CN103191467A - 医用金属表面固定多种细胞生长因子抗菌涂层的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种医用金属表面缓释多种细胞生长因子的抗菌涂层的制备方法。该方法采用共价结合的方式在氧化石墨烯上接枝带氨基的抗生素，以接枝有抗生素的氧化石墨烯为载体，通过层层自组装的方法将分别包裹多种细胞生长因子的纳米颗粒固定在氧化石墨烯层之间，从而在医用金属表面得到同时载有多种细胞生长因子及抗生素的涂层。该法制备的涂层能够独立控制各种细胞生长因子的缓慢有序释放，细胞生长因子的固定量大，骨诱导作用强；并且能在细胞生长因子缓慢释放的整个过程中，均有抗生素的释放，具有长期抗菌效果；且细胞生长因子与抗生素之间不会发生相互作用，各自效能能够得到充分发挥。

Description

医用金属表面固定多种细胞生长因子抗菌涂层的制备方法
技术领域
本发明涉及一种医用金属表面固定多种细胞生长因子抗菌涂层的制备方法。
背景技术
钛及钛合金等生物医用金属表面新骨再生缓慢，在其表面载入细胞生长因子可以大大提高其表面的骨修复能力。骨组织修复过程中，需要多种生长因子协同作用促进新骨生长。因此，往往需要对医用金属进行多种生长因子的修饰。现有的多因子修饰通过高分子薄膜逐层组装生长因子时，其存在的问题是高分子薄膜组装效率低，固定的生长因子量少，对骨生长的促进作用有待提高。同时，医用金属植入过程中容易发生细菌感染，导致伤口难愈，需要进行二次手术治疗，给病人造成更多痛苦；可以通过在医用金属的表面引入抗生素以减少感染。但现有的医用金属表面修饰的抗生素与生长因子没有相互隔离，会发生相互作用，从而降低两者的功效。
发明内容
本发明的目的是提供一种医用金属表面固定多种细胞生长因子抗菌涂层的制备方法。该法制备的涂层能够独立控制各种细胞生长因子的缓慢有序释放，细胞生长因子的固定量大，骨诱导作用强；并且能在细胞生长因子缓慢释放的整个过程中，均有抗生素的释放，具有长期抗菌效果；且细胞生长因子与抗生素之间不会发生相互作用，各自效能能够得到充分发挥。
本发明实现其发明目的所采用的技术方案是，一种医用金属表面固定多种细胞生长因子抗菌涂层的制备方法，其具体步骤如下：
一种医用金属表面固定多种细胞生长因子抗菌涂层的制备方法，其具体步骤如下：
A、多种细胞生长因子分别包裹到聚多糖纳米颗粒中：
A1、将两种以上对骨生长有促进作用的细胞生长因子分别溶解于浓度为0.5-2mg/ml的聚阴离子溶液中，得到含不同细胞生长因子的多组聚阴离子溶液，每组聚阴离子溶液中细胞生长因子的浓度范围均为0.5-10μg/ml；
A2、将A1步的多组聚阴离子溶液分别与浓度为0.5-2mg/ml的聚阳离子溶液按1∶2-10的体积比混合，并搅拌、离心、冷冻干燥，制备出带正电荷的多组聚多糖纳米颗粒；
B、氧化石墨烯羧基化：
在溶液中将氧化石墨烯进行羧基化反应，使氧化石墨烯表面的含氧基团羧基化，冷冻干燥后得到羧基化的氧化石墨烯粉末；
C、羧基化的氧化石墨烯接枝抗生素：
C1、将B步制备的羧基化氧化石墨烯粉末溶于0.1M的2-吗啉乙磺酸溶液中，得到羧基化氧化石墨烯浓度为1mg/ml的混合液；
C2、另将含氨基的抗生素溶于磷酸盐缓冲溶液，得到抗生素浓度为1mg/ml的混合液；
C3、将C1步的混合液和C2步的混合液进行EDC/NHS催化反应，使羧基化氧化石墨烯上的羧基与抗生素的氨基形成酰胺键；再将反应后的溶液透析并冻干，再溶于pH6.0的缓冲液中，得到浓度为0.5-2mg/ml的接枝抗生素的氧化石墨烯溶液；
