CN111615401A - 免疫原性组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种包含自组装肽作为佐剂、且可增强多种抗原的免疫原性的免疫原性组合物。根据本发明，提供一种免疫原性组合物，包括：肽水凝胶，包含具有正电荷或负电荷的自组装肽与水性介质；以及抗原，所述自组装肽与所述抗原并不进行共价键结。

Description

免疫原性组合物
技术领域
本发明涉及一种包含抗原以及肽水凝胶(peptide hydrogel)的免疫原性组合物及其制造方法。
背景技术
自组装肽(self-assembling peptide)是可在水溶液中经由肽分子彼此的相互作用而自发地组装并形成纳米纤维(nanofiber)的肽。所述自组装肽的用途例如遍及细胞培养用基材、止血材料、骨填充材料、药物释放(drug delivery)基材、人工玻璃体、眼科用手术辅助材料、化妆品、褥疮制剂等多方面(例如，专利文献1)。
近年来，提出有RADARADARADARADA(序列编号：18)等自组装肽的作为佐剂(adjuvant)的利用(专利文献2、专利文献3、非专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2010/103887
专利文献2：US2012/0282292A1
专利文献3：日本专利特表2014-512385号公报
非专利文献
非专利文献1：《疫苗(Vaccine.)》2016Nov 4；34(46)：5479-5482
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供一种包含自组装肽作为佐剂、且可增强多种抗原的免疫原性的免疫原性组合物。
解决问题的技术手段
根据本发明的一个方面，提供一种免疫原性组合物，包括：肽水凝胶，包含具有正电荷或负电荷的自组装肽与水性介质；以及抗原，所述自组装肽与所述抗原并不进行共价键结。
在一个实施方式中，所述自组装肽在生理性pH值下每个所述肽分子中具有+3、+2、-3或-2的电荷。
在一个实施方式中，所述自组装肽在生理性pH值下每个所述肽分子中具有+3或+2的电荷。
在一个实施方式中，构成所述自组装肽的氨基酸残基数为10～32。
在一个实施方式中，所述免疫原性组合物以0.3w/v％～2.0w/v％的浓度包含所述自组装肽。
在一个实施方式中，所述自组装肽为包含下述氨基酸序列(A)的肽。
氨基酸序列(A)：a1b1c1b2a2b3db4a3b5c2b6a4
(所述氨基酸序列中，a1～a4分别表示为碱性氨基酸残基；b1～b6分别表示为无电荷极性氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基，其中，b1～b6中的至少五个为疏水性氨基酸残基；c1及c2分别表示为酸性氨基酸残基；d表示为疏水性氨基酸残基或无电荷极性氨基酸残基)
在一个实施方式中，所述自组装肽是选自序列编号1～序列编号16所表示的肽中。
在一个实施方式中，所述自组装肽是选自序列编号1、序列编号15及序列编号16所表示的肽中。
在一个实施方式中，所述抗原的分子量为6.0kDa～1.0×103kDa。
在一个实施方式中，所述抗原包含在生理性pH值下具有正电荷的蛋白质。
在一个实施方式中，所述抗原包含源自食品、螨虫、室内尘埃(house dust)、植物或动物的抗原。
在一个实施方式中，所述抗原包含螨虫过敏的抗原、鸡蛋过敏的抗原或花粉。
在一个实施方式中，所述抗原包含选自卵白蛋白、酪蛋白(casein)、溶菌酶(lysozyme)及木瓜蛋白酶(papain)所组成的组群中的至少一种。
发明的效果
根据本发明的免疫原性组合物，通过适当选择自组装肽，可增强多种抗原的免疫原性。
附图说明
图1是连续滴眼各被实验试样后的豚鼠(guinea pig)的前眼部的照片。
图2是第1次给药后所制作的背部的组织标本图像。
图3是第2次给药后所制作的背部的组织标本图像。
图4是表示给药各被实验试样后的小鼠(mouse)的血中免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)浓度的图表。
图5A是表示给药各被实验试样后的小鼠的血中IgG浓度的图表。
图5B是表示给药各被实验试样后的小鼠的血中IgG浓度的图表。
图5C是表示给药各被实验试样后的小鼠的血中IgG浓度的图表。
图5D是表示给药各被实验试样后的小鼠的血中IgG浓度的图表。
图6A是给药各被实验试样后的小鼠背部的组织标本图像。
图6B是给药各被实验试样后的小鼠背部的组织标本图像。
