CN104083805A - 一种制备可降解载药涂层支架的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备可降解载药涂层支架的方法，具体方法为：第一步、预处理；第二步、将第一步中制备的冻干物溶于三羟甲基氨基甲烷缓冲液中；第三步、钢片的包被；第四步、包被金黄色葡萄球菌A蛋白；第五步、进行封闭，本发明的有益效果：本发明提供的可降解载药涂层支架制备方法解决了目前应用的药物涂层支架中存在的诸多问题，采用本发明提供的制备方法所制取的药物涂层耐冲刷、涂层均匀、稳定、体外捕获内皮组细胞能力强，可以达到很好的抑制血栓形成及降低再狭窄的目的，具有重要的临床应用价值。

Description

一种制备可降解载药涂层支架的方法

技术领域

本发明涉及一种制备支架的方法，特别涉及一种制备可降解载药涂层支架的方法。

背景技术

目前，心血管病已经成为威胁人类生命的最主要疾病之一。世界卫生组织指出，全球每年有约1700万人死于心血管疾病，占全球死亡人数的三分之一，预计到2020年，这个数字将有可能突破2000万。心血管疾病死亡病例中有80％分布在低中等收入国家。一项关于我国人口死亡原因的调查分析资料显示，近年国人死亡人员中，心脑血管疾病导致死亡的占40％，而且这个比例在呈年轻化、上升的趋势。在心血管疾病中对人类最大的病种就是心肌梗塞，已成为我国人口的第一死因，成为危害国人健康的第一杀手，给社会和家庭造成巨大负担。

自1985年Palmaz等首次在外周动脉血管中使用气囊支架后，支架置入术成为治疗心血管病的重要途径之一。然而支架置入术后内膜的过度增生会导致再狭窄的发生，单纯裸支架再狭窄的发生率可达10-30％，故支架置入术后再狭窄一直是心血管病治疗研究中重中之重。

为了防止内皮过渡增生降低支架内再狭窄发生率，人们发明了药物涂层支架(Drug-Eluting Stent，DES)。涂层材料经过选择，具有良好的生物相容性，并且含有抗增生的药物，防止平滑肌细胞过度增生。国际上通常采用的抑制血管平滑肌细胞增生，降低再狭窄的药物是雷帕霉素和紫杉醇，但由于这些药物与支架材料表面键合弱，涂层很容易被血流快速剥离，随着血液的冲刷，药物在1-2周内就降低到很低的浓度，1月后基本上没有药物作用，难以达到长期抑制平滑肌细胞增生，避免血管内膜过渡增厚导致的血管再狭窄。

综合来看，目前应用的药物涂层支架的不足主要包括：

1)内皮完整是预防血栓的最重要的屏障。DES的涂层药物在抑制平滑肌细胞过度增生的同时，也抑制正常内皮细胞再生，导致支架植入后血管内皮化过程延迟，增加了迟发性血栓形成风险；

2)目前支架涂层药物多使用单一药物，而再狭窄是由多种发病机制参与作用，支架上所涂药物不可能在各个环节发挥作用，从而限制其抗支架内再狭窄(Instent Restenosis，ISR)的作用；

3)由于目前常用DES的载体不能降解，在某种程度上也可能会增加病变血管局部慢性炎症的发生，另外药物发挥作用的时间越长，对组织的渗透作用越长，也是造成内皮化延迟的可能因素之一

4)DES的涂层与支架材料表面键合弱，涂层很容易被血流快速剥离，难以达到长期抑制平滑肌细胞增生，避免血管内膜过渡增厚导致的血管再狭窄。

综上所述，临床上亟待开发一种新的制备方法用以制备出新型的能降低血栓形成、防止再狭窄、可降解、耐冲刷涂层支架以解决目前治疗面临的困难。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的临床所用血管支架不能有效地降低血栓形成、不能有效地防止血管再狭窄的发生等诸多问题而提供的一种制备可降解载药涂层支架的方法。

本发明提供的制备可降解载药涂层支架的方法，其具体方法如下所述：

第一步、预处理：先用抛光机将钢片抛光至镜面，然后将抛光后的钢片用去污粉清洗，之后分别用丙酮、乙醇超声清洗，最后用去离子水超声清洗；然后制备多巴胺和肝素缩合形成的化合物的冻干物；钢片及冻干物紫外线灭菌；三羟甲基氨基甲烷缓冲液的配置：Tris碱0.121加80ml Milli-Q水溶解，用1M盐酸调节PH值为8.5，定容至100ml，验证PH值，灭菌，肝素钠溶液配置：3mg/ml肝素钠的Milli-Q水溶液100ml，用0.1M NaOH及1％醋酸调节pH值为4.2，配好的肝素钠溶液，灭菌；

