CN111744051A - 氧化石墨烯-溶菌酶∕碱性成纤维细胞生长因子复合敷料制备及创面愈合方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了氧化石墨烯‑溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子复合敷料制备及创面愈合方法，尤其是氧化石墨烯‑溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子复合敷料制备，包括如下步骤：S1准备氧化石墨烯膜：氧化石墨烯膜购买自南京先锋纳米有限公司(货号：100027，CAS号：7440‑44‑0，参数：尺寸:9x9cm厚度：约25微米)；S2制备氧化石墨烯‑多巴胺膜：在100mL去离子水中加入131.14g tris盐酸溶解，得到的tris溶液中加入多巴胺粉200mg，得到tris‑多巴胺溶液，浓度为2mg/mL,pH值为8.5。本发明在成功制备氧化石墨烯‑溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子敷料的基础上，D组样品较好地实现了抗菌作用和促生长作用，对创面愈合有很大的益处。
Description
技术领域
本发明涉及氧化石墨烯技术领域，尤其涉及氧化石墨烯-溶菌酶 /碱性成纤维细胞生长因子复合敷料制备及创面愈合方法。
背景技术
溶菌酶是一种单体蛋白分子，由129个氨基酸残基组成，具有抗炎、抗病毒、杀菌、抗组胺等一系列生物活性。它一直是一种流行的抗菌剂。溶菌酶虽然能够通过在革兰氏阳性菌细胞壁中降解肽聚糖而有效杀死革兰氏阳性菌，但由于溶菌酶不能穿透外膜作用于目标的肽聚糖层，因此对革兰氏阴性菌杀菌作用较弱。溶菌酶的另一个局限性在于其化学结构不稳定且易失活，因此溶菌酶通常以微球囊形式或与其他抗生素联合使用。据报道,各种生长因子(如表皮生长因子、血小板源生长因子,和纤维母细胞生长因子2)可以分别在不同动态阶段发挥关键部分,包括迁移,增殖及血管生成。本文以碱性成纤维细胞生长因子作为模型因子对制备的材料进行修饰，以增强创面愈合效果。由 17kda多肽组成的碱性成纤维细胞生长因子是细胞增殖的主要促进因子，已被广泛应用于创伤愈合和骨折的修复。考虑到碱性成纤维细胞生长因子在正常生理条件下如不稳定可能会快速失活，因此应将其整合到具有水凝胶等缓释功能的给药系统中，以达到更好的利用。因此，氧化石墨烯膜与溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子的综合研究不仅具有广阔的应用前景，而且具有溶菌酶抗菌与碱性成纤维细胞生长因子促生长的联合作用。
近年来，氧化石墨烯在抗菌方面的优异性能引起了越来越多的关注。已有报道基于氧化石墨烯的纳米复合材料在很大程度上有利于伤口愈合，其抗菌性能的根源在于氧化石墨烯边缘所致的细胞膜紊乱及氧化应激诱导之间的协同作用。此外，氧化石墨烯表面含有丰富的羟基、环氧基团、羧基等表面基团，其亲水性和生物相容性明显增强，同时可以被其他化学物质进一步修饰。因此，我们特意对氧化石墨烯实现功能化，以增强其抗菌作用，同时提高其稳定性。目前，为了防止氧化石墨烯的聚集，已经有几例采用化学材料接枝法，其中交联剂的使用包括聚多巴胺、Fe3O4和银纳米颗(AgNPs)，但银纳米颗的细胞毒性值得警惕。
本文成功制备了一系列氧化石墨烯膜-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子敷料，并在体外对其抗菌性能进行了系统研究。此外，还研究了它们对小鼠创伤愈合的实际作用。所得结果对氧化石墨烯敷料的进一步研究具有指导意义。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了氧化石墨烯膜-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子复合敷料制备及创面愈合方法。
本发明提出的氧化石墨烯-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子复合敷料制备，包括如下步骤：
S1准备A组氧化石墨烯膜：氧化石墨烯膜购买自南京先锋纳米有限公司(货号：100027，CAS号：7440-44-0，参数：尺寸:9x9cm厚度：约25微米)；
S2制备氧化石墨烯-多巴胺膜：
S21在100mL去离子水中加入131.14g tris盐酸溶解，得到的tris溶液中加入多巴胺粉200mg，得到tris-多巴胺溶液，浓度为2mg/mL,pH值为8.5；
S22将S1中的氧化石墨烯膜浸泡在上述溶液中12h后，将混合物转移到振动筛中，在37℃下以100r/min的速度振动；
S3制备B组氧化石墨烯-溶菌酶样品：
先将达托霉素粉溶解于去离子水中，制备10mg/mL的碱性成纤维细胞生长因子水溶液，再将S1中的氧化石墨烯样品，经去离子水仔细清洗，孵育在达托霉素水溶液中，其中孵育温度37℃；震动速度:100r/min；孵化时间,12h。
S4制备C组氧化石墨烯膜-碱性成纤维细胞生长因子：将S2中制备好的氧化石墨烯-多巴胺膜，溶解在10μg/ml的碱性成纤维细胞生长因子溶液中，孵育温度37℃；震动速度:100r/min；孵化时间,12h；
S5制备D组氧化石墨烯-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子：将氧化石墨烯膜-多巴胺加入到S3和S4步骤中相同浓度的达托霉素+ 表皮生长因子混合物中，孵育温度37℃；震动速度:100r/min；孵化时间,12h，制备得氧化石墨烯-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子。
氧化石墨烯-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子复合敷料的创面愈合方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1扫描电镜观察材料表面结构：将A组和D组样品进行喷金，并彻底干燥，然后用扫描电镜仪器在真空中观察得到的薄膜，详细地拍摄孔径结构；
S2傅里叶红外光谱观察材料合成成分：将制备的样品在600cm-1 -4000cm-1波数范围内，通过傅里叶红外光谱测量表征其化学结构；
S3接触角测试仪观察材料亲疏水性：ABCD四组样本被放置水平，每个材料表面均滴1μL去离子水，封闭静置12h，用形成的液滴测量接触角，每个样品测试三次，得到平均角度值；
S4评估材料体外抗菌性：将大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌体培养、扩增至1×109CFU/mL的密度，再经LB稀释至1×104CFU/mL的密度，提取100mL菌液。采用96孔板，将ABCD 每个样本放置3个孔，每孔滴入200μL菌液，孵化24小时，37℃孵化温度。采用分光光度计评估菌液变化，细菌原液标准OD值设为 0.7，24h后再次行OD值检测，观察不同材料对细菌原液影响。
S5评估材料体外细胞毒性：原代成纤维细胞来源于正常的新生小鼠，并进一步将细胞传代至第二代和第三代。采用96孔板进行细胞计数及培养，2000个细胞/孔，将每组样品与血管内皮细胞共同培养，每组3孔。第1、3、5、7天依次检测，37℃条件下孵化后加上LB培养基溶液中(150μL/孔)，上述操作一式三份；
S6评估材料促细胞迁移能力：将血管内皮细胞接种于24孔板(2 ×104/孔)后，使用DMEM培养基培养，使用枪头划出一道划痕，并记录时间为0h，将ABCD四组材料与该细胞进行共培养，用活细胞工作站显微镜进行24小时观察，在单个实验中，每组设置6个重复，使用ImageJ 1.48V软件(美国NIH公司)进行具体测量，上述操作一式三份；
S7小鼠创面模型建立及不同材料对创面愈合影响：小鼠的腹腔内注射戊巴比妥钠(1％,70μL/g)麻醉，然后使用打孔器建立全层皮肤缺损模型，缺损面积直径0.6厘米，每个创面滴加细菌溶液(5μL 108/毫升)培养大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，用75％的酒精对材料进行消毒，用磷酸缓冲盐溶液漂洗彻底去除杂质，然后，在伤口上涂上准备好的薄膜，然后用粘胶毛巾固定，伤后1、3、5、7天拍照更换材料，采用山东贝诺医药生物科技有限公司【国家发明专利号 ZL200620082586.1】采购的市售甲壳素敷料(CCD)作为阳性对照；
S8创面愈合计算：比较创面愈合前后创面面积，计算愈合率，采用IPP6.0软件辅助，根据“感兴趣区域”(AOI)功能选择目标创面面积，我们用“大小计数”方法测量像素面积，伤口面积可按伤口愈合率＝(创面面积-愈合一定时间后的创面面积)/创面面积×100％的公式计算；
S9创面蛋白表达：创面使用材料敷贴第7天后用Wester Blot 方法检测PCNA及CD31表达。即在小鼠全层创面缺损创面中取样约 10mm×10mm的小方块，包括表皮和肉芽组织，并将其立即置于液氮中冷冻，随后裂解提取蛋白。抗CD31抗体(货号：ab28364,品牌：Abcam,生产地：UK)和抗PCNA抗体(货号：ab15497,品牌：Abcam, 生产地：UK)均按1:1000稀释，抗tubulin抗体(品牌：Sungene,生产地：China)按1:2000稀释，所有抗体在使用前一晚维持在4℃，将HRP(中国中山生物公司)标记的山羊抗兔二抗1:2000稀释，与样品在25℃孵育1h，在TBST中洗涤5次后，将收获的PDVF膜送化学发光检测(美国Thermal Scientific)；
S10通过Origin软件，采用单因素方差分析和双因素方差分析分别分析两组之间和两组以上的显著性差异，实验数据以均数±标准差表示，P<0.05被认为有统计学意义。
本发明中，所述氧化石墨烯-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子复合敷料制备及创面愈合方法，粘附复合材料中的离子在氧化石墨烯膜 -溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子(D组)中沉淀，傅里叶红外光谱分析提示溶菌酶和碱性成纤维细胞生长因子可能粘附在氧化石墨烯膜上，接触角试验表明，材料的亲水性逐渐增加，B、D组体外抗菌活性相似，优于A、C组(抗菌性能相近)；4个实验组均优于对照组(P> 0.05)，另一方面，C组和D组在1-7天内均能有效促进细胞增殖(P< 0.05)，且细胞迁移活性相似，高于A组和B组(彼此接近)；实验组均优于对照组(P<0.05)。此外，通过监测PCNA和CD31的表达水平， D组标本在覆盖皮肤缺损时可促进血管生成和细胞繁殖(P<0.05)，伤后7天，A、B、C、D组分别为对照组、试验组，愈合率分别为40.3％、 53.0％、67.8％、62.7％、75.4％；
本发明在成功制备氧化石墨烯膜-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子敷料的基础上，样品较好地实现了抗菌作用和促生长作用，对创面愈合有很大的益处。
附图说明
图1a为氧化石墨烯膜原理图，b为A、D组代表性扫描电镜图像；
图2为接触角(θ)的A组(氧化石墨烯膜)、B(氧化石墨烯-溶菌酶),C(氧化石墨烯-碱性成纤维细胞生长因子)、D(氧化石墨烯- 溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子)图；
图3为抗菌活性测定图；
图4a为在0～24h内观察不同分组对细胞迁移的影响图，b为不同群体的迁移百分比图，c为细胞增殖情况统计图；
图5为Western blot检测创面全层组织中CD31和PCNA的表达图；
图6为感染创面愈合的影响a创面愈合图，b为创面愈合3,7天的统计数据图，c为创面完全愈合所需的时间图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
参照图1-6，氧化石墨烯-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子复合敷料制备，包括如下步骤：
S1准备A组氧化石墨烯膜：氧化石墨烯膜购买自南京先锋纳米有限公司(货号：100027，CAS号：7440-44-0，参数：尺寸:9x9cm厚度：约25微米)；
S2制备氧化石墨烯-多巴胺膜：
S21在100mL去离子水中加入131.14g tris盐酸溶解，得到的tris溶液中加入多巴胺粉200mg，得到tris-多巴胺溶液，浓度为2mg/mL,pH值为8.5；
S22将S1中的氧化石墨烯膜浸泡在上述溶液中12h后，将混合物转移到振动筛中，在37℃下以100r/min的速度振动；
S3制备B组氧化石墨烯-溶菌酶样品：
先将达托霉素粉溶解于去离子水中，制备10mg/mL的碱性成纤维细胞生长因子水溶液，再将S1中的氧化石墨烯样品，经去离子水仔细清洗，孵育在达托霉素水溶液中，其中孵育温度37℃；震动速度:100r/min；孵化时间,12h。
S4制备C组氧化石墨烯膜-碱性成纤维细胞生长因子：将S2中制备好的氧化石墨烯-多巴胺膜，溶解在10μg/ml的碱性成纤维细胞生长因子溶液中，孵育温度37℃；震动速度:100r/min；孵化时间,12h；
S5制备D组氧化石墨烯-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子：将氧化石墨烯膜-多巴胺加入到S3和S4步骤中相同浓度的达托霉素+ 表皮生长因子混合物中，孵育温度37℃；震动速度:100r/min；孵化时间,12h，制备得氧化石墨烯-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子。
氧化石墨烯-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子复合敷料的创面愈合方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1扫描电镜观察材料表面结构：将A组和D组样品进行喷金，并彻底干燥，然后用扫描电镜仪器在真空中观察得到的薄膜，详细地拍摄孔径结构；
S2傅里叶红外光谱观察材料合成成分：将制备的样品在600cm-1 -4000cm-1波数范围内，通过傅里叶红外光谱测量表征其化学结构；
S3接触角测试仪观察材料亲疏水性：ABCD四组样本被放置水平，每个材料表面均滴1μL去离子水，封闭静置12h，用形成的液滴测量接触角，每个样品测试三次，得到平均角度值；
S4评估材料体外抗菌性：将大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌体培养、扩增至1×109CFU/mL的密度，再经LB稀释至1×104CFU/mL的密度，提取100mL菌液。采用96孔板，将ABCD 每个样本放置3个孔，每孔滴入200μL菌液，孵化24小时，37℃孵化温度。采用分光光度计评估菌液变化，细菌原液标准OD值设为 0.7，24h后再次行OD值检测，观察不同材料对细菌原液影响。
S5评估材料体外细胞毒性：原代成纤维细胞来源于正常的新生小鼠，并进一步将细胞传代至第二代和第三代。采用96孔板进行细胞计数及培养，2000个细胞/孔，将每组样品与血管内皮细胞共同培养，每组3孔。第1、3、5、7天依次检测，37℃条件下孵化后加上LB培养基溶液中(150μL/孔)，上述操作一式三份；
S6评估材料促细胞迁移能力：将血管内皮细胞接种于24孔板(2 ×104/孔)后，使用DMEM培养基培养，使用枪头划出一道划痕，并记录时间为0h，将ABCD四组材料与该细胞进行共培养，用活细胞工作站显微镜进行24小时观察，在单个实验中，每组设置6个重复，使用ImageJ 1.48V软件(美国NIH公司)进行具体测量，上述操作一式三份；
S7小鼠创面模型建立及不同材料对创面愈合影响：小鼠的腹腔内注射戊巴比妥钠(1％,70μL/g)麻醉，然后使用打孔器建立全层皮肤缺损模型，缺损面积直径0.6厘米，每个创面滴加细菌溶液(5μL 108/毫升)培养大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，用75％的酒精对材料进行消毒，用磷酸缓冲盐溶液漂洗彻底去除杂质，然后，在伤口上涂上准备好的薄膜，然后用粘胶毛巾固定，伤后1、3、5、7天拍照更换材料，采用山东贝诺医药生物科技有限公司【国家发明专利号 ZL200620082586.1】采购的市售甲壳素敷料(CCD)作为阳性对照；
S8创面愈合计算：比较创面愈合前后创面面积，计算愈合率，采用IPP6.0软件辅助，根据“感兴趣区域”(AOI)功能选择目标创面面积，我们用“大小计数”方法测量像素面积，伤口面积可按伤口愈合率＝(创面面积-愈合一定时间后的创面面积)/创面面积×100％的公式计算；
S9创面蛋白表达：创面使用材料敷贴第7天后用Wester Blot 方法检测PCNA及CD31表达。即在小鼠全层创面缺损创面中取样约 10mm×10mm的小方块，包括表皮和肉芽组织，并将其立即置于液氮中冷冻，随后裂解提取蛋白。抗CD31抗体(货号：ab28364,品牌：Abcam,生产地：UK)和抗PCNA抗体(货号：ab15497,品牌：Abcam, 生产地：UK)均按1:1000稀释，抗tubulin抗体(品牌：Sungene,生产地：China)按1:2000稀释，所有抗体在使用前一晚维持在4℃，将HRP(中国中山生物公司)标记的山羊抗兔二抗1:2000稀释，与样品在25℃孵育1h，在TBST中洗涤5次后，将收获的PDVF膜送化学发光检测(美国Thermal Scientific)；
S10通过Origin软件，采用单因素方差分析和双因素方差分析分别分析两组之间和两组以上的显著性差异，实验数据以均数±标准差表示，P<0.05被认为有统计学意义。
本发明：氧化石墨烯膜的原理图如图1a所示，可以看出，A组氧化石墨烯膜中完整的氧化石墨烯结构保存较好，在高倍镜下可以清晰地观察到结构，D组氧化石墨烯膜溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子样品中，D1仍保留片状结构，D2发生纹理变化，D3进一步显示出嵌入的溶菌酶/多巴胺。白色和红色箭头分别表示溶菌酶球和多巴胺层；
当严重伤害发生在皮肤上时，一个有效的伤口闭合是至关重要的，因为它有利于防止微生物入侵和能量、电解质或体液的损失。伤口敷料具有广泛的功能，如加速伤口愈合，重建皮肤屏障，保护或准备后续手术的。优良的选矿材料应具有良好的生物相容性，对水蒸气具有足够的渗透性，并具有较强的机械性能。此外，这些材料应该为伤口愈合过程创造无菌、适宜的微环境，以避免炎症或感染带来的不良影响。最近有报道说氧化石墨烯纳米薄片具有抗菌活性。当然，也有研究报道氧化石墨烯对抗菌性能有微弱甚至不利的影响。为此，本研究通过多巴胺凝胶反应制备氧化石墨烯-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子纳米复合敷料，证实氧化石墨烯膜的抗菌活性。
图1a是氧化石墨烯膜的示意图。可以看出，原始的氧化石墨烯结构在A组氧化石墨烯膜中得到了完整的保存，在高倍镜下观察到清晰的纹理。D组氧化石墨烯膜溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子样品在D1中仍可见片状结构，D2中规则和纹理发生变化，D3中嵌入的溶菌酶/多巴胺层进一步析出。此外，白色和红色箭头分别表示溶菌酶和多巴胺层。这种现象是由于氧化石墨烯膜结构随反应前的变化而变化，使溶菌酶层有效地附着在膜上。平均接触角(θ)为A组(101.18 ±11.42)°为、B组(86.53±9.17)°,C组(76.13±8.43)°和D组(67.99±7.60)°。显然,样品的亲水性逐渐增加。根据早期的研究，氧化石墨烯可以通过破坏细胞膜或诱导氧化应激来达到较高的抗菌活性，而溶菌酶可以通过扰乱细胞膜来达到同样的效果。然后，我们想知道氧化石墨烯溶菌酶样品是否具有同等甚至促进的抗菌作用。由于革兰氏阴性菌对氧化石墨烯溶菌酶的耐药性通常高于革兰氏阳性菌，因此选择大肠杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行后续抗菌机制的研究。结果表明，氧化石墨烯纳米片与溶菌酶协同作用可获得较好的抗菌性能。具体来说，一方面，氧化石墨烯薄片可以与目标细菌相互作用，包裹住它们的细胞膜；另一方面，氧化石墨烯的存在使接枝的溶菌酶充分接触到菌膜，使更多的溶菌酶能够集中在目标菌周围。24小时培养金黄色葡萄球菌和大肠杆菌导致测定样品的抗菌活性是按照以下顺序:D组≈B组>C组≈A组(P>0.05,图3),这项研究证明溶菌酶复合氧化石墨烯膜可有效改善材料的抗菌性。虽然革兰氏阳性菌可以通过水解细胞肽聚糖在n-乙酰-胞壁酸和n-乙酰-d- 氨基葡萄糖之间的1,4键而被溶菌酶大量抑制，但由于脂多糖的保护作用，革兰氏阴性菌只能在一定程度上被杀菌。最近进行了大量研究，通过以微丸、纳米颗粒和微胶囊的形式制造溶菌酶来提高其抗菌效果。例如，通过在PTFE膜上加载溶菌酶，可使微球菌的水解活性达到3.5U/cm2。酶负荷密度越高，灭菌效果越好。在本研究中，溶菌酶与气孔之间通过多巴胺胶的完全粘附，创造了一个理想的持续释放的微环境来对抗革兰氏阴性菌。