图6C是给药各被实验试样后的小鼠背部的组织标本图像。
具体实施方式
以下，对本发明的优选的实施方式进行说明，但本发明并不限定于这些实施方式。
[A.免疫原性组合物]
本发明的免疫原性组合物包括：肽水凝胶，包含具有正电荷或负电荷的自组装肽与水性介质；以及抗原，所述自组装肽与所述抗原并不进行共价键结。再者，“自组装肽与抗原并不进行共价键结”的记载是指自组装肽与抗原并不有目的地进行共价键结，并且不排除根据pH值环境或保管环境等而会无目的地产生的微少的共价键的存在。再者，如根据说明书整体的记载而明确般，在本发明的免疫原性组合物中，肽水凝胶与抗原并非各自分开地存在，而是抗原以浑然一体化的状态存在于水凝胶中。因此，本发明的免疫原性组合物也可换种说法为“一种凝胶状免疫原性组合物，包含：具有正电荷或负电荷的自组装肽与水性介质以及抗原，所述自组装肽与所述抗原并不进行共价键结”。
由于包含肽水凝胶，因此具代表性的是所述免疫原性组合物也为凝胶。其中，肽水凝胶是通过自组装肽的经由非共价键的自组装化而形成，且可通过搅拌、振动、剪切的赋予等物理性刺激，暂时取得溶胶的形态。因此，所述免疫原性组合物也可对应于物理性刺激而溶胶化，但其后可随时间经过而再次凝胶化。因此，本发明的免疫原性组合物只要具有凝胶化能力，则也可为具有流动性的状态。再者，在本说明书中，所谓凝胶是指固化为冻胶(jelly)状的胶体分散体系。在一个实施方式中，凝胶为失去流动性的溶胶，且可抵抗重力并维持其形状。
免疫原性组合物的在37℃的温度条件下、且利用旋转式流变仪(rheometer)测定的存储弹性模量例如为10Pa以上，优选为50Pa以上，更优选为100Pa以上，进而优选为200Pa以上，另外，例如为2000Pa以下，优选为1500Pa以下，更优选为1000Pa以下。
免疫原性组合物的pH值优选为设定为可维持自组装肽的生理性pH值(7.4)下的电荷的pH值(结果，为肽水凝胶带正电或带负电的pH值)。所述pH值例如可为5.0～9.0，优选为5.5～8.5。
A-1.肽水凝胶
肽水凝胶为包含具有正电荷或负电荷的自组装肽与水性介质、且通过自组装肽在水性介质中进行自组装化而形成的凝胶(自组装肽凝胶)。肽水凝胶由于包含具有正电荷或负电荷的自组装肽，因此就凝胶整体而言可带正电或带负电。
在所述免疫原性组合物中，肽水凝胶作为增强对于抗原的免疫反应的佐剂发挥功能。发挥此种效果的理由并不确定，认为其原因在于：肽水凝胶可在给药部位中在内部和/或表面长期保持抗原。
A-1-1.自组装肽
在本说明书中，所谓自组装肽是指可在水溶液中经由肽分子彼此的相互作用而自发地组装并形成纳米纤维的肽。肽分子彼此的相互作用并无特别限定，例如包含氢键结、离子间相互作用、范德瓦耳斯力(van der Waals force)等静电性相互作用、疏水性相互作用等。纳米纤维的形成例如可通过电子显微镜观察来确认。
作为自组装肽，例如可使用经由β片层(β-sheet)结构的形成而进行自组装化的肽，所述β片层结构包含亲水性相对高的面与亲水性低的面，优选为包含仅配置有疏水性氨基酸残基的疏水性面与含有极性氨基酸残基的亲水性面。作为此种自组装肽的具体例，例如可列举：2n位的氨基酸残基全部为疏水性氨基酸残基，(2n-1)位的氨基酸残基的33％以上、优选为50％以上、更优选为60％以上为极性氨基酸残基，且包含2N个或(2N-1)个氨基酸残基的肽；或者(2n-1)位的氨基酸残基全部为疏水性氨基酸残基，2n位的氨基酸残基的33％以上、优选为50％以上、更优选为60％以上为极性氨基酸残基，且包含2N个或(2N-1)个氨基酸残基的肽(n为1至N的自然数)。
如上所述的自组装肽可在水溶液中以两个β片层在将疏水性面设为内侧并重叠的状态下伸长的方式进行自组装化而形成纳米纤维。所述纳米纤维通过亲水性面彼此的相互作用而进一步组装，从而形成网络结构，由此可进行凝胶化。再者，β片层结构的形成的确认可通过如下方式进行：例如，利用圆二色测定法测定摩尔椭圆率，并对216nm的摩尔椭圆率为负值的情况进行确认。另外，也可通过如下方式进行确认：使用傅里叶变换红外光谱(Fourier-transform infrared spectroscopy，FT-IR)的分析，来检测1620cm-1附近出现的基于β片层的峰值、或1690cm-1附近出现的基于反平行β-片层的峰值。
所述疏水性氨基酸包含：丙氨酸(Ala/A)、亮氨酸(Leu/L)、异亮氨酸(Ile/I)、缬氨酸(Val/V)、蛋氨酸(Met/M)、苯基丙氨酸(Phe/F)、色氨酸(Trp/W)、甘氨酸(Gly/G)、脯氨酸(Pro/P)等非极性氨基酸。其中，优选为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸，更优选为丙氨酸及亮氨酸，进而优选为亮氨酸。
