CN106853265A - 一种酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层及其制备方法 - Google Patents

一种酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层及其制备方法，通过使用壳聚糖和透明质酸以及赖氨酸溶液，通过物理涂敷获得了在水环境下稳定的表面疏水的凝胶涂层，赋予材料抗细菌粘附以及接触杀菌的功能，聚赖氨酸组分提高了材料的抗细菌粘附作用，故该涂层具有良好的抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌黏附和杀菌的能力。该方法工艺简单、快捷，条件温和，易于浸涂、旋涂、喷涂、层层自组装，可工业的方式实现，适用范围广，能够有效地的改善医用装置表面的抗菌性能，生物相容性和润滑性。

Description

一种酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层 及其制备方法
技术领域
本发明具体涉及新材料技术领域，具体涉及一种酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层及其制备方法。
背景技术
随着材料科学、医学、生物学的飞速发展，生物医用材料的研究取得了很大的进步，但是仍面临各种挑战，一些根本性的问题没有解决，其中，除了生物相容性问题，生物材料应用的主要障碍还有感染问题。世界上，64%左右的院内获得性感染是由植入体或医疗器械上黏附病原菌引起的，仅仅在美国，每年就有10万人死于相关的感染。在欧洲，人们大约每年要花费5000万欧元用于医用导管感染的治疗，并且每年有5000个感染死亡病例。感染发生的一般过程是：细菌的黏附；定植和繁殖，形成菌落；分泌胞外基质，菌落通过胞外基质连接在一起，形成生物膜（biofilm），生物膜释放浮游菌体和毒素，引发感染。生物膜容易使细菌产生抗药性，生物膜由于其致密的物理结构，可以制止人体免疫系统中巨噬细胞的吞噬作用，实验证实，在生物膜内的细菌相比自由状态的细菌抵抗能力增加了1000倍。通过对各种医用装置的表面修饰，在保持原有性能的条件下，改善生物医用装置生物相容性成为现代医疗装置应用中的重要问题。
根据抗菌表面和界面性质可以将抗菌材料分为抗细菌黏附的表面、接触式杀菌的表面和释放抗菌剂的表面，抗粘附的涂层能对细菌感染的初始步骤发挥作用，但是单纯的这类涂层不具有杀菌的功能；接触式杀菌表面包括接枝季铵盐、季磷酸盐、吡啶盐等种类，这类抗菌表面的优点是涂层牢固、抗菌能力强，但存在的问题是细胞毒性较大，生物相容性性较差。释放杀菌剂型表面可以进行局部释放和给药，释放纳米银、抗生素、抗菌肽、溶菌酶、NO分子等。这类涂层具有一定的缓释和抗菌能力，但是不具有抗细菌黏附的能力。因此寻求一种简单的面对装置的表面修饰手段成为医用装置抗感染表面设计的关键性问题。而层层自组装技术具有简单、易于操作的特点，并且使膜层具有其组分的复合功能，通过对基材的预处理使其表面具有阳离子，通过静电作用力，使(HA/CHI)10具有接触杀菌的作用，使（HA/PLL）10具有酶溶解抗细菌粘附作用。
发明内容
为了解决现有技术的缺陷及不足。本发明提供了一种酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层及其制备方法。
本发明采用的技术解决方案是： 一种酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层，所述的层层自组装多层膜涂层包括经聚乙烯亚胺预处理过的基材，所述的基材上涂抹有透明质酸（HA）、壳聚糖（CHI）和聚赖氨酸(PLL)。
所述的基材为玻璃、硅片、硅凝胶、云母、不锈钢中的一种。
所述的层层自组装多层膜涂层表面的静态接触角为95-102±1.2-2.5°。
所述的层层自组装多层膜涂层表面的粗糙度RMS为1.85-4.23±0.23-0.54nm。
一种酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层的制备方法，包括以下步骤：
（1）将基材依次用乙醇和去离子水超声清洗，然后用N2吹干，清洗过的基材分别在5mg/ml的聚乙烯亚胺溶液中处理，然后N2吹干，得到表面预处理的基材；
（2）将经表面预处理的基材分别在透明质酸溶液、壳聚糖溶液、聚赖氨酸溶液中涂抹处理，N2吹干，后室温干燥，得到最终所述的酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层产物；
所述的步骤（2）中的经表面预处理的基材依次经透明质酸/壳聚糖溶液和透明质酸/聚赖氨酸溶液涂抹处理。
所述的涂抹处理为层层自组装、浸涂、喷涂、旋涂中的一种。
所述的基材为玻璃、硅片、硅凝胶、云母、不锈钢中的一种。
所述的透明质酸溶液、壳聚糖溶液、聚赖氨酸溶液质量浓度为1mg/ml。
所述的1mg/ml 透明质酸溶液和1mg/ml壳聚糖溶液的pH值为2.9，1mg/ml聚赖氨酸溶液pH值为9.5。
所述的步骤（1）中聚乙烯亚胺溶液处理30min。
