CN105873638A - 免疫原性化合物 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及包含免疫刺激性部分和肽部分的免疫刺激性化合物。所述肽部分不是疾病相关免疫原。此外，所述肽部分具有其中75％或更少的氨基酸残基为疏水性的氨基酸序列和/或具有为5或更大的等电点。本发明的化合物解决了引起不想要的副作用的免疫刺激剂的全身性分布的问题。本发明人已发现免疫刺激剂的物理化学性质可受与肽的共价键联控制。可通过包含另外的特性以有用的方式修饰另外的物理化学性质。

Description

免疫原性化合物
发明领域
本发明涉及新型免疫刺激性化合物以及所述化合物在医学中、特别是作为疫苗佐剂的用途。
发明背景
活的减毒或灭活的细菌和病毒已经形成了许多成功的疫苗的基础。全病毒或细菌的方法仍然是通过疫苗接种产生保护性免疫的最有效的手段。然而，这些疫苗可与轻度至严重的副作用相关。此外，疫苗相关疾病的罕见病例可因减毒病毒至强毒力形式的逆转而引起。基因组学、分子生物学和免疫学的进展已经促进来自感染性生物体的保护性抗原的鉴定、重组表达和免疫学表征，从而允许更合理的方法来进行疫苗设计。目前，纯化的天然的或重组的肽、蛋白质或多糖(与载体蛋白连接的)提供了相对于活的或杀死的全细胞疫苗要清洁、安全、免疫学上更明确得多的替代方案。然而，这些“更纯的”疫苗制剂缺乏激活先天免疫应答所需的危险信号，因此必须利用强效的佐剂或递送系统来进行递送，以产生保护性适应性免疫应答。
疫苗佐剂可用于多种目的，诸如例如以增强疗效，减少抗原的量和/或需要的剂量数，提高应答的速度和/或强度，增加应答的广度(例如，以针对多个表位(诸如可能起因于病原体进化)提供保护)，以及增强应答的持续时间和/或引发以后应答的能力(记忆)。例如，最近增加的对佐剂的兴趣关注它们在弱免疫原(诸如大流行性流感疫苗H5N1)、制造能力不足(节约剂量)以及更广泛的特异性免疫应答(突变病毒)的情况下的使用。佐剂对于老年人(其受免疫衰老机制的约束)、儿童(具有低的预先存在免疫力)和具有低的响应疫苗接种能力的免疫受损个体的疫苗接种也潜在地重要。
存在和与施用疫苗结合的佐剂用于刺激免疫系统的用途相关的某些挑战。首先，共同递送疫苗的抗原成分和免疫刺激性成分并将其维持在注射部位、至少直至接触免疫细胞是重要的。这对于最大化佐剂的益处是重要的，但对于降低毒性也可以是必需的。免疫刺激剂(诸如Toll-样受体(TLR)或Nod-样受体(NLR)的激动剂)通常是小分子，其可容易地被运输遍布身体。因此，它们可因全身反应(诸如触发自身免疫性疾病)而引起不可接受的临床副作用。
已知将免疫刺激剂共价连接至所需抗原，以确保抗原和免疫刺激剂二者可一起被提呈给免疫细胞。例如，WO 2012/167088描述了通过包含聚乙二醇的接头共价连接至抗原的“免疫应答调节剂”。WO2004/032829描述了包含与抗原性部分‘配对’的免疫应答调节剂部分的免疫刺激性组合物，其中可借助于共价键进行配对。WO2006/116475描述了共价连接至抗原性肽的免疫应答调节剂。
还已知修饰免疫刺激剂的化学结构以帮助递送。例如，WO2012/024284和WO 2010/048520描述了共价连接至脂质、使得能够进行配制或改善生物利用度的免疫刺激剂。
发明概述
本发明人已经解决了引起不希望的副作用的免疫刺激剂的全身性分布的问题。本发明人已经发现，免疫刺激剂的物理化学性质可以通过至肽的共价键来被进行控制。其它物理化学性质可通过并入另外的特征来进行修饰。
因此，本发明提供了包含免疫刺性激剂部分和肽部分的化合物，其中所述肽部分：
(a)不是疾病相关抗原；
(b)具有其中75％或更少的氨基酸残基是疏水性的氨基酸序列；和/或
(c)具有为5或更大的等电点。
本发明还提供了包含免疫刺激性部分、肽部分和载体部分的化合物。
本发明还提供：肽降低免疫刺激剂在细胞外液中的溶解度的用途，其中所述肽共价连接至所述免疫刺激剂；用于通过疗法治疗人或动物体的方法的本发明的化合物；包含本发明的化合物和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物；用于通过疗法治疗人或动物体的方法的本发明的药物组合物；用于刺激动物或人对抗原的免疫应答的本发明的药物组合物；以及用于制造用于刺激针对抗原的免疫应答的药剂的本发明的化合物。