所述极性氨基酸包含精氨酸(Arg/R)、赖氨酸(Lys/K)、组氨酸(His/H)等碱性氨基酸以及天冬氨酸(aspartic acid)(Asp/D)、谷氨酸(Glu/E)等酸性氨基酸作为带电性氨基酸。酪氨酸(Tyr/Y)、丝氨酸(Ser/S)、苏氨酸(Thr/T)、天冬酰胺(asparagine)(Asn/N)、谷氨酰胺(glutamine)(Gln/Q)、半胱氨酸(cysteine)(Cys/C)等无电荷极性氨基酸也包含于极性氨基酸中。
所述自组装肽在免疫原性组合物中具有正电荷或负电荷。作为此种自组装肽，例如可优选地使用在生理性pH值下每1分子中具有+1～+3或-1～-3、优选+2、+3、-2或-3、更优选+3或+2的电荷的自组装肽。此种自组装肽可适宜地形成纳米纤维或凝胶。另外，由于可发挥通过搅拌、振动、剪切力的赋予等物理性刺激而流动性增大、且通过停止物理性刺激而流动性减小的可逆的自组装能力，因此也可适宜地应用于滴眼、喷雾、注射等给药中。另外，根据在生理性pH值下不具有电荷的自组装肽，存在可获得免疫原性的增大效果的抗原的种类受限的情况，但根据具有电荷的自组装肽，可对于多种抗原获得免疫原性的增大效果。虽不限定本发明，但推测可获得此种效果的理由在于：由具有电荷、尤其是正电荷的自组装肽形成的凝胶在细胞表面、粘膜的表面、皮下组织内等的滞留性优异。
所述自组装肽的电荷是指所述肽分子中所含的氨基酸残基的电荷的总和。生理性pH值下的所述电荷例如可在蛋白质计算器(PROTEIN CALCULATOR)v3.4的网站(http://protcalc.sourceforge.net/)上使用可利用的程序来算出。
构成所述自组装肽的氨基酸残基数例如为8～60，优选为10～40，更优选为10～32，进而优选为12～32。肽的N末端氨基和/或C末端羧基可适宜地由乙酰基、酰胺基等保护基保护。
作为所述自组装肽，可例示包含下述氨基酸序列(A)的肽。关于所述肽，视需要，其N末端氨基可经乙酰化，C末端羧基也可经酰胺化。
氨基酸序列(A)：a1b1c1b2a2b3db4a3b5c2b6a4
(所述氨基酸序列中，a1～a4分别表示为碱性氨基酸残基；b1～b6分别表示为无电荷极性氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基，其中，b1～b6中的至少五个为疏水性氨基酸残基；c1及c2分别表示为酸性氨基酸残基；d表示为疏水性氨基酸残基或无电荷极性氨基酸残基)。
在一个实施方式中，所述氨基酸序列中，b1～b6全部为疏水性氨基酸残基。b1～b6可分别独立地为丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、或异亮氨酸残基，优选为丙氨酸残基或亮氨酸残基，更优选为b1～b6全部为亮氨酸残基，或者五个为亮氨酸残基，一个为丙氨酸残基。
在一个实施方式中，所述氨基酸序列中，d为丙氨酸残基、亮氨酸残基、天冬酰胺残基、丝氨酸残基或谷氨酰胺残基。
在一个实施方式中，所述氨基酸序列中，a1～a4全部为精氨酸或赖氨酸，优选为精氨酸。
在一个实施方式中，所述氨基酸序列中，c1及c2全部为天冬氨酸或谷氨酸，优选为天冬氨酸。
本发明中可使用的自组装肽并不限定于包含所述氨基酸序列(A)的肽。例如，可将WO2007/000979中记载的肽应用于本发明中。
作为所述自组装肽的具体例，例如可列举序列编号1～序列编号16所表示的肽。在可获得本发明的效果的范围内，自组装肽可单独使用一种，也可将两种以上组合使用。
[表1]
氨基酸序列 pH值7.4下的电荷 序列编号
n-RLDLRLALRLDLR-c +2 1
n-RLDLRLLLRLDLR-c +2 2
n-RADLRLALRLDLR-c +2 3
n-RLDLRLALRLDAR-c +2 4
n-RADLRLLLRLDLR-c +2 5
n-RADLRLLLRLDAR-c +2 6
n-RLDLRALLRLDLR-c +2 7
n-RLDLRLLARLDLR-c +2 8
n-LELSLELSLELS-c -3 9
n-SLDLKLDLSLDL-c -2 10
n-SAEAKAEASAEAKAEA-c -2 11
n-SAEASAEASAEAKAEA-c -3 12
n-RLNLRLDLRLNL-c +2 13
n-RAQARAQARAQARAQA-c +4 14
