KR102428773B1 - 분리형 crRNA 및 이를 이용한 CRISPR-Cas 시스템 - Google Patents

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김성진
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(주)지플러스생명과학
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Abstract

분리형 crRNA 및 이를 이용한 CRISPR-Cas 시스템에 관한 것으로, 일 양상에 따른 분리형 crRNA를 포함하는 CRISPR 시스템 또는 조성물에 의하면, crRNA의 spacer 부분의 제작만으로 다양한 표적에서 CRISPR 시스템을 이용할 수 있어, 기존의 loop 부분과 spacer가 이어져있는 crRNA를 포함하는 CRISRP 시스템과 비교하여 경제적인 효과가 있다.

Description

분리형 crRNA 및 이를 이용한 CRISPR-Cas 시스템{Split form of crRNA and CRISPR-Cas system using the same}
분리형 crRNA 및 이를 이용한 CRISPR-Cas 시스템에 관한 것이다.
유전체 교정(Genome editing)이란 생명체의 유전정보를 자유롭게 교정하는 기술이다. 생명과학분야의 진보와 유전체 서열 분석 기술의 발전을 통해 우리는 다양한 유전정보에 대해 폭넓게 이해할 수 있게 되었다. 예를 들어 동식물의 번식, 질병과 성장, 다양한 인간 유전질병을 일으키는 유전자 변이, 바이오연료의 생산 등을 위한 유전자에 대한 이해는 이미 확보된 상황이지만 이를 직접적으로 활용하여 생명체를 개선하고, 인간 질병을 치료하는 수준에까지 이르기 위해서는 그 이상의 기술 진보가 필수적이다.
유전체 교정 기술은 인간을 포함하여 동물, 식물, 미생물의 유전정보를 변화시켜 그 활용범위를 획기적으로 확장시킬 수 있다. 유전자가위는 원하는 유전정보를 정확히 자를 수 있도록 설계되어 만들어지는 분자 도구로 유전체 교정 기술에서 핵심역할을 하고 있다. 유전자 서열분석 분야를 한 차원 발전시켰던 차세대시퀀싱(Next generation sequencing) 기술과 같이, 유전자가위는 유전정보 활용의 속도와 그 범위를 확장시키고 새로운 산업분야를 창출해 내는 핵심 기술이 되고 있다.
지금까지 개발된 유전자 가위는 그 순서에 따라 3세대로 나눌 수 있다. 1세대 유전자 가위는 ZFN(Zinc Finger Nuclease), 2세대 유전자 가위는 TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease), 가장 최근에 연구된 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Cas(CRISPR-associated) 9은 3세대 유전자 가위다.
여기서 CRISPR-Cas 시스템은 CRISPR RNA(crRNA)를 통해 타겟 서열에 대한 특이성을 가진다. 구체적으로, 가장 먼저 Cas 단백질과 loop(handle) 구조 및 spacer 부분을 갖는 crRNA가 서로 복합체를 형성한다. 형성된 복합체(Cas9:crRNA complex)는 타겟 유전자 중 PAM 서열을 인지하고 찾아간다. crRNA의 spacer와 타겟 서열이 완전히 결합했을 때, 그 타겟 부위의 이중 가닥이 풀리면서 Cas 단백질에 의한 절단이 시작된다.
이와 같이 CRISPR-Cas 시스템에서 crRNA는 Cas 단백질과 결합하는 데 관여하는 loop(handle)구조 및 최대 20bp까지 디자인이 가능한 직접 표적 DNA와 결합하는 부위인 spacer 부분으로 이루어져 있다. 이 spacer가 CRISPR 단백질을 표적 DNA로 이동시켜주기 때문에 자르고 싶은 곳에 맞추어 crRNA의 spacer를 잘 디자인하면 원하는 부위를 교정할 수 있다.
그러나 이러한 crRNA는 loop구조와 spacer 부분이 서로 이어져 있어, 다양한 표적 서열에 사용하기 위한 crRNA를 디자인하는데 있어서 spacer 부분 뿐만 아니라 동일한 서열을 가지는 loop구조까지 같이 이어서 제작해야한다는 단점이 있다. 이에, 개선된 crRNA에 대한 연구가 필요한 실정이다.
일 양상은 분리형 crRNA를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템 또는 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 Cas12 이펙터 단백질 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 폴리뉴클레오티드로서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드는 루프 구조(loop structure)를 갖지 않는 것인 폴리뉴클레오디드; 및 상기 가이드 폴리뉴클레오티드와 연결되어 있지 않은 일부의 또는 전부의 직접 반복부 서열을 포함하는 조작된, 비-천연 발생의 CRISPR-Cas 시스템 또는 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 Cas12 이펙터 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 폴리뉴클레오티드로서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드는 루프 구조(loop structure)를 갖지 않는 것인 폴리뉴클레오디드; 및 상기 가이드 폴리뉴클레오티드와 연결되어 있지 않은 일부의 또는 전부의 직접 반복부 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된, 비-천연 발생의 CRISPR-Cas 벡터 시스템 또는 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 CRISPR-Cas 시스템 또는 조성물, 또는 CRISPR-Cas 벡터 시스템 또는 조성물을 포함하는 입자를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 CRISPR-Cas 시스템 또는 조성물, 또는 CRISPR-Cas 벡터 시스템 또는 조성물을 관심 표적 유전자좌 또는 상기 유전자좌를 함유하는 세포에 전달하는 단계를 포함하는 관심 표적 유전자좌를 변형하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 CRISPR-Cas 시스템 또는 조성물, 또는 CRISPR-Cas 벡터 시스템 또는 조성물을 표적 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는 핵산을 표적화하는 방법 또는 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 CRISPR-Cas 시스템 또는 조성물, 또는 CRISPR-Cas 벡터 시스템 또는 조성물을 유효성분으로 포함하는 질병 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 CRISPR-Cas 시스템 또는 조성물, 또는 CRISPR-Cas 벡터 시스템 또는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질병을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
공지된 CRISPR-Cas 시스템의 작용은 보통 3 단계로 나뉜다: (1) 적응 및 스페이서 통합, (2) CRISPR 유전자좌 (예비-crRNA)의 1차 전사물의 가공 및 CRISPR 반복부의 5' 및 3' 단편에 해당하는 스페이서 및 가변 영역을 포함하는 crRNA의 성숙, 및 (3) DNA(또는 RNA) 간섭. 공지된 CRISRP-Cas 시스템에 있어서, crRNA 또는 가이드 RNA는 스페이서 서열(또는 가이드 서열) 및 직접 반복부 서열 또는 이들의 유도체를 포함한다. 여기서 CRIAPR-Cas 시스템의 Cas 단백질 및 가이드 RNA는 함께 자연적으로 발생하지 않는다. 특정 구현예에서, 스페이서 서열 또는 이의 유도체는 씨드(seed) 서열을 포함하며, 상기 씨드 서열은 표적 유전자좌에서 서열에 대한 인식 및/또는 혼성화에 중요하다. 또한, 공지된 CRISRP-Cas 시스템은 직접 반복 서열에 연결된 가이드 서열을 포함할 수 있으며, 상기 직접 반복부 서열은 하나 이상의 줄기 루프(stem loop) 또는 최적화된 2차 구조를 포함한다. 스템 루프 또는 최적화된 스템 루프 구조 또는 최적화된 2차 구조를 포함한다. 성숙 crRNA는 직접 반복부 서열에서 스템 루프 또는 최적화된 스템 루프 구조를 포함하며, 여기서 스템 루프 또는 최적화된 스템 루프 구조는 절단 활성에 중요하다고 알려져 있다. 또한, 기존에 공지된 바와 같이, 이펙터 단백질 복합체의 절단 활성은 스템 루프 RNA 이중나선 구조에 영향을 미치는 돌연변이를 도입함으로써 변형된다. 본 출원인은 crRNA의 작용에 있어서, 스템 또는 루프의 구조가 필요로 하지 않는다고 결론지었다. 본 출원인은, Cas12 이펙터 단백질 및 스템 또는 루프의 구조를 갖지 않는 crRNA 시스템이 표적 DNA를 절단하는 데 충분하였음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은, 일 양상은 분리형 crRNA를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템을 제공한다. 상세하게는, 본 발명은 Cas12 이펙터 단백질 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 폴리뉴클레오티드로서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드는 루프 구조(loop structure)를 갖지 않는 것인 폴리뉴클레오디드; 및 상기 가이드 폴리뉴클레오티드와 연결되어 있지 않은 일부의 또는 전부의 직접 반복부 서열을 포함하는 조작된, 비-천연 발생의 CRISPR-Cas 시스템을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "분리형 crRNA"는 시스템 내에서 직접 반복부 서열과 가이드 서열(스페이서)가 연결되어 있지 않은 crRNA를 의미할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "연결되어 있지 않은" 또는 "분리된"은 직접 반복부 서열과 가이드 서열이 폴리뉴클레오티드 링커, 개재 뉴클레오티드(intervening nucleotides) 또는 다른 링커의 존재 없이 직접적으로, 및/또는 간접적으로 연결되어 있지 않고 분리되어 있다는 것을 포함한다. 