CN113679891A - 一种zif-8载药水凝胶促成骨支架、制备方法及应用 - Google Patents

一种zif-8载药水凝胶促成骨支架、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于金属‑有机骨架技术领域，公开了一种ZIF‑8载药水凝胶促成骨支架、制备方法及应用，ZIF‑8载药水凝胶促成骨支架的制备方法包括：SIM@ZIF‑8载药体系的构建以及SIM@ZIF‑8/PEGDA/SA水凝胶的构建；所述新型ZIF‑8载药水凝胶促成骨支架为SIM@ZIF‑8/PEGDA/SA。本发明通过原位合成法在ZIF‑8孔隙结构中负载SIM(SIM@ZIF‑8)，改善骨组织生化微环境以达到降脂成骨的双重作用。本发明首次将ZIF‑8负载SIM小分子药物，最终形成的SIM@ZIF‑8体系在高脂条件下降低脂肪形成的同时促进成骨，对于治疗高脂血症引起的骨代谢病具有良好的应用前景。

Description

一种ZIF-8载药水凝胶促成骨支架、制备方法及应用
技术领域
本发明属于金属-有机骨架技术领域，尤其涉及一种ZIF-8载药水凝胶促成骨支架、制备方法及应用。
背景技术
目前，金属-有机骨架(Metal-organic frameworks，MOFs)，是一类以金属离子作为配位中心的新型晶体类材料，具有极高的比表面积，高孔隙率，结构多样性和不饱和的金属配位键，有利于修饰或接枝其他分子物质，近些年在生物医学领域特别是载药领域的应用越来越广泛。ZIF-8是一类具有骨诱导能力的MOF材料，具有良好的稳定性、结构功能可调性，骨诱导性和载药潜能，在组织工程逐渐受到重视。研究结果表明钛的纳米级ZIF-8涂层能有效促进成骨细胞分化和增殖，成骨相关基因如ALP、Runx2、OCN和BMP-2的表达明显增高，并且ZIF-8涂层在体液环境下24小时内能缓慢降解出占自身比例约19.1％的锌离子(Zn2+)，显示出良好的生物相容性，成骨性和抗菌性，可满足骨组织工程的要求。在特定条件下，ZIF-8载药后可具有优良的三级药物缓释动力，即药物分子从孔径中直接释放；药物分子与金属配位中心的配位作用消失后滞后释放；以及伴随ZIF-8降解最终完全释放，并同时释放出自身组分---Zn2+。锌是骨代谢中不可缺少的重要微量元素之一，是ALP、胶原酶的辅助因子，在骨矿化过程中起重要作用。有研究显示Zn2+能增强成骨细胞的增殖及ALP的活性，影响骨桥蛋白、骨钙素的合成，激活细胞外信号调节激酶通路ERK导致Runt相关转录因子-2(Runx2)等成骨相关基因表达水平的变化。另一方面，ZIF-8具有规则的孔径、较高的比表面积及不饱和的金属配位中心，能较好的负载小分子药，并发挥药物缓释作用。
临床上高脂血症与骨质疏松等骨代谢疾病常合并出现，因此，研究者开始寻找脂代谢作用于骨代谢疾病的具体靶点，以达到降低血脂及改善骨代谢疾病的双重作用。研究显示部分降血脂药具有调节骨代谢的功能，其中他汀类降胆固醇药物对骨骼的保护作用具有良好的应用前景。他汀类药物作为HMG-CoA还原酶的特异性抑制剂，是经典有效的降胆固醇药物。根据他汀类药物极性特征，分为亲脂性和相对亲水两类，不同种类对骨骼的影响有所不同。近些年因他汀类药物的成骨性能，使得它在骨修复领域的应用成为研究热点。研究者将他汀类药物通过改性或联合其他材料制备成新型生物复合材料，以期达到降脂，成骨，成血管等多效性能。辛伐他汀(Simvastatin，SIM)作为一种小分子降胆固醇药物，近年来成为骨支架材料内部药物载体的常用负载药物，其促进成骨作用也受到了越来越多的关注。Zhou等得出结论辛伐他汀通过调节自噬流量改善高胆固醇饮食所致的大鼠颌骨微结构缺损。此外，辛伐他汀也具有成血管作用，Liu等研究发现骨内注射辛伐他汀可促进1型糖尿病大鼠内皮祖细胞动员，血管新生及伤口愈合。可见辛伐他汀作为修复高脂血症引起的骨缺损具有潜在前景。最新研究显示，他汀类药物可以通过激活Wnt通路和抑制PPARγ，来促进BMSC向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化，起到治疗脂代谢紊乱引起的骨代谢疾病的作用。SIM可通过激活Wnt/β-catenin以达到促成骨作用，其可上调OCN、OPN等表达，而OCN可作为药物干预对MSCs成骨分化能力影响的参考指标。此外，在骨生化微环境中，Wnt/β-catenin信号通路与成骨细胞分化、增殖和骨形成亦密切相关，其接收来自细胞外基质中的信号分子，可通过促进成骨细胞分化、抑制破骨细胞分化及调控骨细胞功能以提高骨量，促进骨组织再生。
水凝胶作为一种重要的功能材料，由于与天然细胞外基质(ECM)相似的物理结构而被广泛研究。水凝胶的高含水量、低界面张力和高渗透性，为药物的传递、组织的形成提供了独特的环境，并在改善成骨方面显示出良好的效果。本发明开发了一种具有支撑成骨细胞和缓释药物的可注射光固化活性混合水凝胶支架，用于修复不规则骨缺损。这种水凝胶支架是以聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)和海藻酸钠(SA)组成的交联多网络水凝胶支架为基础的。PEGDA是在光引发剂和紫外光存在下在室温下快速凝胶化的一种惰性水凝胶，并且其机械性能可以在大范围模量上变化。作为近些年来用于组织工程和再生医学的新兴支架，PEGDA具有较好的亲水性能及弹性，且可以负载多种生物分子实现药物缓释的作用。海藻酸钠由于其化学控制的材料性质和调节细胞粘附和表型的特性，及其良好的生物相容性，而被广泛研究为促成骨支架。除此之外，海藻酸钠还具有良好的细胞固定能力和可调节的机械性能及粘弹性。但现有技术中将ZIF-8载药体系修饰的水凝胶应用于高脂环境下的骨支架技术方案尚未见报道。因此，急需一种新型的水凝胶促成骨降脂支架及其制备方法。
