CN112778772B - 一种抗菌复合水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗菌复合水凝胶的制备方法，包括将水溶性凝胶基材溶于去离子水中，得到基材溶液；将改性透明质酸溶于基材溶液中，得到混合溶液；将银纳米颗粒均匀分散于混合溶液中，然后通过光引发剂在紫外光照射下固化，制得所述抗菌复合水凝胶。本发明的复合水凝胶具有良好生物相容性、抗菌性能、生物降解和力学性能，可用于创面敷料。

Description

一种抗菌复合水凝胶及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于医用生物材料技术领域，具体涉及一种抗菌复合水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
在急性和慢性伤口愈合中，细菌感染的可能增加了死亡和发病的风险。因此，再生疗法面临的主要挑战之一是控制细菌感染，因细菌感染容易引起严重的并发症、神经和血管损伤，尤其是在2型糖尿病等疾病中。因此，在生物医学应用中，对伤口部位的同时止血和抗菌治疗有很大的需求。
现有手段多为采用抗菌药物来抑制伤口感染，且使用的抗菌药物多为抗生素及其衍生物。而频繁使用抗菌药物尤其是使用抗生素类药物，容易引起细菌耐药性问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，而提供一种抗菌复合水凝胶及其制备方法与应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种抗菌复合水凝胶的制备方法，其包括如下步骤：
(1)将水溶性凝胶基材溶于去离子水中，得到基材溶液；
(2)将改性透明质酸溶于步骤(1)得到的基材溶液中，得到混合溶液；
(3)将银纳米颗粒均匀分散于步骤(2)得到的混合溶液中，然后通过光引发剂在紫外光照射下固化，制得所述抗菌复合水凝胶。
优选地，所述水溶性凝胶基材包括甲基丙烯酰胺化明胶和/或甲基丙烯酰胺化细胞质基质。
优选地，所述改性透明质酸为经过表没食子儿茶素没食子酸酯改性的透明质酸。
优选地，所述水溶性凝胶基材与改性透明质酸的质量比为10:1～10:2。
优选地，所述水溶性凝胶基材与改性透明质酸的质量比为10:1。该配比下，制得的复合水凝胶具有较好的力学性能，且降解速度适宜，利于创面修复。
优选地，所述银纳米颗粒在所述混合溶液中的浓度为10～20μg/mL。该浓度下，制得的复合水凝胶具有较好的抗菌性，且细胞毒性较低。
优选地，所述改性透明质酸的制备方法，包括如下步骤：
(1)将氨基乙醛缩二乙醇和表没食子儿茶素没食子酸酯分别溶于溶剂中，然后在搅拌条件下将两者混合，将混合物在室温及避光条件下搅拌过夜；
(2)将步骤(1)的反应产物从反应体系中分离出来，得到表没食子儿茶素没食子酸酯二聚体；
(3)将透明质酸溶于去离子水中，加入N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐进行活化，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺，在氮气保护下滴入步骤(2)得到的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚体的水溶液，反应完成后透析，冻干，制得所述改性透明质酸。
优选地，所述改性透明质酸的制备方法中，步骤(1)使用的溶剂为甲烷磺酸(MSA)和四氢呋喃(THF)的混合物。
优选地，所述改性透明质酸的制备方法中，步骤(2)中的分离方法为：先通过旋转泵将反应体系浓缩，然后在室温下真空干燥过夜，然后用蒸馏水溶解产物，再用乙酸乙酯萃取纯化，过滤后通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，即得所述表没食子儿茶素没食子酸酯二聚体。
优选地，所述改性透明质酸的制备方法中，透明质酸与表没食子儿茶素没食子酸酯二聚体的质量比为5:0.5～5:2；优选为5:1。
优选地，所述银纳米颗粒为以γ-环糊精金属有机骨架作为载体负载银离子的纳米颗粒。
优选地，所述银纳米颗粒采用溶剂浸渍和改性反应扩散法合成。
优选地，所述银纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：将γ-环糊精金属有机骨架晶体悬浮于有机溶剂中，然后浸泡在AgNO3溶液，最后离心、过滤，对固体产物进行洗涤和干燥，即得所述银纳米颗粒。
