CN105601709B - 一种多肽及其作为细菌或哺乳细胞转染载体的应用 - Google Patents

一种多肽及其作为细菌或哺乳细胞转染载体的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种多肽及其作为细菌或哺乳细胞转染载体的应用。所涉及的多肽的结构如式(1)所示。本发明的转染体系，能够转染多种类型小核酸分子，分枝状肽与小核酸分子以非共价方式结合形成纳米粒，纳米粒制备简单；本发明的多肽不仅适用于细菌的转染，同时也适用于真核细胞的转染。i＝3,6或10；XP3为‑R‑K‑R,YP3为‑R‑W‑L‑A‑W‑L；XP6为‑R‑R‑K‑R,YP6为‑W‑L‑A‑W‑L‑Ac；XP10为‑R‑R‑H‑R,YP3为‑W‑L‑A‑W‑L‑Ac。

Description

一种多肽及其作为细菌或哺乳细胞转染载体的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种多肽及其作为细菌或哺乳细胞转染载体的应用。
背景技术
近些年来，小核酸分子药物得到越来越多的关注与研究。不仅在哺乳细胞上得到了广泛的研究与应用，也成为抗菌药物研究新的突破点。小核酸分子是通过碱基互补配对原理，根据细胞内基因组学相关信息，以细胞内增殖、致病等相关基因为靶点，干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA的剪接加工至输出和翻译等各个环节，从阻断相关基因表达入手，进而达到治疗作用。然而，一个未经修饰的由10个单体组成的寡核苷酸分子量一般在2-3kDa，各种化学结构修饰将进一步增加其大小，核酸分子量增大，细胞摄入率降低，从而不能更好地进入细胞而发挥治疗作用。此外，在细菌中，由于细菌的细胞壁具有不同寻常的结构，这种有效的屏障会使外来分子难以透过，包括小分子化合物和小核酸分子，特别是脂多糖组成的革兰阴性菌的外膜也是阻碍分子进入细菌的一个主要障碍。
多种反义基因靶向核酸药物递药系统已成功地应用于真核细胞的基因治疗，然而由于细菌细胞和真核细胞尺寸、结构组成不同，这些适用于真核细胞的基因递药系统并不完全合适。研究表明，除了脂质体递药系统之外，透膜肽(CPPs)也可用于抗菌反义寡核苷酸分子的运载工具，但相关研究却很少，目前仅发现HIV-TAT，pVEC和(RXR)4三种透膜肽通过与反义寡核苷酸共价结合，可实现反义抗菌分子的递送。但这种共价结合导致合成成本较高，载药量低及工业化生产困难等问题，极大地限制了小核酸药物抗菌的发展。
发明内容
针对现有技术的缺陷或不足，本发明的目的之一是提供一种多肽。该多肽的结构为：
i＝3,6或10；
XP3为-R-K-R,YP3为-R-W-L-A-W-L；
XP6为-R-R-K-R,YP6为-W-L-A-W-L-Ac；
XP10为-R-R-H-R,YP3为-W-L-A-W-L-Ac。
本发明同时提供了多肽-核酸分子复合物的制备方法：方法包括多肽与脂质混合后加入核酸分子制备多肽-核酸分子复合物；所述脂质为DOTAP、DOPC、DODAG、DOPE、DMTAP、DPPC、RPR 209120、Chol、Cardiolipin、DODMA、DSPC、DGG、DLinDMA、DLin-KC2-DMA、PEG2000-C-DMA、AtuFECT01、DphyPE、DSGLA或DSPE。
进一步，本发明的制备方法中盐离子浓度小于0.2mM。
进一步，本发明的制备方法中多肽与核酸中N与P的摩尔比为8：1，脂质的质量与核酸质量相等。
本发明的核酸分子为asRNA、siRNA、miRNA或质粒DNA。
本发明还提供了上述多肽作为细菌转染载体的应用。
本发明同时还提供了上述多肽作为哺乳细胞转染载体的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
脂质体转染具有毒性；慢病毒转染有免疫原性；共价结合方式的多肽转染合成成本高，而且转染对象单一。本发明的转染体系，能够转染多种类型小核酸分子，分枝状肽与小核酸分子以非共价方式结合形成纳米粒，纳米粒制备简单；不仅适用于细菌的转染，同时也适用于真核细胞的转染。