상기한 바와 같이, 기존에는 가이드 폴리뉴클레오티드 또는 crRNA는 직접 반복부 서열 및 가이드 서열 또는 스페이서 서열을 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진 것으로 알려져 있다. 직접 반복부 서열은 가이드 서열 또는 스페이서 서열로부터 상류(즉, 5')에 위치된다. 또한, 통상적으로, 직접 반복부 서열은 스템(stem), 및 루프(loop), 및 선택적으로 핑거(finger)의 구조를 갖는다. 상기 스템은 이중 가닥 핵산 듀플렉스(duplex) 구조를 형성한다. 상기 루프는 적어도 2개, 또는 적어도 4개 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것으로서, 하나의 스템의 상류와 또 다른 스템의 하류를 연결하는 구조를 포함할 수 있다. 그러나, 본 명세서에서, 가이드 폴리뉴클레오티드는 상기한 바와 같은, 스템, 루프, 및/또는 핑거의 구조를 갖지 않는다. 본 명세서의 시스템은, 가이드 폴리뉴클레오티드가 이펙터 단백질 복합체의 절단 활성에 중요하다고 알려진 스템, 및 루프의 구조가 없이도, 이를 시스템 내에서 연결된 구조로 하지 않는 다하더라도, 표적 DNA를 절단하거나, 표적화하거나, 변형시킬 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 crRNA는 표적 서열에 혼성화할 수 있는 스페이서 서열로만 본질적으로 이루어져 있는 조작되지 않은 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 crRNA는 직접 반복부 서열의 일부가 연결된 스페이서 서열로 이루어져 있는 조작된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 직접 반복부 서열읠 일부가 스페이서 서열에 연결되어 있다고 하더라도, 본질적으로 본 발명의 crRNA는 루프 구조, 또는 줄기-루프 구조(stem-loop structure)를 갖지 않는다. 또한, 상기 스페이서 서열에 연결된 직접 반복부 서열의 일부는 이펙터 단백질의 절단 활성을 유도할 수 없고, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드와 연결되어 있지 않은 일부의 또는 전부의 직접 반복부 서열과 함께 이펙터 단백질의 절단 활성을 유도할 수 있다. 또한, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드와 상기 가이드 폴리뉴클레오티드에 연결되어 있지 않은 직접 반복부 서열은 표적 서열의 말단으로 절단을 유발하는 Cas12 이펙터 단백질과 복합체를 형성할 수 있다.
따라서, 본 명세서의 직접 반복부 서열은 "스페이서 서열과 연결된 일부의 직접 반복부 서열"과 "스페이서 서열과 연결되어 있지 않은 일부 또는 전부의 직접 반복부 서열"이 있다. 또한, 상기 "스페이서 서열과 연결된 일부의 직접 반복부 서열"은 이펙터 단백질의 절단 활성을 유도할 수 없고, 상기 "스페이서 서열과 연결되어 있지 않은 일부의 직접 반복부 서열"은 "스페이서 서열과 연결된 일부의 직접 반복부 서열"과 함께 이펙터 단백질의 절단 활성을 유도할 수 있고, CRISPR-Cas 복합체를 형성할 수 있다. 또한, 상기 "스페이서 서열과 연결되어 있지 않은 전부의 직접 반복부 서열"이 사용되는 경우, 스페이서 서열에는 상기의 직접 반복부 서열의 일부가 연결되어 있지 않을 수 있고, 상기 "스페이서 서열과 연결되어 있지 않은 전부의 직접 반복부 서열"은 이펙터 단백질의 절단 활성을 유도할 수 있고, CRISPR-Cas 복합체를 형성할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 본 발명의 crRNA는 루프 구조, 또는 줄기-루프 구조(stem-loop structure)를 갖지 않는다. 또한, 본 발명의 crRNA는 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 핵산 듀플렉스를 포함하지 않는다.
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고, 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하기에, 표적 폴리뉴클레오티드 서열과의 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 임의의 구현예에서, 가이드 서열과 이의 해당하는 표적 서열 간의 상보성의 정도는 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬되는 경우, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상 또는 이를 초과한다. 최적의 정렬은 서열을 정렬하기에 적절한 임의의 알고리즘의 사용으로 결정될 수 있으며, 그의 비제한적인 예는 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우즈-휠러(Burrows-Wheeler) 형질전환에 기반한 알고리즘(예를 들어, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign(Novocraft Technologies; www.novocraft.com에서 이용 가능함), ELAND(Illumina, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 이용 가능함), 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 이용 가능함)를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 길이가 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 개 이상이거나 이를 초과한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 길이가 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 개 이하의 뉴클레오티드 미만이다. 바람직하게 가이드 서열은 길이가 10 개 내지 30 개 뉴클레오티드이다. 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적절한 분석에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험되는 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체를 형성하기에 충분한 CRISPR 시스템의 성분은, CRISPR 서열의 성분을 인코딩하는 벡터를 이용한 형질감염에 의해서와 같이 해당하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포로 제공될 수 있으며, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Surveyor 분석에 의해서와 같이, 표적 서열 내의 우선적인 절단의 평가로 이어질 수 있다. 유사하게, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 절단은 표적 서열, 즉 시험되는 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체의 성분을 제공하고, 표적 서열에서 시험 및 대조군 가이드 서열 반응 간의 결합 또는 절단 속도를 비교함으로써 시험관에서 평가될 수 있다. 기타 다른 분석이 가능하며, 이는 당업자에게 일어날 것이다. 가이드 서열은 임의의 표적 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 게놈 내 서열이다. 예시적인 표적 서열은 표적 게놈에서 특유한 것을 포함한다. 가이드 서열은 임의의 표적 핵산 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 표적 서열은 DNA일 수 있다. 표적 서열은 임의의 RNA 서열일 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 서열은 메신저 RNA(mRNA), 프리-mRNA, 리보솜 RNA(rRNA), 운반 RNA(tRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 소형 핵 RNA(snRNA), 소형 핵소체 RNA(snoRNA), 이중 가닥화 RNA(dsRNA), 비-코딩 RNA(ncRNA), 긴 비-코딩 RNA(lncRNA), 및 소형 세포질 RNA(scRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 mRNA, 프리-mRNA, 및 rRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 다른 구체예에서, 표적 서열은 ncRNA, 및 lncRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 다른 구체예에서, 표적 서열은 mRNA 분자 또는 프리-mRNA 분자 내의 서열일 수 있다.
상기 직접 반복부 서열은 길이가 16 nt 이상, 17 nt 이상 일 수 있다. 상기 직접 반복부 서열은 변형되어 하나 이상의 단백질-결합 RNA 압타머를 포함할 수 있다. 이와 같은 압타머는 박테리오파지 코트 단백질에 결합할 수 있다. 박테리오파지 코트 단백질은 Qβ, F2, GA, fr, JP501, MS2, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, M11, MX1, TW18, VK, SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, Cb5, Cb8r, Cb12r, Cb23r, 7s 및 PRR1을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 직접 반복부 길이는 16 nt 내지 20 nt, 예를 들어 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 또는 20 개 뉴클레오티드이다. 상기 직접 반복부 서열은 성숙형(mature) 또는 미-성숙형(pre-mature)을 포함하는 것일 수 있다. 상기 직접 반복부 서열이 미성숙형인 경우, 직접 반복부 길이는 21 nt 내지 30 nt, 예를 들어 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개, 26개, 27 개, 28 개, 29 개 또는 30 개 뉴클레오티드이다.