第二步、将第一步中制备的冻干物溶于三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，配好的溶液中保证多巴胺浓度为4mg/ml；取48孔板，每孔中放置配置好的溶液，用镊子每孔放1枚钢片，结束钢片上多巴胺的聚合反应：将钢片自溶液中取出，置于新的48孔板中，Milli-Q水清洗，清洗后氮气吹干；

第三步、钢片的包被：将第二步中制得的钢片进行血管内皮生长因子和肝素的包被，包被层数为1-10层；具体包被过程为：将血管内皮生长因子溶于pH值为7.4的PBS缓冲液中，配置成100ug/ml溶液，将制得的钢片浸入血管内皮生长因子溶液中，4℃条件下反应，12小时后取出钢片，去离子水冲洗，氮气吹干，制得的钢片表面生成有血管内皮生长因子层，血管内皮生长因子的等电点为8.5，通过调节pH值能够使血管内皮生长因子溶液和肝素钠溶液分别带正电、负电，然后一层肝素一层血管内皮生长因子再一层肝素这样层层静电吸附直至所需层数；

第四步、包被金黄色葡萄球菌A蛋白：将金黄色葡萄球菌A蛋白中加入PBS，配置成1mg/ml溶液，再进行稀释，最终配置成0.1mg/ml金黄色葡萄球菌A蛋白溶液，将上步中获得的支架置于金黄色葡萄球菌A蛋白溶液中，4℃冰箱中静置24小时，将钢片取出用pH值为7.4的PBS溶液清洗3次，氮气吹干；

第五步、进行封闭：将上步中被金黄色葡萄球菌A蛋白包被后的支架浸入10mg/ml牛血清白蛋白中，4℃下静置封闭，取出用PBS清洗，氮气吹干，然后配置CD34抗体溶液，将封闭后的支架浸入CD34抗体溶液中，4℃条件下反应12小时，取出用PBS清洗，常温干燥；进一步，进行CD34抗体的荧光标记和表征：包被抗体CD34的支架中取一枚进行荧光标记，之前用兔血清封闭，异硫氰酸荧光素标记鼠抗兔IgG抗体配置成混合溶液，将包被抗体CD34的支架与标记物37℃条件下共浴1小时，常温下过夜干燥，固定于载玻片上，送检免疫荧光。

本发明的有益效果：

本发明提供的可降解载药涂层支架制备方法解决了目前应用的药物涂层支架中存在的诸多问题，采用本发明提供的制备方法所制取的药物涂层耐冲刷、涂层均匀、稳定、体外捕获内皮组细胞能力强，可以达到很好的抑制血栓形成及降低再狭窄的目的，具有重要的临床应用价值。

附图说明

图1为涂层支架上的血管内皮生长因子和CD34抗体含量示意图。

图2为酶联免疫吸附法检测涂层支架材料上的血管内皮生长因子的含量示意图。

图3为酶联免疫吸附法检测涂层支架材料上的CD34抗体的含量示意图。

图4为内皮祖细胞分离培养的细胞状态示意图。

图5为流式细胞仪检测的内皮祖细胞空白对照示意图。

图6为流式细胞仪检测的内皮祖细胞CD133的阳性率示意图。

图7为流式细胞仪检测的内皮祖细胞含激酶插入区受体的阳性率示意图。

图8为流式细胞仪检测的内皮祖细胞CD34的阳性率示意图。

图9为噻唑蓝法检测内皮祖细胞的增殖示意图。

具体实施方式

本发明提供的制备可降解载药涂层支架的方法，其具体方法如下所述：

第一步、预处理：先用抛光机将钢片抛光至镜面，然后将抛光后的钢片用去污粉清洗，之后分别用丙酮、乙醇超声清洗，最后用去离子水超声清洗；然后制备多巴胺和肝素缩合形成的化合物的冻干物；钢片及冻干物紫外线灭菌；三羟甲基氨基甲烷缓冲液的配置：Tris碱0.121加80ml Milli-Q水溶解，用1M盐酸调节PH值为8.5，定容至100ml，验证PH值，灭菌，肝素钠溶液配置：3mg/ml肝素钠的Milli-Q水溶液100ml，用0.1M NaOH及1％醋酸调节pH值为4.2，配好的肝素钠溶液，灭菌；