n-RLDLRLSLRLDLR-c +2 15
n-RLDLRLNLRLDLR-c +2 16
关于自组装肽的调配量，例如可以所述免疫原性组合物中的自组装肽浓度成为0.1w/v％～5.0w/v％、优选0.2w/v％～3.0w/v％、更优选0.3w/v％～2.0w/v％、进而优选0.4w/v％～1.5w/v％的方式进行设定。
A-1-2.水性介质
作为水性介质，可列举：水、生理盐水、缓冲盐水、磷酸缓冲液、等张水性缓冲液、与乙醇等低级醇的混合水溶液等。水性介质视需要也可进而包含药学上可容许的添加物。添加物可由本领域技术人员根据免疫原性组合物的用途、制剂等来适当地选择。作为添加物，例如可列举：pH值调整剂、等张化剂、防腐剂、赋形剂、稳定化剂、填充剂、溶解剂等。添加物可单独使用一种，也可将两种以上组合使用。
作为pH值调整剂，例如可列举：柠檬酸、柠檬酸三钠、琥珀酸、琥珀酸一钠、琥珀酸二钠、乙酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、磷酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、组氨酸、赖氨酸等。
作为等张化剂，例如可列举：氯化钠、聚乙二醇、葡聚糖、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、葡萄糖、果糖(fructose)、乳糖、木糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖(raffinose)等。
A-2.抗原
所述抗原为具有免疫原性的物质。抗原可为肽、蛋白质(包含糖蛋白、脂蛋白)、核苷酸(nucleotide)、碳水化合物、脂质(包含糖脂质、磷脂质)或这些的衍生物，优选为蛋白质。抗原可单独使用一种，或者也可将两种以上组合使用。
所述抗原的分子量(kDa)例如为6.0以上，优选为8.0以上，更优选为1.0×10以上。抗原的分子量例如可设为1.0×103以下。
所述抗原可根据免疫原性组合物的用途、目的等来适当地选择。例如，在免疫原性组合物以过敏性疾病(allergic disease)的治疗、研究等为目的的情况下，抗原包含使所述过敏性疾病产生的抗原(过敏原(allergen))。
作为使过敏性疾病产生的抗原，可为食物性，也可为吸入性。食物性抗原通常源自食品，作为具体例，可列举：鸡蛋过敏的抗原(例如，卵清蛋白(ovalbumin)、卵类粘蛋白(ovomucoid)、溶菌酶、卵运铁蛋白(ovotransferrin))、奶过敏的抗原(例如，酪蛋白、α-乳球蛋白(α-lactoglobulin)、β-乳球蛋白)、小麦过敏的抗原(例如，谷蛋白(gluten)、麦醇溶蛋白(gliadin)、麦谷蛋白(glutenin))、花生过敏的过敏原(例如，Ara h1)、鱼过敏的过敏原(例如，源自鳕鱼的Gad c1)等。吸入性的抗原可源自螨虫、室内尘埃、植物(花粉等)、动物(毛、皮肤成分等)等，作为具体例，可列举螨虫过敏的抗原(例如，Der f1、Der p1、Der f2、Der p2)、蟑螂过敏的抗原(例如，Bla g1)等。另外，由于与Der f1及Der p1属于相同的蛋白质家族(半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease))，并且具有类似的蛋白质结构，因此作为螨虫过敏原(mite allergen)的模型蛋白质来使用的木瓜蛋白酶也可作为抗原来利用。
另外，例如，在免疫原性组合物以感染症的预防、治疗等为目的的情况下，抗原包含源自使所述感染症产生的病原体的抗原。
作为源自使所述感染症产生的病原体的抗原，可列举：源自流行性感冒病毒(influenza virus)、肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)、RS病毒、风疹病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、疱疹病毒(herpes virus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、轮状病毒(rotavirus)、乙型脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus)、水痘病毒、腺病毒(adenovirus)、狂犬病病毒、黄热病病毒等病毒的抗原；源自白喉杆菌、破伤风杆菌、百日咳杆菌、流行性感冒杆菌、结核杆菌、肺炎球菌、幽门螺杆菌(helicobacter pylori)、炭疽杆菌、伤寒沙门氏菌、脑膜炎球菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌等细菌的抗原；源自念珠菌真菌、组织胞浆菌真菌、隐球菌真菌、曲霉菌真菌等真菌的抗原。