附图概述
如在实施例中所证实的，图1描绘了针对与不同免疫刺激性肽缀合物组合的重组蛋白的T细胞免疫应答的改善。利用单独的12.5μg HA或其加上13.2μg PEG-FIM-01或15μg PEG-FIM-01(等摩尔剂量)免疫雌性BALB/c小鼠。条棒代表如在IFN-g ELISpot中测量的斑点形成细胞的平均数目。计数每106个脾细胞的IFNγSFC数目。条棒代表针对HA的应答的平均值±SEM。统计分析基于Student T检验。
如在实施例中所证实的，图2描绘了针对与不同免疫刺激性肽缀合物组合的重组蛋白的体液应答的改善。利用单独的12.5μg HA或其加上13.2μg PEG-FIM-01或15μg PEG-FIM-01(等摩尔剂量)免疫雌性BALB/c小鼠。非免疫的小鼠用作阴性对照。数据显示为平均EC50稀释-1的平均值+标准误差。经对数转化的数据用于使用Student T检验的统计分析，其中*<0.05，**<0.01以及***<0.001。
如在实施例中所证实的，图3描绘了与不同免疫性肽缀合物组合的肽疫苗的免疫原性的改善。利用(1)单独的FP-02.2(25mcg/肽)、(2)FP-02.2(25mcg/肽)+FA-FIM-01(5mcg)、(3)FP-02.2(25mcg/肽)+FA-PEG-FIM-01(5mcg)免疫雌性BALB/c小鼠。条棒代表如在IFN-gELISpot中测量的对于FP-02.2疫苗中包含的每种肽的斑点形成细胞的累积平均数目。统计分析基于Student T检验。
如在实施例中所证实的，图4描绘了在不同剂量的免疫刺激性肽缀合物存在的情况下改善的疫苗免疫原性。利用单独的FP-02.2(25mcg/肽)或其与(1)0mcg、(2)0.5mcg、(3)1.58mcg、(4)5mcg、(5)15.8mcg和(6)50mcg的不同剂量的FA-PEG-FIM-01的组合免疫雌性BALB/c小鼠。条棒代表如在IFN-g ELISpot测定中测量的对于FP-02.2疫苗中包含的每种肽的斑点形成细胞的累积平均数目。统计分析基于Student T检验。
如在实施例中所证实的，图5描绘了免疫刺激性肽缀合物相较于游离免疫刺激对应物R848的更优的佐剂性。利用(1)FP-02.2(25mcg/肽)、(2)FP-02.2(25mcg/肽)+FA-PEG-FIM-01(15mcg)、(3)FP-02.2(25mcg/肽)+R848(1.5mcg)、(4)FP-02.2(25mcg/肽)+R848(10mcg)和(5)FP-02.2(25mcg/肽)+R848(50mcg)免疫雌性BALB/c小鼠。条棒代表如在IFN-g ELISpot测定中测量的对于FP-02.2疫苗中包含的每种肽的斑点形成细胞的累积平均数目。统计分析基于Student T检验。
如在实施例中所证实的，图6描绘了由肽部分在免疫刺激性肽缀合物的疫苗佐剂性中所起的关键作用。利用对应于等摩尔剂量的(1)FP-02.2(25mcg/肽)+FA-PEG-FIM-01(15mcg)、(2)FP-02.2(25mcg/肽)+PEG-FIM-01(13.15mcg)、(3)FP-02.2(25mcg/肽)+RKL-PEG-FIM-01(4.3mcg)或(4)FP-02.2(25mcg/肽)+R848(1.5mcg)免疫雌性BALB/c小鼠。条棒代表如在IFN-gELISpot测定中测量的对于FP-02.2疫苗中包含的每种肽的斑点形成细胞的累积平均数目。统计分析基于Student T检验。
如在实施例中所证实的，图7描绘了与游离免疫刺激剂R848相反，免疫刺激性肽缀合物不存在全身性促炎应答。用(1)28mM L-组氨酸媒介物、(2)28mM L-组氨酸中的R848(1.5mcg)、(3)28mM L-组氨酸中的FA-PEG-FIM-01(15mcg)、(3)磷酸盐10mM中的FA-PEG-FIM-01(15mcg)(n＝4/组)单次注射雌性BALB/c小鼠。(以等摩尔剂量递送R848和FA-PEG-FIM-01)。图展示了每一个免疫组的1小时(IL-6、TNF-α、IFNα)或4小时(MCP-1、IFN-γ)时的个体样品的峰值细胞因子浓度。IL-10和IL-12p70对于所有样品是阴性的，数据未显示。统计分析基于Student T检验。