본 발명세에서 용어 "크리스퍼 연관 단백질"은 Cas 효소, CRISPR 효소, CRISPR 단백질, Cas 단백질 및 CRISPR Cas는 일반적으로 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 Cas12 이펙터 단백질("Cpf1 이펙터 단백질"로도 지칭됨)은 다양한 박테리아 종의 유래로부터 유래된 단백질을 의미할 수 있다. 상기 Cas 단백질은 스트렙토코커스(Streptococcus), 캄필로박터(Campylobacter), 니트라티프락토르(Nitratifractor), 스타필로코커스(Staphylococcus), 파르비바쿨룸(Parvibaculum), 로세부리아(Roseburia), 네이세리아(Neisseria), 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter), 아조스피릴룸(Azospirillum), 스파에로카에타(Sphaerochaeta), 락토바실러스(Lactobacillus), 유박테리움(Eubacterium), 코리네박터(Corynebacter), 카르노박테리움(Carnobacterium), 로도박터(Rhodobacter), 리스테리아(Listeria), 팔루디박터(Paludibacter), 클로스트리디움(Clostridium), 라크노스피라세아에(Lachnospiraceae), 클로스트리디아리디움(Clostridiaridium), 렙토트리키아(Leptotrichia), 프란시셀라(Francisella), 레지오넬라(Legionella), 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus), 메타노메티오필러스(Methanomethyophilus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 박테로이데테스(Bacteroidetes), 헬코코커스(Helcococcus), 레토스피라(Letospira), 데설포비브리오(Desulfovibrio), 데설포나트로눔(Desulfonatronum), 오피투타세아에(Opitutaceae), 투베리바실러스(Tuberibacillus), 바실러스(Bacillus), 브레비바실러스(Brevibacilus), 메틸로박테리움(Methylobacterium) 또는 아시다미노코커스(Acidaminococcus) 속 유래의 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 Cas12 이펙터 단백질은 프란시셀라 툴라렌시스 1, 프란시셀라 툴라렌시스 아종 노비시다, 프레보텔라 알벤시스, 라크노스피라세아에 박테리움 MC2017 1, 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스, 페레그리니박테리아 박테리움 GW2011_GWA2_33_10, 파르쿠박테리아 박테리움 GW2011_GWC2_44_17, 스미텔라 종 SCADC, 아시다미노코커스 종 BV3L6, 라크노스피라세아에 박테리움 MA2020, 칸디다투스 메타노플라즈마 테르미툼, 유박테리움 엘리겐스, 모락셀라 보보쿨리 237, 렙토스피라 이나다이, 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006, 포르피로모나스 크레비오리카니스 3, 프레보텔라 디시엔스 및 포르피로모나스 마카카에로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아 종으로부터 유래된 것일 수 있다. 예를 들면, PbCas12a는 Parcubacteria bacterium GWC2011_GWC2_44_17에서 유래한 단백질이며, PeCas12a는 Peregrinibacteria Bacterium GW2011_GWA_33_10에서 유래한 단백질이며, AsCas12a는 Acidaminococcus sp. BVBLG에서 유래한 단백질이며, PmCas12a는 Porphyromonas macacae에서 유래한 단백질이며, LbCas12a는 Lachnospiraceae bacterium ND2006에서 유래한 단백질이며, PcCas12a는 Porphyromonas crevioricanis에서 유래한 단백질이며, PdCas12a는 Prevotella disiens에서 유래한 단백질이며, FnCas12a는 Francisella novicida U112에서 유래한 단백질일 수 있다.
또한, 상기 Cas12 이펙터 단백질은 Cas12a, mgCas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, 및 Cas12i로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
본 명세서는 또한 Cas12 이펙터 단백질의 변형을 포함한다. 본 명세서의 용어 Cas12 이펙터 단백질은 Cas12 이펙터 단백질의 변형을 포함하는 의미로 해석된다. Cas12 단백질이 뉴클레아제 활성을 갖는 경우, Cas12 단백질은 감소된 뉴클레아제 활성, 예를 들어 야생형 효소에 비하여 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 이상, 적어도 97%, 또는 100%의 뉴클레아제 비활성화를 갖도록 변형될 수 있거나; 달리 말하면 Cas12 효소는 유리하게 비-돌연변이된 또는 야생형 Cas12 효소 또는 CRISPR 효소의 약 0%의 뉴클레아제 활성, 또는 비-돌연변이된 또는 야생형 Cas12 효소 또는 CRISPR 효소, 또는 예를 들어 비-돌연변이된 또는 야생형 프란시셀라 노비시다 U112(FnCas12), 아시다미노코커스 종 BV3L6(AsCas12), 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006(LbCas12) 또는 모락셀라 보보쿨리 237(MbCas12) Cas12 효소 또는 CRISPR 효소의 비-돌연변이된 또는 야생형 Cas12 효소의 약 3% 또는 약 5% 또는 약 10% 이하의 뉴클레아제 활성을 갖는다. 이는 Cas12과 이의 오솔로그의 뉴클레아제 도메인 내로 돌연변이를 도입함으로써 가능하다. 보다 특히, 비활성화된 Cas12 효소는 AsCas12의 아미노산 위치 As908, As993, As1263 또는 Cas12 오솔로그에서 상응하는 위치에서 돌연변이된 효소를 포함한다. 추가적으로, 비활성화된 Cas12 효소는 LbCas12의 아미노산 위치 Lb832, 925, 947 또는 1180 또는 Cas12 오솔로그에서 상응하는 위치에서 돌연변이된 효소를 포함한다. 보다 특히, 비활성화된 Cas12 효소는 AsCas12의 돌연변이 AsD908A, AsE993A, AsD1263A 중 하나 이상 또는 Cas12 오솔로그에서 상응하는 돌연변이를 포함하는 효소를 포함한다. 추가적으로, 비활성화된 Cas12 효소는 LbCas12의 돌연변이 LbD832A, E925A, D947A 또는 D1180A 중 하나 이상 또는 Cas12 오솔로그에서 상응하는 돌연변이를 포함하는 효소를 포함한다.
상기 변형된 Cas12a 효소는 AsCas12(아시다미노코커스 종 BV3L6)의 아미노산 위치 번호매김을 참조하여, 위치 R909, R912, R930, R947, K949, R951, R955, K965, K968, K1000, K1002, R1003, K1009, K1017, K1022, K1029, K1035, K1054, K1072, K1086, R1094, K1095, K1109, K1118, K1142, K1150, K1158, K1159, R1220, R1226, R1242, 및/또는 R1252의 돌연변이를 포함한다. 상기 변형된 Cas12a 효소는 AsCas12(아시다미노코커스 종 BV3L6)의 아미노산 위치 번호매김을 참조하여, 위치 K324, K335, K337, R331, K369, K370, R386, R392, R393, K400, K404, K406, K408, K414, K429, K436, K438, K459, K460, K464, R670, K675, R681, K686, K689, R699, K705, R725, K729, K739, K748, 및/또는 K752의 돌연변이를 포함한다. 상기 변형된 Cas12a 효소는 AsCas12(아시다미노코커스 종 BV3L6)의 아미노산 위치 번호매김을 참조하여, 위치 R912, T923, R947, K949, R951, R955, K965, K968, K1000, R1003, K1009, K1017, K1022, K1029, K1072, K1086, F1103, R1226, 및/또는 R1252의 돌연변이를 포함한다. 상기 변형된 Cas12a 효소는 LbCas12(라크노스피라세아에 박테리움 ND2006)의 아미노산 위치 번호매김을 참조하여, 위치 R833, R836, K847, K879, K881, R883, R887, K897, K900, K932, R935, K940, K948, K953, K960, K984, K1003, K1017, R1033, R1138, R1165, 및/또는 R1252의 돌연변이를 포함한다. 상기 변형된 Cas12a 효소는 AsCas12(아시다미노코커스 종 BV3L6)의 아미노산 위치 번호매김을 참조하여, 위치 K15, R18, K26, Q34, R43, K48, K51, R56, R84, K85, K87, N93, R103, N104, T118, K123, K134, R176, K177, R192, K200, K226, K273, K275, T291, R301, K307, K369, S404, V409, K414, K436, K438, K468, D482, K516, R518, K524, K530, K532, K548, K559, K570, R574, K592, D596, K603, K607, K613, C647, R681, K686, H720, K739, K748, K757, T766, K780, R790, P791, K796, K809, K815, T816, K860, R862, R863, K868, K897, R909, R912, T923, R947, K949, R951, R955, K965, K968, K1000, R1003, K1009, K1017, K1022, K1029, A1053, K1072, K1086, F1103, S1209, R1226, R1252, K1273, K1282, 및/또는 K1288의 돌연변이를 포함한다. 상기 변형된 Cas12a 효소는 FnCas12(프란시셀라 노비시다 U112)의 아미노산 위치 번호매김을 참조하여, 위치 K15, R18, K26, R34, R43, K48, K51, K56, K87, K88, D90, K96, K106, K107, K120, Q125, K143, R186, K187, R202, K210, K235, K296, K298, K314, K320, K326, K397, K444, K449, E454, A483, E491, K527, K541, K581, R583, K589, K595, K597, K613, K624, K635, K639, K656, K660, K667, K671, K677, K719, K725, K730, K763, K782, K791, R800, K809, K823, R833, K834, K839, K852, K858, K859, K869, K871, R872, K877, K905, R918, R921, K932, I960, K962, R964, R968, K978, K981, K1013, R1016, K1021, K1029, K1034, K1041, K1065, K1084, 및/또는 K109의 돌연변이를 포함한다. 상기 변형된 Cas12a 효소는 LbCas12(라크노스피라세아에 박테리움 ND2006)의 아미노산 위치 번호매김을 참조하여, 위치 K15, R18, K26, K34, R43, K48, K51, R56, K83, K84, R86, K92, R102, K103, K116, K121, R158, E159, R174, R182, K206, K251, K253, K269, K271, K278, P342, K380, R385, K390, K415, K421, K457, K471, A506, R508, K514, K520, K522, K538, Y548, K560, K564, K580, K584, K591, K595, K601, K634, K640, R645, K679, K689, K707, T716, K725, R737, R747, R748, K753, K768, K774, K775, K785, K787, R788, Q793, K821, R833, R836, K847, K879, K881, R883, R887, K897, K900, K932, R935, K940, K948, K953, K960, K984, K1003, K1017, R1033, K1121, R1138, R1165, K1190, K1199, 및/또는 K1208의 돌엽녀이를 포함한다. 상기 변형된 Cas12a 효소는 MbCas12(모락셀라 보보쿨리 237)의 아미노산 위치 번호매김을 참조하여, 위치 K14, R17, R25, K33, M42, Q47, K50, D55, K85, N86, K88, K94, R104, K105, K118, K123, K131, R174, K175, R190, R198, I221, K267, Q269, K285, K291, K297, K357, K403, K409, K414, K448, K460, K501, K515, K550, R552, K558, K564, K566, K582, K593, K604, K608, K623, K627, K633, K637, E643, K780, Y787, K792, K830, Q846, K858, K867, K876, K890, R900, K901, M906, K921, K927, K928, K937, K939, R940, K945, Q975, R987, R990, K1001, R1034, I1036, R1038, R1042, K1052, K1055, K1087, R1090, K1095, N1103, K1108, K1115, K1139, K1158, R1172, K1188, K1276, R1293, A1319, K1340, K1349, 및/또는 K1356의 돌연변이를 포함한다.
본 명세서에서 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif; PAM) 또는 PAM-유사 모티프는 이펙터 단백질 복합체가 관심이 있는 표적 유전자좌에 결합하는 것을 지시한다. 상기 PAM은 5' T-풍부 모티프 또는 5' AT- 풍부 모티프를 포함한다. 본 발명의 예시적 PAM은 5' TTN이며, 여기서 N은 A/C/G 또는 T이고 이펙터 단백질은 FnCas12p이다. 본 발명의 예시적 PAM은 5' TTTV이며, 여기서 V는 A/C 또는 G이고 이펙터 단백질은 AsCas12, LbCas12 또는 PaCpf1p이다.
본 발명의 일 구현예에서, 적어도 하나의 핵 국소화 신호(nuclear localization signal; NLS)가 Cas12 이펙터 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 부착된다. 일 구체예에 있어서, 적어도 하나 이상의 C-말단 또는 N-말단 NLS가 부착된다. 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS), 예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상, 또는 이를 초과하는 NLS를 포함하는 Cas12/C2c1/C2c2 또는 이의 오솔로그 또는 동족체를 인코딩한다. 본 명세서에 기재된 Cas12 이펙터 단백질 복합체의 바람직한 구현예에서, 코돈 최적화된 이펙터 단백질은 단백질의 C-말단에 부착된 NLS를 포함한다. 특정 구현예에서, 예컨대 Cas를 세포 내 특정 부위, 예컨대 세포 소기관, 예를 들어 미토콘드리아. 플라스티드, 엽록체, 소포, 골지, (핵 또는 세포) 막, 리보솜, 핵소체, ER, 세포골격, 액포, 중심체, 뉴클레오솜, 과립, 중심립 등(이로 제한되지 않음)으로 국소화시키기 위한 기타 다른 국소화 태그를 Cas 단백질에 융합시킬 수 있다.
본 명세서에서 "tracrRNA" 서열 또는 유사체라는 용어는 혼성화를 위해 crRNA 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 명세서에서 상기 나타낸 바와 같이, tracrRNA는 Cas12 이펙터 단백질 복합체의 절단 활성에 있어서 요구되지 않는다. 따라서, 본 발명의 CRISPR-Cas 시스템은 tracrRNA를 포함하지 않는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 Cas12 이펙터 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 폴리뉴클레오티드로서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드는 루프 구조(loop structure)를 갖지 않는 것인 폴리뉴클레오디드; 및 상기 가이드 폴리뉴클레오티드와 연결되어 있지 않은 일부의 또는 전부의 직접 반복부 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된, 비-천연 발생의 CRISPR-Cas 벡터 시스템 또는 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "벡터"는 그것이 연결되어 있는 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는, 단일-가닥, 이중-가닥, 또는 부분적 이중-가닥인 핵산 분자; 하나 이상의 자유 말단을 포함하는 핵산 분자, 자유 말단이 없는 핵산 분자(예를 들어, 원형); DNA, RNA 또는 이들 둘 다를 포함하는 핵산 분자; 및 당업계에서 알려진 기타 다른 다양한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 벡터의 일 종류로 "플라스미드"가 있으며, 이는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하며, 그 안으로 예컨대 표준 분자 클로닝 기법에 의해서 추가적인 DNA 분절이 삽입될 수 있다. 벡터의 또 다른 종류로 바이러스 벡터가 있으며, 바이러스-유래된 DNA 또는 RNA 서열이 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 복제 결함 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스) 내로의 패키징을 위해 벡터에 존재한다. 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 본 발명의 핵산을 포함할 수 있는데, 이는 재조합 발현 벡터가 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 것을 의미하며, 하나 이상의 조절 요소는 발현에 사용될 숙주 세포에 기반하여 선택될 수 있고, 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동 가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오티드 서열이 (예를 들어, 시험관 내 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주 세포에 도입된 경우에는 숙주 세포에서) 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 요소(들)에 연결됨을 의미하는 것으로 의도된다.
