CN116874562A - 以Rn为转角的具有KW重复序列的中心对称β-发卡型抗菌肽及其应用 - Google Patents
以Rn为转角的具有KW重复序列的中心对称β-发卡型抗菌肽及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116874562A CN116874562A CN202310941977.2A CN202310941977A CN116874562A CN 116874562 A CN116874562 A CN 116874562A CN 202310941977 A CN202310941977 A CN 202310941977A CN 116874562 A CN116874562 A CN 116874562A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibacterial peptide
- antibacterial
- trp
- lys
- beta
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 title claims abstract description 59
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 15
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 43
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 38
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002862 amidating effect Effects 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 8
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 11
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 abstract description 10
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 abstract description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 abstract description 6
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 abstract description 6
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 abstract description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 6
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 6
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 6
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 abstract description 6
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 abstract description 5
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 abstract description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 19
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 19
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 12
- YBYIRNPNPLQARY-UHFFFAOYSA-N 1H-indene Chemical compound C1=CC=C2CC=CC2=C1 YBYIRNPNPLQARY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 5
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 4
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N D-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002815 broth microdilution Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 1
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一类以Rn为转角的具有KW重复序列的中心对称β‑发卡型抗菌肽及其应用，所述抗菌肽是以R、RR或RRR为转角，将WK重复单元交替排列在两侧得到，其结构通式为(WK)xRn(KW)x‑NH2，标记为RnWx；其中，n＝1，2，3；x＝2，3。体外抑菌实验和溶血活性实验表明，该类抗菌肽具有强大的抗菌活性和几乎可以忽略的溶血毒性。在对R2W3序列进行D型氨基酸全替换后得到的D‑R2W3其抗菌活性进一步增强，溶血毒性低，还能够抵抗胰蛋白酶和糜蛋白酶的水解，在缓解抗生素耐药性方面具有非常大的潜力，在制备临床抗菌药物中具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，涉及一类以Rn为转角的具有KW重复序列的中心对称β-发卡抗菌肽，本发明同时还涉及该抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用。
背景技术
多药耐药细菌的出现给世界公共卫生带来巨大的挑战，现代抗菌药物开发迫切需要新的抗菌化合物。近年来，关于抗菌肽的研究日益增多，抗菌肽存在于多种动物、植物和微生物体内，具有抗菌、抗炎、免疫调节等多种生物活性作用。与作用于细菌代谢途径等传统抗生素不同，抗菌肽对细菌细胞膜具有强大的破坏作用，其通过增加生物膜的通透性快速杀灭细菌，从而不容易产生耐药性。然而，天然抗菌肽的长序列、低活性、高毒性和稳定性差等问题限制了它们在临床上的应用。抗菌肽主要的二级结构有α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲。一些研究表明，β-折叠结构的抗菌肽比α-螺旋抗菌肽在杀灭细菌和溶血毒性之间有更高的选择性(Jia et al.,2020；Jin et al.,2005；Ma et al.,2014)。
发明内容
本发明的目的之一是提供一类以Rn为转角的具有KW重复序列的中心对称β-发卡抗菌肽。
本发明的目的之二是提供上述抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一、以Rn为转角的具有KW重复序列的中心对称β-发卡抗菌肽的结构设计
本发明以Rn为转角的具有KW重复序列的中心对称β-发卡抗菌肽，是以β-发卡为结构基础，以不同个数的精氨酸为转角，两侧赖氨酸和色氨酸交替排列，并在C端酰胺化得到，其结构通式为：(WK)xRn(KW)x-NH2，标记为RnWx，其中n＝1，2，3；x＝2，3。
具体的，所述抗菌肽为：
WKWKRKWKW-NH2，标记为R1W2，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
或：WKWKRRKWKW-NH2，标记为R2W2，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
或：WKWKRRRKWKW-NH2，标记为R3W2，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；
或：WKWKWKRKWKWKW-NH2，标记为R1W3，其氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示；
或：WKWKWKRRKWKWKW-NH2，标记为R2W3，其氨基酸序列如SEQ IDNo.5所示；
或：WKWKWKRRRKWKWKW-NH2，标记为R3W3，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；
作为本发明技术方案的进一步优选，所述抗菌肽为：WKWKWKRRKWKWKW-NH2，标记为R2W3，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
进一步地，将R2W3序列中所有氨基酸进行D型氨基酸替换，得到新的抗菌肽，其结构式为DWDKDWDKDWDKDRDRDKDWDKDWDKDW-NH2，标记为D-R2W3，其氨基酸序列为D-Trp-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Arg-D-Arg-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Trp-NH2。
上述以Rn为转角的具有KW重复序列的中心对称β-发卡抗菌肽均采用经典固相合成法制备得到。
二、以Rn为转角的具有KW重复序列的中心对称β-发卡抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用
1.体外抑菌实验
为了评价本发明抗菌肽的抑菌活性，采用微量肉汤稀释法测定抗菌肽的最低抑菌浓度。用二倍稀释法配制系列梯度的抗菌肽，然后与细菌稀释液(～105CFU/mL)等体积在37℃共孵育18h，观察无细菌生长的最低肽浓度确定为最小抑菌浓度。实验以链霉素、多粘菌素B和卡那霉素作为阳性对照，测试进行3次独立重复，每次重复三个平行。检测结果见表1。
表1本发明抗菌肽对常见标准菌株的最低抑菌浓度(μM)
表1结果显示，本发明抗菌肽对以金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌，以及对以肺炎克雷伯杆菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌为代表的革兰氏阴性菌都有很强的抑制作用，表现为广谱抗菌活性。
2.溶血活性实验
为了评价本发明抗菌肽对正常哺乳动物细胞的毒性，将抗菌肽与小鼠红细胞在37℃共孵育1h后的溶血情况进行测定，结构见图1。