如在实施例中所证实的，图8描绘了在免疫刺激性肽缀合物存在的情况下改善的疫苗诱导的CTL应答。利用单独的FP-02.2或其加上15μg PEG-FIM-01免疫雌性BALB/c小鼠。条棒代表如在IFN-g ELISpot测定中测量的由CTL表位151诱导的斑点形成细胞的平均数目。统计分析基于Student T检验。
如在实施例中所证实的，图9描绘了免疫刺激性肽缀合物对于TLR-7和TLR-8的特异性。测试FA-PEG-FIM-01、FA-FIM-01、RLK-PEG-FIM-01和PEG-FIM-01相较于R848在表达TLR-7(A)和TLR-8(B)的HEK-293细胞中诱导NF-κB活化的能力。
发明详述
本发明提供了包含任选地通过柔性间隔子偶联至肽的免疫刺激剂的免疫刺激性化合物。所述肽可被进一步偶联至载体。本发明的化合物内的各种部分通过共价键偶联。
本发明的化合物被考虑用于疫苗以预防感染性疾病，诸如病毒、细菌、寄生虫和真菌感染。所述化合物也被考虑用于免疫治疗领域，包括感染的治疗、针对癌细胞的免疫刺激、多肽激素的下调和不适当的免疫应答，诸如过敏反应、变态反应和/或自身免疫的控制。
免疫刺激性部分
本发明的化合物包含免疫刺激性部分。如本文所用，术语“免疫刺激性部分”是指提供为化合物提供免疫刺激活性的化合物的部分。例如，免疫刺激性部分可通过除去氢原子，利用至所述化合物的其余部分的共价键替代至氢的共价键来从已知的免疫刺激剂衍生。
如本文所用，术语“免疫刺激活性”是指刺激个体的免疫系统的能力。免疫刺激剂可促进强劲和长期的细胞介导的免疫，优选CD8+T细胞介导的免疫。替代地或另外，所述免疫刺激剂可以能够活化人树突状细胞，打破对抗原的耐受和/或对抗调节性T细胞的作用。
优选地，免疫刺激性部分具有5000Da或更少的分子量。更优选地，所述分子量为2000Da或更少、1000Da或更少、900Da或更少、800Da或更少、750Da或更少、700Da或更少、650Da或更少、600Da或更少、550Da或更少、500Da或更少、450Da或更少、400Da或更少、350Da或更少、300Da或更少或250Da或更少。免疫刺激性部分可具有为至少50Da、至少100Da、至少150Da、至少200Da、至少250Da、至少300Da、至少400Da、至少500Da、至少600Da、至少700Da、至少800Da、至少900Da或至少1000Da的分子量。可将任何终点与任何其它终点组合以确定合适的分子量范围。例如，免疫刺激性部分可具有100-600Da或500-900Da的分子量。
优选地，免疫刺激性部分是非核苷酸免疫刺激剂。例如，免疫刺激性部分可以是被设计来模拟核苷酸免疫刺激剂的形状和/或功能性的结构，或可具有无关结构和功能。
合适的免疫刺激剂可根据它们用作其的激动剂的受体来进行分类。例如，所述免疫刺激剂可选自Toll-样受体(TLR)激动剂，诸如TLR3、TLR4、TLR7、TLR8或TLR9的激动剂；NOD-样受体(NLR)激动剂，诸如NOD-1或NOD-2的激动剂；以及树突状细胞表面特异性细胞间黏附因子3结合非整合素分子(DC-sign)、树突状细胞相关C型凝集素(Dectin)-1、树突状细胞相关C型凝集素-2、巨噬细胞诱导的C型凝集素(Mincle)、DDX41和STRING中的一种或多种的激动剂。优选地，免疫刺激性部分衍生自TLR 7、TLR8和NOD-2中的至少一种的激动剂。
优选地，免疫刺激性部分包含咪唑并吡啶部分、咪唑喹啉部分、胞壁酰二肽部分、胞壁酰三肽部分和谷氨酰-meso-二氨基庚二酸部分中的至少一种。
基于咪唑并吡啶的结构，特别是基于咪唑并喹啉的结构，已显示作为TLR7和/或TLR8的激动剂的活性。示例性基于咪唑并喹啉的免疫刺激剂包括药物化合物瑞喹莫德(resiquimod)、咪喹莫特(imiquimod)和guardiquimod。