在一个实施方式中，抗原包含在生理性pH值下具有正电荷的蛋白质。在生理性pH值下不具有电荷的自组装肽存在对于在生理性pH值下具有正电荷的蛋白质并不显示出免疫原性的增大效果的情况，但具有电荷的自组装肽对于具有正电荷的蛋白质也可发挥免疫原性的增大效果，因此可更适宜地获得作为佐剂的效果。再者，在生理性pH值下具有正电荷的蛋白质可为等电点为7.5以上、优选8.0以上、更优选8.5以上的蛋白质。
所述免疫原性组合物中的抗原的调配量例如可设为1.0×10-3mg/mL～10.0mg/mL、优选1.0×10-2mg/mL～5.0mg/mL、更优选5.0×10-2mg/mL～1.0mg/mL。
[B.免疫原性组合物的制造方法]
所述免疫原性组合物可通过如下方式获得：将包含自组装肽与水性介质的肽组合物、和抗原或抗原水溶液混合；将自组装肽、与水性介质、以及抗原或抗原水溶液混合等。如上所述，刚混合后的免疫原性组合物可具有流动性，但其后可随时间经过而进行凝胶化。视需要，可对混合前的各成分或混合物进行杀菌。作为混合方法及杀菌方法，可分别使用可在本技术领域中应用的任意的适当的方法。
在一个实施方式中，所述免疫原性组合物的制造方法包括：
(A-I)确定抗原与具有正电荷或负电荷的自组装肽的组合的工序；以及(A-II)将所确定的组合的抗原与自组装肽、和水性介质混合的工序。
关于所述抗原与具有正电荷或负电荷的自组装肽的组合，并无特别限制，例如，在抗原具有蛋白酶活性的情况下，优选为选择对所述蛋白酶活性的感受性低的自组装肽。另外，当抗原包含在生理性pH值下具有正电荷或负电荷的蛋白质的情况下，优选为选择在生理性pH值下每1分子中具有优选+2、+3、-2、或-3、更优选+3或+2的电荷的自组装肽。
关于所确定的组合的抗原与自组装肽、和水性介质的混合，如上所述，可通过如下方式进行：将包含自组装肽与水性介质的肽组合物、和抗原或抗原水溶液混合；将自组装肽、与水性介质、以及抗原或抗原水溶液混合等。
[C.免疫原性组合物的使用方法]
所述免疫原性组合物可出于如下目的来使用：对接种对象的个体赋予对于目标抗原的免疫(获得免疫)、诱发对于目标抗原的免疫反应的降低(降敏作用)或无反应化(脱敏作用)等。免疫原性组合物的接种(给药)例如可采用经皮、肌肉内、静脉内、腹腔内、经粘膜(经口、经鼻、舌下、滴眼、经肠)等接种方法。
接种对象并无特别限定，作为例子，可列举：人以及人以外的各种动物(猴子、黑猩猩、猪、牛、马、山羊、绵羊、鸡、鹌鹑、鸭、鸵鸟、狗、猫、兔子、仓鼠、小鼠、大鼠(rat)、豚鼠、兔子等)。
关于所述免疫原性组合物中所使用的自组装肽，具代表性的是能够可逆地进行自组装化(凝胶化)。因此，即便在因自组装肽的自组装化而免疫原性组合物的粘性变高的情况下，通过施加剪切力也可降低其粘性，可容易地进行基于注射、滴眼、喷雾等的给药。所给药的免疫原性组合物可在给药部位再次进行自组装化，并且可在给药部位长期进行抗原呈递。
所述免疫原性组合物可作为不含溶媒的干燥制品来进行制造及保存。干燥状态的免疫原性组合物可在添加及混合水性介质并制成水性组合物(也可为溶胶或凝胶)后使用(给药)。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明不受这些实施例的限定。实施例中所使用的测定方法以及评价方法为如下所述。
＜存储弹性模量的测定方法＞
使用作为动态粘弹性测定装置的旋转式流变仪(TA仪器(TA instruments)公司制造，制品名“高级流变仪(ADVANCED RHEOMETER)AR 1000”)对试样的存储弹性模量G'进行测定。具体而言为如下所述。首先，在流变仪上安装用于与试样接触的夹具(geometry)(铝制圆锥，直径20mm，锥角1°，间隙24μm)、以及用于将试样台保持为一定温度的恒温槽。继而，在温度：37℃、扭矩：1μN·m、频率：0.5rad/s～100rad/s的测定条件下，按照以下测定顺序对1个试样进行3次测定，并将1rad/s时的值的平均值设为存储弹性模量G'。
(1)使用移液管(pipette)将55μL的试样配置于流变仪的试样台上。
(2)使夹具在自试样台起至24μm的间隙为止的范围内移动，使其与试样接触。
(3)略微挪动夹具，使其与试样融合。