附图说明
图1为P3的质谱谱图；
图2为P3的高效液相图谱；
图3为P6的质谱谱图；
图4为P6的高效液相色谱谱图；
图5为P10的质谱谱图；
图6为P10的高效液相色谱谱图；
图7为Pep3/PS-ODN/DOTAP纳米复合物的电镜照片；
图8为Pep6/PS-ODN/DOTAP纳米复合物的电镜照片；
图9为Pep10/PS-ODN/DOTAP纳米复合物的电镜照片；
图10为Pep3、Pep6、Pep 10包裹PS-ODN的包封率；
图11为Pep3/PS-ODN/DOTAP、Pep6/PS-ODN/DOTAP、Pep10/PS-ODN/DOTAP纳米复合物4℃保存4周的粒径稳定性；
图12为Pep3/PS-ODN/DOTAP纳米复合物的细菌摄取检测结果，其中A为PS-ODN对照组；B为实验组，结果显示Pep3/PS-ODN/DOTAP纳米复合物可被细菌高效摄取；
图13为Pep6/PS-ODN/DOTAP纳米复合物的细菌摄取检测结果，其中A为PS-ODN对照组；B为实验组，结果显示Pep6/PS-ODN/DOTAP纳米复合物可被细菌高效摄取；
图14为Pep10/PS-ODN/DOTAP纳米复合物的细菌摄取实验结果，其中A为PS-ODN对照组；B为实验组，结果显示Pep10/PS-ODN/DOTAP纳米复合物可被细菌高效摄取；
图15为anti-rpoD Pep3/PS-ODN/DOTAP纳米复合物(浓度0.5μM)对ESBLs-E.coli生长的抑制实验结果；
图16为anti-rpoD Pep10/PS-ODN/DOTAP纳米复合物(浓度0.5μM)对ESBLs-E.coli生长的抑制实验结果；
图17为Pep10/PS-ODN/DOTAP纳米复合物抑制细菌靶基因mecA mRNA的水平实验结果；
图18为Pep10/siRNA/DOTAP纳米复合物抑制哺乳细胞靶基因GAPDH mRNA的水平实验结果。
具体实施方式
一、本发明多肽的结构
表1本发明多肽的结构
二、本发明多肽的合成方法及表征
P3、P6和P10同属于两亲性肽，以P6的合成方法为例(合成方法采用Fmoc固相合成法)。
1、合成原料及相关试剂：
保护氨基酸原料：Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-Trp(BOC)-OH，Fmoc-L-Ala-OH，Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-L-Lys(BOC)-OH，Fmoc-L-Lys(BOC)-OH，Fmoc-L-Lys(DDE)-OH,Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH等(成都诚诺)；缩合试剂：HBTU(昊帆生物科技)，DIEA(国药集团上海化学试剂公司)；溶剂：DMF(Dikma)，DCM(Dikma)，甲醇(Fisher)，乙腈(Fisher)；树脂：取代度为0.28mmol/g的Rink Amide-MBHA Resin(天津市南开合成科技有限公司)；脱保护试剂：哌啶(国药集团上海化学试剂公司)；检测试剂：苯酚试剂(自配)，吡啶试剂(自配)，茚三酮试剂(自配)；切割试剂：TFA(J.T.Baker)，TIS(ALDRICH)，EDT，无水乙醚(上海试一化学试剂有限公司)；精密电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；仪器设备：十二通道半自动多肽合成仪，SHIMADZU高效液相色谱仪(型号：制备型，分析型，软件：Class-VP.Sevial System，厂商：SHIMADZU)；LABCONCO冻干机(型号：Freezone.Plus.6，厂商：LABCONCO，离心机(上海安亭科学仪器厂型号：TDL-40B)。
2、合成过程：
(1)树脂溶涨
将Rink Amide-MBHA Resin放入反应管中，加DMF(15ml/g)，振荡60min.
(2)脱氨基保护
去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min.