D、将接枝有多巴胺涂层的医用金属浸泡于C步的接枝抗生素的氧化石墨烯溶液中0.5-24小时，使带正电荷的多巴胺涂层与带负电荷的氧化石墨烯通过静电吸附作用结合，得到组装有接枝抗生素且表面带负电荷的氧化石墨烯层的医用金属；
E、将A步得到的任意一组带正电荷的聚多糖纳米颗粒溶于磷酸盐缓冲溶液中得到纳米颗粒浓度为0.5-2mg/ml的溶液，再将D步得到的医用金属在该溶液中浸泡0.5-24小时，通过带正电荷纳米颗粒与带负电荷的氧化石墨烯之间的静电相互作用，得到外表层固定有细胞生长因子的医用金属；
F、将外表层固定有细胞生长因子的医用金属浸泡于C步得到的接枝抗生素的氧化石墨烯的溶液中0.5-24小时，得到外表层组装有接枝抗生素的带负电荷的氧化石墨烯层的医用金属；
G、将A步得到的任意一组带正电荷的聚多糖纳米颗粒溶于水中得到0.5-2mg/ml的溶液，再将F步得到的医用金属在该溶液中浸泡0.5-24小时，得到外表层固定有细胞生长因子的医用金属；
H、重复以上F-G步的操作5-50次；且A步制备的每组带正电荷的纳米颗粒均至少在一次重复操作中的G步得到了使用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明采用在羧基化的氧化石墨烯上接枝带氨基的抗生素，而且在氧化石墨烯层之间固定包裹有细胞生长因子的纳米颗粒，这样得到的医用金属表面既在氧化石墨烯层上载有抗生素，又在氧化石墨烯层之间的纳米颗粒中包裹有细胞生长因子，从而实现骨诱导和抗菌的双重功能。
2、本发明采用层层自组装的方法在氧化石墨烯涂层之间固定包裹有多种不同生长因子的纳米颗粒，带相反电性的氧化石墨烯涂层与纳米颗粒通过静电吸附作用结合紧密，使纳米颗粒在涂层之间固定牢固，不同层数之间的生长因子不会相互渗透，从而能实现各生长因子的独立、有序缓释。同时纳米颗粒的包裹也阻止了抗生素与细胞生长因子之间的相互渗透，使两者之间不能相互作用，各自效能能够得到充分发挥。
3、氧化石墨烯的比表面积大，能够固定更多的纳米颗粒，生长因子的固定量多，骨诱导作用强。
4、本发明以共价键的方式将抗生素与氧化石墨烯涂层结合，能够避免物理吸附法造成的突释现象；并且抗生素是通过氧化石墨烯的层层自组装的方式结合在医用金属材料表面的各层氧化石墨烯中，它随着氧化石墨烯层之间的纳米颗粒的逐层降解、抗生素也相应地逐层释放、使抗生素能在细胞生长因子缓慢释放的整个过程中，均有释放，具有长期抗菌效果。
上述所述的聚阳离子是壳聚糖或聚赖氨酸。
上述的聚阴离子是肝素、硫酸软骨素、透明质酸或海藻酸钠。
上述的生长因子是骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、骨形态发生蛋白-7(BMP-7)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β2(TGF-β2)或成纤维细胞生长因子(FGF)。
上述的含氨基的抗生素为头孢拉定、头孢氨苄、阿莫西林、万古霉素、庆大霉素、链霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素或阿斯霉素。
上述的医用金属是钛、钛合金或不锈钢。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。
具体实施方式
实施例一
一种医用金属表面固定多种细胞生长因子抗菌涂层的制备方法，其具体步骤如下：
A、多种细胞生长因子分别包裹到聚多糖纳米颗粒中：
A1、将骨形态发生蛋白-2、血管内皮生长因子、转化生长因子β2分别溶解于浓度为2mg/ml的肝素(聚阴离子)溶液中，相应得到分别含骨形态发生蛋白-2、血管内皮生长因子、转化生长因子β2三组肝素溶液，其中骨形态发生蛋白-2、血管内皮生长因子、转化生长因子β2的浓度均为0.5μg/ml；