(4)在停止夹具的运动15秒后(在所述15秒的期间内，安装用于防止溶媒自试样挥发的溶剂捕集器(solvent trap))，开始测定。
＜pH值的测定方法＞
pH值是使用便携式pH值计(堀场制作所公司制造，制品编号“B-712”)来测定。
[肽组合物的制备]
1.肽组合物A：
使用商品名“帕那刻亚凝胶(PanaceaGel)”(美尼康(Menicon)公司制造，包含1.5w/v％的自组装肽(Ac-RLDLRLALRLDLR-CONH2(序列编号：1))、等张化剂、pH值调整剂及水的经高压蒸汽杀菌的肽组合物，pH值5.9，存储弹性模量515.5Pa)作为肽组合物A。
2.肽组合物B～肽组合物D：
依照表2所示的组成将各成分混合及溶解，在121℃下进行20分钟高压蒸汽杀菌，获得肽组合物B～肽组合物D。再者，使用序列编号15及序列编号16的肽制备的肽组合物B及肽组合物C的存储弹性模量分别为704.7Pa及578.5Pa。另一方面，使用序列编号17的肽制备的肽组合物D的存储弹性模量为73.4Pa。
[表2]
Figure BDA0002573156280000121
[实验例1]
对于雌性的哈特利(Hartley)系豚鼠(日本SLC公司制造)，将初次给药日设为第1天并以每周4次～5次的频率按照每只眼10μL的给药量滴眼表3所示的被实验试样直至第21天为止，观察前眼部的状况(N＝1)。将第21天的滴眼后所拍摄的前眼部的照片示于图1中。
[表3]
Figure BDA0002573156280000122
OVA：卵白蛋白(等电点：4.5，和光纯药公司制造，Cat.No.(产品目录号(catalognumber))018-09882)
如图1所示般，滴眼被实验试样1后的个体中，在连续滴眼后的前眼部并无特殊反应，并未看到充血及流泪。滴眼被实验样品2后的个体中，自滴眼第7天起，豚鼠逐渐在滴眼后出现眨眼、半闭眼，且随着天数的经过，这些反应变显著。滴眼第21天时，滴眼5分钟后看到巩膜、结膜的浮肿、充血及流泪。滴眼被实验试样3后的个体中，自滴眼第14天起，豚鼠逐渐在滴眼后出现眨眼、半闭眼。其中，相较于滴眼被实验试样2后的个体而言，均为轻度。滴眼第21天时，滴眼5分钟后看到巩膜、结膜的浮肿、充血及流泪，确认到与滴眼被实验试样2后的个体为相同程度的症状。滴眼被实验试样4后的个体中，虽在刚滴眼后看到几次眨眼，但并未确认到充血、流泪等反应。
根据以上观察结果，推测：刚滴眼肽组合物A后的眨眼是由凝胶滴眼带来的物理刺激引起的，当在经粘膜疫苗中使用肽组合物A的情况下，具有在不激发相对于自身的抗体产生的情况下促进相对于抗原的抗体产生的效果。
[实验例2]
对于1次给药群组的雌性的哈特利(Hartley)系豚鼠(日本SLC公司制造)，在背部两处皮内给药表3所示的被实验试样各0.1mL，自给药起3天后使其安乐死(N＝1)。其后，采集给药处的皮肤来制作组织标本，并观察炎症反应及免疫反应的有无。将第1次给药后所制作的背部的组织标本图像示于图2中。对于2次给药群组的雌性的哈特利(Hartley)系豚鼠(日本SLC公司制造)，在第1天与第8天，分别在背部两处皮内给药表3所示的被实验试样各0.1mL，自第2次给药起6天后使其安乐死(N＝1)。其后，采集给药处的皮肤来制作组织标本，并观察炎症反应及免疫反应的有无。将第2次给药后所制作的背部的组织标本图像示于图3中。
关于第1次给药后的组织标本观察的结果，如图2所示般，给药被实验试样1后的个体中，并未看到上皮的异常，另外，也未确认到细胞浸润。给药被实验试样2后的个体中，表皮明显肥厚且看到多房性水疱。另外，在给药部位确认到大量细胞。给药被实验试样3后的个体中，观察到表皮稍微肥厚、且在给药处周边残存被实验试样3而细胞集聚的状况。给药被实验试样4后的个体中，也同样确认到表皮的肥厚与被实验试样4的残存，且观察到细胞聚集的状况。根据以上情况，认为肽组合物A发挥召集炎症细胞的作用。
另外，如图3所示般，2次给药群组的给药被实验试样1后的个体中，并未看到上皮的异常，仅确认到极少的细胞浸润。相对于此，给药被实验试样2后的个体中，皮肤收缩而形成痂皮，且细胞在皮内聚集。给药被实验试样3后的个体中，虽观察到表皮显著肥厚、且大量细胞在给药处周边聚集的状况，但并未看到痂皮形成或组织的硬质化。认为，相较于第1次给药群组而言，给药被实验试样2及被实验试样3后的个体中，均是更多的抗原呈递细胞及炎症细胞聚集，且免疫反应增强。据此，认为肽组合物A与弗氏完全佐剂(Freund'scomplete adjuvant，FCA)同样地具有佐剂能力，但不会产生痂皮形成或组织的硬质化等皮肤结构的损坏。再者，给药被实验试样4后的个体中，虽看到表皮的肥厚，但与给药被实验试样3后的个体相比，细胞的聚集少。另外，细胞浸润与1次给药群组为相同程度，且通过2次给药并未增强免疫反应。据此，认为，肽组合物A虽在刚给药后会暂时引发炎症，但其自身并无抗原性。暗示有：肽组合物A在给药后几天内引发炎症，由此，促进抗原呈递细胞的聚集，并有效地摄取抗原或产生抗体。
