CN105327406A - 一种制备多层载肝素还原氧化石墨烯涂层的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种制备多层载肝素还原氧化石墨烯涂层的方法，包括以下步骤：S1、在生物材料表面制备多聚赖氨酸涂层；S2、制备载肝素的还原氧化石墨烯溶液；S3、制备单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层；S4、将步骤S3制备得到的生物材料交替浸没到多聚赖氨酸溶液及载肝素还原氧化石墨烯溶液中，分别依次吸附，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层。本发明的有益效果是：实现材料表面抗凝血性能的显著提升。
Description
技术领域
本发明涉及制备氧化石墨烯涂层的方法，尤其涉及一种制备多层载肝素还原氧化石墨烯涂层的方法。
背景技术
生物材料及植入性医疗器械在提高人体健康和预防疾病等方面具有重要应用，然而，对血液接触材料以及血管内植入医疗器械来说，材料与血液之间的相互作用引发的凝血反应可能会引发血栓形成等一系列的副反应及临床并发症，最终导致植入失败，因此，材料的表面性能对植入成败往往具有决定性的作用，表面改性是提高材料血液相容性的关键技术。
肝素是一种具有优异抗凝血性能的葡萄糖胺，在体内外均具有优异的抗凝血效果，已经广泛应用于血液接触材料的表面改性，材料表面肝素化也是抗凝血生物材料以及与血液接触医疗器械表面改性的研究重点和热点。
现有的材料表面肝素化方法主要有共价固定法和离子结合法。
共价固定法是采用各种手段(如，等离子体处理、表面自组装、臭氧化等)在材料表面引入可反应基团，利用基团与肝素中羧基或者羟基的反应将肝素引入到材料表面，但是由于化学反应容易破坏肝素的抗凝生物活性。
离子结合法也称为静电吸附法，是利用各种手段对材料进行表面处理引入正电荷，从而可以吸附带负电荷的肝素，然而这种方法表面肝素结合较弱，肝素量也较少，抗凝效果尤其是长期抗凝效果不佳。
氧化石墨烯是一种具有巨大比面积的纳米材料，在生物材料与医疗器械方面具有十分重要的潜在应用，具有较好的生物相容性。其巨大的比表面积作为药物载体材料具有载药量大、药物活性高等特点，同时，由于其特殊的表面结构，可以与特定结构分子发生π-π相互作用、疏水性相互作用等，另外，由于氧化石墨烯通常带有负电荷，还可以与带有正电荷的材料或分子发生静电相互作用。
肝素的线性链结构中的五元环结构可以与石墨烯表面发生疏水性相互作用，从而使石墨烯表面携带肝素，并且由于肝素带有负电荷，形成的载肝素的石墨烯呈现出负电性，可以与正电荷的材料表面发生层层自组装作用，因此可以使材料表面肝素携带量显著增加，提高材料或器械的抗凝血效果尤其是长期抗凝血效果。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明提供了一种制备多层载肝素还原氧化石墨烯涂层的方法，通过该方法构建多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层，显著提高材料的抗凝血效果，尤其是长期抗凝血效果。
本发明提供了一种制备多层载肝素还原氧化石墨烯涂层的方法，包括以下步骤：
S1、在生物材料表面制备多聚赖氨酸涂层，将生物材料首先浸没在多巴胺盐酸盐溶液中反应，重复多次得到聚多巴胺涂层，然后将制备得到的生物材料浸没到多聚赖氨酸溶液中反应，得到多聚赖氨酸涂层；
S2、制备载肝素的还原氧化石墨烯溶液，配置氧化石墨烯溶液，加入还原剂充分反应，离心干燥后分散成还原氧化石墨烯溶液，并与等体积的肝素钠溶液充分混合反应，离心干燥后重新分散成载肝素还原氧化石墨烯溶液；
S3、制备单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层，将步骤S1制备得到的生物材料浸没到步骤S2中的载肝素还原氧化石墨烯溶液中充分吸附，干燥后得到单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层；
S4、将步骤S3制备得到的生物材料交替浸没到多聚赖氨酸溶液及载肝素还原氧化石墨烯溶液中，分别依次吸附，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层。
作为本发明的进一步改进，在步骤S1中，将生物材料首先浸没在1-5mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中反应6-24小时，重复三次得到聚多巴胺涂层，然后将制备得到的生物材料浸没到5-10mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应4-24小时，得到多聚赖氨酸涂层。