通过上述分析，骨缺损尤其是高脂血症患者仍是临床治疗的难题，近年来骨组织工程水凝胶支架常用于骨缺损修复，但仍存在某些问题及缺陷：随着人们生活水平的提高，以高脂血症为代表的脂代谢紊乱病逐年升高，且常常伴发骨质疏松等骨代谢疾病；相比于健康患者，上述患者一旦因外伤、肿瘤等因素引起骨缺损，极易发生感染，骨不愈合等情况。现有的修复大块骨缺损的手段仍以自体或异体骨移植为主，对于高脂血症患者则会同时应用降脂药物来改善骨微环境。但其不足之处在于骨量来源受限，会造成供体二次损伤，引起机体的免疫排斥反应及增高传播感染性疾病及并发症发病的风险等。因此，骨缺损仍是临床治疗过程中的难点，尤其是高脂血症患者。目前骨组织工程水凝胶支架作为新兴研究热点，常用于骨缺损修复，可在一定程度上弥补自体骨和异体骨移植的不足。然而，现有的骨组织工程水凝胶材料仍具有以下缺陷:1)机械强度不理想，提供骨细胞生长的力学微环境较差；2)对于不规则骨缺损修复缺乏个性化设计；3)骨诱导性不足，不能充分促进骨再生；4)对于合并系统性疾病(如高脂血症，糖尿病等)的骨缺损修复，缺乏针对性治疗的高效成骨材料。因此，本课题拟在将ZIF-8载药体系修饰的水凝胶应用于高脂环境下的骨支架，用于治疗高脂血症患者的骨相关病。
解决以上问题及缺陷的难度为：1)水凝胶机械性能的提升：由于水凝胶本身的机械性能欠佳，所以本发明的难点之一为：迫切需要寻找力学性能较理想的水凝胶或改性水凝胶用于骨组织工程支架。2)设计个性化支架修复不规则骨缺损：对于不规则缺损，水凝胶的可塑性及交联方式十分重要。3)水凝胶复合支架需具备明显骨诱导性：对水凝胶进行成骨组分的修饰是关键。4)针对性治疗高脂血症患者骨缺损修复材料的研发。
解决以上问题及缺陷的意义为：
作为解决高脂状态下骨相关疾病的问题，促进该类患者的骨愈合，本发明首次将SIM小分子药物负载于ZIF-8晶体中，并用来修饰PEGDA/SA水凝胶，制备一种新型可注射个性化成骨降脂骨组织工程水凝胶复合支架。SIM@ZIF-8不仅具有抑制脂肪形成，促成骨作用，而且PEGDA机械强度及SA粘弹性的可调性，为骨细胞提供良好的力学微环境的同时还可个性化修复不规则骨缺损。因此该发明拟应用于脂代谢紊乱病引起的骨相关疾病。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种ZIF-8载药水凝胶促成骨支架、制备方法及应用。
本发明是这样实现的，一种新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架的制备方法，所述新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架的制备方法包括：SIM@ZIF-8载药体系的构建以及SIM@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶的构建。其步骤包括：首先通过原位合成法将SIM负载于ZIF-8晶格中，洗涤离心，真空干燥48小时，制备成SIM@ZIF-8；其次将上述载药体系按一定比例掺入未光交联的PEGDA水凝胶内进行充分混合搅拌；最后向上述水凝胶混合溶液中加入SA，然后紫外光交联，形成具有一定粘弹性的SIM@ZIF-8/PEGDA/SA可注射复合水凝胶。
进一步，所述SIM@ZIF-8载药体系的构建，包括：
(1)将二甲基咪唑溶于100ml甲醇溶剂中，于室温下活力搅拌，形成透明均匀的溶液；
(2)将Zn(NO3)2·6H2O和SIM溶解在50ml的甲醇溶液中，超声处理5min后搅拌30min；
(3)向步骤(2)得到的溶液中逐滴地加入二甲基咪唑溶液，边加边搅拌，充分搅拌2h；
(4)反应结束后，将所得溶液10000rpm/min离心10min，利用10ml甲醇反复洗涤三次；
(5)将洗涤后的材料于37℃真空干燥48h，最终得到SIM@ZIF-8粉末。
进一步，步骤(1)中，所述二甲基咪唑为3.25g。
进一步，步骤(2)中，所述Zn(NO3)2·6H2O为1.47g，所述SIM为0.15g。
进一步，所述SIM@ZIF-8/开店PEGDA/SA水凝胶的构建，包括：
(1)将20wt％的PEGDA溶解于蒸馏水中，并加入0.05wt％的光引发剂，避光充分搅拌1h；
(2)称取0.5mg/ml的SIM@ZIF-8粉末；加入步骤(1)悬浊液中，避光于37℃恒温充分超声搅拌2h，充分混匀，得到SIM@ZIF-8/PEGDA悬浊液；
(3)将2wt％的SA按比例加入步骤(2)的悬浊液中，避光于37℃剧烈搅拌6h，待充分溶解后，形成SIM@ZIF-8/PEGDA/SA液体；
(4)按0.2ml体积将步骤(3)得到的水凝胶注射到预先制作好的模具内，紫外灯固化5min行水凝胶光交联，最终得到SIM@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶支架产品。
(5)步骤(4)最终材料消毒方法采用20kGy计量的Co60照射4～6h，消毒后备用。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架的制备方法制备得到的新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架，所述新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架为SIM@ZIF-8/PEGDA/SA，其主要成分为：SIM小分子药物，ZIF-8金属-有机骨架材料，PEGDA光交联水凝胶，SA水凝胶。
进一步，所述新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架SIM@ZIF-8/PEGDA/SA中，SIM@ZIF-8载药系统为促成骨降脂的核心成分，PEGDA/SA混合水凝胶的多孔，多网络结构为药物二级缓释的主要部分，同时也提供骨细胞生长的力学微环境。