优选地，所述甲基丙烯酰胺化明胶的制备方法为：将明胶溶于水中，加入甲基丙烯酸酐，反应完全后透析，然后进行脱色处理，离心，过滤，冻干，即得所述甲基丙烯酰胺化明胶。
优选地，甲基丙烯酰胺化细胞质基质的制备方法为：称取8g ECM(细胞质基质)冻干粉，将其溶于100mL质量分数为1％的醋酸水溶液中，将溶解后的ECM溶液于37℃、600rpm条件下按1滴/2s的速度加入4.8mL甲基丙烯酸酐中，持续搅拌反应3小时，反应完毕后，将溶液转移至截留分子量为8000～15000D的透析袋中，用纯水透析3～5天，冻干，得到甲基丙烯酰胺化细胞质基质，记为ECMMA。
优选地，所述细胞质基质为动物软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉，更优选为猪软组织源性细胞外基质纳米纤维微粉。
另一方面，本发明还提供了一种抗菌复合水凝胶，其由上述的抗菌复合水凝胶的制备方法制得。
另一方面，本发明还提供了所述抗菌复合水凝胶在创面敷料中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种创面敷料，其包括所述的抗菌复合水凝胶。
银纳米颗粒(Ag NPs)的杀菌活性主要是通过释放Ag+来破坏细胞膜并干扰DNA复制。Ag NPs的抗菌特性与其粒径的大小相关，直径为1～10nm的超细Ag NPs能与细菌发生优先相互作用。由于超细Ag NP的高表面能、高反应性和强大的内聚性，使其不稳定，在热机械应力下容易聚集或聚结。而γ-环糊精金属有机骨架(CD-MOF)具有直径极小的球形空隙，适合将AgNPs嵌入其孔中，且生物相容，其广泛分布在3D网络中的氢氧根抗衡离子适合还原金属离子。因此，使用CD-MOF进行模板指导的Ag NPs合成，可以实现Ag NPs的固定化和金属离子还原的双重功能。
此外，尽管Ag NPs具有优异的抗菌特性，但当其浓度超过一定范围时，与之共培养的细胞在形态上会发生较大改变，显示明显的细胞毒性。
而表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是从绿茶中提取的多酚物质含量最高的一种水溶性活性成分，其在茶叶中约占到茶叶毛质量的7％～13％，也是茶多酚类物质中最具生理活性的物质。而且EGCG是一种天然物质，具有低副作用。因此，本发明在控制Ag NPs浓度的情况下，复配使用EGCG进行联合抗菌，使复合水凝胶达到优异的抗菌效果及使用安全。
此外，EGCG具有四种能清除自由基的酚官能团。而且EGCG结构中的1，2，3-三羟苯基官能团可被氧化形成反应性醌，这与贻贝启发式粘合剂化学结构相似。因此，可将EGCG嫁接到透明质酸这种生物聚合物上，进而赋予生物材料的粘附性能，同时保持EGCG的治疗效果。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明以紫外光交联材料甲基丙烯酰胺化改性生物材料(GelMA或ECMMA)作为水凝胶的基底，然后通过添加超细纳米银(Ag NPs)及表没食子儿茶素没食子酸酯改性的透明质酸(HA-E)进行联合抗菌，既确保了水凝胶的生物相容性，也确保了水凝胶的抗菌性能。本发明的复合水凝胶具有良好生物相容性、抗菌性能、生物降解和力学性能，可用于创面敷料。
附图说明
图1为CD-MOF的SEM图；
图2为Ag NPs的TEM图；
图3为HA和HA-E的红外光谱图；
图4为Gel和GelMA的核磁氢谱图；
图5为HA和HA-E的核磁氢谱图；
图6为实施例4中四种水凝胶的体外溶胀性能测试结果；
图7为实施例4中四种水凝胶的压缩性能测试结果；
图8为实施例4中四种水凝胶在无溶菌酶条件下的降解曲线；
图9为实施例4中四种水凝胶在有溶菌酶条件下的降解曲线；
图10为实施例5中四种抗菌复合水凝胶对大肠杆菌的抗菌率；
图11为实施例5中四种抗菌复合水凝胶对金黄色葡萄球菌的抗菌率；
图12为实施例5中四种抗菌复合水凝胶对铜绿假单胞菌的抗菌率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
甲基丙烯酰胺化明胶(GelMA)的制备，步骤如下：
称取20g的明胶(Gel)溶解在250mL的蒸馏水中，60℃溶解后，加入12mL的甲基丙烯酸酐，60℃下反应8h，蒸馏水透析3～5日(截留分子量：3500D)，透析完毕后，将溶液于60℃水浴中，加入2g活性炭脱色处理15min，8000rpm离心5min，中性滤纸过滤，-80℃冻干，即得GelMA。