(3)检测
抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应。
(4)清洗
DMF(10ml/g)清洗两次，甲醇(10ml/g)清洗两次，DMF(10ml/g)清洗两次。
(5)接第一个氨基酸
通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量Fmoc-L-Lys(DDE)-OH，3倍摩尔过量HBTU，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入DMF溶解，振荡30min。吡啶：乙酸酐＝1:1封头30min。
(6)脱保护
去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。
(7)检测
抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应。
(8)清洗
DMF(10ml/g)清洗两次，甲醇(10ml/g)清洗两次，DMF(10ml/g)清洗两次。
(9)缩合
加入3倍摩尔过量Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH，3倍摩尔过量HBTU，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入DMF溶解，振荡45min。
(10)脱保护形成分枝
去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。
(11)缩合
保护氨基酸Fmoc-L-Trp(BOC)-OH六倍过量，HBTU六倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量.反应45min.
(12)检测
抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,无色说明反应完全。
(13)脱保护
去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。
(14)检测
抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应。
(15)清洗
DMF(10ml/g)清洗两次，甲醇(10ml/g)清洗两次，DMF(10ml/g)清洗两次。
(16)重复(11)至(15)步操作，从右到左依次连接Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-Ala-OH，Fmoc-L-Trp(BOC)-OH，Fmoc-L-Leu-OH，并脱除最后一个氨基酸氨基保护Fmoc。吡啶：乙酸酐＝1:1修饰AC。
(17)去DDE
加入2％水合肼/DMF(20ml),两次，每次10min。检测并洗。
(18)重复(9)到(15)步骤，依次连接
Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH,Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-L-Lys(BOC)-OH，Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH，并脱除最后一个氨基酸氨基保护Fmoc.注：序列五氨基酸顺序为Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH,Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-L-His(Trt)-OH，Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH
(19)抽干，按照下列方法洗树脂
DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)三次，甲醇(10ml/g)四次，抽干10min。
(20)脱去侧链保护基
配制切割液(10/g)TFA94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS 1％切割时间：180min。
(21)吹干洗涤
将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。
(22)纯化制备，将纯化后的溶液冻干，既得到成品。
(23)鉴定
分别取少量的成品多肽，做MS的分子量鉴定，和HPLC分析的纯度鉴定。
4、结构表征：
P3结构表征：质谱分析结果见图1，MS(ESI)，[M+3]3+m/z 979.65，与理论值978.56基本相符，检测分子量与理论值相符，成功合成不对称型两亲性肽(P3)；纯度检测结果见图2，HPLC显示P3纯度为95.49％。
P6结构表征：质谱分析结果见图3，MS(ESI)，[M+3]3+m/z 1007.2，与理论值1006.2基本相符，由结果知，检测分子量与理论值相符，成功合成不对称性两性肽P6；纯度检测结果见图4，HPLC显示P6纯度为99.34％。
P10结构表征：质谱分析结果见图5，MS(ESI)，[M+3]3+m/z 1013.2，与理论值1012.3基本相符，由结果知，检测分子量与理论值相符，成功合成不对称性两亲性肽P10；纯度检测结果见图6，HPLC显示P10纯度为99.87％。