胞壁酰二肽和三肽已显示作为NOD2的激动剂的活性。示例性免疫刺激剂包括N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、N-羟乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺n-丁酯(莫拉丁酯)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-赖氨酸、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-γ-D-谷氨酰-meso-二氨基庚二酸、N-乙酰基-D-葡萄胺基-(β-1,4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、6-O-硬脂酰-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、米伐莫肽和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸胆固醇酯。
基于谷氨酰-meso-二氨基庚二酸的结构已显示作为NOD1的拮抗剂的活性。示例性免疫刺激剂包括γ-D-谷氨酰-meso-二氨基庚二酸、L-丙氨酰-γ-D-谷氨酰-meso-二氨基庚二酸、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-γ-D-谷氨酰-meso-二氨基庚二酸和月桂酰-γ-D-谷氨酰-meso-二氨基庚二酸。
优选地，免疫刺激性部分具有根据式(I)、式(IIa)、式(IIb)、式(IIIa)、式(IIIb)或式(IV)之一的结构：
其中R1、R4和R5各自独立地选自H或C1-C6支链或直链烷基或烯基，或R4和R5与它们所附接的碳原子一起形成4-、5-、6-、7-或8-元环烷基、环烯基或芳烃环，R1、R4、R5的每一个以及组合的R4和R5中有至多2个碳原子各自可被选自O、N和S的杂原子替代；以及
波浪线表示至化合物的其余部分的附接点。更优选地，免疫刺激性部分具有根据式(I)、式(IIa)、式(IIIa)和式(IV)中的任一式的结构。
例如，免疫刺激性部分可以是6-O-(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺)-基、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰基、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酰基或6-O-(N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸)-基。
具体地，免疫刺激性部分可具有根据式(V)的结构：
其中R1是如上定义的。
免疫刺激性部分优选具有根据式(VI)的结构：
肽部分
本发明的化合物包含肽部分。如本文中所用，术语“肽部分”是指可从肽衍生的化合物的部分。具体地，所述肽部分可通过除去一个或多个氢原子和/或C-末端羟基，利用与免疫刺激性化合物的一个或多个其它部分的键替代与氢和/或羟基的共价键来从肽衍生。因此，所述肽部分会包含至少2个氨基酸残基。
优选地，所述肽部分包含100个或更少的氨基酸残基，或50个或更少的氨基酸残基。例如，所述肽部分可包含45个或更少，35个或更少，25个或更少，20个或更少，15个或更少的氨基酸残基。替代地或另外，所述肽部分可包含4个或更多，5个或更多，6个或更多，7个或更多，8个或更多，9个或更多，10个或更多，15个或更多，20个或更多，或30个或更多氨基酸残基。可将任何终点与任何其它终点组合以提供合适的肽长度范围。例如，所述肽部分可包含4-45个氨基酸残基，或10-35个氨基酸残基。
形成所述肽部分的氨基酸可以是具有氨基基团和羧酸基团二者的任何合适的氨基酸。具体地，所述氨基酸可以是天然存在的氨基酸(包括22个蛋白质来源的氨基酸，优选由通用遗传密码编码的20个氨基酸中的任意一个氨基酸)和/或非天然氨基酸。氨基酸的氨基基团和羧酸基团可间隔单个碳原子(α-氨基酸)，间隔两个碳原子(β-氨基酸)，或间隔3个或更多个碳原子。在氨基酸包含立体中心的情况下，所述立体中心可具有R或S立体化学。在具有手性α碳原子的α-氨基酸的情况下，该氨基酸可以具有D或L立体化学。
形成所述肽部分的氨基酸残基，除了肽主链的共价键以外，还可具有不同氨基酸残基的侧链之间的一个或多个共价连接。所述侧链连接可存在于在氨基酸序列中相邻的氨基酸残基的侧链之间，或被分开得更远的那些氨基酸残基之间。共价连接的实例包括二硫键、碳-杂原子键和碳-碳键。
所述肽部分可具有其中75％或更少、60％或更少、50％或更少、45％或更少或40％或更少的氨基酸残基具有疏水侧链的氨基酸序列。具体地，具有疏水侧链的氨基酸可以是其中侧链选自氢、烃侧链、包含芳烃环的侧链、硫醇侧链和硫醚侧链的那些氨基酸。