本发明的另一目的在于提供一种所述的新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架在生物医学领域中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述的新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架在载药领域中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述的新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架在骨组织工程中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架，通过原位合成法在ZIF-8孔隙结构中负载SIM(SIM@ZIF-8)，改善骨组织生化微环境以达到降脂成骨的双重作用。本发明首次将ZIF-8负载SIM小分子药物，最终形成的SIM@ZIF-8体系在高脂条件下降低脂肪形成的同时促进成骨，对于治疗高脂血症引起的骨代谢病具有良好的应用前景。
本发明通过构建ZIF-8/SIM载药系统，使载药体系具有可控的药物缓释性、适宜的生物降解性及良好的生物相容性，可以诱导成骨细胞分化增殖促进骨修复，尤其适用于高脂血症患者；通过构建SIM@ZIF-8/PEGDA/SA生物活性可注射光固化支架，该材料具有多孔多网络结构，良好机械性能，适当降解性，降脂性及骨诱导性；通过体内外实验，初步探明该活性水凝胶支架改善成骨细胞力学微环境及SIM@ZIF-8载药系统改善高脂环境下成骨细胞生化微环境，最终达到降低脂肪，促进成骨的作用，为高脂血症患者的不规则骨修复提供新的思路和方向。
本发明立足于高脂血症环境下不规则骨缺损的修复，着眼于缺损部位的骨微环境，构建PEGDA/SA三维多孔水凝胶支架；聚焦SIM@ZIF-8载药系统对高脂环境下细胞生化微环境的影响，通过构建SIM@ZIF-8/PEGDA/SA生物复合支架以解决高脂环境不规则骨缺损这一难题，为ZIF-8载药系统应用于骨组织工程材料开辟新的研究空间。
本发明利用PEGDA的光引发性能及机械性能，SA的粘弹性，并通过加入SIM@ZIF-8载药体系构建SIM@ZIF-8/PEGDA/SA三维复合可注射光固化生物活性缓释支架，以改善骨细胞生长的生化微环境。在生物活性SIM@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶体系中，PEGDA与SA交联形成第一网络，PEGDA光交联为第二网络，ZIF-8晶体中的Zn2+交联海藻酸钠水凝胶为第三网络，最终构成的多网络，多孔结构不仅可以为骨细胞提供支架，而且可以达到药物的多级缓释作用，使得SIM@ZIF-8发挥更持久的作用。同时作为三维复合水凝胶的核心---SIM@ZIF-8，一方面SIM及其本身长效缓释Zn2+可以促进成骨，另一方面SIM也可以发挥降胆固醇作用。因此，本发明通过光固化交联形成SIM@ZIF-8/PEGDA/SA可注射复合支架，可以研制针对高脂血症的骨缺损材料，达到降脂与成骨的双重作用。
本发明设想将粘弹性可调节的SA混合PEGDA水凝胶，制备的PEGDA/SA水凝胶既能获得适宜粘弹性又能对不规则骨缺损实现水凝胶的可注射。然而，PEGDA/SA作为水凝胶支架材料缺乏骨诱导性，不能充分诱导骨再生，本发明首次将ZIF-8载药系统与PEGDA/SA水凝胶支架相结合，构建三维支架材料---SIM@ZIF-8/PEGDA/SA。该材料的多级网络结构(PEGDA与SA交联形成第一网络，PEGDA光交联为第二网络，ZIF-8晶体中的Zn2+交联海藻酸钠水凝胶为第三网络)，能够为成骨细胞生长提供支架，还可以达到药物的多级缓释作用(ZIF-8释放SIM，Zn2+为一级缓释，PEGDA/SA释放SIM，Zn2+为二级缓释)。因此，本发明设计的SIM@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶光固化复合支架具有骨诱导性、降低脂肪、载药缓释潜能、可注射性，为脂代谢紊乱引起的骨代谢疾病提供重要的理论指导。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的SIM@ZIF-8载药体系的构建方法流程图。
图3是本发明实施例提供的SIM@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶的构建方法流程图。
图4是本发明实施例提供的制备的SIM@ZIF-8载药体系的扫描电镜图(SEM)及透射电镜图(TEM)；其中，图4(a)SEM；图4(b)TEM。
图5是本发明实施例提供的合成SIM@ZIF-8载药体系的XRD及FTIR对比图；其中，图5(a)XRD；图5(b)FTIR。
图6是本发明实施例提供的合成SIM@ZIF-8载药体系高分辨质谱检测图。
图7是本发明实施例提供的合成SIM@ZIF-8载药体系LC-MSMS检测图。
图8是本发明实施例提供的合成SIM@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶支架扫描电镜图。
图9是本发明实施例提供的制备的SIM@ZIF-8/PEGDA/SA细胞相容性分析图。
图10是本发明实施例提供的制备的SIM@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶支架与骨髓间充质干细胞粘附性能图。
图11是本发明实施例提供的制备的SIM@ZIF-8/PEGDA/SA与ZIF-8/PEGDA/SA对骨髓间充质干细胞成骨性对比图。