三、多肽/RNA/DOTAP核酸分子(Pep/PS-ODN/DOTAP)纳米复合物的制备：
1、相关试剂和配方
(1)主要组分：
DOTAP(1,2-Distearoyl--3-Trimethylammonium-Propane)+多肽(P3、P6、P10)+核酸分子(PS-ODN)；
(2)组分比例：
DOTAP与核酸分子质量比为1：1；多肽与核酸分子的氮磷比为8:1(氮磷比分别根据多肽结构中含有的游离氨基个数和核酸分子中磷酸基个数计算)；
(3)其他工作溶液：
PBS溶液的配置：称取NaCl l8g，KCl 0.2g，Na2HPO41.44g，K2HPO40.24g，用800mL去离子水溶解，调节PH至7.4，定容至1L，即配制成10mM的PBS溶液。
NaH2PO4-Na2HPO4溶液：精密称取Na2HPO4和NaH2PO4用去离子水溶解，制备20mM、2mM和0.2mM的母液；然后去0.2mM NaH2PO4-Na2HPO4溶液作为基本溶液，调节pH，分别制备pH为3.5、4.5、5.5、6.5和7.5的溶液备用。
反义核酸PS-ODN母液的配制：取1管PS-ODN，共104.4nmol，加入104.4μl ddH2O，涡旋使溶解，配制成1mM母液备用。
多肽的溶解和母液制备：参见表2
表2 P3、P6和P10母液的配制
2、制备方法：
首先将多肽与DOTAP混合，2600r/min震荡1min，37℃孵育30min，然后加入一定量的反义核酸药物PS-ODN，2600r/min震荡1min，37℃孵育30min，即可得到Pep/PS-ODN/DOTAP纳米复合物。整个制备溶液中盐离子浓度应该小于0.2mM或者用去离子水制备，pH为6.5左右。
3、Pep/PS-ODN/DOTAP纳米复合物的结构表征和稳定性：
(1)通过高分辨率透射电子显微镜观察，Pep3/PS-ODN/DOTAP、Pep6/PS-ODN/DOTAP、Pep10/PS-ODN/DOTAP纳米复合物的形态特征，结果如图7-9所示。
(2)所制备的Pep3/PS-ODN/DOTAP、Pep6/PS-ODN/DOTAP、Pep10/PS-ODN/DOTPA纳米复合物的包封率高达95％，在4℃储存稳定性好，结果如图10和11所示。
四、Pep/PS-ODN/DOTAP纳米复合物的细菌摄取实验
(1)实验所用菌株：革兰氏阳性菌和阴性菌的标准菌株和耐药菌株各一株，如下表3所示：
表3
(2)菌悬液的制备：取冻存于﹣20℃的待测菌株，划线接种于M-H琼脂平板，37℃孵箱中孵育过夜，次日用接种环挑取单克隆菌落，接种于3mL营养肉汤中，37℃,220r/min,增殖至对数生长期后，用M-H肉汤将菌液稀释至约1×108CFU/mL；12000r/min，4℃，离心5min，去上清，加入1mL去离子水混悬，备用。
(3)如前所述，用不同Pep包裹FITC标记的PS-ODN制备FITC-labeled-Pep/PS-ODN/DOTAP纳米复合物,然后加入100μl稀释好的菌悬液，约1×107CFU，然后置于37℃孵箱中继续孵育1h，然后将样品高速离心，12000r/min，5min，去除上清液，用PBS缓冲溶液清洗两次后，采用流式细胞术检测细菌对FITC-labeled-Pep/PS-ODN/DOTAP纳米复合物的摄取情况。
(4)细菌摄取率实验研究结果：所制备的纳米复合物可以被四株检测细菌迅速高效摄取，结果如图12-14分别为Pep3、6、10/PS-ODN/DOTAP纳米复合物与细菌共孵育1小时后，待测细菌摄入含有荧光分子纳米复合物的比例。
五、Pep/PS-ODN/DOTAP纳米复合物抑制待测菌株生长试验：
(1)rpoD与细菌生长密切相关，因此如果抑制rpoD的表达，细菌的生长必然受到抑制。本实验中设计合成anti-rpoD PS-ODN序列(5’-tttgctccat-3’)，用Pep/DOTAP系统包裹anti-rpoD PS-ODN，通过生长曲线实验进一步验证了本发明所构建纳米递药系统可以成功将反义核酸PS-ODN递送至细菌体内，并发挥作用。
(2)实验方法：将新鲜过夜培养的细菌转种于营养肉汤培养基中，37℃、220rpm培养至对数生长中期，稀释至0.5麦氏比浊标准。然后取适量的细菌分组，每组加入不同浓度的纳米粒复合物溶液，将菌液及药物的混合液(200μL)加入到96孔板中，37℃、150r/min振荡培养，分别于1、2、3、4、5、6、7、8h测定吸光度OD630，绘制生长曲线，观察细菌生长情况。
(3)结果：0.5μM的anti-rpoD Pep/PS-ODN/DOTAP纳米复合物可以显著抑制耐药菌ESBL-EC的生长，而其他对照组均没有抑制效果。这提示，本发明的递药体系可以成功将反义核酸药物递送至细菌体内，并顺利释放PS-ODN，使其与靶点结合发挥抗菌作用，结果如图15-16。
六、Pep/PS-ODN/DOTAP纳米复合物抑制细菌靶基因：
(1)在本实验中，以MRSA为研究对象，以细菌体内耐药密切相关的mecA基因为靶点，设计并合成抗mecA的anti-mecA PS-ODN：5’-cgagtccctttttaccaa-3’和错配序列mismatched：5’-aaactcttctggtaggtg-3’，制备Pep/PS-ODN/DOTAP纳米复合物，并与待检测细菌共孵育5小时，观察其对细菌靶基因mecA mRNA水平的抑制。