第二步、将第一步中制备的冻干物溶于三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，配好的溶液中保证多巴胺浓度为4mg/ml；取48孔板，每孔中放置配置好的溶液，用镊子每孔放1枚钢片，结束钢片上多巴胺的聚合反应：将钢片自溶液中取出，置于新的48孔板中，Milli-Q水清洗，清洗后氮气吹干；

第三步、钢片的包被：将第二步中制得的钢片进行血管内皮生长因子和肝素的包被，包被层数为1-10层；具体包被过程为：将血管内皮生长因子溶于pH值为7.4的PBS缓冲液中，配置成100ug/ml溶液，将制得的钢片浸入血管内皮生长因子溶液中，4℃条件下反应，12小时后取出钢片，去离子水冲洗，氮气吹干，制得的钢片表面生成有血管内皮生长因子层，血管内皮生长因子的等电点为8.5，通过调节pH值能够使血管内皮生长因子溶液和肝素钠溶液分别带正电、负电，然后一层肝素一层血管内皮生长因子再一层肝素这样层层静电吸附直至所需层数；

第四步、包被金黄色葡萄球菌A蛋白：将金黄色葡萄球菌A蛋白中加入PBS，配置成1mg/ml溶液，再进行稀释，最终配置成0.1mg/ml金黄色葡萄球菌A蛋白溶液，将上步中获得的支架置于金黄色葡萄球菌A蛋白溶液中，4℃冰箱中静置24小时，将钢片取出用pH值为7.4的PBS溶液清洗3次，氮气吹干；

第五步、进行封闭：将上步中被金黄色葡萄球菌A蛋白包被后的支架浸入10mg/ml牛血清白蛋白中，4℃下静置封闭，取出用PBS清洗，氮气吹干，然后配置CD34抗体溶液，将封闭后的支架浸入CD34抗体溶液中，4℃条件下反应12小时，取出用PBS清洗，常温干燥；进一步，进行CD34抗体的荧光标记和表征：包被抗体CD34的支架中取一枚进行荧光标记，之前用兔血清封闭，异硫氰酸荧光素标记鼠抗兔IgG抗体配置成混合溶液，将包被抗体CD34的支架与标记物37℃条件下共浴1小时，常温下过夜干燥，固定于载玻片上，送检免疫荧光。

具体做法如下：

材料准备：钢板规格-316L不锈钢，直径6mm圆片，厚度1mm，刚好能置于96孔板中；Tris碱、Milli-Q水、4M盐酸(即盐酸浓度为4mol/L)、去污粉、丙酮、乙醇、去离子水、冻干物、配置好的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、已处理好的钢片(18片)、灭菌的Milli-Q水、肝素钠、0.1M NaOH、1％醋酸、血管内皮生长因子、PBS缓冲液溶液(pH值为7.4)、金黄色葡萄球菌A蛋白、牛血清白蛋白、CD34抗体，制备好的冻干物成分---为多巴胺中氨基和肝素中羧基缩合反应后形成的化合物。

仪器准备：电子天平、100ml容量瓶1个、量筒100ml 1个、加样枪及枪头、PH计、PH试纸(碱性)、PH试纸(酸性)、抛光机、超声清洗机、60℃烘箱、紫外灭菌灯、超净工作台、48孔板、无菌镊子、真空低温无菌保存装置、烧杯(200ml)、烧杯(50ml)、加样枪(5ml、200ul)、EP管。

制作方法如下：

溶液配制：配置三羟甲基氨基甲烷缓冲液(10mM，pH8.5)：Tris碱0.121g加80ml Milli-Q水溶解，用1M盐酸调节PH为8.5，定容至100ml，验证PH，灭菌。多巴胺中氨基和肝素中羧基缩合反应后形成的化合物，将化合物制备成冻干物备用。

钢片的抛光：用抛光机抛光至镜面。

抛光后的钢片处理：将抛光后的钢片用去污粉清洗，之后分别用丙酮、乙醇超声清洗，分别超声15min。最后去离子水超声清洗3次，每次15 min。清洗后60℃烘箱中干燥24h。

钢片及冻干物紫外线灭菌。

钢片上多巴胺聚合：在超净工作台中操作。将冻干物溶于三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，配好的溶液中保证多巴胺浓度为4mg/ml；取48孔板，将24个孔每孔中放置0.25ml配置好的溶液，用镊子每孔放1枚钢片。(1片钢片约需0.25ml溶液，共需聚合3组钢片，每组6片，共需4.5ml溶液。制备的冻干物中共含20mg多巴胺，可配置5ml溶液。)