图12是本发明实施例提供的制备的SIM@ZIF-8/PEGDA/SA与ZIF-8/PEGDA/SA对骨髓间充质干细胞成骨性定量分析图。
图13是本发明实施例提供的制备的SIM@ZIF-8/PEGDA/SA与ZIF-8/PEGDA/SA，PEGDA/SA对骨髓间充质干细胞油红O染色对比图.
图14是本发明实施例提供的制备的SIM@ZIF-8/PEGDA/SA与ZIF-8/PEGDA/SA对骨髓间充质干细胞油红半定量分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种ZIF-8载药水凝胶促成骨支架、制备方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架的制备方法包括：
S101，SIM@ZIF-8载药体系的构建；
S102，SIM@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶的构建。
如图2所示，本发明实施例提供的SIM@ZIF-8载药体系的构建，包括：
S201，将3.25g的二甲基咪唑溶于100ml甲醇溶剂中，于室温下活力搅拌，形成透明均匀的溶液；
S202，将1.47g的Zn(NO3)2·6H2O和0.15g的SIM溶解在50ml的甲醇溶液中，超声处理5min后搅拌30min；
S203，向S202得到的溶液中逐滴地加入二甲基咪唑溶液，边加边搅拌，充分搅拌2h；
S204，反应结束后，将所得溶液10000rpm/min离心10min，利用10ml甲醇反复洗涤三次；
S205，将洗涤后的材料于37℃真空干燥48h，最终得到SIM@ZIF-8粉末。
如图3所示，本发明实施例提供的SIM@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶的构建，包括：
S301，将20wt％的PEGDA溶解于蒸馏水中，并加入0.05wt％的光引发剂，避光充分搅拌1h；
S302，称取0.5mg/ml的SIM@ZIF-8粉末；加入S301悬浊液中，于37℃恒温避光充分超声搅拌2h，充分混匀，得到SIM@ZIF-8/PEGDA悬浊液；
S303，将2wt％的SA按比例加入S302的悬浊液中，避光于37℃剧烈搅拌6h，待充分溶解后，形成SIM@ZIF-8/PEGDA/SA液体；
S304，按0.2ml体积将S303得到的水凝胶注射到预先制作好的模具内，紫外灯固化5min，最终得到SIM@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶支架。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
实施例1
1、为进一步提高材料的骨诱导性及降脂性，充分发挥ZIF-8载药及缓释的优势，本发明通过原位合成法在ZIF-8孔隙结构中负载SIM(SIM@ZIF-8)，改善骨组织生化微环境以达到降脂成骨的双重作用。
本发明利用PEGDA的光引发性能及机械性能，SA的粘弹性，并通过加入SIM@ZIF-8载药体系构建SIM@ZIF-8/PEGDA/SA三维复合可注射光固化生物活性缓释支架，以改善骨细胞生长的生化微环境。在生物活性SIM@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶体系中，PEGDA与SA交联形成第一网络，PEGDA光交联为第二网络，ZIF-8晶体中的Zn2+交联海藻酸钠水凝胶为第三网络，最终构成的多网络，多孔结构不仅可以为骨细胞提供支架，而且可以达到药物的多级缓释作用，使得SIM@ZIF-8发挥更持久的作用。同时作为三维复合水凝胶的核心---SIM@ZIF-8，一方面SIM及其本身长效缓释Zn2+可以促进成骨，另一方面SIM也可以发挥降胆固醇作用。因此，本发明通过光固化交联形成SIM@ZIF-8/PEGDA/SA可注射复合支架，可以研制针对高脂血症的骨缺损材料，达到降脂与成骨的双重作用。
2、一种三维复合可注射光固化生物活性缓释支架SIM@ZIF-8/PEGDA/SA，SIM@ZIF-8载药系统为促成骨降脂的核心成分，PEGDA/SA混合水凝胶的多孔，多网络结构为药物二级缓释的主要部分，同时也提供骨细胞生长的力学微环境。
2.1SIM@ZIF-8载药体系的构建
(1)将3.25g二甲基咪唑溶于100ml甲醇溶剂中，室温下活力搅拌，形成透明均匀的溶液。
(2)Zn(NO3)2·6H2O(1.47g)和SIM(0.15g)溶解在50ml的甲醇溶液中，超声处理5分钟后搅拌30分钟。
(3)向步骤(2)得到的溶液中逐滴地加入二甲基咪唑溶液(边加边搅拌)，充分搅拌2小时。
(4)反应结束后，将所得溶液10000rpm/min离心10min，10ml甲醇反复洗涤三次。
(5)洗涤后的材料37℃真空干燥48小时，最终得到SIM@ZIF-8粉末。
2.2SIM@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶的构建
(1)将20wt％PEGDA溶解于蒸馏水中，并加入0.05wt％的光引发剂，避光充分搅拌1小时。
(2)称取0.5mg/mlSIM@ZIF-8粉末；加入步骤(1)悬浊液中，避光37℃恒温充分超声搅拌2小时，使其充分混匀，得到SIM@ZIF-8/PEGDA悬浊液。
(3)将2wt％的SA按比例加入步骤(2)中，避光37℃剧烈搅拌6小时，待充分溶解后，形成SIM@ZIF-8/PEGDA/SA液体。
(4)按0.2ml体积将步骤(3)得到的水凝胶注射到预先制作好的模具内，紫外灯固化5分钟，最终得到SIM@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶支架。
3、技术效果