细胞增殖抑制的考验(图4)表明,C和D组可以有效地促进1-7 天的细胞增殖(P<0.05),并且同样能促进体外细胞迁移。溶菌酶以蛋白为原始来源，由于其安全性和天然特性[24]，在食品保鲜领域享有很高的知名度。我们知道，急性放射性皮炎等总是伴随着体表的损伤，即我们的防御屏障被破坏，随之而来的是我们的免疫能力下降。广泛的组织坏死和细菌侵袭会引起创面感染，一直是放疗常见并发症。图6中分别为对照组、A组、B组、C组、D组的7天创面愈合率分别为40.3％、53.0％、67.8％、62.7％、75.4％,与对照组比较，D组可有效促进创面愈合，差异有统计学意义(P<0.05)。因此，D组、B 组、C组、A组和对照组完全恢复所需的平均霜量分别从8.5天增加到9.1天、9.6天、10.1天和10.3天。在伤口愈合的过程中，伤口会与上皮细胞的形成一起收缩。由于人类是皮肤致密的物种，重新上皮化作用是伤口愈合的主要驱动力。在溶菌酶的作用下，巨噬细胞的功能增强，人体抵抗力增强，对药物的抗性减弱。一些研究人员已经证明溶葡萄球菌素是一种有效的伤口感染治疗药物，在高溶菌酶复合浓度下，经一次至五次应用，可完全清除有害微生物，从而显示出令人满意的杀菌能力。然而，重新上皮化也可以通过其他途径实现。例如，通过血管生成，肉芽组织可以修复或再生，提供必要的营养和氧气。因此，我们也监测了PCNA和CD31的表达水平。结果表明，D组皮肤损伤标本应用能促进血管生成和细胞增殖(P<0.05)；因此，伤口愈合的速度可以大大提高。同时，本研究也存在一定的局限性。因此，改进修饰材料的制备方法，提高氧化石墨烯膜的稳定性，提高对革兰氏阴性菌的治疗效果至关重要。此外，下一步我们将把抗菌物质/生长因子与不同类型的氧化石墨烯膜结合起来，从而获得最理想的用于伤口治疗和感染预防的敷料。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.氧化石墨烯-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子复合敷料制备，其特征在于，包括如下步骤：
S1准备A组氧化石墨烯膜：氧化石墨烯膜购买自南京先锋纳米有限公司(货号：100027，CAS号：7440-44-0，参数：尺寸:9x9cm厚度：约25微米)；
S2制备氧化石墨烯-多巴胺膜：
S21在100mL去离子水中加入131.14g tris盐酸溶解，得到的tris溶液中加入多巴胺粉200mg，得到tris-多巴胺溶液，浓度为2mg/mL,pH值为8.5；
S22将S1中的氧化石墨烯膜浸泡在上述溶液中12h后，将混合物转移到振动筛中，在37℃下以100r/min的速度振动；
S3制备B组氧化石墨烯-溶菌酶样品：
先将达托霉素粉溶解于去离子水中，制备10mg/mL的碱性成纤维细胞生长因子水溶液，再将S1中的氧化石墨烯样品，经去离子水仔细清洗，孵育在达托霉素水溶液中，其中孵育温度37℃；震动速度:100r/min；孵化时间,12h；
S4制备C组氧化石墨烯膜-碱性成纤维细胞生长因子：将S2中制备好的氧化石墨烯-多巴胺膜，溶解在10μg/ml的碱性成纤维细胞生长因子溶液中，孵育温度37℃；震动速度:100r/min；孵化时间,12h；
S5制备D组氧化石墨烯-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子：将氧化石墨烯膜-多巴胺加入到S3和S4步骤中相同浓度的达托霉素+表皮生长因子混合物中，孵育温度37℃；震动速度:100r/min；孵化时间,12h，制备得氧化石墨烯-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子。