作为本发明的进一步改进，在步骤S2中，配置0.1-2mg/ml的氧化石墨烯溶液，加入还原剂充分反应2-12小时，离心干燥后分散成0.1-2mg/ml还原氧化石墨烯溶液，并与等体积的浓度为1-10mg/ml的肝素钠溶液充分混合反应2-8小时，离心干燥后重新分散成1-5mg/ml的载肝素还原氧化石墨烯溶液。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中的还原氧化石墨烯的还原剂为硼氢化钠或肼。
作为本发明的进一步改进，所述还原剂的加入量为氧化石墨烯质量的10-50％。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中的还原反应的温度为60-120℃。
作为本发明的进一步改进，在步骤S3中，将步骤S1制备得到的生物材料浸没到步骤S2中的载肝素还原氧化石墨烯溶液中充分吸附0.5-2小时，干燥后得到单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层。
作为本发明的进一步改进，在步骤S4中，将步骤S3制备得到的生物材料交替浸没到多聚赖氨酸溶液及载肝素还原氧化石墨烯溶液中，分别依次吸附0.5-2小时，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层。
作为本发明的进一步改进，所述生物材料是金属材料、非金属材料或者高分子材料中的任意一种。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中的多巴胺盐酸盐溶液的pH值为8-8.5。
本发明的有益效果是：通过上述方案，步骤S1中的多巴胺分子中的儿茶酚基团可以与任意材料基底形成配位键结合，并进一步通过自聚反应在材料表面形成牢固的多巴胺涂层，该涂层具有二次反应性，可以与多聚赖氨酸溶液中的氨基发生西弗碱反应从而形成带正电荷的多聚赖氨酸涂层；通过步骤S2的技术方法形成带负电荷的载肝素石墨烯分散液，从而通过静电吸附固定在多聚赖氨酸涂层表面；通过步骤S3的交替吸附，可以在生物材料表面层层自组装得到多层结构的载肝素石墨烯涂层，从而实现材料表面抗凝血性能的显著提升。
附图说明
图1是本发明一种制备单层载肝素还原氧化石墨烯涂层的方法的流程示意图，将图1所示步骤制备得到的单层载肝素还原氧化石墨烯涂层交替浸没到多聚赖氨酸溶液和载肝素的还原氧化石墨烯溶液中，即可获得本发明所要制备的多层载肝素还原氧化石墨涂层。
图2为生物材料(a)(本例为医用钛合金)及氧化石墨烯涂层(b)以及载肝素的还原氧化石墨烯(c)表面的血小板粘附情况的对照示意图。
图3是典型的生物材料表面载肝素石墨烯涂层的拉曼光谱图。
具体实施方式
下面结合附图说明及具体实施方式对本发明进一步说明。
如图1所示，本发明公开了一种在生物材料表面制备多层载肝素还原氧化石墨烯涂层的方法，首先在生物材料表面制备多聚赖氨酸(PLL)涂层，然后吸附载肝素的还原氧化石墨烯(He-rGO)，进而交替吸附PLL和He-rGO，得到具有多层结构的载肝素还原氧化石墨烯涂层。采用本发明的方法对生物材料或医疗器械进行表面处理，可以赋予材料优异的抗凝血性能，在血液接触材料或者血管内植入性医疗器械方面获得应用。
实施实例1：依以下步骤对材料表面进行处理
(1)在生物材料表面制备PLL涂层，将清洗干燥后的样品首先浸没在1mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中，用NaOH调节pH值到8-8.5，常温下反应24小时后用蒸馏水充分清洗后干燥，重复这一步骤三次，得到聚多巴胺涂层，然后将制备的材料浸没到5mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应4小时，样品取出后用蒸馏水充分清洗干燥后得到PLL涂层。
(2)制备载肝素的还原氧化石墨烯溶液，首先配置0.1mg/ml的氧化石墨烯溶液，取20ml氧化石墨烯溶液加入0.2mg一水合肼，80℃充分搅拌反应2小时，离心干燥得到还原氧化石墨烯，重新超声分散成0.1mg/ml的溶液，加入等体积的浓度为1mg/ml的肝素钠溶液充分混合2小时，离心后重新分散成载肝素还原氧化石墨烯溶液(He-rGO)。
(3)将具有PLL涂层的材料浸没1mg/ml的He-rGO溶液中吸附30分钟，蒸馏水清洗后干燥，得到单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层(PLL/He-rGO)。
(4)将具有PLL/He-rGO涂层的材料再次浸没到5mg/ml的PLL溶液中吸附30分钟，蒸馏水清洗，干燥后浸没到1mg/ml的He-rGO溶液中，吸附30分钟后蒸馏水清洗、干燥，不断重复上述步骤，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层((PLL/He-rGO)n)。