용어 "조절 요소"는 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 엔트리 부위(internal ribosomal 진입 site; IRES), 및 기타 다른 발현 제어 요소(예를 들어, 전사 종결 신호, 예컨대 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열)를 포함할 수 있다. 이와 같은 조절 요소는, 예를 들어 문헌[Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 기재되어 있다. 조절 요소는 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것들과 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 것들(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)을 포함한다. 일부 구체예에서, 벡터는 하나 이상의 pol III 프로모터 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 개 또는 그 이상의 pol III 프로모터), 하나 이상의 pol II 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 개 또는 그 이상의 pol II 프로모터), 하나 이상의 pol I 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 개 또는 그 이상의 pol I 프로모터), 또는 이들의 조합을 포함한다. pol III 프로모터의 예들은, 이로 제한되지는 않지만, U6 및 H1 프로모터를 포함한다. pol II 프로모터의 예들은, 이로 제한되지는 않지만, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus; RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서와 함께), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서와 함께), SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나아제(phosphoglycerol kinase; PGK) 프로모터, 및 EF1α 프로모터를 포함한다.
벡터의 구체적인 예시로는, 렌티바이러스 및 아데노-연관 바이러스(AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 또는 AAV9)를 포함하며, 이와 같은 벡터의 유형은 또한 특정 유형의 세포들의 표적화를 위해 선택될 수 있다.
또한, 상기 벡터 시스템 내의 복수의 핵산 분자는 동일하거나 상이한 벡터 상에 위치할 수 있다.
다른 양상은, 상기의 벡터 시스템으로 형질전환된, 진핵 숙주 세포 또는 세포주를 제공한다.
또 다른 양상은 상기의 벡터를 이용하여 형질전환된 또는 상기의 CRISPR-Cas 시스템을 발현하는 유전자이식 유기체, 또는 이의 자손을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 CRISPR-Cas 시스템, 또는 CRISPR-Cas 벡터 시스템을 포함하는 입자를 제공하는 것이다. 여러 유형의 입자(나노입자) 전달 시스템 및/또는 제형은 다양한 범위의 생체의학 적용에서 유용하다고 알려져 있다. 상기 시스템은 예를 들어, 지질 또는 리피도이드(lipidoid) 및 친수성 중합체, 예를 들어, 양이온성 지질 및 친수성 중합체를 포함하는 전달 입자를 통해 전달될 수 있다. 상기 입자는 엑소좀, 리포좀, 기타 다른 지질 입자 등을 포함할 수 있다.
다른 양상에 있어서, 상기 시스템 또는 조성물은 다수의 세포 유형에서 표적 DNA 또는 RNA를 변형시키는(예를 들어, 결실시키는, 삽입하는, 전위시키는, 불활성화시키는, 활성화시키는) 것을 포함하는 매우 다양한 유용성을 갖는다. 이와 같이, 상기 시스템은, 예를 들어 유전자 치료법, 약물 스크리닝, 질병 진단 및 예후에서 광범위한 적용을 갖는다.
이에 일 양상은 상기 시스템을 관심 표적 유전자좌 또는 상기 유전자좌를 함유하는 세포에 전달하는 단계를 포함하는 관심 표적 유전자좌를 변형하는 방법을 제공한다. 또 다른 양상은 상기 시스템을 이용하여 진핵 세포 내에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 변형하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 폴리뉴클레오티드에 결합하는 CRISPR 복합체를 이용함으로써 표적 폴리뉴클레오티드의 발현 증가 또는 감소를 포함한다. 또 다른 양상은 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 상기 시스템을 이용하여 진핵 세포 내에서 표적 폴리뉴클레오티드를 변형하는 방법을 제공한다. 또 다른 양상은 상기 시스템을 이용하여 표적 RNA 또는 DNA를 절단하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 표적 RNA 또는 DNA와 결합하여 상기 표적 RNA 또는 DNA의 절단을 수행하는 상기 시스템을 사용하여 표적 RNA를 변형하는 것을 포함한다.
상기 시스템은 Cas12은 표적 서열의 위치에서 단일 또는 이중 가닥 파손을 유도한다. 가닥 파손은 5' 오버행을 이용한 엇갈린 절단일 수 있다.
상기 기재된 방법 중 관심이 있는 표적 유전자좌는 관심이 있는 게놈 또는 후성유전체 유전자좌일 수 있다. 상기 시스템은 복합 사용을 위한 다수의 가이드와 함께 전달될 수 있다.
표적 서열은 진핵 세포에 내인성이거나 외인성인 임의의 핵산일 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산은 진핵 세포의 핵에 존재하는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 표적 서열의 예는 신호화 생화학 경로와 연관된 서열, 예를 들어 신호화 생화학적 경로-연관 핵산을 포함한다. 표적 서열의 예는 질병 연관 핵산을 포함한다. "질병-연관" 핵산은 질병이 없는 대조군의 조직 또는 세포에 비하여, 질병-발생 조직으로부터 유래된 세포에서 비정상적인 수준 또는 비정상적인 형태로 번역 산물을 생성하는 임의의 핵산을 의미한다. 그것은 비정상적으로 높은 수준으로 발현되는 유전자로부터 전사된 핵산일 수 있으며; 그것은 비정상적으로 낮은 수준으로 발현되는 유전자로부터 전사된 핵산일 수 있고, 여기서 변경된 발현은 질병의 발생 및/또는 진행과 상관관계가 있다. 또한, 질병-연관 핵산은 질병의 병인에 직접적인 원인이 있거나, 그에 원인이 있는 유전자(들)와 연관 불균형이 있는 돌연변이(들) 또는 유전적 변이를 갖는 유전자로부터 전사된 핵산을 지칭한다. 번역된 산물은 공지된 것이거나 미공지된 것일 수 있으며, 정상 또는 비정상 수준으로 존재할 수 있다.
상기 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포 일 수 있다. 상기 진핵 세포는 식물 세포, 동물 세포, 임의의 생물의 특정 세포 유형일 수 있으며, 이는 줄기 세포, 면역 세포, T 세포, B 세포, 수지상 세포, 심혈관 세포, 상피 세포, 줄기 세포 등을 포함한다. 식물 세포는 카사바, 옥수수, 수수, 밀 또는 쌀과 같은 작물 식물의 것일 수 있다. 식물 세포는 또한 조류, 나무 또는 채소일 수 있다.
본 명세서의 상기 시스템을 이용하는 게놈 편집 방법은 목적하는 특성을 본질적으로 임의의 식물에 수여하는데 사용될 수 있다. 광범위한 종류의 식물 및 식물 세포 시스템은, 본 개시 내용의 핵산 구조물과 상기 언급된 각종 형질전환 방법을 이용하여 본 명세서에 설명된 바람직한 생리학적 및 작물학적 특징들에 대해, 조작될 수 있다. 식물의 부분, 즉 "식물 조직"은 본 발명의 방법에 따라 처리되어 개선된 식물을 생산할 수 있다. 식물 조직은 또한 식물 세포를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "식물 세포"는, 온전한 전체 식물로, 또는 배양 매질 또는 버퍼 중 현탁액 내 또는 완충액 또는 매질 또는 한천 상, 시험관 내 조직 배양에서 성장한 분리된 형태 중 어느 하나, 또는 예를 들어 식물 조직, 식물 기관 또는 전체 식물과 같은 고도의 조직화된 단위의 일부로서, 살아있는 식물의 개별 단위를 지칭한다.
