肪酸还原胺化得到相应的拟糖脂；
第四步，自组装得到抗菌脂肽复合物：脂肽和拟糖脂在溶液中自组装得到抗菌脂肽复合物。
第三步中的饱和脂肪酸为二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺。
第三步中的寡糖和饱和脂肪酸的物质的量之比为32：1。
第四步中的溶液为氯仿甲醇混合溶液。
所述的具有靶向功能的抗菌脂肽复合物在制备靶向抗菌药物或材料中的应用。
有益效果：
1.本发明以拟糖脂中糖基单元为趋化剂，在细菌细胞膜糖转运过程中有效靶定细菌细胞膜，由脂肽发挥抗菌作用，是一种具有靶向功能的抗菌体系。
2.本发明抗菌脂肽和拟糖脂复合脂质体具有抗菌活性高、作用时间长、剂量低等特点，可避免耐药性发生、降低对正常组织的损伤等。
3.本发明采用拟糖脂技术将寡糖与脂分子偶联，为制备及应用含糖基单元的脂质体提供了一种新的途径。
具体实施方式
本发明由结构相似的脂肽和拟糖脂在溶液中自组装得到抗菌脂肽复合物，其中，脂肽包含活性肽和疏水链段，拟糖脂包含寡糖和相似的疏水链段。本发明具有靶向功能的抗菌脂肽复合物由拟糖脂中糖基单元为趋化剂靶定细菌细胞膜，由抗菌脂肽发挥抗菌作用。
通过固相合成法合成抗菌脂肽，脂肽包含活性肽和疏水链段，其中活性肽序列为RLARIVVIRVAR，RIWVIWRR，KRWWKWWRR，IRWRIRVWVRRI，KRWRIRVRVIRK，KKWKIVVIKWKK，WIVVIWRRKRRR中的一种，疏水链段为月桂酸(C12)、肉豆蔻酸(C14)、或棕榈酸(C16)脂质部分的一种。通过还原胺化将寡糖与含有磷酸乙醇铵的氨基脂偶联制备拟糖脂。拟糖脂包含寡糖和疏水链段，其中寡糖的单糖单元为葡萄糖、甘露糖中的一种，疏水链段为棕榈酸(C16)脂质部分。具有靶向功能的抗菌脂肽复合物由结构相似的脂肽和拟糖脂在溶液中自组装而成。
实施例1
通过Fmoc(9-芴甲氧羰基)固相合成法合成活性肽(RLARIVVIRVAR)，采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)偶联活性肽-棕榈酸(Palm)，得到脂肽产物RLARIVVIRVAR-Palm。通过还原胺化将寡糖与二棕榈酸酯磷酯酰乙醇胺(DHPE购自sigma公司)偶联制备拟糖脂。取四糖溶液加至聚四氟乙烯瓶中，加入DHPE，两者摩尔比为32:1。加入氯仿/甲醇/水混合溶液，水浴超声后加入新配制的NaCNBH3，继续反应72小时。取适量脂肽和拟糖脂，加入氯仿/甲醇混合溶剂，探头超声间歇处理30分钟，制得抗菌脂肽复合物。
实施例2
通过固相合成法合成活性肽(RIWVIWRR)，采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)偶联活性肽-硬脂酸(Stearic)，得到脂肽产物RIWVIWRR-Stearic。取六糖溶液加至聚四氟乙烯瓶中，加入DHPE，两者摩尔比为32:1。加入氯仿/甲醇/水混合溶液，水浴超声后加入新配制的NaCNBH3，继续反应48小时。取适量脂肽和拟糖脂，加入氯仿/甲醇混合溶剂，探头超声间歇处理15分钟，制得抗菌脂肽复合物。
以浊度法和平板涂布法评价脂肽-拟糖脂复合脂质体对不同菌种的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，结果见表1，采用脂肽脂质体为对照组。
表1抗菌脂肽复合物对不同菌种的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)
实施例3
通过固相合成法合成活性肽(KRWWKWWRR)，采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)偶联活性肽-月桂酸(Lauric)，得到脂肽产物KRWWKWWRR-Lauric。取四糖溶液加至聚四氟乙烯瓶中，加入DHPE，两者摩尔比为32:1。加入氯仿/甲醇/水混合溶液，水浴超声后加入新配制的NaCNBH3，继续反应72小时。取适量脂肽和拟糖脂，加入氯仿/甲醇混合溶剂，探头超声间歇处理30分钟，制得抗菌脂肽复合物。
序列表
SEQNO.1: RLARIVVIRVAR
SEQNO.2: RIWVIWRR
SEQNO.3: KRWWKWWRR
SEQNO.4: IRWRIRVWVRRI
SEQNO.5: KRWRIRVRVIRK
SEQNO.6: KKWKIVVIKWKK
SEQNO.7: WIVVIWRRKRRR

Claims (9)

1.一种具有靶向功能的抗菌脂肽复合物，其特征在于，抗菌脂肽复合物由脂肽和拟糖脂在溶液中自组装而成，其中，所述的脂肽包含活性肽和疏水链段，所述的拟糖脂包含寡糖和疏水链段，所述的疏水链段均为C12以上饱和脂肪酸脂质部分。
2.根据权利要求1所述的具有靶向功能的抗菌脂肽复合物，其特征在于，所述活性肽的序列为RLARIVVIRVAR、RIWVIWRR、KRWWKWWRR、IRWRIRVWVRRI、KRWRIRVRVIRK、KKWKIVVIKWKK、WIVVIWRRKRRR中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的具有靶向功能的抗菌脂肽复合物，其特征在于，所述寡糖的单糖单元为葡萄糖、甘露糖中的一种。
4.根据权利要求1所述的具有靶向功能的抗菌脂肽复合物，其特征在于，所述脂肽的疏水链段为月桂酸、肉豆蔻酸或棕榈酸脂质部分的一种。
5.根据权利要求1所述的具有靶向功能的抗菌脂肽复合物，其特征在于，所述拟糖脂的疏水链段为棕榈酸脂质部分。
6.制备权利要求1～5任一所述的具有靶向功能的抗菌脂肽复合物的方法，其特征在于，第一步，合成活性肽：采用Fmoc固相合成法合成活性肽；
第二步，合成脂肽：采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺偶联活性肽和疏水链段得到脂肽；
第三步，还原胺化制备拟糖脂：采用氰基硼氢化钠为还原剂使寡糖和饱和脂肪酸还原胺化得到相应的拟糖脂；
第四步，自组装得到抗菌脂肽复合物：脂肽和拟糖脂在溶液中自组装得到抗菌脂肽复合物。
7.根据权利要求6所述的制备具有靶向功能的抗菌脂肽复合物的方法，其特征在于，第三步中的饱和脂肪酸为二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺。
8.根据权利要求6所述的制备具有靶向功能的抗菌脂肽复合物的方法，其特征在于，第三步中的寡糖和饱和脂肪酸的物质的量之比为32：1。
9.根据权利要求6所述的制备具有靶向功能的抗菌脂肽复合物的方法，其特征在于，第四步中的溶液为氯仿甲醇混合溶液。
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