A2、将A1步制备的含骨形态发生蛋白-2、血管内皮生长因子、转化生长因子β2的肝素溶液分别与0.5mg/ml的壳聚糖(聚阳离子)溶液按1∶2的体积比混合，并搅拌、离心、冷冻干燥，制备出分别包裹骨形态发生蛋白-2、血管内皮生长因子、转化生长因子β2的带正电荷的纳米颗粒；
B、氧化石墨烯羧基化：
在溶液中将氧化石墨烯进行羧基化反应，使氧化石墨烯表面的含氧基团羧基化，冷冻干燥后得到羧基化的氧化石墨烯粉末；
即，将80mg氧化石墨烯加入5ml体积比为1∶1的20mg/ml ClCH2COONa和20mg/ml NaOH的混合溶液中反应1.5h，使氧化石墨烯上的含氧基团羧基化；反应后将溶液做透析处理，并冻干，得到羧基化的氧化石墨烯粉末；
C、氧化石墨烯接枝抗生素：
C1、将B步制备的羧基化氧化石墨烯粉末溶于0.1M的2-吗啉乙磺酸溶液中，得到羧基化氧化石墨烯浓度为1mg/ml的混合液；
C2、将庆大霉素溶于磷酸盐缓冲溶液中，得到庆大霉素浓度为1mg/ml的混合液，
C3、将C1步的混合液和C2步的混合液进行EDC/NHS催化反应，使羧基化氧化石墨烯上的羧基与庆大霉素(抗生素)的氨基形成酰胺键；
EDC/NHS催化反应为现有技术，其具体操作可以为：向C1步的1ml羧基化氧化石墨烯的混合液中加入0.4mg浓度为2mM的EDC和0.6mg浓度为5mM的NHS，pH调至5～6；室温下反应15min；再向溶液中加入1.4μl浓度为20mM的2-巯基乙醇(2-mercapto ethanol)中和多余的EDC；再取C2步得到的混合液1ml加入溶液中，调节pH至7.2～7.5，室温下反应2h，通过庆大霉素的氨基与羧基化氧化石墨烯上的羧基反应形成酰胺键，使庆大霉素与氧化石墨烯结合；然后加入浓度为10mM的羟胺以中和未反应的NHS。
随后，将反应后的溶液透析并冻干，再溶于pH6.0的缓冲液中，得到接枝庆大霉素(抗生素)的氧化石墨烯浓度为0.5mg/ml的溶液；
D、将接枝有多巴胺涂层的钛金属浸泡于C步的接枝庆大霉素(抗生素)的氧化石墨烯溶液中30分钟，并调节溶液pH为6.0，使带正电荷的多巴胺涂层与带负电荷的氧化石墨烯通过静电吸附作用结合，即在钛金属表面组装上一层带负电荷的接枝庆大霉素(抗生素)的氧化石墨烯层；
E、将A步得到的包裹骨形态发生蛋白-2的带正电荷的纳米颗粒溶于磷酸盐缓冲溶液中得到纳米颗粒浓度为2mg/ml的溶液，再将D步处理后的钛片在该纳米颗粒溶液中浸泡30分钟，通过纳米颗粒与氧化石墨烯的静电相互作用，得到外表层固定有一层骨形态发生蛋白-2的钛金属；
F、将外表层固定有骨形态发生蛋白-2的钛金属浸泡于C步得到的接枝庆大霉素(抗生素)的氧化石墨烯的溶液中30分钟，并调节溶液pH为6.0，带正电荷的纳米颗粒与带负电荷的氧化石墨烯通过静电吸附结合，得到外表层组装有接枝庆大霉素(抗生素)的氧化石墨烯层；
G、将A步得到的包裹骨形态发生蛋白-2的带正电荷的纳米颗粒溶于磷酸盐缓冲溶液中得到纳米颗粒浓度为0.5mg/ml的溶液，再将F步处理后的钛片在该纳米颗粒溶液中浸泡30分钟，通过纳米颗粒与氧化石墨烯的静电相互作用，得到外表层固定有一层骨形态发生蛋白-2的钛金属；
H、重复以上F-G步的操作2次。再重复以上F-G步的操作3次，且将E步中的包裹骨形态发生蛋白-2的带正电荷的纳米颗粒换成包裹血管内皮细胞生长因子的带正电荷的纳米颗粒。又重复E-F步的操作3次，且在重复操作中将E步中带正电荷的纳米颗粒换成包裹转化生长因子β2的带正电荷的纳米颗粒。即在钛金属表面制得从下至上依次包裹有三层骨形态发生蛋白-2、三层血管内皮生长因子、三层转化生长因子β2和十层载有庆大霉素的氧化石墨烯缓释涂层。