2.氧化石墨烯-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子复合敷料的创面愈合方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1扫描电镜观察材料表面结构：将A组和D组样品进行喷金，并彻底干燥，然后用扫描电镜仪器在真空中观察得到的薄膜，详细地拍摄孔径结构；
S2傅里叶红外光谱观察材料合成成分：将制备的样品在600cm-1-4000cm-1波数范围内，通过傅里叶红外光谱测量表征其化学结构；
S3接触角测试仪观察材料亲疏水性：ABCD四组样本被放置水平，每个材料表面均滴1μL去离子水，封闭静置12h，用形成的液滴测量接触角，每个样品测试三次，得到平均角度值；
S4评估材料体外抗菌性：将大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌体培养、扩增至1×109CFU/mL的密度，再经LB稀释至1×104CFU/mL的密度，提取100mL菌液。采用96孔板，将ABCD每个样本放置3个孔，每孔滴入200μL菌液，孵化24小时，37℃孵化温度。采用分光光度计评估菌液变化，细菌原液标准OD值设为0.7，24h后再次行OD值检测，观察不同材料对细菌原液影响；
S5评估材料体外细胞毒性：原代成纤维细胞来源于正常的新生小鼠，并进一步将细胞传代至第二代和第三代。采用96孔板进行细胞计数及培养，2000个细胞/孔，将每组样品与血管内皮细胞共同培养，每组3孔。第1、3、5、7天依次检测，37℃条件下孵化后加上LB培养基溶液中(150μL/孔)，上述操作一式三份；
S6评估材料促细胞迁移能力：将血管内皮细胞接种于24孔板(2×104/孔)后，使用DMEM培养基培养，使用枪头划出一道划痕，并记录时间为0h，将ABCD四组材料与该细胞进行共培养，用活细胞工作站显微镜进行24小时观察，在单个实验中，每组设置6个重复，使用ImageJ1.48V软件(美国NIH公司)进行具体测量，上述操作一式三份；
S7小鼠创面模型建立及不同材料对创面愈合影响：小鼠的腹腔内注射戊巴比妥钠(1％,70μL/g)麻醉，然后使用打孔器建立全层皮肤缺损模型，缺损面积直径0.6厘米，每个创面滴加细菌溶液(5μL108/毫升)培养大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，用75％的酒精对材料进行消毒，用磷酸缓冲盐溶液漂洗彻底去除杂质，然后，在伤口上涂上准备好的薄膜，然后用粘胶毛巾固定，伤后1、3、5、7天拍照更换材料，采用山东贝诺医药生物科技有限公司【国家发明专利号ZL200620082586.1】采购的市售甲壳素敷料(CCD)作为阳性对照；
S8创面愈合计算：比较创面愈合前后创面面积，计算愈合率，采用IPP6.0软件辅助，根据“感兴趣区域”(AOI)功能选择目标创面面积，我们用“大小计数”方法测量像素面积，伤口面积可按伤口愈合率＝(创面面积-愈合一定时间后的创面面积)/创面面积×100％的公式计算；
S9创面蛋白表达：创面使用材料敷贴第7天后用Wester Blot方法检测PCNA及CD31表达。即在小鼠全层创面缺损创面中取样约10mm×10mm的小方块，包括表皮和肉芽组织，并将其立即置于液氮中冷冻，随后裂解提取蛋白。抗CD31抗体(货号：ab28364,品牌：Abcam,生产地：UK)和抗PCNA抗体(货号：ab15497,品牌：Abcam,生产地：UK)均按1:1000稀释，抗tubulin抗体(品牌：Sungene,生产地：China)按1:2000稀释，所有抗体在使用前一晚维持在4℃，将HRP(中国中山生物公司)标记的山羊抗兔二抗1:2000稀释，与样品在25℃孵育1h，在TBST中洗涤5次后，将收获的PDVF膜送化学发光检测(美国Thermal Scientific)；
S10通过Origin软件，采用单因素方差分析和双因素方差分析分别分析两组之间和两组以上的显著性差异，实验数据以均数±标准差表示，P<0.05被认为有统计学意义。
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