CN114306210A

CN114306210A - 一种用于口腔牙周组织治疗的ph响应型水凝胶

Info

Publication number: CN114306210A
Application number: CN202111582279.5A
Authority: CN
Inventors: 王冉; 朱元静; 周红波; 朱桐雨
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明涉及口腔治疗技术领域，尤其为一种用于口腔牙周组织治疗的PH响应型水凝胶，其方法包括如下步骤：制备ZIF‑8纳米颗粒，合成ZIF‑8‑EGCG载药体系，检测载药体系在酸性条件下，药物的释放特性，将成功合成的纳米粒用于后续实验。本发明采用EGCG作为药物，以前期制备的具有促进成骨作用的ZIF‑8纳米颗粒作为载体，合成ZIF‑8‑EGCG纳米载药体系，使用可原注射的水凝胶，可最大程度减少牙周手术的创伤，提高了患者的舒适度，其次水凝胶流体状态时可随注射位置而最终形成不定形水凝胶，避免了因不规则形状造成的机体损伤，解决了传统的中药药物，存在化学稳定性较差、易被氧化、生物利用度低等缺点，且手术创伤大，会造成患者不舒服的问题。

Description

一种用于口腔牙周组织治疗的PH响应型水凝胶

技术领域

本发明涉及口腔治疗技术领域，具体为一种用于口腔牙周组织治疗的PH响应型水凝胶。

背景技术

牙周炎是牙周组织的慢性感染性疾病，其特点是牙周组织破坏，牙周袋形成、牙槽骨吸收，最终会导致牙周韧带和牙槽骨的逐步破坏、牙周附着丧失，进而引发牙齿脱落，失去咀嚼功能，通过早期调控炎症反应建立良好的局部免疫环境将有利于骨组织的再生，且若炎症反应持续存在则也会直接影响骨缺损的修复效果，故有效控制炎症并促进牙周支持组织的再生仍是目前临床研究的重要方向。

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是一种从茶叶中提取的天然酚类活性物质，在抗氧化抗炎、抑制牙槽骨吸收、抑制细菌粘附和生物膜形成、保护上皮完整性等方面都有着重要的作用，但是EGCG与其它抗氧化药物一样，存在化学稳定性较差、易被氧化、生物利用度低等缺点，进而限制了其进一步的应用，将EGCG负载于载体可能是解决目前其存在问题的有效方法之一，ZIF-8纳米载体具有较大的孔径和高的比表面积，为高效药物输送提供了可能，且ZIF-8本身具有促成骨分化的特性，故本研究拟将EGCG与ZIF-8构建载药体系，其内部形成稳定的Zn—多酚化合物配位结合，将其复合可原位注射的水凝胶，构建载有EGCG的纳米复合水凝胶控释系统。

负载EGCG纳米颗粒的复合水凝胶系统将给牙周炎等疾病导致的不规则骨缺损的修复治疗带来有效的方法，主要体现在：EGCG可调控炎症-促进成骨；ZIF-8纳米颗粒药物载体可高效载药-控释-促成骨，凝胶系统可原位注射、发挥物理支持及支架作用，具有临床可操作性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于口腔牙周组织治疗的PH响应型水凝胶，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于口腔牙周组织治疗的PH响应型水凝胶，其方法包括如下步骤：

步骤一：制备ZIF-8纳米颗粒，合成ZIF-8-EGCG载药体系，检测载药体系在酸性条件下，药物的释放特性，将成功合成的纳米粒用于后续实验；

步骤二：ZIF-8-EGCG-GelMA水凝胶的合成、表征以及筛选，制备得到ZIF-8-EGCG-GelMA复合水凝胶，对比不同质量比下的复合水凝胶的力学性能和断面形貌，确定最优比例后用于后续实验；

步骤三：在体外进行ZIF-8-EGCG纳米微球细胞水平安全性实验，探讨ZIF-8-EGCG-GelMA水凝胶体外促进成骨分化作用；

步骤四：利用结扎丝建立大鼠牙周炎模型，探讨ZIF-8-EGCG-GelMA水凝胶体内促进成骨分化作用。

优选的，所述步骤一中，分别称取六水合硝酸锌溶液和2-甲基咪唑，并将其各自溶解在置有甲醇的玻璃罐中，将2-甲基咪唑加入至六水合硝酸锌甲醇溶液，搅拌反应3小时，反应结束后，离心收集ZIF-8纳米颗粒，并用甲醇洗三遍，最后真空干燥保存。