3.1本发明立足于高脂血症环境下不规则骨缺损的修复，着眼于缺损部位的骨微环境，构建PEGDA/SA三维多孔水凝胶支架；聚焦SIM@ZIF-8载药系统对高脂环境下细胞生化微环境的影响，通过构建SIM@ZIF-8/PEGDA/SA生物复合支架以解决高脂环境不规则骨缺损这一难题，为ZIF-8载药系统应用于骨组织工程材料开辟新的研究空间。
3.2近些年，随着人口老龄化的增长，以高脂血症为代表的脂代谢异常疾病及骨代谢疾病发病率日益增高，且脂代谢异常与骨代谢异常常合并发生。高脂血症是引发骨质疏松等骨代谢相关疾病的危险因素之一，对骨代谢通常起负调控作用。研究者开始研制针对高脂血症的促骨材料进行骨缺损修复，以达到降脂与成骨的双重作用。其中，某些他汀类降胆固醇药物(如辛伐他汀)的骨保护及抑制成脂的多效性作用，为综合治疗代谢性骨病提出了新的思路。同时ZIF-8是一类具有骨诱导性及载药潜能的MOF材料，因此本研究首次将ZIF-8负载SIM小分子药物，最终形成的SIM@ZIF-8体系在高脂条件下降低脂肪形成的同时促进成骨，对于治疗高脂血症引起的骨代谢病具有良好的应用前景。
光固化PEGDA水凝胶具有良好亲水性及可调节的机械性能被广泛应用于组织工程和再生医学。但由于其流动性好，虽可制备成可注射水凝胶但不利于修复不规则骨缺损，本发明设想将粘弹性可调节的SA混合PEGDA水凝胶，制备的PEGDA/SA水凝胶既能获得适宜粘弹性又能对不规则骨缺损实现水凝胶的可注射。然而，PEGDA/SA作为水凝胶支架材料缺乏骨诱导性，不能充分诱导骨再生，本发明首次将ZIF-8载药系统与PEGDA/SA水凝胶支架相结合，构建三维支架材料---SIM@ZIF-8/PEGDA/SA。该材料的多级网络结构(PEGDA与SA交联形成第一网络，PEGDA光交联为第二网络，ZIF-8晶体中的Zn2+交联海藻酸钠水凝胶为第三网络)，能够为成骨细胞生长提供支架，还可以达到药物的多级缓释作用(ZIF-8释放SIM，Zn2+为一级缓释，PEGDA/SA释放SIM，Zn2+为二级缓释)。因此，本发明设计的SIM@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶光固化复合支架具有骨诱导性、降低脂肪、载药缓释潜能、可注射性，为脂代谢紊乱引起的骨代谢疾病提供重要的理论指导。
3.3产生效果
1.构建SIM@ZIF-8载药系统，使载药体系具有可控的药物缓释性、适宜的生物降解性及良好的生物相容性，可以诱导成骨细胞分化增殖促进骨修复，尤其适用于高脂血症患者。
2.构建SIM@ZIF-8/PEGDA/SA生物活性可注射光固化支架，该材料具有多孔多网络结构，良好机械性能，适当降解性，降脂性及骨诱导性；通过体内外实验，初步探明该活性水凝胶支架改善成骨细胞力学微环境及SIM@ZIF-8载药系统改善高脂环境下成骨细胞生化微环境，最终达到降低脂肪，促进成骨的作用，为高脂血症患者的不规则骨修复提供新的思路和方向。
实施例2
为了证明本材料的成骨降脂的效果，本发明采用合成ZIF-8/PEGDA/SA及PEGDA/SA作为对照样品。
1.ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶合成方法如下：
所述ZIF-8粉末的合成，包括：
(1)将二甲基咪唑溶于100ml甲醇溶剂中，于室温下活力搅拌，形成透明均匀的溶液；
(2)将Zn(NO3)2·6H2O溶解在50ml的甲醇溶液中，超声处理5min后搅拌30min；
(3)向步骤(2)得到的溶液中逐滴地加入步骤(1)二甲基咪唑溶液，边加边搅拌，充分搅拌2h；
(4)反应结束后，将所得溶液10000rpm/min离心10min，利用10ml甲醇反复洗涤三次；
(5)将洗涤后的材料于37℃真空干燥48h，最终得到ZIF-8粉末。
进一步，步骤(1)中，所述二甲基咪唑为3.25g。
进一步，步骤(2)中，所述Zn(NO3)2·6H2O为1.47g。
进一步，所述ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶的构建，包括：
(1)将20wt％的PEGDA溶解于蒸馏水中，并加入0.05wt％的光引发剂，避光充分搅拌1h；
(2)称取0.5mg/ml的ZIF-8粉末；加入步骤(1)悬浊液中，避光于37℃恒温充分超声搅拌2h，充分混匀，得到ZIF-8/PEGDA悬浊液；
(3)将2wt％的SA按比例加入步骤(2)的悬浊液中，避光于37℃剧烈搅拌6h，待充分溶解后，形成SIM@ZIF-8/PEGDA/SA未交联水凝胶；
(4)按0.2ml体积将步骤(3)得到的水凝胶注射到预先制作好的模具内，紫外灯固化5min，最终得到ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶。
(5)步骤(4)最终材料消毒方法采用20kGy计量的Co60照射4～6h，消毒后备用。
2.所述PEGDA/SA水凝胶的构建，包括：
(1)将20wt％的PEGDA溶解于蒸馏水中，并加入0.05wt％的光引发剂，避光充分搅拌1h；
(2)将2wt％的SA按比例加入步骤(1)的悬浊液中，避光于37℃剧烈搅拌6h，待充分溶解后，形成PEGDA/SA未交联水凝胶；
(3)按0.2ml体积将步骤(2)得到的水凝胶注射到预先制作好的模具内，紫外灯固化5min，最终得到PEGDA/SA水凝胶。
(4)步骤(3)最终材料消毒方法采用20kGy计量的Co60照射4～6h，消毒后备用。