实施例2
银纳米颗粒(Ag NPs)的制备，步骤如下：
(1)CD-MOF的合成：γ-环糊精(γ-CD，97.3g)和氢氧化钾(KOH，33.6g)以1：8的摩尔比溶解在3L的纯净水中。溶液通过0.45μm的膜过滤器过滤后，将其加入反应容器。通过蒸馏装置将甲醇(1.8L)加热，其蒸汽在50℃的水溶液中扩散20min。然后加入聚乙二醇(Mo＝20000，38.4g)，搅拌10min。将溶液在15℃下孵育一夜，以触发结晶。沉淀物用乙醇多次洗涤，在真空炉中40℃烘干过夜，得到CD-MOF晶体。
(2)Ag NPs的合成：采用溶剂浸渍和改性反应扩散法合成Ag NPs。具体为，将CD-MOF晶体(600mg)悬浮在1.5mL乙腈中，然后浸泡在AgNO3溶液(5mL，10mmol L-1)中72h，样品离心，沉淀物用乙腈多次洗涤除去溶解的盐和反应产物。沉淀物在40℃的真空中干燥过夜，得到Ag NPs。
实施例3
改性透明质酸(HA-E)的制备，步骤如下：
将145μL氨基乙醛缩二乙醇溶解在1.2mL 4℃的甲烷磺酸(MSA)和四氢呋喃(THF)的混合物(MSA:THF＝1:5，v/v)中，得到氨基乙醛缩二乙醇混合物。将EGCG(2.29g)溶于3.8mL THF和1.7μL MSA中，然后在搅拌下加入上述氨基乙醛缩二乙醇混合物，在室温及黑暗条件下搅拌一夜。将得到的混合物通过旋转泵浓缩20分钟，并在室温下真空干燥过夜。产物用10mL蒸馏水溶解，用10mL乙酸乙酯萃取纯化5次，有机相用足量的无水硫酸钠除去水分，过滤后通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到EGCG的二聚体。接下来，称取5g透明质酸(HA)，将其溶于100mL去离子水中，加入1.0g N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化15min，再加入1.5g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，继续搅拌15min。然后，在氮气保护下，缓慢滴加10mL上述EGCG二聚体的水溶液(0.1g/mL)，反应12h后，用去离子水透析三天，冻干，得到EGCG改性的透明质酸(HA-E)。
实施例4
水凝胶的制备：
(1)将实施例1制备的GelMA溶于去离子水中，制备成浓度为10％(w/v)的GelMA溶液；
(2)将实施例3制备的HA-E溶于上述GelMA溶液中，分别制备成浓度为0％(w/v)、1％(w/v)、1.5％(w/v)、2％(w/v)的A溶液、B溶液、C溶液和D溶液；
(3)分别向A溶液、B溶液、C溶液和D溶液中加入0.1％(w/v)光引发剂LAP，然后在356nm紫外光照射30s，得到10％GelMA、10％GelMA/1％HA-E、10％GelMA/1.5％HA-E和10％GelMA/2％HA-E四种水凝胶。
实施例5
抗菌复合水凝胶的制备：
将实施例1制备的GelMA溶于去离子水中，制备成浓度为10％(w/v)的GelMA溶液；将实施例3制备的HA-E溶于上述GelMA溶液中，制备成浓度为1％(w/v)的混合溶液。
准备四个样，各个样品装有等量上述制备的混合溶液。向各个样品中分别加入实施例2制备的Ag NPs，Ag NPs在各样品中的浓度依次为0、10、20、40μg/mL，然后分别加入0.1％(w/v)光引发剂LAP，在356nm紫外光照射30s，分别制得Ag浓度为0、10、20、40μg/mL的10％GelMA/1％HA-E/Ag的四种水凝胶。
实验例：
一、扫描电镜(SEM)测试
将实施例2制备的CD-MOF进行扫描电镜(SEM)测试：取10mg CD-MOF,将其均匀的铺洒在导电胶上，对其表面喷金30s后，利用扫描电子显微镜观察水凝胶的表面形貌，如图1所示。从图1中看出，所制备的CD-MOF具有较为规则的晶体结构，整体粒径在200nm左右。
二、透射电镜(TEM)测试
将实施例2制备的Ag NPs进行透射电镜(TEM)测试：将制备的Ag NPs配成1mg mL-1的水溶液，用0.22um滤膜过滤，滤液滴在铜网的碳支持膜上，空气中自然干燥后，置于高分辨透射电镜中观察纳米粒子的总体形貌，如图2所示。从图2中看出，所制备的Ag NPs粒径在10nm左右，且分散性较好，具备超细纳米材料1～10nm的要求。
三、红外测试