[实验例3]
将3周龄的雌性BALB/c小鼠(查尔斯河(Charles River)公司制造)分为4个群组且每个群组各6只，如表4所示般使其致敏。具体而言，在给药第0天与第7天，分别在背部两处皮内给药被实验试样各50μL，在第14天，对各群组的半数的小鼠，自下腔静脉采血(对于未处置群组，并未进行皮内给药)。对于各群组的剩余的小鼠，在第14天～第27天的期间内，以3次/周～4次/周的频率，在两鼻处滴鼻给药2mg/10μL的OVA溶液各5μL，在第28天(最后进行滴鼻24小时后)，自下腔静脉采血。
[表4]
Figure BDA0002573156280000141
所采集的血液并未进行肝素(heparin)处理，而是在4℃下保存一晚后，在4℃、1200g下进行20分钟离心分离，采集上清液(血清)。使用制品名“小鼠免疫球蛋白G酶联免疫试剂盒(MouseIgG ELISA kit)”(生命诊断(Life Diagnostics Inc.)公司制造)，测定血中的IgG。再者，血清是使用试剂盒所附带的稀释缓冲液(Dilution Buffer)稀释为200,000倍。将结果示于图4中。
如图4所示般，看到如下倾向：在给药群组A-1～给药群组A-3的任一群组中，血中IgG浓度的值与激发(滴鼻给药)前相比，激发后均显著变高。给药群组A-2及给药群组A-3中，IgG值的上升特别大。未处置群组的IgG浓度低，激发后也未确认到浓度的上升。
另外，对小鼠进行观察，结果，给药1周后，给药群组A-2及给药群组A-3的小鼠的背部皮内隆起，形成痂皮。另一方面，给药群组A-1及未处置群组的小鼠中，并未确认到异常。关于滴鼻给药，自给药第4天前后起，所有的群组中均看到半闭眼或打颤、挠鼻、毁坏垫料的行为等。这些症状是在给药4分钟～5分钟后开始出现且在15分钟～30分钟左右的时间内间歇性地确认到这些症状。若继续给药，则虽看到其频率有上升的倾向，但在群组之间并未确认到显著的差异。
[实验例4]
将5周龄的雌性BALB/c小鼠(查尔斯河(Charles River)公司生产)分组至各给药群组且每个群组各2只，并将3只作为未处置群组。在给药第0天、第7天及第14天，对相应群组的小鼠皮内给药表5中记载的被实验试样100μL。在第3次给药7天后(给药第21天)，自各小鼠(包括未处置群组在内)的下腔静脉进行采血。所采集的血液是在25℃下培养(incubate)30分钟后，在4℃下保存一晚使血块凝聚，在1000×g～1200×g下、且4℃下进行20分钟离心分离，采集上清液。使用IgG ELISA试剂盒对所采集的血清的血中IgG值进行测定。再者，血清是使用试剂盒所附带的稀释缓冲液(Dilution Buffer)稀释为200,000倍。将结果示于图5A～5D中。另外，采血后，采集包括第3次被实验试样的给药部位在内的背部皮肤，制成组织标本。将组织标本图像示于图6A～6C中。
再者，所述被实验试样的制备方法中，是以如下方式进行制备。即，使抗原蛋白质溶解于水中来制备抗原溶液，将所述抗原溶液、与1.5w/v％的肽组合物(表1中记载的肽组合物A～肽组合物D)或普拉麦特丽库斯(PuraMatrix)(TM)(日本康宁(Corning Japan)公司制造，包含1.0w/v％的Ac-RADARADARADARADA-CONH2(序列编号：18)的自组装肽组合物)以自组装肽浓度成为0.75w/v％、抗原蛋白质浓度成为0.25mg/mL(＝0.025w/v％)的方式混合，由此进行制备。另外，使用将所述抗原溶液与生理盐水以抗原蛋白质浓度成为0.25mg/mL的方式混合而成的物质作为对照试样。
[表5]
Figure BDA0002573156280000161
*1：蛋白质溶液与肽组合物的混合起15分钟后的形态
*2：酪蛋白(等电点＝4.6)，和光纯药公司制造，Cat.No.030-01505
*3：溶菌酶(等电点＝11.1)，和光纯药公司制造，Cat.No.120-02674
*4：木瓜蛋白酶(等电点＝8.75)，和光纯药公司制造，Cat.No.164-00172