当然本发明不仅仅局限于SIM@ZIF-8/PEGDA/SA复合水凝胶支架的构建，用于高脂环境下成骨降脂。本发明其中的成分ZIF-8及SIM均具有成骨作用，因此也可以用于血脂正常患者以达到促成骨的目的。由于ZIF-8的载药特性，按上述合成方法还可以对ZIF-8负载其他药物，例如治疗糖尿病药物二甲双胍(MF)，将二甲双胍药物负载于ZIF-8晶体内，制备MF@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶支架。MF为治疗2型糖尿病的一线用药，近些年有研究发现MF也同时具有促进体外成骨细胞的增殖、分化及细胞外基质矿化的作用，逆转高浓度葡萄糖对成骨细胞功能的损伤，抑制破骨细胞的形成。与高脂血症患者相似，糖尿病患者往往伴有骨代谢相关疾病，骨缺损修复往往愈合不良。因此，对于2型糖尿病患者骨缺损修复及治疗骨代谢相关病，MF@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶支架可能具有成骨降糖双重作用，促进成骨与降低血糖相互影响形成正反馈作用。
MF@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶支架合成方法如下：
所述MF@ZIF-8载药体系的构建，包括：
(1)将二甲基咪唑溶于100ml甲醇溶剂中，于室温下活力搅拌，形成透明均匀的溶液；
(2)将Zn(NO3)2·6H2O和MF溶解在50ml的甲醇溶液中，超声处理5min后搅拌30min；
(3)向步骤(2)得到的溶液中逐滴地加入二甲基咪唑溶液，边加边搅拌，充分搅拌2h；
(4)反应结束后，将所得溶液10000rpm/min离心10min，利用10ml甲醇反复洗涤三次；
(5)将洗涤后的材料于37℃真空干燥48h，最终得到MF@ZIF-8粉末。
进一步，步骤(1)中，所述二甲基咪唑为3.25g。
进一步，步骤(2)中，所述Zn(NO3)2·6H2O为1.47g，所述MF为0.15g。
进一步，所述MF@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶的构建，包括：
(1)将20wt％的PEGDA溶解于蒸馏水中，并加入0.05wt％的光引发剂，避光充分搅拌1h；
(2)称取0.5mg/ml的MF@ZIF-8粉末；加入步骤(1)悬浊液中，避光于37℃恒温充分超声搅拌2h，充分混匀，得到MF@ZIF-8/PEGDA悬浊液；
(3)将2wt％的SA按比例加入步骤(2)的悬浊液中，避光于37℃剧烈搅拌6h，待充分溶解后，形成MF@ZIF-8/PEGDA/SA液体；
(4)按0.2ml体积将步骤(3)得到的水凝胶注射到预先制作好的模具内，紫外灯固化5min，最终得到MF@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶支架产品。
(5)步骤(4)最终材料消毒方法采用20kGy计量的Co60照射4～6h，消毒后备用。
下面结合具体实验数据以及附图对本发明的积极效果做进一步描述。
SEM及TEM分析SIM@ZIF-8载药体系微观结构(如图4，其中，图4(a)SEM；图4(b)TEM)，图示SIM@ZIF-8粒径大小均匀一致，约为100-200nm左右。对上述制备得到的SIM@ZIF-8载药体系进行一系列表征，以明确SIM@ZIF-8合成是否成功。
如图5SIM@ZIF-8粉末XRD及FTIR结果显示与ZIF8相同，表明ZIF-8成功包裹SIM。其中，图5(a)为标准ZIF8及SIM@ZIF-8的XRD；图5(b)为SIM@ZIF-8的FTIR。
如图6高分辨质谱检测(HRMS)显示，SIM@ZIF-8降解体系检测到SIM，证实SIM@ZIF-8构建成功。
如图7通过LC-MSMS计算得出SIM@ZIF-8的载药量及包封率分别为30.77％，68.77％。对SIM@ZIF-8/SA水凝胶进行SEM观察(如图8)，证实本实验合成的水凝胶体系表面为疏松多孔状结构，有利于细胞粘附及增殖。
对PEGDA/SA，ZIF-8/PEGDA/SA，SIM@ZIF-8/PEGDA/SA进行细胞相容性测试，其测试方法为：取三组样品分别接种骨髓间充质干细胞，于1d、3d、5d进行CCK-8增殖检测，其测试结果如图9所示。可以看出，三组材料对骨髓间充质干细胞相容性均较好，因此，本发明公开的新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架具有良好的生物相容性，有利于细胞长入及组织愈合。
将大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)定植于三组水凝胶(PEGDA/SA，ZIF-8/PEGDA/SA，SIM@ZIF-8/PEGDA/SA)表面24小时，免疫荧光观察细胞的粘附情况，结果显示SIM@ZIF-8/PEGDA/SA组，细胞黏附及伸展形态最好(如图10),证明SIM@ZIF-8/SA水凝胶支架具有促细胞粘附及增殖的作用。
本发明为了分析SIM@ZIF-8/SA水凝胶对BMSCs早期成骨的促进效果，将BMSCs接种于水凝胶上，成骨诱导培养7天后，检测前期成骨标志物碱性磷酸酶(ALP)，其染色图像如图11所示，SIM@ZIF-8/PEGDA/SA对BMSCs的成骨诱导效果明显优于其他两组，同时ALP定量检测也证明了以上结论的正确性(图12)。表明相较于PEGDA/SA，ZIF-8/PEGDA/SA，本发明制备的新型ZIF-8载药水凝胶复合支架--SIM@ZIF-8/PEGDA/SA具有更好的成骨活性。