结束钢片上多巴胺的聚合反应：将24片钢片自溶液中取出，置于新的48孔板中，Milli-Q水清洗3遍，每遍5min，清洗后氮气吹干。取其中8枚钢片，记作肝素-多巴胺组，真空低温无菌保存。余16片钢片继续下述自组装过程。

进行血管内皮生长因子和肝素的层层自组装：配置3mg/ml肝素钠的Milli-Q水溶液100ml，用0.1M NaOH及1％醋酸调节pH为4.2，配好的肝素钠溶液，灭菌。配置1ug/ml的血管内皮生长因子的PBS缓冲液溶液(pH为7.4)20ml，灭菌。在48孔板的16个孔中各置入0.3ml肝素钠溶液，将上述吸附有血管内皮生长因子的钢板各置入孔中，室温下静置30min。将钢片取出，置入48孔板新的孔中，之后Milli-Q水冲洗3遍，每次5min，氮气吹干。在48孔板的16个孔中各置入0.2ml血管内皮生长因子溶液，将上述D-H组钢片置于孔中，浸入血管内皮生长因子溶液中，室温下静置30min。将钢片取出，置入48孔板新的孔中，之后Milli-Q水冲洗3遍，每次5min，氮气吹干。取其中8枚再次紫外线灭菌后低温干燥无菌保存，另8枚钢片进行下一步包被。

自组装金黄色葡萄球菌A蛋白和CD34抗体：将总量1mg金黄色葡萄球菌A蛋白中加入1mlPBS，配置成1mg/ml溶液，再取出100ul稀释于900ulPBS中，最终配置成0.1mg/ml金黄色葡萄球菌A蛋白溶液，灭菌。8枚钢片每片需要0.25ml，共需2ml。在48孔板的8个孔中各置入0.25ml金黄色葡萄球菌A蛋白溶液，将最终获得的钢片置于孔中，室温下静置30分钟。将钢片取出，置入48孔板新的孔中，之后Milli-Q水冲洗3遍，每次5分钟，氮气吹干。配置10mg/ml牛血清白蛋白，灭菌。将上述钢片浸入10mg/ml牛血清白蛋白中，4℃下静置24h封闭，取出用Milli-Q水冲洗清洗5min，氮气吹干。配置2ug/mlCD34抗体溶液，每枚钢片约需0.2ml抗体溶液，共8枚，约需1.6ml抗体溶液，需要3.2ug抗体。将封闭后的钢片浸入抗体溶液中，4℃条件下反应12h。取出用PBS清洗5min，常温下过夜干燥。

进行CD34抗体的荧光标记和表征：取制好的一枚钢片进行荧光标记。之前用兔血清封闭，异硫氰酸荧光素标记鼠抗兔IgG抗体配置成混合溶液，将钢片与标记物37℃条件下共浴1h，常温下过夜干燥。固定于载玻片上，送检免疫荧光。

具体检测方法如下：

一、免疫荧光检测涂层支架上的血管内皮生长因子和CD34抗体含量检测：

(一)主要设备和产地：

1)激光共聚焦显微镜Leica公司SP5激光共聚焦显微镜

2)微量移液枪德国Eppendorf公司

3)细胞培养级别盖玻片美国corning公司

4)湿盒(塑料饭盒与纱布)、塑料盖玻片或封口膜上海实生公司

(二)试剂：

1×PBS(Sangon上海生工)

牛血清蛋白(美国BD)

洗涤缓冲液(Sangon上海生工)

抗体：血管内皮生长因子(abcam ab46154,1:100)

荧光二抗(abcam ab99700,1:400)

(三)实验方法：

1、用PBS清洗钢板。

2、用含3％牛血清蛋白的PBS在室温封闭1h。

3、洗涤缓冲液室温漂洗三次，每次5 min。

4、加入一抗(CD34组不加一抗，直接孵育二抗)湿盒内4℃孵育过夜(附：抗体稀释比例，P651:100)。

5、用PBS在室温漂洗三次，每次5 min。

6、加入荧光二抗1：400，在室温下避光孵育1h。

7、去除二抗。

8、用PBS在室温漂洗三次，每次10min。

9、在荧光显微镜下观察结果。

(四)实验结果：

实验结果如图1所示，D-H[316不锈钢支架-多巴胺聚合物](图中用Ⅰ表示)，其中D-(H-V)10[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-(肝素-血管内皮生长因子)10]组(图中用Ⅱ表示)和D-(H-V)10-A[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-(肝素-血管内皮生长因子)10-蛋白A]组(图中用Ⅲ表示)中血管内皮生长因子包被很成功，能明显检测出血管内皮生长因子；D-(H-V)10-A[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-(肝素-血管内皮生长因子)10-蛋白A]组中CD34抗体包被很成功。