优选的，所述步骤一中，室温下，避光称取EGCG粉末溶解于无水乙醇中，超声分散，称取ZIF-8粉末加入到含有EGCG的溶液中，在避光条件下磁力搅拌，摇床震荡，促使EGCG分子充分渗入ZIF-8孔道内部获得最大负载，随后离心收集沉淀，将沉淀无水乙醇清洗3次、过滤、真空干燥后，得到最终产物。

优选的，所述步骤一中，扫描电镜观察载药微球的形态结构、红外光谱分析载药体系的官能团、紫外分光光度计计算微球的包封率和载药率，并检测载药体系在PH＝4.5、5.5、7.4的条件下，EGCG的释放情况、利用ICP检测Zn²⁺的释放，以此证明EGCG是否成功载入ZIF-8纳米颗粒中，将成功合成的载药体系于后续实验。

优选的，所述步骤二中，向GelMA固体海绵中加入PBS，然后置于37℃水浴锅中溶解至透明状液体，接着加入光引发剂，溶解后得到5％W/V的GelMA溶液。

优选的，所述步骤二中，取ZIF-8-EGCG载药体系加入GelMA溶液中，用波长为405nm的蓝光光源手电筒照射1min得到ZIF-8-EGCG浓度为0.5％W/V的GelMA水凝胶，同时制备得到ZIF-8-EGCG-GelMA-1％/1.5％复合水凝胶。

优选的，所述步骤三中，采用LPS刺激RAW264.7细胞建立炎症模型，共培养24h后用qPCR和Westernblot检测炎症相关因子TNF-α、IL-6、IL-1、IL-10的表达情况。

优选的，所述步骤三中，根据实验目的及分组，将含有不同组份的水凝胶均匀涂布于孔板内并光固化，将BMSCs接种于固化后的水凝胶上，用于后续实验。

优选的，所述步骤三中，成骨诱导0d、3d、7d后提取各组细胞RNA和全蛋白，利用Real-timePCR和Westernblot方法检测ALP、OCN、VEGF、β-Catenin、Runx2、OPG及RANKL等基因和蛋白表达水平成骨诱导7d、21d后，做ALP和茜素红染色。

优选的，所述步骤四中，利用结扎丝和LPS注射法建立大鼠牙周炎模型，并通过Micro CT扫描骨量和骨密度分析，组织染色检测缺损区成骨情况。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、本发明采用EGCG作为药物，以前期制备的具有促进成骨作用的ZIF-8纳米颗粒作为载体，利用GelMA建立负载EGCG控释系统，三者协同调控骨再生，使用可原注射的水凝胶，最大程度减少了手术的创伤，提高了患者的舒适度，其次水凝胶流体状态时可随注射位置而最终形成不定形水凝胶，这对于注射型植入生物材料来说尤为重要，避免了因不规则形状造成的机体损伤，解决了传统的中药药物，存在化学稳定性较差、易被氧化、生物利用度低等缺点，且手术创伤大，会造成患者不舒服的问题。

2、本发明根据Zn可与多酚化合物配位结合的特性，将EGCG多酚化合物负载于ZIF-8纳米颗粒中，使EGCG与ZIF-8中的Zn形成稳定的结合，进一步提升EGCG在纳米微球中的载药率，根据炎症微环境酸性的特性，将合成的ZIF-8-EGCG载药体系负载于GelMA水凝胶中，制备PH响应的复合体，使药物能够达到可控释放的目的，精准地到达病变组织区域内，能够释放加载的EGCG同时释放Zn²⁺，使两者协同促进骨修复。

附图说明

图1为本发明水凝胶控释系统流程图；

图2为本发明载药体系合成示意图；

图3为本发明步骤一中检测方法示意图；

图4为本发明步骤二中水凝胶筛选示意图；

图5为本发明促进BMSCs成骨分化示意图；

图6为本发明在炎症微环境下对炎症相关因子调控的示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种用于口腔牙周组织治疗的PH响应型水凝胶，其方法包括如下步骤：

ZIF-8纳米颗粒的形成：分别称取150mg六水合硝酸锌溶液和330mg2-甲基咪唑，并将其各自溶解在置有7.15ml甲醇的玻璃罐中，将2-甲基咪唑加入至六水合硝酸锌甲醇溶液，搅拌反应3小时，反应结束后，离心收集ZIF-8纳米颗粒，并用甲醇洗三遍，最后真空干燥保存。

ZIF-8-EGCG载药体系的合成：室温下，避光称取5mgEGCG粉末溶解于6.25ml无水乙醇中，超声分散5min，称取5mgZIF-8粉末加入到含有EGCG的溶液中，在避光条件下磁力搅拌2h(速度400rpm)，摇床震荡24h，促使EGCG分子充分渗入ZIF-8孔道内部获得最大负载，随后在10000rpm下离心15min收集沉淀，将沉淀无水乙醇清洗3次、过滤、真空干燥后，得到最终产物。

检测：扫描电镜观察载药微球的形态结构、红外光谱分析载药体系的官能团、紫外分光光度计计算微球的包封率和载药率，并检测载药体系在PH＝4.5、5.5、7的条件下，EGCG的释放情况、利用ICP检测Zn²⁺的释放，以此证明EGCG是否成功载入ZIF-8纳米颗粒中，将成功合成的载药体系于后续实验。

向0.5gGelMA固体海绵中加入10mlPBS，然后置于37℃水浴锅中溶解至透明状液体，接着加入0.025g光引发剂(苯基－2，4，6－三甲基苯甲酰磷酸锂，LAP)，溶解后得到5％W/V的GelMA溶液，取5mgZIF-8-EGCG载药体系加入1mlGelMA溶液中，用波长为405nm的蓝光光源手电筒照射1min得到ZIF-8-EGCG浓度为0.5％W/V的GelMA水凝胶(ZIF-8-EGCG-GelMA-0.5％复合水凝胶)，同时制备得到ZIF-8-EGCG-GelMA-1％/1.5％复合水凝胶，对比不同质量比下的复合水凝胶的力学性能和断面形貌，利用大鼠BMSC对ZIF-8-EGCG-GelMA水凝胶的生物相容性及细胞增殖性能进行探究，进而筛选最合适的比例，确定最优比例后用于后续实验。

a.杨氏模量

分别配制ZIF-8-EGCG-GelMA-0％/0.5％/1％/1.5％混合液，取90μL混合液于1mL去头的无菌注射器中，用波长为405nm的蓝光光源手电筒照射2min，成胶后，推出得到直径为5mm，高为5mm的圆柱状水凝胶，之后使用万能力学试验机对所制得的水凝胶样品进行力学压缩测试。

b.扫描电子显微镜

分别配制ZIF-8-EGCG-GelMA-0％/0.5％/1％/1.5％混合液，取1mL混合液于1.5mL的EP管中，用波长为405nm的蓝光光源手电筒照射2min，完全成胶后，通过冻干机冷冻干燥得到干燥的ZIF-8-EGCG-GelMA复合水凝胶固体样本，经液氮脆断后利用导电胶粘于SEM样品台上，喷金后经扫描电子显微镜观察样本断面形貌。

c.细胞骨架染色

配制GelMA溶液，然后经0.22μm的无菌滤头过滤，得到无菌的GelMA溶液，用75％乙醇浸泡ZIF-8-EGCG载药体系24h，然后10000rpm离心15min去除75％乙醇，接着用PBS重悬ZIF-8-EGCG载药体系并浸泡24h，10000rpm离心15min去除PBS，然后重悬于无菌GelMA溶液中制得ZIF-8-EGCG-GelMA-0％/0.5％/1％/1.5％溶液，取300μL混合液于24孔板中，用波长为405nm的蓝光光源手电筒照射1min成胶，每组3重复，无菌PBS洗3遍，然后按照一定的浓度将BMSC种于水凝胶表面，每孔加入1mL含有10％胎牛血清，1％青霉素－链霉素的完全培养基，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24h，然后进行细胞骨架染色，具体步骤如下：吸出培养基，PBS洗3遍，4％多聚甲醛固定40min，PBS洗3遍，0.3％Triton细胞打孔15min，加入3％BSA溶液并置于4℃冰箱中封闭过夜，鬼笔环肽染色1h，PBS洗3遍，DAPI染5min，PBS洗3遍，之后置于倒置荧光显微镜下拍照，通过观察细胞的形态以及物理表征筛选合适的比例进行后期的细胞增殖实验。

d.BMSC在复合水凝胶表面的增殖性能

将筛选的ZIF-8-EGCG-GelMA用于后期的表面增殖性能的检测。

i：采用LPS刺激RAW264.7(单核巨噬细胞)细胞建立炎症模型，共培养24h后用qPCR和Westernblot检测炎症相关因子TNF-α、IL-6、IL-1、IL-10的表达情况。

a.分组：

control组：单纯GelMA+LPS+基础培养液。

ZIF-8组：ZIF-8-GelMA+LPS+基础培养液。

EGCG组：EGCG-GelMA+LPS+基础培养液。

ZIF-8-EGCG组：ZIF-8-EGCG-GelMA+LPS+基础培养液。

b.检测：LPS刺激RAW264.7(单核巨噬细胞)细胞建立炎症模型，共培养24h后用qPCR和Westernblot检测炎症相关因子TNF-α、IL-6、IL-1、IL-10的表达情况。

ii：建立该控释系统与BMSCs共培养体系，探讨该水凝胶在炎症微环境下调控BMSCs成骨分化的作用效果，根据实验目的及分组，将含有不同组份的水凝胶均匀涂布于孔板内并光固化，将BMSCs接种于固化后的水凝胶上，用于后续实验。

a.分组：

ZIF-8组：ZIF-8-GelMA+成骨诱导液。

EGCG组：EGCG-GelMA+成骨诱导液。

ZIF-8-EGCG组：ZIF-8-EGCG-GelMA+成骨诱导液。

b.检测：

成骨诱导0d、3d、7d后提取各组细胞RNA和全蛋白，利用Real-timePCR和Westernblot方法检测ALP、OCN、VEGF、β-Catenin、Runx2、OPG及RANKL等基因和蛋白表达水平成骨诱导7d、21d后，做ALP和茜素红染色。

i：利用结扎丝+LPS注射法建立大鼠牙周炎模型：

分别用正畸结扎丝结扎每只大鼠上颌左侧第一磨牙牙颈部，并每周3次在麻醉下检查结扎情况(未发现结扎丝脱落)，同时在大鼠腭侧第一磨牙和第二磨牙间牙龈乳头下注射10μL的Pg-LPS(1.0mg/mL)，持续2周，建造大鼠实验性牙周炎模型，Micro CT扫描骨量和骨密度分析，组织染色检测缺损区成骨情况。

a.分组：

ZIF-8组：ZIF-8-GelMA水凝胶。

EGCG组：EGCG-GelMA水凝胶。

ZIF-8-EGCG组：ZIF-8-EGCG-GelMA水凝胶。

b.检测：

由第一磨牙腭侧距离龈缘1mm处，从近中向远中倾斜30°进针，深度为2mm，每只大鼠按着分组注射量均为0.2ml，左、右侧各0.1ml，第3周、第5周、第7周重复注射，术后进行Micro CT扫描，进行相关骨量和骨密度分析，制作组织切片，利用HE染色和免疫组化方法检测。

综上可得，根据Zn²⁺可与多酚化合物配位结合的特性，将EGCG多酚化合物负载于ZIF-8纳米颗粒中，使EGCG与ZIF-8中的Zn²⁺形成稳定的结合，进一步提升EGCG在纳米微球中的载药率，根据菌膜微环境酸性的特性，将合成的ZIF-8-EGCG载药体系负载于GelMA水凝胶中，制备PH响应的复合体，使药物能够达到可控释放的目的，精准地到达病变组织区域内，能够释放加载的EGCG同时释放Zn²⁺，使两者协同促进骨修复。