红外测试：首先分别称取3～5mg的HA、实施例3制备的HA-E和适量干燥的溴化钾粉末(质量比约为5％)于玛瑙研钵中，充分研磨使两者均匀混合，然后取适量研磨好的样品粉末进行压片(真空压力20mmHg，压片5min)，得到样品薄片，设定扫描范围为4000-500cm-1，利用傅里叶红外光谱仪进行检测，如图3所示。从图3中可看出，相较于HA，HA-E的红外光谱图在1641cm-1和1546cm-1处出现强吸收，分别对应酰胺键上C＝O双键以及EGCG苯环结构中C＝C双键的收缩振动吸收峰，证明EGCG成功接枝于HA上。
四、核磁
以氘代重水作为溶剂，分别称取3～5mg Gel、实施例1制备的GelMA、HA、实施例3制备的HA-E溶解，待溶液完全溶解至澄清后，装入干净的核磁管中，利用核磁共振光谱仪在室温条件下进行核磁结构测定，并采用MestReNova软件进行图谱分析，如图4～5所示。图4为实施例1中Gel和GelMA的核磁氢谱图，GelMA核磁氢谱图中在化学位移为5.64和5.41新出现的吸收峰，对应为甲基丙烯酰胺键烯烃键上氢的吸收峰，可证明Gel改性成功。图5为实施例3中HA和HA-E的核磁氢谱图，HA-E的核磁氢谱图中在化学位移为6.99、6.62和6.15新出现的吸收峰，归属为EGCG结构中苯环上氢的吸收峰，可证明EGCG成功接枝于HA上。
五、体外溶胀性能测试
将400μL水凝胶置于37℃水浴锅中水浴15min后脱模，并测量其初始重量(W0)，然后将样品分别浸泡于37℃PBS缓冲液(pH 7.4)中水化0.3、1、2、3、4、6h，将其取出，用滤纸轻轻擦干表面水分，称取水凝胶以获得其重量(W1)。得到水凝胶的溶胀率(Q)可计算为：
Q＝(W1-W0)/W0×100(％)
根据水凝胶的初始状态，通过测量其直径和厚度来估算水凝胶在水、PBS的膨胀速率。
图6为实施例4中四种水凝胶的体外溶胀性能测试结果，10％GelMA水凝胶的溶胀率在33％左右，添加了HA-E后，水凝胶溶胀度增加，随着HA-E浓度增大，溶胀度也随之增加。过高的溶胀率因水凝胶整体外观发生较大变化而不太适用于创面敷料，因此从溶胀性能来看，10％GelMA/1％HA-E组较为合适，其溶胀率为40％左右，相较于10％GelMA变化不大。
六、压缩性能测试
将48孔板制备的600uL水凝胶样品放于凝胶强度专用探头的正下方，测量水凝胶的初始高度和直径，分别记为h0和d0，凝胶探头对水凝胶进行挤压，直至破裂，记录下压缩过程中的力和变化高度，分别记为F和h1,水凝胶的压缩模量(P)按以下公式计算：
P＝F×h0/(π×d/2×d/2×h1)
根据压缩模量P和应变(h1/h0)作图。
图7为实施例4中四种水凝胶的压缩性能测试结果，从图中可看出，10％GelMA水凝胶组在应变为67％时，水凝胶便破碎了，而添加了HA-E后，水凝胶韧性增加，其中，10％GelMA/1％HA-E组在应变为89％时才破裂，在四组水凝胶中表现出最强的韧性，因此，从压缩强度来看，10％GelMA/1％HA-E组是最为适合用作创面敷料的。
七、降解性能测试
先将达到溶胀平衡后的水凝胶冷冻干燥后称取质量，记为Wo，再将初始的水凝胶浸泡在PBS或含1000U/ml溶菌酶的PBS溶液中，置于恒温摇床(37℃，70rpm)。在测量的时间点(第1、2、3、4、7、10、14、25、33和45天)，取出水凝胶，用超纯水洗涤后冻干，将其冷冻干燥，干燥后准确称取质量，记(Wt)，采用公式计算出支架的重量变化：
重量变化(％)＝Wt/Wo×100％
根据重量变化与时间的关系作图。
图8和图9分别为实施例4中四组水凝胶在无溶菌酶和有溶菌酶条件下的降解曲线，从图中可看出，水凝胶在有溶菌酶条件下的降解速度明显比无溶菌酶条件下的降解速度快，10％GelMA水凝胶组在无酶条件下11天降解完全，而在有酶条件下，仅8天就完全降解了；HA-E的添加会加速水凝胶的降解，且随着HA-E的浓度增加，降解速度也随之增加，水凝胶过快的降解速度不利于创面的修复，其中10％GelMA/1％HA-E组的降解速度跟10％GelMA组相差不大，在有酶条件下基本上7天就降解完了，其降解时间与创面修复的时间较为吻合，相对于10％GelMA/1.5％HA-E和10％GelMA/2％HA-E组来说是跟适合的。
八、体外抗菌试验
用革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌及铜绿假单胞菌评价水凝胶抗菌性能。将抗菌试验中的细菌OD值调整为0.1。水凝胶样品与细菌悬液在37℃的生化培养箱中共培养24h后，对共混菌液进行OD值测量。将100μL的菌悬液稀释后接种在LB琼脂平板上。37℃培养24h后计数可培养菌落数，用公式