图1结果显示，256μM的R1W3与小鼠红细胞孵育1h之后溶血率低于10％，其余的抗菌肽在512μM的溶血率仍低于10％，远远高于抗菌肽发挥抗菌活性的浓度，表明这些抗菌肽的生物相容性较高。
3.治疗指数
为了评价本发明抗菌肽的有效性和安全性，计算了它们的治疗指数，即MHC10与GMMIC的比值(MHC10：引起10％溶血的肽浓度；GMMIC：本发明抗菌肽对六种细菌的MIC的几何平均值)。如果抗菌肽在最高测试浓度512μM的溶血活性低于10％，计算治疗指数时其MHC10按照1024计算。
表2本发明抗菌肽的治疗指数
表2结果表明本发明的抗菌肽都具有很高的治疗指数。前六条抗菌肽中R2W3的治疗指数最高，达到了203.2，但L型氨基酸组成的抗菌肽的稳定性差，因此对其进行了D型氨基酸替换得到了D-R2W3，意想不到的是D-R2W3在保持低毒性的同时抗菌活性也增强了，因此D-R2W3具有最高的治疗指数，即322.5。
4.酶解稳定性测定
为了评价本发明抗菌肽对酶的抵抗性，将本发明抗菌肽与不同浓度的胰蛋白酶或糜蛋白酶孵育1h后，60℃灭活15min，然后检测抗菌肽对细菌生长的抑制能力，抗菌肽的终浓度为2×MIC，结果见图2。
图2结果显示，由L型氨基酸组成的肽R1W2、R2W2、R3W2、R1W3、R2W3和R3W3的稳定性较差，与较低浓度的酶孵育之后就失去了抑菌能力。治疗指数最高的R2W3与2μg/mL或更高浓度的胰蛋白酶孵育1h之后就失去了抑制金黄色葡萄球菌的能力；在与20μg/mL或更高浓度的糜蛋白酶孵育之后失去了抑制金黄色葡萄球菌生长的能力，而D-R2W3与最高浓度的胰蛋白酶或糜蛋白酶孵育之后仍能完全抑制细菌的生长，表明D-R2W3有非常高的酶解稳定性。
本发明以R、RR或RRR为转角，将WK重复单元交替排列在两侧，得到一类中心对称的β-发卡抗菌肽RnWx。体外抑菌实验和溶血活性实验表明，该类抗菌肽具有强大的抗菌活性和几乎可以忽略的溶血毒性。在对R2W3序列进行D型氨基酸全替换后得到的其抗菌活性进一步增强，溶血毒性低，还能够抵抗胰蛋白酶和糜蛋白酶的水解，在缓解抗生素耐药性方面具有非常大的潜力，在制备临床抗菌药物中具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明抗菌肽与小鼠红细胞孵育1h后对红细胞的溶血活性结果；
图2为本发明抗菌肽与糜蛋白酶或胰蛋白酶孵育1h后对金黄色葡萄球菌的抗菌活性；
图3为本发明抗菌肽R1W2的质谱图；
图4为本发明母肽R2W2的质谱图；
图5为本发明抗菌肽R3W2的质谱图；
图6为本发明抗菌肽R1W3的质谱图；
图7为本发明抗菌肽R2W3的质谱图；
图8为本发明抗菌肽R3W3质谱图；
图9为本发明抗菌肽D-R2W3质谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明广谱抗菌活性、低毒性且耐酶解的抗菌肽的合成作进一步说明。
实施例1：抗菌肽D-R2W3的合成
(1)树脂的活化及预处理
称取MBHA树脂加入多肽固相合成仪中，经DCM溶胀30min，DMF洗涤后，茚三酮显色法鉴定树脂，若无色表明树脂合格。
(2)Fmoc-D-R2W3-MBHA的合成
用含有20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基团，茚检树脂呈蓝紫色表明成果脱保护使氨基暴露。用DMF洗涤四次之后将3倍量的D-Trp、3倍量的HOBt、HBTU，6倍量的DIEA用DMF溶解后加入到合成仪中搅拌缩合1h，反应到时间后用DMF洗涤三遍，茚检树脂呈无色透明表明缩合成功，得到Fmoc-D-Trp-MBHA。
按照上述方法依次缩合D-Lys、D-Trp、D-Lys、D-Trp、D-Lys、D-Arg、D-Arg、D-Lys、D-Trp、D-Lys、D-Trp、D-Lys、D-Trp，得到Fmoc-D-Trp-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Arg-D-Arg-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Trp-MBHA。
(3)多肽切割
将所得Fmoc-D-Trp-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Arg-D-Arg-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Trp-MBHA。用含有20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基团后，依次用DCM、甲醇洗涤，彻底抽干树脂。加入10mL切割试剂(TFA:Tris:水＝95:2.5:2.5(v:v:v))反应3h，经乙醚萃取后冷冻干燥。
(4)多肽纯化
RP-HPLC纯化条件为流动相A：0.1％TFA/乙腈，流动相B：0.1％TFA/水，采用线性梯度洗脱，收集目标峰流出液，冻干，得到抗菌肽D-R2W3，其质谱图如图9所示。
实施例2：抗菌肽R2W3的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-R2W3-MBHA的合成
用含有20％哌啶的DMF溶液脱去Fmoc保护基团，茚检树脂呈蓝紫色表明成果脱保护使氨基暴露。用DMF洗涤四次之后将3倍量的Trp、3倍量的HOBt、HBTU，6倍量的DIEA用DMF溶解后加入到合成仪中搅拌缩合1h，反应到时间后用DMF洗涤三遍，茚检树脂呈无色透明表明缩合成功，得到Fmoc-Trp-MBHA。