实施实例2：依以下步骤对材料表面进行处理
(1)在生物材料表面制备PLL涂层，将清洗干燥后的样品首先浸没在1mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中，用NaOH调节pH值到8-8.5，常温下反应12小时后用蒸馏水充分清洗后干燥，重复这一步骤三次，得到聚多巴胺涂层，然后将制备的材料浸没到8mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应24小时，样品取出后用蒸馏水充分清洗干燥后得到PLL涂层。
(2)制备载肝素的还原氧化石墨烯溶液，首先配置0.1mg/ml的氧化石墨烯溶液，取20ml氧化石墨烯溶液加入0.6mg硼氢化钠，120℃充分搅拌反应8小时，离心干燥得到还原氧化石墨烯，重新超声分散成0.5mg/ml的溶液，加入等体积的浓度为5mg/ml的肝素钠溶液充分混合4小时，离心后重新分散成载肝素还原氧化石墨烯溶液(He-rGO)。
(3)将具有PLL涂层的材料浸没2mg/ml的He-rGO溶液中吸附30分钟，蒸馏水清洗后干燥，得到单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层(PLL/He-rGO)。
(4)将具有PLL/He-rGO涂层的材料再次浸没到8mg/ml的PLL溶液中吸附30分钟，蒸馏水清洗，干燥后浸没到2mg/ml的He-rGO溶液中，吸附30分钟后蒸馏水清洗、干燥，不断重复上述步骤，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层((PLL/He-rGO)n)。
实施实例3：依以下步骤对材料表面进行处理
(1)在生物材料表面制备PLL涂层，将清洗干燥后的样品首先浸没在1mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中，用NaOH调节pH值到8-8.5，常温下反应24小时后用蒸馏水充分清洗后干燥，重复这一步骤三次，得到聚多巴胺涂层，然后将制备的材料浸没到10mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应12小时，样品取出后用蒸馏水充分清洗干燥后得到PLL涂层。
(2)制备载肝素的还原氧化石墨烯溶液，首先配置0.1mg/ml的氧化石墨烯溶液，取20ml氧化石墨烯溶液加入1mg硼氢化钠，120℃充分搅拌反应8小时，离心干燥得到还原氧化石墨烯，重新超声分散成2mg/ml的溶液，加入等体积的浓度为5mg/ml的肝素钠溶液充分混合8小时，离心后重新分散成载肝素还原氧化石墨烯溶液(He-rGO)。
(3)将具有PLL涂层的材料浸没5mg/ml的He-rGO溶液中吸附1小时，蒸馏水清洗后干燥，得到单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层(PLL/He-rGO)。
(4)将具有PLL/He-rGO涂层的材料再次浸没到10mg/ml的PLL溶液中吸附1小时，蒸馏水清洗，干燥后浸没到5mg/ml的He-rGO溶液中，吸附1小时后蒸馏水清洗、干燥，不断重复上述步骤，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层((PLL/He-rGO)n)。
实施实例4：依以下步骤对材料表面进行处理
(1)在生物材料表面制备PLL涂层，将清洗干燥后的样品首先浸没在1mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中，用NaOH调节pH值到8-8.5，常温下反应6小时后用蒸馏水充分清洗后干燥，重复这一步骤三次，得到聚多巴胺涂层，然后将制备的材料浸没到8mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应4小时，样品取出后用蒸馏水充分清洗干燥后得到PLL涂层。
(2)制备载肝素的还原氧化石墨烯溶液，首先配置1mg/ml的氧化石墨烯溶液，取20ml氧化石墨烯溶液加入2mg一水合肼，80℃充分搅拌反应4小时，离心干燥得到还原氧化石墨烯，重新超声分散成0.1mg/ml的溶液，加入等体积的浓度为1mg/ml的肝素钠溶液充分混合6小时，离心后重新分散成载肝素还原氧化石墨烯溶液(He-rGO)。
(3)将具有PLL涂层的材料浸没5mg/ml的He-rGO溶液中吸附2小时，蒸馏水清洗后干燥，得到单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层(PLL/He-rGO)。