二、酶联免疫吸附法检测涂层支架材料上的血管内皮生长因子和CD34抗体的含量

(一)主要设备和产地

1、80℃低温冰箱美国Thermo Forma公司；

2、台式水平离心机Eppendorf，5810R德国；

3、Nanopure超纯水仪日本SANYO公司；

4、AA-200型电子天平美国Denver Instrumol/Lent公司；

5、90一2型磁力搅拌器上海沪西分析仪器厂

6、低温高速离心机ThermoForma公司

7、酶标仪：Biotek公司，型号：synergy H4 Hybrid Reader

8、微量移液枪德国Eppendorf公司

9、烧杯、容量瓶：上海实生公司

(二)试剂和材料

1、RIPA(完全裂解液)；Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐):50mM,pH7.4；NP-40(非离子去污剂):1％；NaCl:150mM；EDTA(乙二胺四乙酸二钠)1mM；PMSF(蛋白酶抑制剂)1mM；Leupeptin(亮抑肽酶)10ug/ml；Pepstatin(抑肽素)2ug/ml；

2、PI3-Kinase activity ELISA Kit(磷脂酰肌醇3-激酶活动酶联免疫试剂盒):美国echelon公司K-1000；

3、ATP(三磷酸腺苷)美国Sigma公司；

4、TBST(洗涤缓冲液):FW；Tris-Base(三羟甲基氨基甲烷)20mM121.14、2.4228g/L；NaCl、137 mM、58.44、8.0145g/L；Tween-20(吐温20)0.1％(V/V)、1ml/L、PH＝7.6。

(三)实验方法

从-80℃取出处理过的细胞(一个100mm圆盘视野＞5×106细胞)，酶管中加60 ul RIPA(细胞裂解液)，在4℃裂解30min。12000rpm，4℃，离心10min。

BCA(牛血清白蛋白)法测定蛋白浓度(测定方法详见“Western Blot(蛋白印迹)BCA(牛血清白蛋白)法测定蛋白含量”部分)，用RIPA(细胞裂解液)调整样本蛋白浓度至5ug/ul。测定蛋白样本浓度与平衡(见表1)。

表1.测定蛋白样本浓度与平衡表格

血管内皮生长因子/CD34抗体检测反应：每个反应体系为：6ul反应buffer(缓冲液)(200mM Tris pH7.4，100mM Nacl，40mM MgCl2,250uM ATP)+2.4ul100uM的血管内皮生长因子/CD34抗体+6 ul细胞裂解液，再加双蒸水补齐到60ul，每个样品做3复孔。其中3个孔用反应buffer(缓冲液)取代细胞裂解液，作为PIP2(二磷酸磷脂酰肌醇)，即说明书上的F。用膜封闭好后，放室温反应1.5h(小时)。按照说明书配好标准品，(试剂盒自带配置说明)，使其浓度为4uM，每孔加入60ul，相当于每孔含240pmol的血管内皮生长因子/CD34抗体，然后再这个基础上进行倍比稀释，使其量分别达120pmol，60pmol，30pmol和15pmol。加入单独的60ulTBS(TBS缓冲液)作为对照(即为说明书中的G)，而加入120ul的TBS(TBS缓冲液)作为空白对照组(即为说明书中的H，没有血管内皮生长因子/CD34抗体)。将上述标准品和对照加入反应板中，每个做3复孔。

用TBST(洗涤缓冲液)配制血管内皮生长因子/CD34抗体detector/EDTA(抗体检测液/乙二胺四乙酸二钠)溶液：按1:200稀释血管内皮生长因子/CD34抗体检测液，用TBST(洗涤缓冲液)作为稀释液，并且在ml稀释好的血管内皮生长因子/CD34抗体检测液中加入63ul 100mM的EDTA乙二胺四乙酸)(试剂盒自带)。

PI3-K(磷脂酰肌醇3-激酶)反应：每个反应孔中加入60ul的血管内皮生长因子/CD34抗体detector/EDTA(抗体检测液/乙二胺四乙酸)混合溶液，用膜封闭后放在摇床慢速反应1小时。

将上述所得的反应液各取100ul加入到测试板中，用膜封好孔后，摇床慢速摇1小时。

倒掉液体，每孔加入200ul的TBST(洗涤缓冲液)，将每孔洗一次。

每孔加入100ul secondary detector(二次检测液)(用之前按1:80，用TBST(洗涤缓冲液)对其进行稀释)。用膜封好孔后，室温摇床慢速孵育30min。