按照上述方法依次缩合Lys、Trp、Lys、Trp、Lys、Arg、Arg、Lys、Trp、Lys、Trp、Lys、Trp，得到Fmoc-Trp-Lys-Trp-Lys-Trp-Lys-Arg-Arg-Lys-Trp-Lys-Trp-Lys-Trp-MBHA。
(3)多肽切割
同实施例1。
(4)多肽纯化
同实施例1，得到抗菌肽R2W3，其质谱图如图7所示。
实施例3：抗菌肽R1W2的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-R1W2-MBHA的合成
Fmoc-Trp-MBHA的合成同实施例2。
按照上述方法依次缩合Lys、Trp、Lys、Arg、Lys、Trp、Lys、Trp，得到Fmoc-Trp-Lys-Trp-Lys-Arg-Lys-Trp-Lys-Trp-MBHA。
(3)多肽切割
同实施例1。
(4)多肽纯化
同实施例1，得到抗菌肽R1W2，其质谱图如图3所示。
实施例4：抗菌肽R2W2的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-R2W2-MBHA的合成
Fmoc-Trp-MBHA的合成同实施例2。
按照上述方法依次缩合Lys、Trp、Lys、Arg、Arg、Lys、Trp、Lys、Trp，得到Fmoc-Trp-Lys-Trp-Lys-Arg-Arg-Lys-Trp-Lys-Trp-MBHA。
(3)多肽切割
同实施例1。
(4)多肽纯化
同实施例1，得到抗菌肽R2W2，其质谱图如图4所示。
实施例5：抗菌肽R3W2的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-R3W2-MBHA的合成
Fmoc-Trp-MBHA的合成同实施例2。
按照上述方法依次缩合Lys、Trp、Lys、Arg、Arg、Arg、Lys、Trp、Lys、Trp，得到Fmoc-Trp-Lys-Trp-Lys-Arg-Arg-Arg-Lys-Trp-Lys-Trp-MBHA。
(3)多肽切割
同实施例1。
(4)多肽纯化
同实施例1，得到抗菌肽R3W2，其质谱图如图5所示。
实施例6：抗菌肽R1W3的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-R1W3-MBHA的合成
Fmoc-Trp-MBHA的合成同实施例2。
按照上述方法依次缩合Lys、Trp、Lys、Trp、Lys、Arg、Lys、Trp、Lys、Trp、Lys、Trp，得到Fmoc-Trp-Lys-Trp-Lys-Trp-Lys-Arg-Lys-Trp-Lys-Trp-Lys-Trp-MBHA。
(3)多肽切割
同实施例1。
(4)多肽纯化
同实施例1，得到抗菌肽R1W3，其质谱图如图6所示。
实施例7：抗菌肽R3W3的合成
(1)树脂的活化及预处理
同实施例1。
(2)Fmoc-R3W3-MBHA的合成
Fmoc-Trp-MBHA的合成同实施例2。
按照上述方法依次缩合Lys、Trp、Lys、Trp、Lys、Arg、Arg、Arg、Lys、Trp、Lys、Trp、Lys、Trp，得到Fmoc-Trp-Lys-Trp-Lys-Trp-Lys-Arg-Arg-Arg-Lys-Trp-Lys-Trp-Lys-Trp-MBHA。
(3)多肽切割
同实施例1。
(4)多肽纯化
同实施例1，得到抗菌肽R3W3，其质谱图如图8所示。
Claims (5)
1.一类以Rn为转角的具有KW重复序列的中心对称β-发卡型抗菌肽，其特征是，所述抗菌肽是以β-发卡为结构基础，以不同个数的精氨酸为转角，两侧赖氨酸和色氨酸交替排列，并在C端酰胺化得到，其结构通式为：
(WK)xRn(KW)x-NH2，标记为RnWx，其中n＝1，2，3；x＝2，3。
2.如权利要求1所述的一类以Rn为转角的具有KW重复序列的中心对称β-发卡型抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽为：
WKWKRKWKW-NH2，标记为R1W2，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
或：WKWKRRKWKW-NH2，标记为R2W2，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
或：WKWKRRRKWKW-NH2，标记为R3W2，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；
或：WKWKWKRKWKWKW-NH2，标记为R1W3，其氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示；
或：WKWKWKRRKWKWKW-NH2，标记为R2W3，其氨基酸序列如SEQ IDNo.5所示；
或：WKWKWKRRRKWKWKW-NH2，标记为R3W3，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
3.如权利要求1所述的一类以Rn为转角的具有KW重复序列的中心对称β-发卡型抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽为：WKWKWKRRKWKWKW-NH2，标记为R2W3，其氨基酸序列如SEQ IDNo.5所示。