(4)将具有PLL/He-rGO涂层的材料再次浸没到8mg/ml的PLL溶液中吸附2小时，蒸馏水清洗，干燥后浸没到5mg/ml的He-rGO溶液中，吸附2小时后蒸馏水清洗、干燥，不断重复上述步骤，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层((PLL/He-rGO)n)。
实施实例5：依以下步骤对材料表面进行处理
(1)在生物材料表面制备PLL涂层，将清洗干燥后的样品首先浸没在2mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中，用NaOH调节pH值到8-8.5，常温下反应6小时后用蒸馏水充分清洗后干燥，重复这一步骤三次，得到聚多巴胺涂层，然后将制备的材料浸没到5mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应12小时，样品取出后用蒸馏水充分清洗干燥后得到PLL涂层。
(2)制备载肝素的还原氧化石墨烯溶液，首先配置0.1mg/ml的氧化石墨烯溶液，取20ml氧化石墨烯溶液加入0.6mg一水合肼，60℃充分搅拌反应6小时，离心干燥得到还原氧化石墨烯，重新超声分散成0.1mg/ml的溶液，加入等体积的浓度为5mg/ml的肝素钠溶液充分混合2小时，离心后重新分散成载肝素还原氧化石墨烯溶液(He-rGO)。
(3)将具有PLL涂层的材料浸没1mg/ml的He-rGO溶液中吸附30分钟，蒸馏水清洗后干燥，得到单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层(PLL/He-rGO)。
(4)将具有PLL/He-rGO涂层的材料再次浸没到5mg/ml的PLL溶液中吸附30分钟，蒸馏水清洗，干燥后浸没到1mg/ml的He-rGO溶液中，吸附30分钟后蒸馏水清洗、干燥，不断重复上述步骤，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层((PLL/He-rGO)n)。
实施实例6：依以下步骤对材料表面进行处理
(1)在生物材料表面制备PLL涂层，将清洗干燥后的样品首先浸没在2mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中，用NaOH调节pH值到8-8.5，常温下反应24小时后用蒸馏水充分清洗后干燥，重复这一步骤三次，得到聚多巴胺涂层，然后将制备的材料浸没到8mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应4小时，样品取出后用蒸馏水充分清洗干燥后得到PLL涂层。
(2)制备载肝素的还原氧化石墨烯溶液，首先配置1mg/ml的氧化石墨烯溶液，取20ml氧化石墨烯溶液加入10mg硼氢化钠，80℃充分搅拌反应12小时，离心干燥得到还原氧化石墨烯，重新超声分散成0.1mg/ml的溶液，加入等体积的浓度为1mg/ml的肝素钠溶液充分混合8小时，离心后重新分散成载肝素还原氧化石墨烯溶液(He-rGO)。
(3)将具有PLL涂层的材料浸没2mg/ml的He-rGO溶液中吸附1小时，蒸馏水清洗后干燥，得到单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层(PLL/He-rGO)。
(4)将具有PLL/He-rGO涂层的材料再次浸没到8mg/ml的PLL溶液中吸附1小时，蒸馏水清洗，干燥后浸没到2mg/ml的He-rGO溶液中，吸附1小时后蒸馏水清洗、干燥，不断重复上述步骤，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层((PLL/He-rGO)n)。
实施实例7：依以下步骤对材料表面进行处理
(1)在生物材料表面制备PLL涂层，将清洗干燥后的样品首先浸没在2mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中，用NaOH调节pH值到8-8.5，常温下反应12小时后用蒸馏水充分清洗后干燥，重复这一步骤三次，得到聚多巴胺涂层，然后将制备的材料浸没到8mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应12小时，样品取出后用蒸馏水充分清洗干燥后得到PLL涂层。
(2)制备载肝素的还原氧化石墨烯溶液，首先配置1mg/ml的氧化石墨烯溶液，取20ml氧化石墨烯溶液加入2mg一水合肼，60℃充分搅拌反应12小时，离心干燥得到还原氧化石墨烯，重新超声分散成1mg/ml的溶液，加入等体积的浓度为5mg/ml的肝素钠溶液充分混合6小时，离心后重新分散成载肝素还原氧化石墨烯溶液(He-rGO)。
(3)将具有PLL涂层的材料浸没5mg/ml的He-rGO溶液中吸附2小时，蒸馏水清洗后干燥，得到单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层(PLL/He-rGO)。