所述的层层自组装方式为：将预处理后基材在透明质酸溶液中浸泡8min，用相同pH的洗液中浸泡1~2s，用N2吹干，再浸入壳聚糖溶液中浸泡8min，同样用相同pH的洗液中浸泡1~2s，用N2吹干反复，此操作重复10次。再将处理后的基材以同样的方法在透明质酸/聚赖氨酸中反复浸涂10次。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层及其制备方法，聚赖氨酸/透明质酸明显提高了抗细菌黏附的能力，透明质酸/壳聚糖提高了涂层的杀菌能力，且凝胶涂层对人晶状体上皮细胞细胞毒性较低，因此具有良好的细胞相容性。抗菌涂层具有良好的润滑性能，本发明涂层溶液配制简便，能实现无污染操作，可采用层层自组装、旋涂、喷涂的方法，可工业实现的方式，适用范围广，能够对具有复杂体型结构的生物医用装置进行涂层修饰；涂层可改善医用装置表面的抗菌性能，润滑性，生物相容性，在人体环境下以水凝胶的形式存在，这种性质使生物材料表面润滑，减少材料表面和粘膜组织之间的摩接阻力；能适应人体的内环境；涂层能够实现广谱的多功能抗菌的能力。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。
基材表面预处理：
将各基材（玻璃、硅片、硅凝胶、云母、不锈钢）经刀片裁剪成1.5×2.5cm2大小，然后依次用前经乙醇和去离子水分别超声15min清洗，N2吹干。清洗过的基材分别在5mg/ml的PEI（聚乙烯亚胺）中处理30min，N2吹干，得到表面PEI处理的基材；
下列实施例中所用的基材均为通过上述表面与处理过后的基材。
实施例1：
在250ml小烧杯中加入100ml去离子水或超离子水（pH=7.0），磁力搅拌，缓慢加入0.1g的透明质酸，浓度为1mg/ml，边搅拌边缓慢加入盐酸溶液调pH到2.9继续搅拌直至溶解，同样调出pH=2.9的壳聚糖溶液和pH=9.5的聚赖氨酸，即为涂膜液，同时调出相对应同pH的洗液。硅凝胶片经刀片裁剪成1.5×2.5cm2大小，作为基材使用，用水超声清洗，N2吹干。用镊子夹住硅凝胶片，浸入5mg/mlPEI溶液中2h进行预处理，取出预处理后的硅凝胶依次在HA和CHI中来回浸泡10次，每次8min，取出后用洗液浸泡1~2s，用N2吹干，再在HA和PLL溶液中来回浸泡10次，取出，用N2吹干，然后放置于玻璃平板上，。室温干燥24h。
断面场发射扫描电镜测试涂层的厚度为3.34±0.48μm。静态接触角研究发现涂膜后疏水性增加，和10层透明质酸/壳聚糖膜相比，由43°±1.13°增加到98°±1.24°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为3.27±0.32 nm。结果显示该膜层能在24 h杀死93%的大肠杆菌和100%的金黄色葡萄球菌。抗细菌黏附实验发现和未涂膜的的基材相比，该多层膜降低了90%的大肠杆菌黏附和82%的金黄色葡萄球菌的黏附。
实施例 2：
在250ml小烧杯中加入100ml去离子水超离子水（pH=7.0），磁力搅拌，缓慢加入0.1g的透明质酸，浓度为1mg/ml，边搅拌边缓慢加入盐酸溶液调pH到2.9继续搅拌直至溶解，同样调出pH=2.9的壳聚糖溶液和pH=9.5的聚赖氨酸，即为涂膜液，同时调出相对应同pH的洗液。玻璃片作为基材，用镊子夹住玻璃片片，浸入5mg/mlPEI溶液中2h进行预处理，取出预处理后的玻璃片依次在HA和CHI中来回浸泡10次，每次8min，取出后用洗液浸泡1~2s，用N2吹干，再在HA和PLL溶液中来回浸泡10次，取出，用N2吹干，然后放置于玻璃平板上，。室温干燥24h。
静态接触角测试膜层显示出一定的疏水性，为100°±1.5°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为3.52±0.24 nm。结果显示该膜层能在24 h杀死93%的大肠杆菌和100%的金黄色葡萄球菌。抗细菌黏附实验发现和未涂膜的的基材相比，该多层膜降低了90%的大肠杆菌黏附和82%的金黄色葡萄球菌的黏附。
实施例 3：
在250ml小烧杯中加入100ml超离子水（pH=7.0），磁力搅拌，缓慢加入0.1g的透明质酸，浓度为1mg/ml，边搅拌边缓慢加入盐酸溶液调pH到2.9继续搅拌直至溶解，同样调出pH=2.9的壳聚糖溶液和pH=9.5的聚赖氨酸，即为涂膜液。玻璃作为基材。涂膜方法采用旋涂的方法，先在1000rad/min旋涂10s，然后在2500rad/min下旋涂2min，重复操作，旋涂5次。最后室温干燥24h。断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为0.85±0.18μm。静态接触角测试膜层显示出一定的疏水性，为95°±1.32°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为2.44±0.26 nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌性能，结果显示该膜层能在24 h杀死94%的大肠杆菌和100%的金黄色葡萄球菌。抗细菌黏附实验发现和未涂膜的的基材相比，该多层膜降低了90%的大肠杆菌黏附和87%的金黄色葡萄球菌的黏附。
实施例 4：