倒掉液体后，每孔用200ul TBST(洗涤缓冲液)洗2次，再每孔用300ul TBST(洗涤缓冲液)洗1次，将剩余液体拍打干净。

每孔加入100ul TMB(四甲基联苯胺)，反应1-15min(分钟)，使240 pmol孔的颜色呈淡蓝，而对照组孔的颜色呈海蓝时，每孔加入50ul 1 NH2SO4,使反应终止，液体也由蓝边黄。

450nm波长下测吸光值。

(四)实验结果

实验结果见图2、图3所示，D-H[316不锈钢支架-多巴胺聚合物](图中用Ⅰ表示)，在D-(H-V)10[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-(肝素-血管内皮生长因子)10]组(图中用Ⅱ表示)和D-(H-V)10-A[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-(肝素-血管内皮生长因子)10-蛋白A]组(图中用Ⅲ表示)中，能明显的检测出血管内皮生长因子(血管内皮生长因子)的含量，浓度可达到15.29ng/ml和14.57ng/ml；在D-(H-V)10-A[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-(肝素-血管内皮生长因子)10-蛋白A]组中，可以明显的检测出CD34抗体的含量，浓度达到7.84ng/ml。实验说明涂层支架包被血管内皮生长因子和CD34抗体是非常成功的。

内皮祖细胞的分离培养和鉴定：

一、EPC(内皮祖细胞)的分离培养

1、取人脐静脉血50m1，用含0.02％EDTA(乙二胺四乙酸)的PBS等倍稀释；

2、取15m1离心管，下层放入淋巴细胞分离液Ficoll(淋巴细胞分离液)，上层缓慢加入等体积稀释好的混合脐静脉血，注意应尽量使界面分层清晰；

3、离心，2000r/min,20min；

4、观察离心管中液体分四层，用200μ1枪头小心吸出单核细胞层，用含0.02％EDTA的PBS洗2遍；

5、弃上清，加M199培养液(含20％FBS(胎牛血清))混匀,计数板计数。

6、用M199培养液(含20％FBS(胎牛血清)),l00u/ml青、链霉素，VEGF(血管内皮生长因子),bFGF(细胞生长因子)调整细胞浓度，使上述分离得到的细胞2×106 cm-2密度接种在FN(纤维蛋白)包被的6孔细胞培养板中。

7、将培养板置于37℃,5％CO2,95％湿度孵箱中静止培养，48h后换液，除去未贴壁细胞，以后每3天换液1次。培养1-2周，观察细胞状态。

细胞的状态如图4所示，EPC(内皮祖细胞)分离培养的细胞状态正常。

二、EPC(内皮祖细胞)的鉴定：

(一)主要设备和产地：

1、YJ-875超净工作台苏州工业园区三兴净化科技有限公司；

2、C02培养箱3111型美国Thermo Forma公司；

3、-80℃低温冰箱美国Thermo Forma公司；

4、细胞培养皿美国Nunc公司；

5、15ml离心管美国Corning公司；

6、EP管(eppendorf管，离心管)德国Eppendorf公司；

7、Nanopure超纯水仪日本SANYO公司；

8、流式细胞仪FACSAria美国BD；

9、AA-200型电子天平美国Denver Instrumol/Lent公司；

10、300目细胞筛美国BD公司；

11、微量移液枪德国Eppendorf公司；

(二)主要药品及试剂：

1、胰蛋白酶美国Amresco公司；

2、胎牛血清美国Gibco公司；

3、DMEM培养液美国Gibco公司；

4、无水乙醇国药试剂有限公司；

5、Rnase A(核糖核酸酶A)天根生物；

(三)实验步骤：

1、取培养至第12d的细胞，0.05％胰蛋白酶消化收集细胞:PBS洗两遍。

2、消化后的细胞悬液用0.5％BSA-PBS(牛血清白蛋白PBS缓冲液)离心1000rpm,5min,2次，制成单细胞悬液。

3、分装4个Eppendorf管，保证每管含1×105以上的细胞，其中3管分别加荧光标记的鼠抗人CD34,CD133,KDR(含激酶插入区受体)抗体各10u1,一管加入荧光标记的非特异工IgG作为同型对照，37℃孵育30min。

4、0.5％BSA-PBS(牛血清白蛋白PBS溶液)离心1000rpm(转/分),5min(分钟)，洗掉未结合抗体。

5、4％多聚甲醛固定后，流式细胞仪检测

(四)实验结果：

实验结果如图5、图6、图7和图8所示，分离培养的EPC(内皮祖细胞)中，CD133的阳性率有89.9％，KDR(含激酶插入区受体)的阳性率有90.4％，CD34的阳性率达到91.3％。