(2)细菌总RNA的提取及反转录：孵育培养5小时后，4℃，12000rpm离心2分钟收集菌体沉淀。按照天根试剂盒说明书操作提取细菌总RNA，最后一步加入30μl RNase-free ddH2O溶解吸附的RNA，若不立即反转录，可将RNA溶液放于-80℃保存。
(3)荧光定量PCR：mecA的引物序列为：
Forward:5’-aactacggtaacattgatcgcaac-3’,
Reverse:5’-gctttggtctttctgcattcct-3’；
16srRNA的引物序列为：
Forward:5’-gtgacaaaccggaggaaggt-3’,
Reverse:5’-atccgaactgagaacaactttatgg-3’；反应体系为20μL：Premix Ex TaqTM Ⅱ10μL，cDNA 1μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，灭菌去离子水7μL，内参为16s rRNA。反应条件：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸45s，运行40个循环，每个反应重复3次。在Mx3005PCR仪上进行荧光定量PCR反应，溶解曲线测定的起始温度设定为60℃，目标温度95℃，每台阶升高0.4℃，恒温20s，测定目的基因和内参基因的标准曲线和溶解曲线。测定结束后，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对于内参基因mecA的相对表达量。结果如图17所示。
七、Pep/siRNA/DOTAP纳米复合物抑制哺乳细胞靶基因：
(1)在本实验中，以人来源的胶质瘤细胞系U251为研究对象，以GAPDH基因为靶点，设计并合成抗GAPDH的siRNA：
sense:5'-UGACCUCAACUACAUGGUUTT-3',
antisense:5'-AACCAUGUAGUUGAGGUCATT-3'和错配序列，制备Pep/siRNA/DOTAP纳米复合物，并与待检测细胞共孵育5小时，更换血清培养基继续培养24h，观察其对细胞靶基因GAPDH mRNA水平的抑制。
(2)细胞总RNA的提取：孵育培养5小时后，4℃，12000rpm离心2分钟收集菌体沉淀。按照天根试剂盒说明书操作提取总RNA，最后一步加入30μl RNase-free dd H2O溶解吸附的RNA，若不立即反转录，可将RNA溶液放于-80℃保存。
(3)反转录：对提取的总RNA进行初步定量，并调节浓度约到100ng/μL，使用Takala试剂盒逆转录。
(4)荧光定量PCR：GAPDH的引物序列为：
Forward:5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’,
Reverse:5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；
β-actin的引物序列为：
Forward:5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，
Reverse:5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’；
PCR条件：15μL体系(cDNA 1μL,水4.5μL,SYBRⅡ7.5μL,10μM的上下引物各1μL)；选用β-actin作为内参基因。反应条件：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸45s，运行40个循环，每个反应重复3次。在Mx3005PCR仪上进行荧光定量PCR反应，溶解曲线测定的起始温度设定为60℃，目标温度95℃，每台阶升高0.4℃，恒温20s，测定目的基因和内参基因的标准曲线和溶解曲线。测定结束后，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对于内参基因的相对表达量。结果如图18所示。

Claims (7)

1.一种多肽，该多肽的结构为：
2.多肽-核酸分子复合物的制备方法，其特征在于，方法包括多肽与脂质混合后加入核酸分子制备多肽-核酸分子复合物，所述多肽为权利要求1所述多肽的一种；所述脂质为DOTAP、DOPC、DODAG、DOPE、DMTAP、DPPC、RPR 209120、Chol、Cardiolipin、DODMA、DSPC、DGG、DLinDMA、DLin-KC2-DMA、PEG2000-C-DMA、AtuFECT01、DphyPE、DSGLA或DSPE。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，制备过程中盐离子浓度小于0.2mM。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，多肽与核酸中N与P的摩尔比为8：1，脂质的质量与核酸质量相等。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，核酸分子为asRNA、siRNA、miRNA或质粒DNA。
6.权利要求1所述多肽在制备细菌转染载体中的应用。
7.权利要求1所述多肽在制备哺乳细胞转染载体中的应用。
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