本发明为了探究SIM@ZIF-8/SA水凝胶降脂性能，将BMSCs接种于水凝胶上，成脂诱导培养14天后，对细胞进行油红O染色及其半定量实验，显示PEGDA/SA，ZIF-8/PEGDA/SA及SIM@ZIF-8/PEGDA/SA促进BMSCs成脂能力有差异；如图13所示，SIM@ZIF-8/PEGDA/SA对BMSCs的成脂诱导效果明显低于其他两组，说明SIM@ZIF-8载药体系抑制了BMSCs的成脂分化，具有一定降脂作用，同时油红O染色半定量检测也得到同样的验证(图14)。表明相较于PEGDA/SA，ZIF-8/PEGDA/SA，本发明制备的新型ZIF-8载药水凝胶复合支架具有更好的降脂活性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架的制备方法，其特征在于，所述新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架的制备方法包括：SIM@ZIF-8载药体系的构建以及SIM@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶的构建；通过原位合成法在ZIF-8孔隙结构中负载SIM，形成的SIM@ZIF-8体系在高脂条件下降低脂肪形成的同时促进成骨。
2.如权利要求1所述的新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架的制备方法，其特征在于，所述SIM@ZIF-8载药体系的构建，包括：
(1)将二甲基咪唑溶于100ml甲醇溶剂中，于室温下活力搅拌，形成透明均匀的溶液；
(2)将Zn(NO3)2·6H2O和SIM溶解在50ml的甲醇溶液中，超声处理5min后搅拌30min；
(3)向步骤(2)得到的溶液中逐滴地加入二甲基咪唑溶液，边加边搅拌，充分搅拌2h；
(4)反应结束后，将所得溶液10000rpm/min离心10min，利用10ml甲醇反复洗涤三次；
(5)将洗涤后的材料于37℃真空干燥48h，最终得到SIM@ZIF-8粉末。
3.如权利要求2所述的新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述二甲基咪唑为3.25g。
4.如权利要求2所述的新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述Zn(NO3)2·6H2O为1.47g，所述SIM为0.15g。
5.如权利要求1所述的新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架的制备方法，其特征在于，所述SIM@ZIF-8/SPEGDA/SA水凝胶的构建，包括：
(1)将20wt％的PEGDA溶解于蒸馏水中，并加入0.05wt％的光引发剂，避光充分搅拌1h；
(2)称取0.5mg/ml的SIM@ZIF-8粉末；加入步骤(1)悬浊液中，避光于37℃恒温充分超声搅拌2h，充分混匀，得到SIM@ZIF-8/PEGDA悬浊液；
(3)将2wt％的SA按比例加入步骤(2)的悬浊液中，避光于37℃剧烈搅拌6h，待充分溶解后，形成SIM@ZIF-8/PEGDA/SA液体；
(4)按0.2ml体积将步骤(3)得到的水凝胶注射到预先制作好的模具内，紫外灯固化5min，最终得到SIM@ZIF-8/PEGDA/SA水凝胶支架。
6.一种应用如权利要求1～5任意一项所述的新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架的制备方法制备得到的新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架，其特征在于，所述新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架为SIM@ZIF-8/PEGDA/SA。
7.如权利要求6所述的新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架，其特征在于，所述新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架SIM@ZIF-8/PEGDA/SA中，SIM@ZIF-8载药系统为促成骨降脂的核心成分，PEGDA/SA混合水凝胶的多孔，多网络结构为药物二级缓释的主要部分，同时也提供骨细胞生长的力学微环境。
8.一种如权利要求6～7任意一项所述的新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架在生物医学领域中的应用。
9.一种如权利要求6～7任意一项所述的新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架在载药领域中的应用。
10.一种如权利要求6～7任意一项所述的新型ZIF-8载药水凝胶促成骨支架在骨组织工程中的应用。
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Zhang et al. Facile fabrication of a biocompatible composite gel with sustained release of aspirin for bone regeneration
Chen et al. Developing a strontium-releasing graphene oxide-/collagen-based organic–inorganic nanobiocomposite for large bone defect regeneration via MAPK signaling pathway
Latifi et al. A tissue-mimetic nano-fibrillar hybrid injectable hydrogel for potential soft tissue engineering applications
Wang et al. Thermogelling chitosan and collagen composite hydrogels initiated with β-glycerophosphate for bone tissue engineering