(4)将具有PLL/He-rGO涂层的材料再次浸没到8mg/ml的PLL溶液中吸附2小时，蒸馏水清洗，干燥后浸没到5mg/ml的He-rGO溶液中，吸附2小时后蒸馏水清洗、干燥，不断重复上述步骤，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层((PLL/He-rGO)n)。
实施实例8：依以下步骤对材料表面进行处理
(1)在生物材料表面制备PLL涂层，将清洗干燥后的样品首先浸没在2mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中，用NaOH调节pH值到8-8.5，常温下反应24小时后用蒸馏水充分清洗后干燥，重复这一步骤三次，得到聚多巴胺涂层，然后将制备的材料浸没到10mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应4小时，样品取出后用蒸馏水充分清洗干燥后得到PLL涂层。
(2)制备载肝素的还原氧化石墨烯溶液，首先配置1mg/ml的氧化石墨烯溶液，取20ml氧化石墨烯溶液加入6mg硼氢化钠，80℃充分搅拌反应8小时，离心干燥得到还原氧化石墨烯，重新超声分散成0.5mg/ml的溶液，加入等体积的浓度为10mg/ml的肝素钠溶液充分混合6小时，离心后重新分散成载肝素还原氧化石墨烯溶液(He-rGO)。
(3)将具有PLL涂层的材料浸没2mg/ml的He-rGO溶液中吸附2小时，蒸馏水清洗后干燥，得到单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层(PLL/He-rGO)。
(4)将具有PLL/He-rGO涂层的材料再次浸没到10mg/ml的PLL溶液中吸附2小时，蒸馏水清洗，干燥后浸没到2mg/ml的He-rGO溶液中，吸附2小时后蒸馏水清洗、干燥，不断重复上述步骤，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层((PLL/He-rGO)n)。
实施实例9：依以下步骤对材料表面进行处理
(1)在生物材料表面制备PLL涂层，将清洗干燥后的样品首先浸没在5mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中，用NaOH调节pH值到8-8.5，常温下反应6小时后用蒸馏水充分清洗后干燥，重复这一步骤三次，得到聚多巴胺涂层，然后将制备的材料浸没到5mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应4小时，样品取出后用蒸馏水充分清洗干燥后得到PLL涂层。
(2)制备载肝素的还原氧化石墨烯溶液，首先配置2mg/ml的氧化石墨烯溶液，取20ml氧化石墨烯溶液加入20mg一水合肼，120℃充分搅拌反应4小时，离心干燥得到还原氧化石墨烯，重新超声分散成2mg/ml的溶液，加入等体积的浓度为10mg/ml的肝素钠溶液充分混合8小时，离心后重新分散成载肝素还原氧化石墨烯溶液(He-rGO)。
(3)将具有PLL涂层的材料浸没1mg/ml的He-rGO溶液中吸附30分钟，蒸馏水清洗后干燥，得到单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层(PLL/He-rGO)。
(4)将具有PLL/He-rGO涂层的材料再次浸没到5mg/ml的PLL溶液中吸附30分钟，蒸馏水清洗，干燥后浸没到1mg/ml的He-rGO溶液中，吸附30分钟后蒸馏水清洗、干燥，不断重复上述步骤，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层((PLL/He-rGO)n)。
实施实例10：依以下步骤对材料表面进行处理
(1)在生物材料表面制备PLL涂层，将清洗干燥后的样品首先浸没在5mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中，用NaOH调节pH值到8-8.5，常温下反应12小时后用蒸馏水充分清洗后干燥，重复这一步骤三次，得到聚多巴胺涂层，然后将制备的材料浸没到8mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应4小时，样品取出后用蒸馏水充分清洗干燥后得到PLL涂层。
(2)制备载肝素的还原氧化石墨烯溶液，首先配置2mg/ml的氧化石墨烯溶液，取20ml氧化石墨烯溶液加入4mg硼氢化钠，80℃充分搅拌反应12小时，离心干燥得到还原氧化石墨烯，重新超声分散成0.5mg/ml的溶液，加入等体积的浓度为10mg/ml的肝素钠溶液充分混合4小时，离心后重新分散成载肝素还原氧化石墨烯溶液(He-rGO)。