AR(％)＝(Ncontrol-Nsample)/Ncontrol×100
计算抗菌率(AR)，其中Ncontrol为对照样品的平均菌落数，Nsample为水凝胶样品的平均细菌菌落数。
图10～12为实施例5中10％GelMA/1％HA-E、10％GelMA/1％HA-E/Ag(10μg/mL)、10％GelMA/1％HA-E/Ag(20μg/mL)、10％GelMA/1％HA-E/Ag(μg/mL)四种抗菌复合水凝胶分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌的抗菌率。从图中可看出，10％GelMA/1％HA-E组水凝胶对三种菌的抗菌率达到75％以上，表明其具有一定的抗菌作用。随着Ag的加入，水凝胶抗菌率增强，当Ag的浓度达到20μg/mL时，水凝胶的抗菌率几乎达到100％，这比其他研究中单纯的Ag的抗菌浓度(32μg/mL)要低，主要归因于HA-E的联合抗菌作用，Ag的使用浓度的降低，也可减弱水凝胶的细胞毒性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种抗菌复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将水溶性凝胶基材溶于去离子水中，得到基材溶液；
(2)将改性透明质酸溶于步骤(1)得到的基材溶液中，得到混合溶液；
(3)将银纳米颗粒均匀分散于步骤(2)得到的混合溶液中，然后通过光引发剂在紫外光照射下固化，制得所述抗菌复合水凝胶；
所述水溶性凝胶基材包括甲基丙烯酰胺化明胶和/或甲基丙烯酰胺化细胞质基质；
所述改性透明质酸为经过表没食子儿茶素没食子酸酯改性的透明质酸；
所述银纳米颗粒为以γ-环糊精金属有机骨架作为载体负载银离子的纳米颗粒，采用溶剂浸渍和改性反应扩散法合成。
2.根据权利要求1所述的抗菌复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述水溶性凝胶基材与改性透明质酸的质量比为10:1～10:2。
3.根据权利要求1所述的抗菌复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述水溶性凝胶基材与改性透明质酸的质量比为10:1。
4.根据权利要求1所述的抗菌复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述银纳米颗粒在所述混合溶液中的浓度为10～20μg/mL。
5.根据权利要求1所述的抗菌复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述改性透明质酸的制备方法，包括如下步骤：
(1)将氨基乙醛缩二乙醇和表没食子儿茶素没食子酸酯分别溶于溶剂中，然后在搅拌条件下将两者混合，将混合物在室温及避光条件下搅拌过夜；
(2)将步骤(1)的反应产物从反应体系中分离出来，得到表没食子儿茶素没食子酸酯二聚体；
(3)将透明质酸溶于去离子水中，加入N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐进行活化，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺，在氮气保护下滴入步骤(2)得到的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚体的水溶液，反应完成后透析，冻干，制得所述改性透明质酸。
6.根据权利要求1所述的抗菌复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述银纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：将γ-环糊精金属有机骨架晶体悬浮于有机溶剂中，然后浸泡在AgNO3溶液，最后离心、过滤，对固体产物进行洗涤和干燥，即得所述银纳米颗粒。
7.一种抗菌复合水凝胶，其特征在于，根据权利要求1～6任一项所述的抗菌复合水凝胶的制备方法制得。
8.根据权利要求7所述的抗菌复合水凝胶在创面敷料中的应用。
9.一种创面敷料，其特征在于，包括权利要求7所述的抗菌复合水凝胶。
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