4.如权利要求2所述的一类以Rn为转角的具有KW重复序列的中心对称β-发卡抗菌肽，其特征是，所述抗菌肽是将R2W3序列中所有氨基酸进行D型氨基酸替换得到，其结构式为DWDKDWDKDWDKDRDRDKDWDKDWDKDW-NH2，标记为D-R2W3。
5.如权利要求1-4任一项所述的一类以Rn为转角的具有KW重复序列的中心对称β-发卡抗菌肽在制备临床抗菌药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310941977.2A CN116874562A (zh) | 2023-07-28 | 2023-07-28 | 以Rn为转角的具有KW重复序列的中心对称β-发卡型抗菌肽及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310941977.2A CN116874562A (zh) | 2023-07-28 | 2023-07-28 | 以Rn为转角的具有KW重复序列的中心对称β-发卡型抗菌肽及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116874562A true CN116874562A (zh) | 2023-10-13 |
Family
ID=88262048
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310941977.2A Pending CN116874562A (zh) | 2023-07-28 | 2023-07-28 | 以Rn为转角的具有KW重复序列的中心对称β-发卡型抗菌肽及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116874562A (zh) |
-
2023
- 2023-07-28 CN CN202310941977.2A patent/CN116874562A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106632600B (zh) | 含d型非天然氨基酸的抗菌肽类似物及其合成与应用 | |
| CN111363010B (zh) | 一类对称短序列抗菌肽类似物及其应用 | |
| CN111057134B (zh) | 一类具有广谱抗菌活性、低毒性且无诱导耐药性的抗菌肽及其应用 | |
| CN112625107A (zh) | 一种绿海龟抗菌肽的改造体抗菌肽c-cm8及其制备方法和应用 | |
| CN115947788A (zh) | 色氨酸和亮氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WLF及制备方法和应用 | |
| CN112625108A (zh) | 一种绿海龟抗菌肽的改造体抗菌肽c-cm5及其制备方法和应用 | |
| CN115960171A (zh) | 高稳定性Trp-pocket跨链交互型β-发卡抗菌肽及制备方法和应用 | |
| CN115960261A (zh) | 色氨酸和苯丙氨酸跨链交互β-发卡抗菌肽WFL及其制备方法和应用 | |
| CN112625109A (zh) | 一种绿海龟抗菌肽的改造体抗菌肽c-cm6及其制备方法和应用 | |
| CN110938112A (zh) | 脂肪酸修饰的超短序列抗菌肽类似物及其应用 | |
| CN116874614B (zh) | 一种具有高活性低裂解效果的抗菌多肽aph171及其制备方法和应用 | |
| CN113045628B (zh) | 一种抗菌肽或其变体在制备抗菌产品中的应用 | |
| CN112778401B (zh) | 一种辛酸酰化修饰抗菌肽及其应用 | |
| CN113214355B (zh) | 一种专杀真菌的抗菌肽gl4w及其制备方法和应用 | |
| CN110054664B (zh) | 含d型氨基酸的侧链脂肪酸修饰抗菌肽类似物及其合成和应用 | |
| CN110066320B (zh) | 抗多重耐药菌环肽及其制备方法和应用 | |
| CN109535227B (zh) | 抗菌肽、抗菌肽制备方法、抗菌组合物、抗菌方法和应用 | |
| CN115043925B (zh) | 一种改造体抗菌肽oNCM及其应用 | |
| CN116874562A (zh) | 以Rn为转角的具有KW重复序列的中心对称β-发卡型抗菌肽及其应用 | |
| CN113999297B (zh) | 一种抗菌肽hrNCM及其制备方法与应用 | |
| CN113185576B (zh) | 一类具有RRRF转角的β-发卡型低毒广谱抗菌肽及其应用 | |
| CN113185577B (zh) | 具有不同电荷排列模式及不同电荷种类的低毒广谱抗菌肽及其应用 | |
| Kawai et al. | Proline residue‐modified polycationic analogs of gramicidin S with high antibacterial activity against both Gram‐positive and Gram‐negative bacteria and low hemolytic activity | |
| CN112321680A (zh) | 一种能够特异性识别并靶向S.aureus菌的抗菌肽 | |
| CN117466975A (zh) | 一类具有不同转角的中心对称β-发卡抗菌肽及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |