CN104941002A - 一种针对透明质酸酶分泌型细菌的细菌响应性钛基抗菌植入材料制备方法 - Google Patents

一种针对透明质酸酶分泌型细菌的细菌响应性钛基抗菌植入材料制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种针对透明质酸酶分泌型细菌的细菌响应性钛基抗菌植入材料制备方法。该方法首先通过阳极氧化法在钛材表面构建二氧化钛纳米管，并将其用做构建抗菌植入材料的载药基底。其次，利用层层自组装技术(旋涂法)构建壳聚糖/透明质酸-天蚕肽B多层膜，从而在载药纳米管基材表面构建出一种细菌(透明质酸酶分泌型细菌)响应性的抗菌生物涂层，以提高钛基移植体的抗菌性能。

Description

一种针对透明质酸酶分泌型细菌的细菌响应性钛基抗菌植入材料制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，涉及一种功能性钛基植入材料的制备方法。
背景技术
钛及钛合金移植体因其出色的力学性能及良好的生物相容性等被广泛应用于骨修复等外科手术中。然而，钛移植体植入体内后，材料介导的细菌感染将会导致植入手术的失败。研究显示，金黄色葡萄球菌是临床骨科手术后最常见的感染性细菌，该细菌感染发生后会在短时间内大量增殖并分泌多种有害物质(例如外毒素，肠毒素，透明质酸酶等)，影响正常机体细胞的增殖生长，进而阻碍植入材料与机体之间的机械整合。为了解决这一难题，对钛材进行表面改性以提高其抗菌性能成为医用材料研究领域的重要内容。
目前此类研究多集中在植入材料中抗菌性离子(银、铜、锌)的嵌入、抗生素类药物的储池装载、抗细菌粘附性涂层的构建等方面。但研究中仍存在以下问题：第一，目前多项研究中制备的抗菌材料多忽略其生物相容性问题，因其载药种类或载药量等问题会大幅度降低钛基材本身的良好生物相容性，在植入受体后不能很好的与人体相容，致使受体发生排异反应，严重危害受体健康。第二，抗细菌粘附性的涂层多会在一定程度上影响的正常细胞在材料表面的附着，进而降低了材料的细胞相容性。第三，目前研究的抗菌性植入材料很少能智能有效的调控药物释放速率，它们在细菌感染前后药物释放速率往往不会发生大的变化，从而导致药物过早或过晚释放，达不到良好的抗菌目的。
发明内容
本专利旨在制备一种针对透明质酸酶分泌型细菌的细菌响应性钛基抗菌植入材料。该制备方法不需要特殊设备，操作简单、可控性强。利用该方法构建的功能化钛材界面具有良好的生物相容性以及抗菌活性，在骨移植技术中有重要的研究价值和临床意义。
为实现本发明目的而采用的技术方案是这样的，一种针对透明质酸酶分泌型细菌的细菌响应性钛基抗菌植入材料制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.利用阳极氧化法构建管径70nm的二氧化钛纳米管(TNT)，并对其进行药物(天蚕肽B)装载。
b.利用酰胺反应在透明质酸钠(SH)多糖链上接枝天蚕肽B(CecB)。
c.利用层层自组装方法(旋涂法)，在载药纳米管表面构建壳聚糖/透明质酸-天蚕肽(Chi/SH-CecB)多层膜。
优选的，所述步骤a是利用阳极氧化法构建管径70nm的二氧化钛纳米管(TNT)，并对其进行药物(天蚕肽B)装载。具体步骤是：首先，将钛箔(10mm×10mm)依次用乙醇，丙酮，乙醇和蒸馏水各自清洗10～20分钟。60℃干燥。利用铂箔作为电化学电池的阴极，钛箔作为电化学电池的阳极。所述电化学电池的电解溶液为溶解有氟化铵的水/甘油混合物，其中：水和甘油的体积比为0:1、1:3、1:1、3:1或1:0，氟化铵浓度为0.27M。在10～30V恒定电压的条件下，电解30～90分钟。将电解后的钛箔在450℃条件下煅烧2小时，得到结构稳定的锐钛矿型二氧化钛纳米管。最后，在每片含纳米管样品中装载20～200μg的抗菌短肽-天蚕肽B。
更优选的，所述步骤a是利用阳极氧化法构建管径70nm的二氧化钛纳米管(TNT)，并对其进行药物(天蚕肽B)装载。具体步骤是：首先，将钛箔(10mm×10mm)依次用乙醇，丙酮，乙醇和蒸馏水各自清洗15分钟。60℃干燥。利用铂箔作为电化学电池的阴极，钛箔作为电化学电池的阳极。所述电化学电池的电解溶液为溶解有氟化铵的水/甘油混合物，其中：水和甘油的体积比为1:1，氟化铵浓度为0.27M。在20V恒定电压的条件下，电解60分钟。将电解后的钛箔在450℃条件下煅烧2小时，得到结构稳定的锐钛矿型二氧化钛纳米管。最后，在每片含纳米管样品中装载200μg的抗菌短肽-天蚕肽B。
优选的，步骤b是利用酰胺反应在透明质酸钠(SH)多糖链上接枝天蚕肽B(CecB)。具体步骤是：首先，将10～50mg的透明质酸钠和10～35mg的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)溶解于25mL的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液中，调节其溶液为pH为4.5～6.5，在磁力搅拌条件下反应10～60分钟。再在以上混合物溶液中加入1～10mg的CecB蛋白质，磁力搅拌12～24小时。所获得的产物(SH-CecB)用分子量为5000D的透析袋透析3天，冻干燥并收集产物。
更优选的，步骤b是利用酰胺反应在透明质酸钠(SH)多糖链上接枝天蚕肽B(CecB)。具体步骤是：首先，将25mg的透明质酸钠和18mg的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)溶解于25mL的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液中，调节其溶液为pH为5.5，在磁力搅拌条件下反应30分钟。再在以上混合物溶液中加入5mg的CecB蛋白质，磁力搅拌24小时。所获得的产物(SH-CecB)用分子量为5000D的透析袋透析3天，冻干燥并收集产物。
优选的，步骤c是利用层层自组装方法(旋涂法)，在载药纳米管表面构建壳聚糖/透明质酸-天蚕肽(Chi/SH-CecB)多层膜。
具体步骤为：
用蒸馏水制备SH-CecB溶液；SH-CecB浓度0.5～2mg/mL。
用0.1％(v/v)的醋酸制备壳聚糖溶液(Chi)，壳聚糖浓度为1～10mg/mL，回调pH为5.5。
将旋涂仪(spin-coater)设置参数为：
Ⅰ、100～400rpm/min，5～10s，或Ⅱ、2000-4000rpm/min，20～60s。
Chi溶液和SH-CecB溶液交替旋涂5次，最终得到的薄膜系统为(Chi/SH-CecB)5。
更优选的，用蒸馏水制备SH-CecB溶液(0.8mg/mL)，用0.1％(v/v)的醋酸制备壳聚糖溶液(4mg/mL，回调pH为5.5)。将spin-coater(旋涂仪)设置为150rpm/min(8s)，2500rpm/min(40s)。Chi和SH-CecB交替旋涂5次，最终得到的薄膜系统为(Chi/SH-CecB)5。
本发明还包括基于上述制备方法的材料制备，即针对透明质酸酶分泌型细菌的细菌响应性钛基抗菌植入材料制备。
值得说明的是，为了克服此类研究的缺点(背景技术所提到的)，在本专利中，我们利用具有缓释作用的TNT、低毒性的抗菌短肽CecB及透明质酸酶敏感性的Chi/SH-CecB涂层共同制备了具有细菌响应性的钛基抗菌植入材料。Chi/SH-CecB涂层覆盖的载药纳米管在没有细菌感染时会缓慢的释放其内装载的CecB(1周左右)。但当透明质酸酶分泌型的细菌(如金黄色葡萄球菌)感染发生时，涂层的降解速率会大大提高，从而短时间内释放大量抗菌肽，以达到快速杀灭细菌的目的。研究还发现，修饰后的SH-CecB在保持了其抗菌性能的同时大大提高了其表面蛋白及细胞的粘附能力，进而使得所制备材料(TNT-CecB-LBLc)具有较好的细胞相容性。因此，本专利中所制备的细菌响应性钛基体不仅具有良好的生物相容性，还具有较强的响应性抗菌性能，其在临床医疗过程中具有较好的应用前景。
本发明的显著优点在于：该制备方法不需要特殊设备，操作简单、可控性强。利用该方法构建的功能化钛材界面具有良好的生物相容性以及抗菌活性，在骨移植技术中有重要的研究价值和临床意义。
附图说明
图1：纯钛(Ti)、二氧化钛纳米管(TNT)、(Chi/SH)5铺膜样品(TNT-CecB-LBL)和(Chi/SH-CecB)5铺膜后样品(TNT-CecB-LBLc)的表面扫描电镜图。
图2A：透明质酸钠(a)、天蚕肽B(b)和透明质酸钠-天蚕肽B(c)的红外图谱。B：透明质酸钠(a)和透明质酸钠-天蚕肽B(b)的核磁共振图谱。
图3A：有/无透明质酸酶(HAase)条件下TNT-CecB-LBL和TNT-CecB-LBLc样品中天蚕肽B释放量的曲线图。B：有/无金黄色葡萄球菌(S.Aureus)条件下不同培养时间(4、12和24小时)后TNT-CecB-LBLc样品表面多层膜的荧光图片(FM)。
图4A：不同修饰样品表面金黄色葡萄球菌培养4小时后的扫描电镜(SEM)和共聚焦显微镜(CLSM)图片。B：不同修饰样品表面金黄色葡萄球菌培养4、24和72小时后的细菌活性，n＝6，*p<0.05；**p<0.01。C：不同修饰样品培养基中金黄色葡萄球菌培养4、24和72小时后的细菌活性，n＝6，*p<0.05；**p<0.01。
图5A：不同修饰样品表面成骨细胞培养48小时后的扫描电镜(SEM)和荧光显微镜(FM)图片。B：不同修饰样品表面成骨细胞培养4天和7天后的细胞活性，n＝6，**p<0.01。
图6：不同修饰样品表面金黄色葡萄球菌和成骨细胞共培养24小时后，成骨细胞的活/死染色(绿色/红色)图片：纯钛(a)、二氧化钛纳米管(b)、(Chi/SH)5铺膜样品(c)和(Chi/SH-CecB)5铺膜后样品(d)。
具体实施方式
为了使本研究发明的技术方案以及优点更为的清晰，下面将根据附图对本发明的实施方案进行详细描述。
本发明首先通过酰胺反应得到透明质酸钠的抗菌肽修饰产物透明质酸钠-天蚕肽B。其次，通过阳极氧化法制备二氧化钛纳米管，并利用其装载适量的抗菌肽CecB(200μg)。最后利用层层自组装技术在装载CecB的纳米管表面构建了具有细菌响应性且具有良好细胞相容性的(Chi/SH-CecB)5涂层。在构建流程中，诸多因素会影响二氧化钛纳米管的合成以及钛材表面层状薄膜的构建，例如透明质酸钠修饰时天蚕肽B的量、电解过程中电解液/电压及电解时间、层层自组装时聚阳/阴离子的浓度旋涂的转速与时间等，不同的控制条件将影响到细菌响应性钛基植入材料的构建。本发明着重对修饰透明质酸钠时天蚕肽B的量、层层自组装过程中聚阳/阴离子的浓度、旋涂采用的转速进行了考察。结果显示，当用5mg天蚕肽B修饰25mg透明质酸钠时即可得到具有良好细胞相容性和强抗菌性的透明质酸钠-天蚕肽B产物。当旋涂设置为150rpm(8s)，2500rpm(40s)，壳聚糖和透明质酸钠-天蚕肽B的浓度分别为4mg/mL和0.8mg/mL时，5个壳聚糖/透明质酸钠-天蚕肽B即可在载药纳米管表面形成均匀的覆盖层。
实施例1、细菌(透明质酸酶分泌型细菌)响应性钛基抗菌植入材料制备
a.二氧化钛纳米管的制备及药物装载：将钛箔(10mm×10mm)依次用乙醇，丙酮，乙醇和蒸馏水各自清洗15分钟。60℃干燥后，利用铂箔作为阴极和钛箔作为阳极的电化学电池，含有0.27M氟化铵的体积比为1:1的水/甘油混合物作为电解溶液，在20V恒定电压的条件下电解60分钟。将电解后的钛箔在450℃条件下煅烧2小时，得到结构稳定的锐钛矿型二氧化钛纳米管。最后，利用真空压力载药法在每片含纳米管样品中装载200μg的抗菌短肽-天蚕肽B。
b.透明质酸钠的天蚕肽B接枝：将25mg的透明质酸钠和18mg的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)溶解于25mL的PBS溶液中，调节其溶液为pH5.5，在磁力搅拌条件下反应30分钟。再在以上混合物溶液中加入5mg的CecB蛋白质，磁力搅拌24小时。所获得的产物(SH-CecB)用分子量5000D的透析袋透析3天，并利用冷冻干燥技术收集。
c.载药纳米管表面多层膜的构建：以0.1％(v/v)的醋酸制备壳聚糖溶液(4mg/mL，回调pH为5.5)，蒸馏水制备SH-CecB溶液(0.8mg/mL)。将spin-coater(旋涂仪)设置为150rpm/min(8s)，2500rpm/min(40s)。Chi和SH-CecB交替旋涂5次，最终得到的薄膜系统为(Chi/SH-CecB)5。
以上a步骤制备所得的二氧化钛纳米管的扫描电镜图为图1.b，可见本发明中制备得到的纳米管具有均匀的管径且分布在70nm左右。b步骤制备所得产物(SH-CecB)的红外和核磁表征图谱分别为图2.A和图2.B，两个结果都证明了在SH糖链上成功的接枝了CecB。c步骤制备的铺膜样品(TNT-CecB-LBLc)的扫描电镜图为图1.d，从图中可以发现铺膜后纳米管被成功的覆盖，在其表面出现许多均匀的纳米尺度高聚物团聚颗粒。由此可以证明，本发明成功构建了细菌(透明质酸酶分泌型细菌)响应性的钛基抗菌植入材料。
实验例1、CecB的释放及多层膜的降解
本研究中，外源性透明质酸酶(100μg/孔)和金黄色葡萄球菌(2×106个/孔)被用来辅助研究材料表面多层膜是否对透明质酸酶分泌型细菌具有响应性。首先，为了验证透明质酸酶对药物释放的影响，每组(TNT-CecB-LBL和TNT-CecB-LBLc)三个样品分别浸泡到PBS和富含透明质酸酶的PBS(HAase-PBS)溶液中。不同时间(1、3、6、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216和240小时)孵育(37℃)后，每组样品中取70μL浸出液用以检测CecB的释放速率，每次液体取出后立即补充相等量的PBS/HAase-PBS溶液。本实验中CecB的释放量是利用BCA检测试剂盒在570nm波长下测定的，其计算公式为：CecB(％)＝(CecB总释放量)/(CecB总载药量)×100％。其次，我们还利用FITC标记的SH-CecB去制备了多层膜，进而验证其在金黄色葡萄球菌存在的条件下是否会快速被破坏。在此，不同培养时间(4、6、12和24小时)后FITC标记TNT-CecB-LBLc样品的荧光强度被初步检测，并将其与对照组(细菌培养基)三个时间段的荧光强度进行对比分析。
图3.A结果显示，在透明质酸酶存在的条件下CecB得到快速的释放，在6小时就出现了药物爆释现象，且药物在72小时左右就被释放完全。但没有透明质酸酶存在时，药物呈现缓慢释放状态，缓释时间可以延缓到168小时。图3.B显示当金黄色葡萄球菌存在时，TNT-CecB-LBLc样品表面的荧光会加速衰减：孵育12小时后荧光即衰减过半，当延长到24小时时荧光几乎全部消失。以上结果说明，该发明中所制备的多层膜对透明质酸酶具有强的响应性，它可以加速透明质酸酶分泌型细菌感染时CecB的释放速率，从而达到快速、高效抗菌的目的。
实验例2、材料表面金黄色葡萄球菌形态及活性检测
当金黄色葡萄球菌150rpm震荡孵育10小时后，以2×106个/孔的密度接种于不同钛基材料的表面以及TCPS上，37℃条件下培养不同时间。4小时培养后，分别利用扫描电镜(SEM)和共聚焦显微镜(CLSM)观察了不同材料表面的细菌形貌和数量。另外还利用CCK-8技术检测了4,24和72小时培养后不同材料表面及各组培养基中的细菌活性。该检测中，为了制备SEM观察样品，我们首先利用4％的多聚甲醛溶液对细菌进行40分钟的固定，然后对其进行了梯度脱水(20％，40％，60％，80％和100％，叔丁醇)和喷金处理。为了制备CLSM观察样品，细菌也首先被4％的多聚甲醛溶液固定，然后用Hoechst 33258染料对细菌核区进行了染色。为了检测不同材料表面的细菌活性，吸弃旧培养液，加入200μL新鲜培养基以及20μL CCK-8溶液，继续培养1h后在450nm处测量各组吸光值。为了检测不同组培养基中的细菌活性，首先将200μL的旧细菌培养液被分别收集到一个新的96孔板的各孔中，然后向每孔中加入20μL CCK-8溶液，培养1h后在450nm处测量各组吸光值。
图4.A中展示出了4小时培养后不同材料表面粘附细菌的SEM和CLSM图。从图中我们可以看到在培养前期，TNT-CecB-LBL表面的细菌数目最少，但该部分细菌的形貌趋于正常，这可能是由于SH涂层抗细菌粘附的特性导致了少量细菌的粘附。TNT-CecB-LBLc材料表面也表现出了强的抗菌性能，从它的SEM图中我们发现大部分的粘附细菌表现出了畸态的细菌形貌，这可能是涂层中暴露的CecB末端赋予了该样品强的抗菌能力。另外，材料表面(图4.B)和培养基中(图4.C)的细菌活性实验结果也证实了细菌感染初期(4小时)TNT-CecB-LBL表面会粘附最少的细菌，但剩余的细菌会在培养基中大量增殖。随着感染时间的加长，TNT-CecB-LBL的抗菌能力会明显低于TNT-CecB-LBLc组。由此，结果表明相较于其它实验组，TNT-CecB-LBLc样品具有最强且最长效的抗菌性能。
实验例4、材料表面成骨细胞形态及活性检测
当成骨细胞成长到第三代时，2×104个/孔的密度接种于各钛片表面以及TCPS上，以1×106个/孔的密度接种于不同钛基材料的表面以及TCPS上，37℃、5％CO2条件下培养不同时间。48小时培养后，分别利用扫描电镜(SEM)和荧光显微镜(FM)观察了不同材料表面的细胞的形貌。另外还利用CCK-8技术检测了4天和7天培养后不同材料表面的细胞活性。该检测中，为了制备SEM观察样品，我们首先利用4％的多聚甲醛溶液对材料表面的成骨细胞进行了40分钟的固定，然后对利用梯度脱水(20％，40％，60％，80％和100％，叔丁醇)和喷金处理完成样品制备。为了制备CLSM观察样品，成骨细胞也首先被4％的多聚甲醛溶液固定，然后使用0.2％的Triton X-100裂解液对细胞进行打孔处理，最后鬼笔环肽(过夜)和Hoechst 33258(5分钟)染料分别被选择来对成骨细胞的细胞骨架和细胞核进行了染色。为了检测不同材料表面的成骨细胞细胞活性，吸弃旧培养液后各孔中加入200μL不含血清的新鲜培养基以及20μL CCK-8溶液，继续培养1.5h后在450nm处测量各组吸光值。
从图5.A中可以看出未修饰的SH涂层样品(TNT-CecB-LBL)表面不利于成骨细胞的粘附和铺展，但TNT-CecB-LBLc材料表面却表现出了良好的细胞铺展状态，这说明双亲性CecB的修饰大大改善了透明质酸钠的细胞相容性。从CCK-8的结果中我们也可以看出，两个时间段(4天和7天)培养后，TNT-CecB-LBLc表面的细胞活性均明显优越与TNT-CecB-LBL表面的活性。另外，尽管TNT-CecB-LBLc的细胞活性还是稍低于与二氧化钛纳米管组的活性，但它与纯钛相比却没有明显的差异。综上，该研究结果表明，含有Chi/SH-CecB多层膜的TNT-CecB-LBLc样品具有良好的生物相容性，其具有良好的临床应用潜能。
实验例5、细菌/细胞共培养
将金黄色葡萄球菌(2×103个/孔)和三代成骨细胞(2×104个/孔)同时接种到不同的材料表面，以探究细菌存在条件下不同材料表面上成骨细胞的活/死细胞比率。本研究中荧光素双醋酸酯-碘化丙啶(FDA-PI)染色法被选用来检测各种材料上的活/死细胞。细菌/细胞共培养24小时后，首先用PBS对各材料清洗三次，然后将掺有FDA(10ug/ml)的1ml新鲜细胞培养基加入到各孔中培养25分钟。接着逐个向孔中加入一定量的PI染料(终浓度为6ug/ml)，再孵育5分钟。最后，将染色样品用PBS漂洗3次后用荧光显微镜对它们进行观察。图6为该实验的检测结果，从结果中我们可以看出TNT-CecB-LBLc表面的活细胞(绿色)与死细胞(红色)比率明显要高于Ti和TNT组，在其表面的活细胞更趋于正常形貌。另外，我们发现TNT-CecB-LBL样品表面仅有少量未铺展的活/死细胞出现，这进一步说明了SH涂层表面不利于细胞的粘附和铺展。
因此，本研究一方面，保证了材料本身的生物相容性，为成骨细胞生长提供了良好的微环境，另一方面，Chi/SH-CecB涂层及装载的CecB为所制备材料提供了细菌(透明质酸酶分泌型细菌)相应性的强效抗菌功能。
最后说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，并不构成对本发明内容的限制。尽管通过上述实施例已经对本发明做了较为详细的例举，但本领域技术人员仍然可以根据发明内容部分和实施例部分所描述的技术内容，在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (8)

1.一种针对透明质酸酶分泌型细菌的细菌响应性钛基抗菌植入材料制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.利用阳极氧化法构建管径70nm的二氧化钛纳米管(TNT)，并对其进行药物(天蚕肽B)装载；
b.利用酰胺反应在透明质酸钠(SH)多糖链上接枝天蚕肽B(CecB)；
c.利用层层自组装方法(旋涂法)，在载药纳米管表面构建壳聚糖/透明质酸-天蚕肽(Chi/SH-CecB)多层膜。
2.根据权利要求1所述的一种针对透明质酸酶分泌型细菌的细菌响应性钛基抗菌植入材料制备方法，其特征在于：
所述步骤a是利用阳极氧化法构建管径70nm的二氧化钛纳米管(TNT)，并对其进行药物(天蚕肽B)装载；具体步骤是：首先，将钛箔(10mm×10mm)依次用乙醇，丙酮，乙醇和蒸馏水各自清洗10～20分钟；60℃干燥；利用铂箔作为电化学电池的阴极，钛箔作为电化学电池的阳极；所述电化学电池的电解溶液为溶解有氟化铵的水/甘油混合物，其中：水和甘油的体积比为0:1、1:3、1:1、3:1或1:0，氟化铵浓度为0.27M；在10～30V恒定电压的条件下，电解30～90分钟；将电解后的钛箔在450℃条件下煅烧2小时，得到结构稳定的锐钛矿型二氧化钛纳米管；最后，在每片含纳米管样品中装载20～200μg的抗菌短肽-天蚕肽B。
3.根据权利要求1所述的一种针对透明质酸酶分泌型细菌的细菌响应性钛基抗菌植入材料制备方法，其特征在于：