实施例二
本例的操作与实施例一基本相同，只是将实例一中所使用的抗生素由庆大霉素换成新霉素。
实施例三
本例的操作与实施例一基本相同，只是将实例一中所使用的抗生素由庆大霉素换成头孢拉定。
实施例四
本例的操作与实施例一基本相同，只是将实例一中所使用的抗生素由庆大霉素换成阿斯霉素。
实施例五
一种医用金属表面固定多种细胞生长因子抗菌涂层的制备方法，其具体步骤如下：
A、多种细胞生长因子分别包裹到聚多糖纳米颗粒中：
A1、将骨形态发生蛋白-7、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子分别溶解于浓度为0.5mg/ml的硫酸软骨素(聚阴离子)溶液中，相应得到分别含骨形态发生蛋白-7、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子三组硫酸软骨素溶液，其中骨形态发生蛋白-7、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子的浓度均为8μg/ml；
A2、将A1步制备的含骨形态发生蛋白-7、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子的硫酸软骨素溶液分别与1mg/ml的聚赖氨酸(聚阳离子)溶液按1∶6的体积比混合，并搅拌、离心、冷冻干燥，制备出分别包裹骨形态发生蛋白-7、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子的带正电荷的纳米颗粒；
B、氧化石墨烯羧基化：
在溶液中将氧化石墨烯进行羧基化反应，使氧化石墨烯表面的含氧基团羧基化，冷冻干燥后得到羧基化的氧化石墨烯粉末；
即，将80mg氧化石墨烯加入5ml体积比为1∶1的20mg/ml ClCH2COONa和20mg/ml NaOH的混合溶液中反应1.5h，使氧化石墨烯上的含氧基团羧基化；反应后将溶液做透析处理，并冻干，得到羧基化的氧化石墨烯粉末；
C、氧化石墨烯接枝抗生素：
C1、将B步制备的羧基化氧化石墨烯粉末溶于0.1M的2-吗啉乙磺酸溶液中，得到羧基化氧化石墨烯浓度为1mg/ml的混合液；
C2、将万古霉素溶于磷酸盐缓冲溶液中，得到万古霉素浓度为1mg/ml的混合液，
C3、将C1步的混合液和C2步的混合液进行EDC/NHS催化反应，使羧基化氧化石墨烯上的羧基与万古霉素(抗生素)的氨基形成酰胺键；
EDC/NHS催化反应为现有技术，其具体操作可以为：向C1步的1ml羧基化氧化石墨烯的混合液中加入0.4mg浓度为2mM的EDC和0.6mg浓度为5mM的NHS，pH调至5～6；室温下反应15min；再向溶液中加入1.4μl浓度为20mM的2-巯基乙醇(2-mercapto ethanol)中和多余的EDC；再取C2步得到的混合液1ml加入溶液中，调节pH至7.2～7.5，室温下反应2h，通过万古霉素的氨基与羧基化氧化石墨烯上的羧基反应形成酰胺键，使万古霉素与氧化石墨烯结合；然后加入浓度为10mM的羟胺以中和未反应的NHS。
随后，将反应后的溶液透析并冻干，再溶于pH6.0的缓冲液中，得到接枝万古霉素(抗生素)的氧化石墨烯浓度为1mg/ml的溶液；
D、将接枝有多巴胺涂层的钛合金浸泡于C步的接枝万古霉素(抗生素)的氧化石墨烯溶液中10小时分钟，并调节溶液pH为6.0，使带正电荷的多巴胺涂层与带负电荷的氧化石墨烯通过静电吸附作用结合，即在钛合金表面组装上一层带负电荷的接枝万古霉素(抗生素)的氧化石墨烯层；
E、将A步得到的包裹骨形态发生蛋白-7的带正电荷的纳米颗粒溶于磷酸盐缓冲溶液中得到纳米颗粒浓度为1mg/ml的溶液，再将D步处理后的钛合金片在该纳米颗粒溶液中浸泡10小时，通过纳米颗粒与氧化石墨烯的静电相互作用，得到外表层固定有一层骨形态发生蛋白-7的钛合金；
F、将外表层固定有骨形态发生蛋白-7的钛合金浸泡于C步得到的接枝万古霉素(抗生素)的氧化石墨烯的溶液中10小时，并调节溶液pH为6.0，带正电荷的纳米颗粒与带负电荷的氧化石墨烯通过静电吸附结合，得到外表层组装有接枝万古霉素(抗生素)的氧化石墨烯层；
G、将A步得到的包裹骨形态发生蛋白-7的带正电荷的纳米颗粒溶于磷酸盐缓冲溶液中得到纳米颗粒浓度为1mg/ml的溶液，再将F步处理后的钛合金在该纳米颗粒溶液中浸泡10小时，通过纳米颗粒与氧化石墨烯的静电相互作用，得到外表层固定有一层骨形态发生蛋白-7的钛合金；
H、重复以上F-G步的操作1次。再重复以上F-G步的操作2次，且将E步中的包裹骨形态发生蛋白-7的带正电荷的纳米颗粒换成包裹血管内皮生长因子的带正电荷的纳米颗粒。又重复E-F步的操作2次，且在重复操作中将E步中带正电荷的纳米颗粒换成包裹成纤维细胞生长因子的带正电荷的纳米颗粒。即在钛合金表面制得从下至上依次包裹有二层骨蛋白-7、二层血管内皮生长因子、二层成纤维细胞生长因子和七层载有万古霉素的氧化石墨烯缓释涂层。
实施例六
本例的操作与实施例五基本相同，只是将实例五中所使用的抗生素由万古霉素换成链霉素。
实施例七
本例的操作与实施例五基本相同，只是将实例五中所使用的抗生素由万古霉素换成丁胺卡那霉素。
实施例八
本例的操作与实施例五基本相同，只是将实例五中所使用的抗生素由万古霉素换成核糖霉素。
实施例九
一种医用金属表面固定多种细胞生长因子抗菌涂层的制备方法，其具体步骤如下：
A、多种细胞生长因子分别包裹到聚多糖纳米颗粒中：
A1、将骨形态发生蛋白-7、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β2分别溶解于浓度为1mg/ml的透明质酸(聚阴离子)溶液中，相应得到分别含骨形态发生蛋白-7、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β2三组透明质酸溶液，其中骨形态发生蛋白-7、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β2的浓度均为10μg/ml；
A2、将A1步制备的含骨形态发生蛋白-7、转化生长因子β2、成纤维细胞生长因子的透明质酸溶液分别与2mg/ml的聚赖氨酸(聚阳离子)溶液按1∶10的体积比混合，并搅拌、离心、冷冻干燥，制备出分别包裹骨形态发生蛋白-7、转化生长因子β2、成纤维细胞生长因子的带正电荷的纳米颗粒；
B、氧化石墨烯羧基化：
在溶液中将氧化石墨烯进行羧基化反应，使氧化石墨烯表面的含氧基团羧基化，冷冻干燥后得到羧基化的氧化石墨烯粉末；
即，将80mg氧化石墨烯加入5ml体积比为1∶1的20mg/ml ClCH2COONa和20mg/ml NaOH的混合溶液中反应1.5h，使氧化石墨烯上的含氧基团羧基化；反应后将溶液做透析处理，并冻干，得到羧基化的氧化石墨烯粉末；
C、氧化石墨烯接枝抗生素：
C1、将B步制备的羧基化氧化石墨烯粉末溶于0.1M的2-吗啉乙磺酸溶液中，得到羧基化氧化石墨烯浓度为1mg/ml的混合液；
C2、将卡那霉素溶于磷酸盐缓冲溶液中，得到卡那霉素浓度为1mg/ml的混合液，
C3、将C1步的混合液和C2步的混合液进行EDC/NHS催化反应，使羧基化氧化石墨烯上的羧基与抗生素卡那霉素的氨基形成酰胺键；
EDC/NHS催化反应为现有技术，其具体操作可以为：向C1步的1ml羧基化氧化石墨烯的混合液中加入0.4mg浓度为2mM的EDC和0.6mg浓度为5mM的NHS，pH调至5～6；室温下反应15min；再向溶液中加入1.4μl浓度为20mM的2-巯基乙醇(2-mercapto ethanol)中和多余的EDC；再取C2步得到的混合液1ml加入溶液中，调节pH至7.2～7.5，室温下反应2h，通过卡那霉素的氨基与羧基化氧化石墨烯上的羧基反应形成酰胺键，使卡那霉素与氧化石墨烯结合；然后加入浓度为10mM的羟胺以中和未反应的NHS。
随后，将反应后的溶液透析并冻干，再溶于pH6.0的缓冲液中，得到接枝卡那霉素(抗生素)的氧化石墨烯浓度为2mg/ml的溶液；
D、将接枝有多巴胺涂层的不锈钢浸泡于C步的接枝卡那霉素(抗生素)的氧化石墨烯溶液中24小时，并调节溶液pH为6.0，使带正电荷的多巴胺涂层与带负电荷的氧化石墨烯通过静电吸附作用结合，即在不锈钢表面组装上一层带负电荷的接枝卡那霉素(抗生素)的氧化石墨烯层；
E、将A步得到的包裹骨形态发生蛋白-7的带正电荷的纳米颗粒溶于磷酸盐缓冲溶液中得到纳米颗粒浓度为0.5mg/ml的溶液，再将D步处理后的不锈钢片在该纳米颗粒溶液中浸泡24小时，通过纳米颗粒与氧化石墨烯的静电相互作用，得到外表层固定有一层骨形态发生蛋白-7的不锈钢；
F、将外表层固定有骨形态发生蛋白-7的不锈钢浸泡于C步得到的接枝卡那霉素(抗生素)的氧化石墨烯的溶液中24小时，并调节溶液pH为6.0，带正电荷的纳米颗粒与带负电荷的氧化石墨烯通过静电吸附结合，得到外表层组装有接枝卡那霉素(抗生素)的氧化石墨烯层；
G、将A步得到的包裹骨形态发生蛋白-7的带正电荷的纳米颗粒溶于磷酸盐缓冲溶液中得到纳米颗粒浓度为2mg/ml的溶液，再将F步处理后的不锈钢在该纳米颗粒溶液中浸泡24小时，通过纳米颗粒与氧化石墨烯的静电相互作用，得到外表层固定有一层骨形态发生蛋白-7的不锈钢；
H、重复以上F-G步的操作10次。再重复以上F-G步的操作20次，且将E步中的包裹骨形态发生蛋白-7的带正电荷的纳米颗粒换成包裹转化生长因子β2的带正电荷的纳米颗粒。又重复E-F步的操作20次，且在重复操作中将E步中带正电荷的纳米颗粒换成包裹成纤维细胞生长因子的带正电荷的纳米颗粒。即在不锈钢表面制得从下至上依次包裹有十一层骨形态发生蛋白-7、二十层转化生长因子β2、二十层成纤维细胞生长因子和五十二层载有卡那霉素的氧化石墨烯缓释涂层。
实施例十
本例的操作与实施例九基本相同，只是将实例九中所使用的聚阴离子由透明质酸换成海藻酸钠、抗生素由卡那霉素换成妥布霉素。
实施例十一
本例的操作与实施例九基本相同，只是将实例九中所使用的抗生素由卡那霉素换成小诺霉素。
本发明中制备多巴胺涂层的医用金属、氧化石墨烯的羧基化均为现有技术，其具体操作可以是：
配制2mg/ml的多巴胺于10mM的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-HCl)溶液里，调节pH至8.5，将酸碱处理后的钛片浸泡到多巴胺溶液里12h，反应完后冲洗钛片三次，就在钛表面接枝了一层多巴胺涂层。
将浓度为20mg/ml的ClCH2COONa溶液和浓度为20mg/ml的NaOH溶液按体积比1∶1配制成混合溶液，再将80mg的氧化石墨烯加入4-6ml的混合溶液中反应1.5-2.5小时，使氧化石墨烯上的含氧基团羧基化；然后将溶液透析并冻干，得到羧基化的氧化石墨烯粉。

Claims (5)

1.一种医用金属表面固定多种细胞生长因子抗菌涂层的制备方法，其具体步骤如下：