本发明采用EGCG作为药物，以前期制备的具有促进成骨作用的ZIF-8纳米颗粒作为载体，利用GelMA建立负载EGCG控释系统，三者协同调控骨再生，使用可原注射的水凝胶，最大程度减少了手术的创伤，提高了患者的舒适度，其次水凝胶流体状态时可随注射位置而最终形成不定形水凝胶，这对于注射型植入生物材料来说尤为重要，避免了因不规则形状造成的机体损伤，解决了传统的中药药物，存在化学稳定性较差、易被氧化、生物利用度低等缺点，且手术创伤大，会造成患者不舒服的问题。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种用于口腔牙周组织治疗的PH响应型水凝胶，其特征在于：其方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种用于口腔牙周组织治疗的PH响应型水凝胶，其特征在于：所述步骤一中，分别称取六水合硝酸锌溶液和2-甲基咪唑，并将其各自溶解在置有甲醇的玻璃罐中，将2-甲基咪唑加入至六水合硝酸锌甲醇溶液，搅拌反应3小时，反应结束后，离心收集ZIF-8纳米颗粒，并用甲醇洗三遍，最后真空干燥保存。

3.根据权利要求1所述的一种用于口腔牙周组织治疗的PH响应型水凝胶，其特征在于：所述步骤一中，室温下，避光称取EGCG粉末溶解于无水乙醇中，超声分散，称取ZIF-8粉末加入到含有EGCG的溶液中，在避光条件下磁力搅拌，摇床震荡，促使EGCG分子充分渗入ZIF-8孔道内部获得最大负载，随后离心收集沉淀，将沉淀无水乙醇清洗3次、过滤、真空干燥后，得到最终产物。

4.根据权利要求1所述的一种用于口腔牙周组织治疗的PH响应型水凝胶，其特征在于：所述步骤一中，扫描电镜观察载药微球的形态结构、红外光谱分析载药体系的官能团、紫外分光光度计计算微球的包封率和载药率，并检测载药体系在PH＝4.5、5.5、7.4的条件下，EGCG的释放情况、利用ICP检测Zn²⁺的释放，以此证明EGCG是否成功载入ZIF-8纳米颗粒中，将成功合成的载药体系于后续实验。

5.根据权利要求1所述的一种用于口腔牙周组织治疗的PH响应型水凝胶，其特征在于：所述步骤二中，向GelMA固体海绵中加入PBS，然后置于37℃水浴锅中溶解至透明状液体，接着加入光引发剂，溶解后得到5％W/V的GelMA溶液。

6.根据权利要求1所述的一种用于口腔牙周组织治疗的PH响应型水凝胶，其特征在于：所述步骤二中，取ZIF-8-EGCG载药体系加入GelMA溶液中，用波长为405nm的蓝光光源手电筒照射1min得到ZIF-8-EGCG浓度为0.5％W/V的GelMA水凝胶，同时制备得到ZIF-8-EGCG-GelMA-1％/1.5％复合水凝胶。

7.根据权利要求1所述的一种用于口腔牙周组织治疗的PH响应型水凝胶，其特征在于：所述步骤三中，采用LPS刺激RAW264.7细胞建立炎症模型，共培养24h后用qPCR和Westernblot检测炎症相关因子TNF-α、IL-6、IL-1、IL-10的表达情况。

8.根据权利要求1所述的一种用于口腔牙周组织治疗的PH响应型水凝胶，其特征在于：所述步骤三中，根据实验目的及分组，将含有不同组份的水凝胶均匀涂布于孔板内并光固化，将BMSCs接种于固化后的水凝胶上，用于后续实验。

9.根据权利要求1所述的一种用于口腔牙周组织治疗的PH响应型水凝胶，其特征在于：所述步骤三中，成骨诱导0d、3d、7d后提取各组细胞RNA和全蛋白，利用Real-timePCR和Westernblot方法检测ALP、OCN、VEGF、β-Catenin、Runx2、OPG及RANKL等基因和蛋白表达水平成骨诱导7d、21d后，做ALP和茜素红染色。

10.根据权利要求1所述的一种用于口腔牙周组织治疗的PH响应型水凝胶，其特征在于：所述步骤四中，利用结扎丝和LPS注射法建立大鼠牙周炎模型，并通过Micro CT扫描骨量和骨密度分析，组织染色检测缺损区成骨情况。