如图5A～5D所示般，序列编号1、序列编号15及序列编号16的自组装肽凝胶即便在与任一种抗原蛋白质并用的情况下，也使其免疫原性增大。相对于此，包含序列编号18的自组装肽的普拉麦特丽库斯(PuraMatrix)(TM)对白蛋白与酪蛋白(均为在生理性pH值下具有负电荷的蛋白质)显示出免疫原性的增大作用，但对溶菌酶与木瓜蛋白酶(均为在生理性pH值下具有正电荷的蛋白质)并未显示出免疫原性的增大作用。再者，虽然图中并未示出，但给药包含序列编号17的自组装肽的流动体后的群组(OVA/SPG204)的血中IgG值与OVA/生理盐水群组为相同程度，并未确认到免疫原性的增大作用。
另外，如图6A～6C所示般，在给药包含序列编号1或序列编号15的自组装肽凝胶的被实验试样后的小鼠的皮内，自给药起7天后观察到在皮下残留有被实验试样的状况。另一方面，在给药使用生理盐水的被实验试样或使用普拉麦特丽库斯(PuraMatrix)(TM)的被实验试样后的小鼠的皮内，确认到微量的被实验试样的残留，或者并未确认到被实验试样的残留。
产业上的可利用性
本发明可适宜地在医药品的制造领域中利用。
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Claims (15)

1.一种免疫原性组合物，包括：肽水凝胶，包含具有正电荷或负电荷的自组装肽与水性介质；以及抗原，所述自组装肽与所述抗原并不进行共价键结。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述自组装肽在生理性pH值下每个所述肽分子中具有+3、+2、-3或-2的电荷。
3.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述自组装肽在生理性pH值下每个所述肽分子中具有+3或+2的电荷。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫原性组合物，其中构成所述自组装肽的氨基酸残基数为10～32。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫原性组合物，其中以0.3w/v％～2.0w/v％的浓度包含所述自组装肽。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述自组装肽为包含下述氨基酸序列(A)的肽，
氨基酸序列(A)：a1b1c1b2a2b3db4a3b5c2b6a4
(所述氨基酸序列中，a1～a4分别表示为碱性氨基酸残基；b1～b6分别表示为无电荷极性氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基，其中，b1～b6中的至少五个为疏水性氨基酸残基；c1及c2分别表示为酸性氨基酸残基；d表示为疏水性氨基酸残基或无电荷极性氨基酸残基)。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述自组装肽是选自序列编号1～序列编号16所表示的肽中。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述自组装肽是选自序列编号1、序列编号15及序列编号16所表示的肽中。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述自组装肽包含序列编号1所表示的肽。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原的分子量为6.0kDa～1.0×103kDa。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原包含在生理性pH值下具有正电荷的蛋白质。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原包含源自食品、螨虫、室内尘埃、植物或动物的抗原。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原包含螨虫过敏的抗原、鸡蛋过敏的抗原或花粉。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原包含选自卵白蛋白、酪蛋白、溶菌酶及木瓜蛋白酶所组成的组群中的至少一种。
15.一种免疫原性组合物的制造方法，其制造如权利要求1至14中任一项所述的免疫原性组合物，所述制造方法包括：
(A-I)确定抗原与具有正电荷或负电荷的自组装肽的组合的工序；以及
(A-II)将所确定的组合的抗原与自组装肽、和水性介质混合的工序。
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