A、多种细胞生长因子分别包裹到聚多糖纳米颗粒中：
A1、将两种以上对骨生长有促进作用的细胞生长因子分别溶解于浓度为0.5-2mg/ml的聚阴离子溶液中，得到含不同细胞生长因子的多组聚阴离子溶液，每组聚阴离子溶液中细胞生长因子的浓度范围均为0.5-10μg/ml；
A2、将A1步的多组聚阴离子溶液分别与浓度为0.5-2mg/ml的聚阳离子溶液按1∶2-10的体积比混合，并搅拌、离心、冷冻干燥，制备出带正电荷的多组聚多糖纳米颗粒；
B、氧化石墨烯羧基化：
在溶液中将氧化石墨烯进行羧基化反应，使氧化石墨烯表面的含氧基团羧基化，冷冻干燥后得到羧基化的氧化石墨烯粉末；
C、羧基化的氧化石墨烯接枝抗生素：
C1、将B步制备的羧基化氧化石墨烯粉末溶于0.1M的2-吗啉乙磺酸溶液中，得到羧基化氧化石墨烯浓度为1mg/ml的混合液；
C2、另将含氨基的抗生素溶于磷酸盐缓冲溶液，得到抗生素浓度为1mg/ml的混合液；
C3、将C1步的混合液和C2步的混合液进行EDC/NHS催化反应，使羧基化氧化石墨烯上的羧基与抗生素的氨基形成酰胺键；再将反应后的溶液透析并冻干，再溶于pH6.0的缓冲液中，得到浓度为0.5-2mg/ml的接枝抗生素的氧化石墨烯溶液；
D、将接枝有多巴胺涂层的医用金属浸泡于C步的接枝抗生素的氧化石墨烯溶液中0.5-24小时，使带正电荷的多巴胺涂层与带负电荷的氧化石墨烯通过静电吸附作用结合，得到组装有接枝抗生素且表面带负电荷的氧化石墨烯层的医用金属；
E、将A步得到的任意一组带正电荷的聚多糖纳米颗粒溶于磷酸盐缓冲溶液中得到纳米颗粒浓度为0.5-2mg/ml的溶液，再将D步得到的医用金属在该溶液中浸泡0.5-24小时，通过带正电荷纳米颗粒与带负电荷的氧化石墨烯之间的静电相互作用，得到外表层固定有细胞生长因子的医用金属；
F、将外表层固定有细胞生长因子的医用金属浸泡于C步得到的接枝抗生素的氧化石墨烯的溶液中0.5-24小时，得到外表层组装有接枝抗生素的带负电荷的氧化石墨烯层的医用金属；
G、将A步得到的任意一组带正电荷的聚多糖纳米颗粒溶于水中得到0.5-2mg/ml的溶液，再将F步得到的医用金属在该溶液中浸泡0.5-24小时，得到外表层固定有细胞生长因子的医用金属；
H、重复以上F-G步的操作5-50次；且A步制备的每组带正电荷的纳米颗粒均至少在一次重复操作中的G步得到了使用。
2.根据权利要求1所述的一种医用金属表面固定多种细胞生长因子抗菌涂层的制备方法，其特征在于：所述的聚阳离子是壳聚糖或聚赖氨酸；所述的聚阴离子是肝素、硫酸软骨素、透明质酸或海藻酸钠。
3.根据权利要求1所述的一种医用金属表面固定多种细胞生长因子抗菌涂层的制备方法，其特征在于：所述的细胞生长因子是骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、骨形态发生蛋白-7(BMP-7)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β2(TGF-β2)或成纤维细胞生长因子(FGF)。
4.根据权利要求1所述的种一种医用金属表面固定多种细胞生长因子抗菌涂层的制备方法，其特征在于：所述的含氨基的抗生素为头孢拉定、万古霉素、庆大霉素、链霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素或阿斯霉素。
5.根据权利要求1所述的种一种医用金属表面固定多种细胞生长因子抗菌涂层的制备方法，其特征在于：所述的医用金属是钛、钛合金或不锈钢。
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