涂层支架材料的EPC(内皮祖细胞)的毒理评价、原理：MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。

MTT(噻唑蓝)比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT(噻唑蓝)还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT(噻唑蓝)结晶形成的量与细胞数成正比。

一、材料试剂：

(一)主要设备和产地：

1、微量移液枪德国Eppendorf公司；

2、酶标仪美国Molecular Devices公司；

(二)试剂

1、MTT(噻唑蓝)试剂盒:碧云天

2、0.22μm滤膜:美国millipore公司

3、PBS溶液：将药品(NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 1.56g，KH2PO40.2g)倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。10％NaOH调PH到7.4。

4、MTT(噻唑蓝)溶液：称取MTT(噻唑蓝)0.5克，溶于100 ml的PBS中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。

二、实验步骤：

(一)细胞培养：

培养分选的EPC(内皮祖细胞)，分别以每孔5000个细胞分别接种于48孔板内，孔板内放有D-H[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-肝素]；D-(H-V)10[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-(肝素-VEGF)10]；D-(H-V)10-A[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-(肝素-VEGF)10-蛋白A]三中钢板材料，每孔加入细胞培养液培养0h，24h，48h，72h，每组选择三个复孔。

(二)呈色：

拿出培养箱后，每孔加入500μl细胞培养液和50μl MTT(噻唑蓝)溶液(5mg/ml)。37℃培养箱内孵育4小时。小心吸出细胞培养液，加入500μlDMSO(二甲基亚砜)，震荡10min，使结晶物充分溶解。

(三)比色：

每孔分别取出100μl，加入96孔板中进行检测。选择490nm波长，以对照孔调零，在酶标仪上测定各孔的吸光值。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线图。

三、试验结果

实验结果如图9所示，三种D-H[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-肝素]；D-(H-V)10[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-(肝素-VEGF)10]；D-(H-V)10-A[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-(肝素-VEGF)10-蛋白A]钢板材料中，D-H[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-肝素]组的钢板上细胞无法生长；包被VEGF(血管内皮生长因子)之后，细胞能较好的在钢板上面增殖，同时D-(H-V)10-A[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-(肝素-VEGF)10-蛋白A]钢板上的细胞生长情况明显的优于单独包被VEGF(血管内皮生长因子)的钢板，说明CD34的抗体能明显的促进EPC(内皮祖细胞)在钢板材料上面的生长。

涂层支架材料上EPC的分化能力评估：

EPC诱导分化方法：

37℃，5％CO2，湿度100％条件下，以DMEM(细胞培养基)及20％胎牛血清培养，其内添加VEGFl65(血管内皮生长因子165)(20 ng/m1)，EGF(表皮生长因子)(1 ng/m1)和IGF(胰岛素样生长因子)-1(2 ng/m1)，bFGF(成纤维细胞生长因子)(4ng/ml)，谷氨酰胺(300/zg/m1)，青霉素G(100 U/m1)和链霉素(100 mg/L)。

2-3天更换培养，培养2周。免疫荧光检测分化成EC(内皮细胞)的特异性标记(KDR，CD31和VE-cadherin血管内皮钙黏蛋白)

免疫荧光方法：

一、材料试剂

(一)主要设备和产地

1)激光共聚焦显微镜Leica公司SP5激光共聚焦显微镜

2)微量移液枪德国Eppendorf公司

3)细胞培养级别盖玻片6孔细胞培养板美国corning公司

4)湿盒(塑料饭盒与纱布)、塑料盖玻片或封口膜上海实生公司

(二)试剂：

1×PBS(Sangon上海生工)

多聚甲醛(上海凌峰化学试剂有限公司)

Triton-X100(聚乙二醇辛基苯基醚)(美国Bio-Rad)

BSA(牛血清白蛋白)(美国BD)

TBST(洗涤缓冲液)(Sangon上海生工)

荧光用封片剂：Deck公司

抗体：

CD31(abcam ab28364,1:100)

KDR(激酶插入区受体)(abcam ab9530,1:100)

VE-cadherin(血管内皮钙黏蛋白)(abcam ab33168,1:100)

荧光二抗(abcam ab99700,1:400)

二、实验步骤

1.移去完全培养基，用PBS清洗两次细胞。

2.用4％的多聚甲醛在室温固定15分钟。

3.用PBS在室温漂洗三次，每次5分钟。

4.用含0.1％Triton-X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)的PBS在室温通透化处理15分钟。