(3)将具有PLL涂层的材料浸没2mg/ml的He-rGO溶液中吸附1小时，蒸馏水清洗后干燥，得到单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层(PLL/He-rGO)。
(4)将具有PLL/He-rGO涂层的材料再次浸没到8mg/ml的PLL溶液中吸附1小时，蒸馏水清洗，干燥后浸没到2mg/ml的He-rGO溶液中，吸附1小时后蒸馏水清洗、干燥，不断重复上述步骤，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层((PLL/He-rGO)n)。
实施实例11：依以下步骤对材料表面进行处理
(1)在生物材料表面制备PLL涂层，将清洗干燥后的样品首先浸没在5mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中，用NaOH调节pH值到8-8.5，常温下反应24小时后用蒸馏水充分清洗后干燥，重复这一步骤三次，得到聚多巴胺涂层，然后将制备的材料浸没到8mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应4小时，样品取出后用蒸馏水充分清洗干燥后得到PLL涂层。
(2)制备载肝素的还原氧化石墨烯溶液，首先配置2mg/ml的氧化石墨烯溶液，取20ml氧化石墨烯溶液加入12mg硼氢化钠，120℃充分搅拌反应2小时，离心干燥得到还原氧化石墨烯，重新超声分散成0.1mg/ml的溶液，加入等体积的浓度为5mg/ml的肝素钠溶液充分混合2小时，离心后重新分散成载肝素还原氧化石墨烯溶液(He-rGO)。
(3)将具有PLL涂层的材料浸没5mg/ml的He-rGO溶液中吸附2小时，蒸馏水清洗后干燥，得到单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层(PLL/He-rGO)。
(4)将具有PLL/He-rGO涂层的材料再次浸没到8mg/ml的PLL溶液中吸附2小时，蒸馏水清洗，干燥后浸没到5mg/ml的He-rGO溶液中，吸附2小时后蒸馏水清洗、干燥，不断重复上述步骤，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层((PLL/He-rGO)n)。
实施实例12：依以下步骤对材料表面进行处理
(1)在生物材料表面制备PLL涂层，将清洗干燥后的样品首先浸没在5mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中，用NaOH调节pH值到8-8.5，常温下反应24小时后用蒸馏水充分清洗后干燥，重复这一步骤三次，得到聚多巴胺涂层，然后将制备的材料浸没到10mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应24小时，样品取出后用蒸馏水充分清洗干燥后得到PLL涂层。
(2)制备载肝素的还原氧化石墨烯溶液，首先配置1mg/ml的氧化石墨烯溶液，取20ml氧化石墨烯溶液加入10mg一水合肼，60℃充分搅拌反应12小时，离心干燥得到还原氧化石墨烯，重新超声分散成0.1mg/ml的溶液，加入等体积的浓度为5mg/ml的肝素钠溶液充分混合2小时，离心后重新分散成载肝素还原氧化石墨烯溶液(He-rGO)。
(3)将具有PLL涂层的材料浸没5mg/ml的He-rGO溶液中吸附2小时，蒸馏水清洗后干燥，得到单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层(PLL/He-rGO)。
(4)将具有PLL/He-rGO涂层的材料再次浸没到10mg/ml的PLL溶液中吸附2小时，蒸馏水清洗，干燥后浸没到5mg/ml的He-rGO溶液中，吸附2小时后蒸馏水清洗、干燥，不断重复上述步骤，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层((PLL/He-rGO)n)。
实施实例13：依以下步骤对材料表面进行处理
(1)在生物材料表面制备PLL涂层，将清洗干燥后的样品首先浸没在1mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中，用NaOH调节pH值到8-8.5，常温下反应12小时后用蒸馏水充分清洗后干燥，重复这一步骤三次，得到聚多巴胺涂层，然后将制备的材料浸没到5mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应12小时，样品取出后用蒸馏水充分清洗干燥后得到PLL涂层。