在250ml小烧杯中加入100ml超离子水（pH=7.0），磁力搅拌，缓慢加入0.1g的透明质酸，浓度为1mg/ml，边搅拌边缓慢加入盐酸溶液调pH到2.9继续搅拌直至溶解，同样调出pH=2.9的壳聚糖溶液和pH=9.5的聚赖氨酸，即为涂膜液，云母作为基材。涂膜方法采用旋涂的方法，各种溶液组合10层HA/CHI和10层HA/PLL交替涂抹,先在1000rad/min旋涂10s，然后在2500rad/min下旋涂2min。最后室温干燥24h。断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为1.45±0.22μm，静态接触角测试膜层显示出一定的疏水水性，为98±1.24°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为2.45±0.23 nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌性能，结果显示该膜层能在24 h杀死93%的大肠杆菌和100%的金黄色葡萄球菌。抗细菌黏附实验发现和未涂膜的的基材相比，该多层膜降低了90%的大肠杆菌黏附和82%的金黄色葡萄球菌的黏附。
实施例 5：
在250ml小烧杯中加入100ml超离子水（pH=7.0），磁力搅拌，缓慢加入0.1g的透明质酸，浓度为1mg/ml，边搅拌边缓慢加入盐酸溶液调pH到2.9继续搅拌直至溶解，同样调出pH=2.9的壳聚糖溶液和pH=9.5的聚赖氨酸，即为涂膜液。不锈钢作为基材。涂膜方法采用旋涂的方法，各种溶液组合10层HA/CHI和10层HA/PLL交替涂抹，先在1000rad/min旋涂10s，然后在2500rad/min下喷涂2min。最后室温干燥24h。断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为1.35±0.28μm，静态接触角测试膜层显示出一定的疏水性，为97.54±2.53°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为1.85±0.33 nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌性能，结果显示该膜层能在24 h杀死76%的大肠杆菌和98%的金黄色葡萄球菌。抗细菌黏附实验发现和未涂膜的的基材相比，该共混膜降低了97%的大肠杆菌黏附和87%的金黄色葡萄球菌的黏附。
实施例 6：
在250ml小烧杯中加入100ml超离子水（pH=7.0），磁力搅拌，缓慢加入0.1g的透明质酸，浓度为1mg/ml，边搅拌边缓慢加入盐酸溶液调pH到2.9继续搅拌直至溶解，同样调出pH=2.9的壳聚糖溶液和pH=9.5的聚赖氨酸，即为涂膜液。云母作为基。涂膜方法采用浸涂的方法，最后室温干燥24h。断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为6.45±0.72μm，静态接触角测试膜层显示出一定的疏水性，为97.45±2.14°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为4.23±0.54 nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌性能，结果显示该膜层能在24 h杀死93%的大肠杆菌和100%的金黄色葡萄球菌。抗细菌黏附实验发现和未涂膜的的基材相比，该共混膜降低了90%的大肠杆菌黏附和82%的金黄色葡萄球菌的黏附。
实施例 7：
在250ml小烧杯中加入100ml超离子水（pH=7.0），磁力搅拌，缓慢加入0.3g的透明质酸，浓度为3mg/ml，边搅拌边缓慢加入盐酸溶液调pH到2.9继续搅拌直至溶解，同样调出pH=2.9的壳聚糖溶液和pH=9.5的聚赖氨酸，即为涂膜液。石英片作为基材。涂膜方法采用浸涂的方法，最后室温干燥24h。断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为4.24±0.52μm。静态接触角测试膜层显示出一定的疏水性，为96.45±2.34°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为3.53±0.43 nm。采用MTT和FDA实验结果发现对人晶状体上皮细胞毒性较低，细胞活性达到TCPS的80%，因此具有良好的细胞相容性。
实施例 8：
在250ml小烧杯中加入100ml超离子水（pH=7.0），磁力搅拌，缓慢加入0.5g的透明质酸，浓度为5mg/ml，边搅拌边缓慢加入盐酸溶液调pH到2.9继续搅拌直至溶解，同样调出pH=2.9的壳聚糖溶液和pH=9.5的聚赖氨酸，即为涂膜液，硅片作为基材。涂膜方法采用浸涂的方法，最后室温干燥24h。断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为3.84±0.32μm，静态接触角测试膜层显示出一定的疏水性，为98.45±2.04°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为2.53±0.23 nm。该涂层在PBS中浸泡24h，用场发射扫描电镜观察断面，发现该膜层均匀和稳定存在于硅片表面，表明预处理提高了膜层的粘结性能。采用MTT和FDA实验结果发现对人晶状体上皮细胞细胞毒性较低，细胞活性达到TCPS的75%，因此具有良好的细胞相容性。
实施例 9：