5.用PBS在室温漂洗三次，每次5分钟。

6.用含3％BSA(牛血清白蛋白)的PBS在室温封闭1小时。

7.TBST室温漂洗三次，每次5分钟。

8.加入一抗湿盒内4℃孵育过夜(附：抗体稀释比例，P651:100)。

9.用PBS在室温漂洗三次，每次5分钟。

10.加入荧光二抗1：1000，在室温下避光孵育一小时。

11.去除二抗，加入Hoechst染色液[Hoechst染色液(赫斯特染色液)]1：1000室温孵育10分钟。

12.用PBS在室温漂洗三次，每次10分钟。

13.在荧光显微镜下观察结果。

三、实验结果

通过实验结果可知D-(H-V)10[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-(肝素-VEGF)10]；D-(H-V)10-A[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-(肝素-VEGF)10-蛋白A]钢板材料中培养的EPC(内皮祖细胞)均能成功的分化成EC(内皮细胞)，D-(H-V)10-A[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-(肝素-VEGF)10-蛋白A]钢板材料中EPC(内皮祖细胞)的分化效率明显高于D-(H-V)10[316不锈钢支架-多巴胺聚合物-(肝素-VEGF)10]钢板材料。实验结果说明CD34抗体可以明显的促进EPC(内皮祖细胞)在涂层支架材料中的生长和分化。

Claims (1)

1.一种制备可降解载药涂层支架的方法，其特征在于：其具体方法如下所述：

第一步、预处理：先用抛光机将钢片抛光至镜面，然后将抛光后的钢片用去污粉清洗，之后分别用丙酮、乙醇超声清洗，最后用去离子水超声清洗；然后制备多巴胺和肝素缩合形成的化合物的冻干物；钢片及冻干物紫外线灭菌；三羟甲基氨基甲烷缓冲液的配置：Tris碱0.121加80ml Milli-Q水溶解，用1M盐酸调节PH值为8.5，定容至100ml，验证PH值，灭菌，肝素钠溶液配置：3mg/ml肝素钠的Milli-Q水溶液100ml，用0.1M NaOH及1％醋酸调节pH值为4.2，配好的肝素钠溶液，灭菌；

第二步、将第一步中制备的冻干物溶于三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，配好的溶液中保证多巴胺浓度为4mg/ml；取48孔板，每孔中放置配置好的溶液，用镊子每孔放1枚钢片，结束钢片上多巴胺的聚合反应：将钢片自溶液中取出，置于新的48孔板中，Milli-Q水清洗，清洗后氮气吹干；

第三步、钢片的包被：将第二步中制得的钢片进行血管内皮生长因子和肝素的包被，包被层数为1-10层；具体包被过程为：将血管内皮生长因子溶于pH值为7.4的PBS缓冲液中，配置成100ug/ml溶液，将制得的钢片浸入血管内皮生长因子溶液中，4℃条件下反应，12小时后取出钢片，去离子水冲洗，氮气吹干，制得的钢片表面生成有血管内皮生长因子层，血管内皮生长因子的等电点为8.5，通过调节pH值能够使血管内皮生长因子溶液和肝素钠溶液分别带正电、负电，然后一层肝素一层血管内皮生长因子再一层肝素这样层层静电吸附直至所需层数；

第四步、包被金黄色葡萄球菌A蛋白：将金黄色葡萄球菌A蛋白中加入PBS，配置成1mg/ml溶液，再进行稀释，最终配置成0.1mg/ml金黄色葡萄球菌A蛋白溶液，将上步中获得的支架置于金黄色葡萄球菌A蛋白溶液中，4℃冰箱中静置24小时，将钢片取出用pH值为7.4的PBS溶液清洗3次，氮气吹干；

第五步、进行封闭：将上步中被金黄色葡萄球菌A蛋白包被后的支架浸入10mg/ml牛血清白蛋白中，4℃下静置封闭，取出用PBS清洗，氮气吹干，然后配置CD34抗体溶液，将封闭后的支架浸入CD34抗体溶液中，4℃条件下反应12小时，取出用PBS清洗，常温干燥；进一步，进行CD34抗体的荧光标记和表征：包被抗体CD34的支架中取一枚进行荧光标记，之前用兔血清封闭，异硫氰酸荧光素标记鼠抗兔IgG抗体配置成混合溶液，将包被抗体CD34的支架与标记物37℃条件下共浴1小时，常温下过夜干燥，固定于载玻片上，送检免疫荧光。