(2)制备载肝素的还原氧化石墨烯溶液，首先配置0.5mg/ml的氧化石墨烯溶液，取20ml氧化石墨烯溶液加入1mg一水合肼，60℃充分搅拌反应4小时，离心干燥得到还原氧化石墨烯，重新超声分散成0.1mg/ml的溶液，加入等体积的浓度为1mg/ml的肝素钠溶液充分混合4小时，离心后重新分散成载肝素还原氧化石墨烯溶液(He-rGO)。
(3)将具有PLL涂层的材料浸没1mg/ml的He-rGO溶液中吸附30分钟，蒸馏水清洗后干燥，得到单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层(PLL/He-rGO)。
(4)将具有PLL/He-rGO涂层的材料再次浸没到5mg/ml的PLL溶液中吸附30分钟，蒸馏水清洗，干燥后浸没到1mg/ml的He-rGO溶液中，吸附30分钟后蒸馏水清洗、干燥，不断重复上述步骤，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层((PLL/He-rGO)n)。
实施实例14：依以下步骤对材料表面进行处理
(1)在生物材料表面制备PLL涂层，将清洗干燥后的样品首先浸没在1mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中，用NaOH调节pH值到8-8.5，常温下反应12小时后用蒸馏水充分清洗后干燥，重复这一步骤三次，得到聚多巴胺涂层，然后将制备的材料浸没到8mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应12小时，样品取出后用蒸馏水充分清洗干燥后得到PLL涂层。
(2)制备载肝素的还原氧化石墨烯溶液，首先配置0.5mg/ml的氧化石墨烯溶液，取20ml氧化石墨烯溶液加入3mg一水合肼，60℃充分搅拌反应4小时，离心干燥得到还原氧化石墨烯，重新超声分散成0.1mg/ml的溶液，加入等体积的浓度为1mg/ml的肝素钠溶液充分混合4小时，离心后重新分散成载肝素还原氧化石墨烯溶液(He-rGO)。
(3)将具有PLL涂层的材料浸没2mg/ml的He-rGO溶液中吸附1小时，蒸馏水清洗后干燥，得到单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层(PLL/He-rGO)。
(4)将具有PLL/He-rGO涂层的材料再次浸没到8mg/ml的PLL溶液中吸附1小时，蒸馏水清洗，干燥后浸没到2mg/ml的He-rGO溶液中，吸附1小时后蒸馏水清洗、干燥，不断重复上述步骤，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层((PLL/He-rGO)n)。
实施实例15：依以下步骤对材料表面进行处理
(1)在生物材料表面制备PLL涂层，将清洗干燥后的样品首先浸没在2mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中，用NaOH调节pH值到8-8.5，常温下反应12小时后用蒸馏水充分清洗后干燥，重复这一步骤三次，得到聚多巴胺涂层，然后将制备的材料浸没到8mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应12小时，样品取出后用蒸馏水充分清洗干燥后得到PLL涂层。
(2)制备载肝素的还原氧化石墨烯溶液，首先配置0.5mg/ml的氧化石墨烯溶液，取20ml氧化石墨烯溶液加入5mg硼氢化钠，60℃充分搅拌反应4小时，离心干燥得到还原氧化石墨烯，重新超声分散成0.1mg/ml的溶液，加入等体积的浓度为1mg/ml的肝素钠溶液充分混合4小时，离心后重新分散成载肝素还原氧化石墨烯溶液(He-rGO)。
(3)将具有PLL涂层的材料浸没2mg/ml的He-rGO溶液中吸附2小时，蒸馏水清洗后干燥，得到单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层(PLL/He-rGO)。
(4)将具有PLL/He-rGO涂层的材料再次浸没到8mg/ml的PLL溶液中吸附2小时，蒸馏水清洗，干燥后浸没到2mg/ml的He-rGO溶液中，吸附2小时后蒸馏水清洗、干燥，不断重复上述步骤，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层((PLL/He-rGO)n)。
图1为生物材料表面单层载肝素还原氧化石墨烯涂层的制备方法示意图，主要包括的步骤为：(1)制备正电性的多聚赖氨酸涂层；(2)制备载肝素的还原氧化石墨烯；(3)制备载肝素的还原氧化石墨烯。图1制备得到了单层载肝素还原氧化石墨烯涂层，在此基础上重复交替沉积PLL和载肝素的还原氧化石墨烯，即可得到本发明所要制备的多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层。