또 다른 양상은 상기 CRISPR-Cas 시스템 또는 조성물, 또는 CRISPR-Cas 벡터 시스템 또는 조성물을 표적 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는 핵산을 표적화하는 방법 또는 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 표적화하는 방법 또는 검출하는 방법은 Cas12 이펙터 단백질의 표적 서열에의 결합 또는 표적 서열의 절단으로 인해 생성되는 검출 가능한 신호를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 검출 가능한 신호는 Cas12 이펙터 단백질의 존재 하에 표적 서열과 혼성화할 때 생기는 또는 표적 서열이 절단될 때 생긴 임의의 신호일 수 있다. 예를 들어, 상기 측정하는 단계는, 금 나노입자 기반 검출, 형광 편광, 콜로이드 상 전이/분산, 전기화학적 검출, 반도체-기반 센싱 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 이러한 검출 방법의 판독은 임의의 편리한 판독일 수 있다. 가능한 판독의 예는 측정 가능한 양의 검출 가능한 형광 신호; 겔 상에서 밴드의 시각적 분석, 색의 존재 또는 부재의 시각적 또는 센서 기반 검출(즉, 색 검출 방법), 및 전기 신호의 (또는 특정 양의) 존재 또는 부재를 포함할 수 있다. 측정하는 단계는 예를 들어, 검출되는 신호의 양이 샘플 내 존재하는 표적 DNA의 양을 결정하는 데 사용될 수 있다는 의미에서 정량적일 수 있다. 측정하는 단계는 일부 경우에, 예를 들어, 검출 가능한 신호의 존재 또는 부재가 표적 서열(예를 들어, 바이러스, SNP 등)의 존재 또는 부재를 나타낼 수 있다는 의미에서 정성적일 수 있다.
상기 검출하는 방법은 샘플(예를 들어, 표적 DNA 및 복수의 비-표적 DNA를 포함하는 타액, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 흡입물 및 생검 샘플 등)의 양을 결정하는 데 사용될 수 있다. 샘플 내 표적 핵산의 양을 결정하는 것은 시험 샘플로부터 생성된 검출 가능한 신호의 양을 기준 샘플로부터 생성된 검출 가능한 신호의 양과 비교하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 CRISPR-Cas 시스템 또는 조성물, 또는 CRISPR-Cas 벡터 시스템 또는 조성물을 유효성분으로 포함하는 질병 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 CRISPR-Cas 시스템 또는 조성물, 또는 CRISPR-Cas 벡터 시스템 또는 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질병을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 치료제로서의 사용을 위한 상기 기재된 임의의 조작된 CRISPR 효소(예를 들어, 조작된 Cas12), 조성물, 시스템 또는 CRISPR 복합체를 제공한다. 치료제는 유전자 또는 게놈 편집, 또는 유전자 치료법을 위한 것일 수 있다.
본 발명은 의약, 예를 들어 대상체의 치료를 위한 또는 대상체의 치료 방법을 위한 의약 제조에서 이와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 용도를 포함한다.
상기 대상 질병은 유전자의 변형으로 인해 나타나는 질환, 또는 유전자의 변형이 나타나는 질환을 모두 포함할 수 있다. 상기 대상 질병은 유전자 또는 게놈 편집, 또는 유전자 치료법이 적용될 수 있는 모든 질환을 포함할 수 있다. 구체적인 예시로는 암, 어셔 증후군 또는 망막색소변성증, 낭포성 섬유증, HIV 및 AIDS, 베타 지중해빈혈, 겸상 적혈구 빈혈증(SCD), 단순 포진 바이러스 1 및 2, 황반변성 등의 안질환, 헌팅턴병, 알츠하이머 등의 뇌질환, 조혈줄기세포 관련 질환, 기타 유전질환 등을 포함할 수 있다.
상기 시스템의 전달은, 벡터 전달, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 전달, 예를 들어, 아데노 연관 바이러스(AAV), 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 기타 다른 바이러스 벡터 유형, 또는 이의 조합을 사용하여 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 벡터는, 예를 들어 근육내 주사에 의해 관심 조직으로 전달되는 한편, 기타 다른 경우에 전달은 정맥내, 경피, 비강내, 구강, 점막 또는 기타 다른 전달 방법을 통하여 이루어진다. 이와 같은 전달은 단일 용량 또는 다중 용량 중 어느 하나를 통하여 이루어질 수 있다. 당업자는, 본 명세서에서 전달되는 실제 투여량은 다양한 인자, 예컨대 벡터 선택, 표적 세포, 유기체, 또는 조직, 치료될 대상체의 일반 상태, 구하는 형질전환/변형의 정도, 투여 경로, 투여 방법, 구하는 형질전환/변형의 형태 등에 따라 크게 달라질 수 있다. 투여량은, 예를 들어 담체(물, 식염수, 에탄올, 글리세롤, 락토오스, 수크로오스, 인산칼슘, 젤라틴, 덱스트란, 한천, 펙틴, 땅콩유, 참기름 등), 희석제, 약학적으로 허용가능한 담체(예를 들어, 인산염 완충 식염수), 약학적으로 허용가능한 부형제, 및/또는 당업계에 알려진 기타 다른 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 투여량은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 염, 예를 들어 무기산 염, 예컨대 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등; 및 유기산 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등을 추가로 함유할 수 있다. 추가적으로, 보조 성분, 예컨대 습윤 또는 유화제, pH 완충 성분, 겔 또는 겔화 물질, 풍미제, 착색제, 마이크로스피어, 중합체, 현탁제 등이 또한 본 명세서에서 제시될 수 있다. 추가적으로, 하나 이상의 기타 다른 통상의 약학 성분들, 예컨대 보존제, 보수제, 현탁화제, 계면활성제, 산화방지제, 충전제, 킬레이트화제, 코팅제, 화학 안정화제 등이 또한 존재할 수 있다. 적합한 예시적인 성분으로는, 미세결정성 셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 폴리소르베이트 80, 페닐에틸 알코올, 클로로부탄올, 칼륨 소르베이트, 소르빈산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀, 파라클로로페놀, 젤라틴, 알부민 및 이의 조합을 포함한다. 예를 들면, 질병 치료를 위한 전달은 AAV를 통해 이루어질 수 있다. 인간에 대한 AAV의 생체 내 전달을 위한 치료적으로 유효한 투여량은, 용액 ml 당 약 1Х1010 내지 약 1Х10100의 AAV를 함유하는 약 20 ml 내지 약 50 ml 범위의 식염수 용액일 수 있다. 투여량은 임의의 부작용에 대하여 치료 이익의 균형을 맞추도록 조정될 수 있다.
본 발명은 또한 세포, 성분 및/도는 시스템에 존재하는 미량의 양이온을 갖는 본 발명의 세포, 성분 및/또는 시스템을 포함한다. 상세하게는 양이온은 Mg2+일 수 있다. 바람직한 농도는 인간 기반 세포, 성분 및/또는 시스템에 대해 약 1 mM일 수 있으며 박테리아 기반 세포, 성분 및/또는 시스템에 대해 약 10 mM 내지 약 15 mM일 수 있다.
일 양상에 따른 분리형 crRNA를 포함하는 CRISPR 시스템 또는 조성물에 의하면, crRNA의 spacer 부분의 제작만으로 다양한 표적에서 CRISPR 시스템을 이용할 수 있어, 기존의 loop 부분과 spacer가 이어져있는 crRNA를 포함하는 CRISRP 시스템과 비교하여 경제적인 효과가 있다.
도 1은 표적 DNA인 HsCCR5에 대한 crRNA 구조를 나타낸 모식도이다.