Wu et al. In situ controlled release of stromal cell-derived factor-1α and antimiR-138 for on-demand cranial bone regeneration
Darling et al. Click by click microporous annealed particle (MAP) scaffolds
Cui et al. Nanoengineered hydrogels as 3D biomimetic extracellular matrix with injectable and sustained delivery capability for cartilage regeneration
Kretlow et al. From material to tissue: Biomaterial development, scaffold fabrication, and tissue engineering
Liu et al. Molecular recognition-directed site-specific release of stem cell differentiation inducers for enhanced joint repair
Liu et al. Fabrication of engineered nanoparticles on biological macromolecular (PEGylated chitosan) composite for bio-active hydrogel system in cardiac repair applications
KR101522462B1 (ko) 효소 고정화 지지체를 이용한 in situ 형성 하이드로젤의 제조방법 및 이의 생의학적 용도
Jo et al. Effects of recombinant human bone morphogenic protein‐2 and human bone marrow‐derived stromal cells on in vivo bone regeneration of chitosan–poly (ethylene oxide) hydrogel
Oryan et al. RETRACTED ARTICLE: Mesenchymal stem cells seeded onto tissue-engineered osteoinductive scaffolds enhance the healing process of critical-sized radial bone defects in rat
Bodakhe et al. Injectable photocrosslinkable nanocomposite based on poly (glycerol sebacate) fumarate and hydroxyapatite: development, biocompatibility and bone regeneration in a rat calvarial bone defect model
CN111068116B (zh) 一种注射用软骨修复温敏凝胶及其制备方法
Maji et al. Photo-crosslinked alginate nano-hydroxyapatite paste for bone tissue engineering
Liu et al. Magnesium ammonium phosphate composite cell-laden hydrogel promotes osteogenesis and angiogenesis in vitro
Castro et al. Biomimetic biphasic 3‐D nanocomposite scaffold for osteochondral regeneration
Holkar et al. Hydrogel-assisted 3D model to investigate the osteoinductive potential of MC3T3-derived extracellular vesicles
CN116019973A (zh) 基于纳米酶复合体的纳米杂化双网络水凝胶及其制备方法与应用
Zhou et al. Synergistically promoting bone regeneration by icariin-incorporated porous microcarriers and decellularized extracellular matrix derived from bone marrow mesenchymal stem cells
Zarkesh et al. Scalable and cost-effective generation of osteogenic micro-tissues through the incorporation of inorganic microparticles within mesenchymal stem cell spheroids
Lagneau et al. Click and bioorthogonal hyaluronic acid hydrogels as an ultra-tunable platform for the investigation of cell-material interactions
CN115475283B (zh) 基于水凝胶材料构建的组织工程骨及其制备方法与应用

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