图2为对照生物材料(a)(本例为医用钛合金)及氧化石墨烯涂层(b)以及载肝素的还原氧化石墨烯(c)表面的血小板粘附情况，可以看出，表面装载肝素后显著减少了血小板粘附，并且表面石墨烯清晰可见，表面血液相容性提高。
本发明提供的一种制备多层载肝素还原氧化石墨烯涂层的方法具有以下优点：
一、本发明采用的多巴胺可以在几乎所有材料表面形成稳定的化学键合，其后续的步骤也较为简单，因此，本发明的技术路线几乎适用于所有生物材料的表面改性。
二、本发明的所有反应体系均可以在水溶液中进行，对各种生物材料表面几乎都没有损伤，因此，使用面广，实现容易。
三、本发明充分利用了石墨烯具有巨大比表面积的这一特点，显著提高了材料表面肝素的载入量，同时，由于是疏水性相互作用，并不破坏肝素的抗凝生物活性。
三、本发明采用的正电荷物质为多聚赖氨酸，具有显著的促细胞生长作用以及抗菌作用，因此，本发明的技术方案不仅可以显著提高生物材料的抗凝血性能，而且可以促进细胞生长以及赋予材料一定的抗菌能力。
四、本发明采用的技术方案为层层自组装，表面肝素量可以通过自组装层数控制，肝素释放行为可以通过PLL涂层控制。
五、由于本发明的技术步骤都是在溶液中进行，因此，本发明的技术方案对复杂形状的生物材料也适合，可以适用于血管支架、医用导管等复杂形状的医疗器械的表面改性。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种制备多层载肝素还原氧化石墨烯涂层的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、在生物材料表面制备多聚赖氨酸涂层，将生物材料首先浸没在多巴胺盐酸盐溶液中反应，重复多次得到聚多巴胺涂层，然后将制备得到的生物材料浸没到多聚赖氨酸溶液中反应，得到多聚赖氨酸涂层；
S2、制备载肝素的还原氧化石墨烯溶液，配置氧化石墨烯溶液，加入还原剂充分反应，离心干燥后分散成还原氧化石墨烯溶液，并与等体积的肝素钠溶液充分混合反应，离心干燥后重新分散成载肝素还原氧化石墨烯溶液；
S3、制备单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层，将步骤S1制备得到的生物材料浸没到步骤S2中的载肝素还原氧化石墨烯溶液中充分吸附，干燥后得到单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层；
S4、将步骤S3制备得到的生物材料交替浸没到多聚赖氨酸溶液及载肝素还原氧化石墨烯溶液中，分别依次吸附，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层。
2.根据权利要求1所述的制备多层载肝素还原氧化石墨烯涂层的方法，其特征在于：在步骤S1中，将生物材料首先浸没在1-5mg/ml的多巴胺盐酸盐溶液中反应6-24小时，重复三次得到聚多巴胺涂层，然后将制备得到的生物材料浸没到5-10mg/ml的多聚赖氨酸溶液中反应4-24小时，得到多聚赖氨酸涂层。
3.根据权利要求1所述的制备多层载肝素还原氧化石墨烯涂层的方法，其特征在于：在步骤S2中，配置0.1-2mg/ml的氧化石墨烯溶液，加入还原剂充分反应2-12小时，离心干燥后分散成0.1-2mg/ml还原氧化石墨烯溶液，并与等体积的浓度为1-10mg/ml的肝素钠溶液充分混合反应2-8小时，离心干燥后重新分散成1-5mg/ml的载肝素还原氧化石墨烯溶液。
4.根据权利要求1或3所述的制备多层载肝素还原氧化石墨烯涂层的方法，其特征在于：步骤S2中的还原氧化石墨烯的还原剂为硼氢化钠或肼。
5.根据权利要求4所述的制备多层载肝素还原氧化石墨烯涂层的方法，其特征在于：所述还原剂的加入量为氧化石墨烯质量的10-50％。
6.根据权利要求4所述的制备多层载肝素还原氧化石墨烯涂层的方法，其特征在于：步骤S2中的还原反应的温度为60-120℃。
7.根据权利要求1所述的制备多层载肝素还原氧化石墨烯涂层的方法，其特征在于：在步骤S3中，将步骤S1制备得到的生物材料浸没到步骤S2中的载肝素还原氧化石墨烯溶液中充分吸附0.5-2小时，干燥后得到单层载肝素的还原氧化石墨烯涂层。
8.根据权利要求1所述的制备多层载肝素还原氧化石墨烯涂层的方法，其特征在于：在步骤S4中，将步骤S3制备得到的生物材料交替浸没到多聚赖氨酸溶液及载肝素还原氧化石墨烯溶液中，分别依次吸附0.5-2小时，得到多层载肝素的还原氧化石墨烯涂层。
9.根据权利要求1所述的制备多层载肝素还原氧化石墨烯涂层的方法，其特征在于：所述生物材料是金属材料、非金属材料或者高分子材料中的任意一种。
10.根据权利要求1所述的制备多层载肝素还原氧化石墨烯涂层的方法，其特征在于：步骤S1中的多巴胺盐酸盐溶液的pH值为8-8.5。
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