所述步骤a是利用阳极氧化法构建管径70nm的二氧化钛纳米管(TNT)，并对其进行药物(天蚕肽B)装载；具体步骤是：首先，将钛箔(10mm×10mm)依次用乙醇，丙酮，乙醇和蒸馏水各自清洗15分钟；60℃干燥；利用铂箔作为电化学电池的阴极，钛箔作为电化学电池的阳极；所述电化学电池的电解溶液为溶解有氟化铵的水/甘油混合物，其中：水和甘油的体积比为1:1，氟化铵浓度为0.27M；在20V恒定电压的条件下，电解60分钟；将电解后的钛箔在450℃条件下煅烧2小时，得到结构稳定的锐钛矿型二氧化钛纳米管；最后，在每片含纳米管样品中装载200μg的抗菌短肽-天蚕肽B。
4.根据权利要求1所述的一种针对透明质酸酶分泌型细菌的细菌响应性钛基抗菌植入材料制备方法，其特征在于：
步骤b是利用酰胺反应在透明质酸钠(SH)多糖链上接枝天蚕肽B(CecB)；具体步骤是：首先，将10～50mg的透明质酸钠和10～35mg的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)溶解于25mL的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液中，调节其溶液为pH为4.5～6.5，在磁力搅拌条件下反应10～60分钟；再在以上混合物溶液中加入1～10mg的CecB蛋白质(天蚕肽B)，磁力搅拌12～24小时；所获得的产物(SH-CecB)用分子量为5000D的透析袋透析3天，冻干燥并收集产物。
5.根据权利要求1所述的一种针对透明质酸酶分泌型细菌的细菌响应性钛基抗菌植入材料制备方法，其特征在于：
步骤b是利用酰胺反应在透明质酸钠(SH)多糖链上接枝天蚕肽B(CecB)；具体步骤是：首先，将25mg的透明质酸钠和18mg的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)溶解于25mL的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液中，调节其溶液为pH为5.5，在磁力搅拌条件下反应30分钟；再在以上混合物溶液中加入5mg的CecB蛋白质，磁力搅拌24小时；所获得的产物用分子量为5000D的透析袋透析3天，冻干燥并收集产物(SH-CecB)。
6.根据权利要求1所述的一种针对透明质酸酶分泌型细菌的细菌响应性钛基抗菌植入材料制备方法，其特征在于：步骤c是利用层层自组装方法(旋涂法)，在载药纳米管表面构建壳聚糖/透明质酸-天蚕肽(Chi/SH-CecB)多层膜；
具体步骤为：
用蒸馏水制备SH-CecB溶液；SH-CecB浓度0.5～2mg/mL；
用0.1％(v/v)的醋酸制备壳聚糖溶液(Chi)，壳聚糖浓度为1～10mg/mL，回调pH为5.5；
将旋涂仪(spin-coater)设置参数为：
Ⅰ、100～400rpm/min，5～10s，或Ⅱ、2000-4000rpm/min，20～60s；
Chi溶液和SH-CecB溶液交替旋涂5次，最终得到的薄膜系统为(Chi/SH-CecB)5。
7.根据权利要求6所述的一种针对透明质酸酶分泌型细菌的细菌响应性钛基抗菌植入材料制备方法，其具体特征在于：用蒸馏水制备 SH-CecB溶液(0.8mg/mL)，用0.1％(v/v)的醋酸制备壳聚糖溶液(4mg/mL，回调pH为5.5)。将spin-coater(旋涂仪)设置为150rpm/min(8s)，2500rpm/min(40s)。Chi和SH-CecB交替旋涂5次，最终得到的薄膜系统为(Chi/SH-CecB)5。
8.采用权利要求1至7任一项所述制备方法完成针对透明质酸酶分泌型细菌的细菌响应性钛基抗菌植入材料制备。
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