도 2는 handle과 spacer가 분리되지 않은 Full length의 HsCCR5_crRNA를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 Premature full handle (36-mer)과 spacer (24-mer)가 분리된 HsCCR5_crRNA를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 Mature full handle (20-mer)과 spacer (24-mer)가 분리된 HsCCR5_crRNA를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 5는 Premature half handle (28-mer)과 half handle 및 spacer가 합쳐진 부분 (32-mer)이 분리된 HsCCR5_crRNA를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 Mature half handle (12-mer)과 half handle 및 spacer가 합쳐진 부분 (32-mer)이 분리된 HsCCR5_crRNA를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 Premature half handle (28-mer)과 half handle 및 spacer가 합쳐진 부분 (32-mer)이 분리된 HsCCR5_crRNA를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 8은 Mature full handle (20-mer) 및 spacer (24-mer)가 분리된 HsCCR5_crRNA를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 9는 5'-modified full handle (26-mer) 및 spacer (24-mer)가 분리된 HsCCR5_crRNA를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 10은 Lb2Cas12a에 대한 Full handle crRNA 및 spacer가 분리된 HsCCR5_crRNA 및 CRISPR 단백질로 FnCas12a를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 11은 FnCas12a 에 대한 Full handle crRNA 및 spacer가 분리된 HsCCR5_crRNA 및 CRISPR 단백질로 FnCas12a를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 12는 AsCas12a에 대한 Full handle crRNA 및 spacer가 분리된 HsCCR5_crRNA 및 CRISPR 단백질로 FnCas12a를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 13은 LbCas12a에 대한 Full handle crRNA 및 spacer가 분리된 HsCCR5_crRNA 및 CRISPR 단백질로 FnCas12a를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 14는 FnCas12a에 대한 Full handle crRNA 및 spacer가 분리되지 않은 HsCCR5_crRNA 및 CRISPR 단백질로 FnCas12a를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 15는 Lb2Cas12a에 대한 Full handle crRNA 및 spacer가 분리된 HsCCR5_crRNA 및 CRISPR 단백질로 AsCas12a를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 16은 FnCas12a 에 대한 Full handle crRNA 및 spacer가 분리된 HsCCR5_crRNA 및 CRISPR 단백질로 AsCas12a를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 17은 AsCas12a에 대한 Full handle crRNA 및 spacer가 분리된 HsCCR5_crRNA 및 CRISPR 단백질로 AsCas12a를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 18은 LbCas12a에 대한 Full handle crRNA 및 spacer가 분리된 HsCCR5_crRNA 및 CRISPR 단백질로 AsCas12a를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 19는 FnCas12a에 대한 Full handle crRNA 및 spacer가 분리되지 않은 HsCCR5_crRNA 및 CRISPR 단백질로 AsCas12a를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 20은 Lb2Cas12a에 대한 Full handle crRNA 및 spacer가 분리된 HsCCR5_crRNA 및 CRISPR 단백질로 mgCas12a-1_6ХNLS를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 21은 FnCas12a 에 대한 Full handle crRNA 및 spacer가 분리된 HsCCR5_crRNA 및 CRISPR 단백질로 mgCas12a-1_6ХNLS를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 22는 AsCas12a에 대한 Full handle crRNA 및 spacer가 분리된 HsCCR5_crRNA 및 CRISPR 단백질로 mgCas12a-1_6ХNLS를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 23은 LbCas12a에 대한 Full handle crRNA 및 spacer가 분리된 HsCCR5_crRNA 및 CRISPR 단백질로 mgCas12a-1_6ХNLS를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
도 24는 FnCas12a에 대한 Full handle crRNA 및 spacer가 분리되지 않은 HsCCR5_crRNA 및 CRISPR 단백질로 mgCas12a-1_6ХNLS를 이용하여 HsCCR5를 절단한 결과를 나타낸 사진이다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1: 다양한 구조의 crRNA 합성
하기와 같이 6가지의 다양한 형태의 crRNA를 Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT) 사에 의뢰하여 합성하였다. crRNA의 형태를 도 1에 나타내었고, 각 형태의 구조 및 서열은 하기와 같다.
1. Full length HsCCR5_crRNA (44-mer) - 양성 대조군
5'-UAAUUUCUACUGUUGUAGAUGGAUUCCCGAGUAGCAGAUGACCA-3'
2. Premature half handle crRNA (28-mer) + HsCCR5_crRNA spacer for half handle (32-mer)
5'-GUCUAAGAACUUUAAAUAAUUUCUACUG-3' + 5'-UUGUAGAUGGAUUCCCGAGUAGCAGAUGACCA- 3'
3. Mature half handle crRNA (12-mer) + HsCCR5_crRNA spacer for half handle (32-mer)
5'-UAAUUUCUACUG-3' + 5'-UUGUAGAUGGAUUCCCGAGUAGCAGAUGACCA-3'
4. Premature full handle crRNA (36-mer) + HsCCR5_crRNA spacer (24-mer)
5'-GUCUAAGAACUUUAAAUAAUUUCUACUGUUGUAGAU-3' + 5'-GGAUUCCCGAGUAGCAGAUGACCA-3'
5. Mature full handle crRNA (20-mer) + HsCCR5_crRNA spacer (24-mer)
5'-UAAUUUCUACUGUUGUAGAU-3' + 5'-GGAUUCCCGAGUAGCAGAUGACCA-3'
6. 5'-modified full handle crRNA (26-mer) + HsCCR5_crRNA spacer (24-mer)
5'-UUUAAAUAAUUUCUACUGUUGUAGAU-3' + 5'-GGAUUCCCGAGUAGCAGAUGACCA-3'
실험예 1: crRNA 구조에 따른 in vitro에서의 DNA 절단 효능 확인
상기 실시예 1의 crRNA를 사용하여 in vitro에서 단백질 절단 효능을 확인하였다.
DNA 기질로는 HsCCR5를 이용하였고, 이는 Forward Primer 서열 5'-GCCAGGACGGTCACCTTTGG-3', Reverse Primer 서열 5'-CACACTGGCCATATCGGTGGTC-3'을 이용하여 PCR하여 수득하였다. CRISPR 단백질은 mgCas12a-1_6ХNLS을 정제하여 사용하였다. 절단이 되었을 때 예상되는 단편의 크기는 547 bp 및 183 bp이다. 각 절단 반응은 각 crRNA별로 하기 표 1과 같이 반응물의 용량을 조금씩 달리하여 진행하였고, crRNA가 첨가되지 않은 경우(NC1) 및 mgCas12a-1_6ХNLS가 첨가되지 않은 경우(NC2)를 음성 대조군으로 하였다.
구체적인 절단 방법은 다음과 같다. 반응 버퍼 NEBuffer 3.1(50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 100 μg/ml BSA, pH 7.9 at 25℃)을 첨가하여 총 반응 부피를 0 ul로 하여 37℃에서 30분 동안 반응시켜 DNA를 절단하였다. 절단 반응 후, Proteinase K (0.8 unit) 1.0 ul을 첨가하여 37℃에서 10분 동안 인큐베이션 시켜 반응을 중단시키고, 서던 블로팅(southern blotting)하여 2.0% 아가로오스 겔 상에서 절단된 DNA 조각을 확인하였다.
Reaction
(20 μl)		 Time
(min)		 Reaction Buffer
NEBuffer 3.1		 HsCCR5_crRNA3
14 ng/μl (1 μM)		 mgCas12a-1_6ХNLS 148 ng/μl (1 μM) Substrate DNA
226 ng/μl (0.5 μM)
1 30 2 μl 14 ng (1 pmol) 148 ng (1 pmol) 452 ng (1 pmol)
2 30 2 μl 28 ng (2 pmol) 296 ng (2 pmol) 452 ng (1 pmol)
3 30 2 μl 42 ng (3 pmol) 444 ng (3 pmol) 452 ng (1 pmol)
4 30 2 μl 56 ng (4 pmol) 592 ng (4 pmol) 452 ng (1 pmol)
NC1 30 2 μl - 444 ng (3 pmol) 452 ng (1 pmol)
NC2 30 2 μl 42 ng (3 pmol) - 452 ng (1 pmol)
그 결과, 도 2 내지 9에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군과 비교하였을 때 절단된 형태의 crRNA를 이용한 절단 효능은 양성 대조군과 비슷한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 handle 부분과 spacer 부분이 연결되어 있는 일반적인 구조의 crRNA와 비교해 비슷한 절단 효능을 가지는 handle 부분과 spacer 부분이 분리된 crRNA를 사용하여도 DNA를 절단할 수 있음을 나타낸다.
실시예 2: CRISPR 단백질에 따른 핸들 서열을 갖는 crRNA 합성
하기와 같이 4가지의 Cas12a 단백질에 대한 각 핸들 서열을 갖는 crRNA를 Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT) 사에 의뢰하여 합성하였다. 각 서열은 하기와 같다.