选取不锈钢作为基材，将质量浓度为5mg/ml的壳聚糖和质量浓度为5mg/ml的透明质酸以及5mg/ml赖氨酸溶液作为喷涂液，将喷涂液加入到雾化器中，喷涂在基材上1s，在60℃烘箱干燥20min，此操作重复5次，经自然干燥处理12h和真空干燥处理12h。获得酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层。
断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为1.65±0.32μm。静态接触角测试膜层显示出一定的疏水性，为97.54±2.53°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为1.85±0.33 nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌性能，结果显示该膜层能在24 h杀死76%的大肠杆菌和98%的金黄色葡萄球菌。抗细菌黏附实验发现和未涂膜的的基材相比，该多层膜降低了94%的大肠杆菌黏附和97%的金黄色葡萄球菌的黏附。
实施例 10：
选取云母作为基材，将质量浓度为2 mg/ml的壳聚糖和质量浓度为1mg/ml的透明质酸以及1mg/ml赖氨酸溶液分别作为喷涂液，将喷涂液加入到雾化器中，喷涂在基材上1s，在60℃烘箱干燥20min，此操作重复10次，经自然干燥处理12h和真空干燥处理12h。最后室温干燥24h，获得酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层。
断面场发射扫描电镜测试膜层的厚度为1.06±0.22μm。静态接触角测试膜层显示出一定的疏水性，为102.45±1.24°，原子力显微镜观察形貌发现表面具有很低的粗糙度，RMS为2.45±0.23 nm。摇瓶培养和稀释涂平板法测试膜层的杀菌性能，结果显示该膜层能在24 h杀死93%的大肠杆菌和100%的金黄色葡萄球菌。抗细菌黏附实验发现和未涂膜的的基材相比，该多层膜降低了88%的大肠杆菌黏附和92%的金黄色葡萄球菌的黏附。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层，其特征在于，所述的层层自组装多层膜涂层包括经聚乙烯亚胺预处理过的基材，所述的基材上涂抹有透明质酸、壳聚糖和聚赖氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层，其特征在于，所述的基材为玻璃、硅片、硅凝胶、云母、不锈钢中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层，其特征在于，所述的层层自组装多层膜涂层表面的静态接触角为95-102±1.2-2.5°。
4.根据权利要求1所述的一种酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层，其特征在于，所述的层层自组装多层膜涂层表面的粗糙度RMS为1.85-4.23±0.23-0.54nm。
5.一种酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将基材依次用乙醇和去离子水超声清洗，然后用N2吹干，清洗过的基材分别在5mg/ml的聚乙烯亚胺溶液中处理，然后N2吹干，得到表面预处理的基材；
（2）将经表面预处理的基材分别在透明质酸溶液、壳聚糖溶液、聚赖氨酸溶液中涂抹处理，N2吹干，后室温干燥，得到最终所述的酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层产物。
6.根据权利要求5所述的酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）中的经表面预处理的基材依次经透明质酸/壳聚糖溶液和透明质酸/聚赖氨酸溶液涂抹处理。
7.根据权利要求5所述的酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层的制备方法，其特征在于，所述的涂抹处理为层层自组装、浸涂、喷涂、旋涂中的一种。
8.根据权利要求5所述的酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层的制备方法，其特征在于，所述的透明质酸溶液、壳聚糖溶液、聚赖氨酸溶液质量浓度为1mg/ml。
9.根据权利要求8所述的酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层的制备方法，其特征在于，所述的1mg/ml 透明质酸溶液和1mg/ml壳聚糖溶液的pH值为2.9，1mg/ml聚赖氨酸溶液pH值为9.5。
10.根据权利要求7所述的酶响应智能抗细菌粘附和杀菌的层层自组装多层膜涂层的制备方法，其特征在于，所述的层层自组装方式为：将预处理后基材在透明质酸溶液中浸泡8min，用相同pH的洗液中浸泡1~2s，用N2吹干，再浸入壳聚糖溶液中浸泡8min，同样用相同pH的洗液中浸泡1~2s，用N2吹干反复，此操作重复10次，再将处理后的基材以同样的方法在透明质酸/聚赖氨酸中反复浸涂10次。
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