1. AsCas12a에 대한 Full handle crRNA + HsCCR5_crRNA3 spacer
5'-UAAUUUCUACU-CUUGUAGAU-3' + 5'-GGAUUCCCGAGUAGCAGAUGACCA-3'
2. FnCas12a에 대한 Full handle crRNA + HsCCR5_crRNA3 spacer
5'-UAAUUUCUACU-GUUGUAGAU-3' + 5'-GGAUUCCCGAGUAGCAGAUGACCA-3'
3. LbCas12a에 대한 Full handle crRNA + HsCCR5_crRNA3 spacer
5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3' + 5'-GGAUUCCCGAGUAGCAGAUGACCA-3'
4. Lb2Cas12a에 대한 Full handle crRNA + HsCCR5_crRNA3 spacer
5'-UAAUUUCUACU-AUUGUAGAU-3' + 5'-GGAUUCCCGAGUAGCAGAUGACCA-3'
5. FnCas12a에 대한 Full length HsCCR5_crRNA (44-mer) - 양성 대조군
5'-UAAUUUCUACUGUUGUAGAUGGAUUCCCGAGUAGCAGAUGACCA-3'
실험예 2: CRISPR 단백질에 따른 in vitro에서의 DNA 절단 효능 확인
상기 실시예 2의 다양한 Cas12a 단백질에 대한 핸들 부분을 갖는 crRNA 및 CRISPR 단백질로 FnCas12a, AsCas12a 또는 mgCas12a-1_6ХNLS를 사용하여 in vitro에서 단백질 절단 효능을 확인하였다.
DNA 기질로는 HsCCR5를 이용하였고, 이는 Forward Primer 서열 5'-GCCAGGACGGTCACCTTTGG-3', Reverse Primer 서열 5'-CACACTGGCCATATCGGTGGTC-3'을 이용하여 PCR하여 수득하였다. CRISPR 단백질은 FnCas12a, AsCas12a, LbCas12a 및 mgCas12a-1_6ХNLS를 사용하였다. FnCas12a는 G+Flas 사에서 정제된 것을 사용하였고, AsCas12a는 IDT 사의 Alt-R　 A.s. Cas12a (Cpf1)를 사용하였으며, LbCas12a는 NEB 사의 EnGen　 Lba Cas12a (Cpf1)를 사용하였고, mgCas12a-1_6ХNLS는 G+Flas 사에서 정제된 것을 사용하였다. 각 절단 반응은 상기 표 1과 같이 진행하였고, 구체적인 절단 방법은 상기 실험예 1과 같이 진행하였다.
FnCas12a 단백질로 절단시킨 결과는 도 11 내지 15에 나타내었고, AsCas12a 단백질로 절단시킨 결과는 도 16 내지 20에 나타내었으며, mgCas12a-1_6ХNLS 단백질로 절단시킨 결과는 도 21 내지 25에 나타내었다.
도 10 내지 24에 나타낸 바와 같이, 다양한 CRISPR 단백질을 사용하여 DNA를 절단한 경우에도 handle과 spacer 부분이 분리된 crRNA에서 절단 효능이 양성 대조군과 비슷한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 handle 부분과 spacer 부분이 연결되어 있는 일반적인 구조의 crRNA와 비교해 비슷한 절단 효능을 가지는 handle 부분과 spacer 부분이 분리된 crRNA를 사용하여도 CRISPR 단백질과 무관하게 DNA를 절단할 수 있음을 나타낸다.

Claims (22)

  1. Cas12 이펙터 단백질 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 폴리뉴클레오티드로서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드는 루프 구조(loop structure)를 갖지 않고 이중 가닥 핵산 듀플렉스를 포함하지 않는 것인 폴리뉴클레오티드; 및
    상기 가이드 폴리뉴클레오티드와 연결되어 있지 않은 일부의 또는 전부의 직접 반복부 서열을 포함하고,
    tracr 서열을 포함하지 않으며,
    상기 가이드 폴리뉴클레오티드와 상기 직접 반복부 서열은 상보적으로 결합하지 않아 듀플렉스 구조를 이루지 않는 조작된, 비-천연 발생의 CRISPR-Cas 시스템.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드는 crRNA이고, 상기 crRNA는 표적 서열에 혼성화할 수 있는 스페이서 서열로 이루어져 있는 폴리뉴클레오티드이거나, 직접 반복부 서열의 일부가 연결된 스페이서 서열로 이루어져 있는 조작된 폴리뉴클레오티드인 것인, 시스템.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 스페이서 서열에 연결된 직접 반복부 서열의 일부는 이펙터 단백질의 절단 활성을 유도할 수 없고, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드와 연결되어 있지 않은 일부의 또는 전부의 직접 반복부 서열과 함께 이펙터 단백질의 절단 활성을 유도할 수 있는 것인, 시스템.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드는 줄기-루프 구조(stem-loop structure)를 갖지 않는 것인, 시스템.
  5. 삭제
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 직접 반복 서열은 성숙형(mature) 또는 미-성숙형(pre-mature) 직접 반복 서열인 것인, 시스템.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드와 상기 가이드 폴리뉴클레오티드에 연결되어 있지 않은 직접 반복부 서열은 표적 서열의 말단으로 절단을 유발하는 Cas12 이펙터 단백질과 복합체를 형성하는 것인, 시스템.
  8. 삭제
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 표적 서열은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 3'인 것인, 시스템.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 PAM은 5' T-풍부 모티프를 포함하는 것인, 시스템.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 표적 서열은 세포 내에 있는 것인, 시스템.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포인 것인, 시스템.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 진핵 세포는 식물 세포 또는 동물 세포인 것인, 시스템.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 Cas12 이펙터 단백질은 Cas12a, mgCas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, 및 Cas12i로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 시스템.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 Cas12 이펙터 단백질은 프란시셀라 툴라렌시스 1, 프란시셀라 툴라렌시스 아종 노비시다, 프레보텔라 알벤시스, 라크노스피라세아에 박테리움 MC2017 1, 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스, 페레그리니박테리아 박테리움 GW2011_GWA2_33_10, 파르쿠박테리아 박테리움 GW2011_GWC2_44_17, 스미텔라 종 SCADC, 아시다미노코커스 종 BV3L6, 라크노스피라세아에 박테리움 MA2020, 칸디다투스 메타노플라즈마 테르미툼, 유박테리움 엘리겐스, 모락셀라 보보쿨리 237, 렙토스피라 이나다이, 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006, 포르피로모나스 크레비오리카니스 3, 프레보텔라 디시엔스 및 포르피로모나스 마카카에로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아 종으로부터 유래된 것인, 시스템.
  16. 청구항 1에 있어서, 상기 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵 국소화 신호를 포함하는 것인 시스템.
  17. Cas12 이펙터 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 폴리뉴클레오티드로서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드는 루프 구조(loop structure)를 갖지 않고 이중 가닥 핵산 듀플렉스를 포함하지 않는 것인 폴리뉴클레오티드; 및
    상기 가이드 폴리뉴클레오티드와 연결되어 있지 않은 일부의 또는 전부의 직접 반복부 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
    tracr 서열을 포함하지 않으며,
    상기 가이드 폴리뉴클레오티드와 상기 직접 반복부 서열은 상보적으로 결합하지 않아 듀플렉스 구조를 이루지 않는 조작된, 비-천연 발생의 CRISPR-Cas 벡터시스템.
  18. 청구항 1의 CRISPR-Cas 시스템, 또는 청구항 17의 CRISPR-Cas 벡터 시스템을 관심 표적 유전자좌 또는 상기 유전자좌를 함유하는 세포에 전달하는 단계를 포함하는 비-인간 유기체, 단리된 세포, 또는 시험관 내에서 관심 표적 유전자좌를 변형하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 관심 표적 유전자좌의 변형은 가닥 파손인 방법.
  20. 청구항 18에 있어서, 상기 관심 표적 유전자좌는 엇갈린 DNA 이중 가닥 손상 내로 DNA 삽입물의 통합에 의해 변형되는 것인 방법.
  21. 청구항 18에 있어서, 상기 시스템은 입자, 소포, 또는 하나 이상의 바이러스 벡터를 통해 전달되는 것인 방법.
  22. 청구항 1의 CRISPR-Cas 시스템, 또는 청구항 17의 CRISPR-Cas 벡터 시스템을 표적 핵산과 접촉시키는 단계를 포함하는 비-인간 유기체, 단리된 세포, 또는 시험관 내에서 핵산을 표적화하는 방법.
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