例如，具有疏水侧链的氨基酸可选自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸和甘氨酸(W、Y、F、L、I、V、M、A、G)。在其它实例中，具有疏水侧链的氨基酸可以是选自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸的那些氨基酸。乙酰化赖氨酸通常也被认为是疏水性氨基酸。
所述肽部分可以具有非天然的氨基酸序列。具体地，所述肽部分可具有与任何已知的天然肽序列具有小于100％、90％或更小、80％或更小、70％或更小、60％或更小或50％或更小的序列同一性的氨基酸序列。非天然序列可仅包含天然存在的氨基酸，或可另外或替代地包含一个或多个非天然氨基酸。
优选地，所述肽部分不衍生自疾病相关抗原。具体地，所述肽部分可具有与已知的疾病相关抗原具有小于100％、99％或更小、98％或更小、95％或更小、90％或更小、85％或更小、80％或更小、70％或更小、60％或更小或50％或更小的序列同一性的氨基酸序列。已知的疾病相关抗原的序列是容易获得的。
优选地，所述肽部分具有为5或更大的等电点。具体地，所述肽部分可具有为5.0或更大、5.2或更大、5.4或更大、5.6或更大、5.8或更大、6.0或更大、6.5或更大或7.0或更大的等电点。所述等电点可以为12.6或更小、8.0或更小、7.5或更小、7.0或更小、6.5或更小或6.0或更小。可将任何下限与任何上限组合以确定合适的值范围。因此，例如，所述肽部分可具有5.0-12.6，或5.0-7.0或5.2-5.8的等电点。
优选地，所述肽部分具有为2或更多、3或更多、4或更多的绝对净正电荷。优选地，所述肽部分具有2:17至3:4的带净正电荷的氨基酸对总氨基酸的比。优选地，所述肽部分含有至少一个组氨酸残基。
优选地，所述肽部分具有如本文中定义的绝对净正电荷和/或如本文中定义的带净正电荷的氨基酸对总氨基酸的比，以及如本文中定义的其中75％或更少、60％或更少、50％或更少、45％或更少或40％或的氨基酸残基具有疏水侧链的氨基酸序列。
优选地，所述肽部分具有低的固有免疫原性。例如，所述肽部分可不包含已知的或预测的T细胞表位，和/或已知的或预测的B细胞表位。替代地，存在于所述肽部分中的任何表位可以是不诱导免疫应答的表位，例如，因为其为在被人类免疫系统耐受的人蛋白质中发现的表位。
优选地，所述肽部分不是已知的或适用于靶向和/或结合特定类型的细胞受体，或适用于穿过细胞膜。
所述肽部分可用于修饰所述化合物的物理化学性质。包含具有通常为疏水性的或亲水性的侧链的氨基酸残基的可能性允许产生在不同溶剂中具有所需溶解度的肽部分或化合物。此外，由于氨基酸残基可具有为酸性或碱性以及具有不同pKa值的侧链，因此可通过改变溶液的pH和/或离子浓度来操作溶解度。肽的模块化性质与能够掺入宽范围的氨基酸的用于肽合成的标准化技术一起使得肽部分容易适合用于本目的。
应该理解的是，所述肽部分的物理化学性质不仅涉及单个化合物与周围溶剂之间的相互作用，而且还涉及肽部分与其自身的相互作用(例如，肽的折叠)，以及与其它附近的化合物的实例的肽部分的相互作用(例如聚集)。因此，所述肽部分可具有在某些条件下有利于特定二级结构的氨基酸序列。替代地或另外，所述肽可与存在于药物组合物中存在的其它组分相互作用。例如，所述肽部分可与基于铝的佐剂(诸如氢氧化铝或磷酸铝)结合。所述肽部分上存在的电荷可以触发此类相互作用。任何此类相互作用可引起肽聚集。
这样，所述肽可以被选择来提供在不同条件下具有所需性质的化合物。例如，可能希望该化合物可溶于第一溶液，诸如注射用水、组氨酸缓冲液(例如，28mM L-组氨酸缓冲液)、碳酸氢钠、Tris-HCl、磷酸盐缓冲液或乙酸缓冲液，以使化合物能够被配制于药物组合物中。随后可期望所述化合物在第二溶液诸如血清、血浆、组织间隙液或细胞培养基(或代表这样的生理溶液的溶液，例如：氯化钠水性溶液诸如0.9％氯化钠溶液；氯化钠和组氨酸的水性溶液，诸如28mM L-组氨酸中的9.％的氯化钠；或磷酸盐缓冲液，PBS)中具有较低的溶解度和/或聚集。具体地，可溶性化合物可独立于化合物的其它分子在整个溶液自由扩散，然而不溶性化合物具有受限的扩散自由。降低的生理流体尤其是细胞外液中的溶解度可限制化合物在施用后被容易地围绕人体或动物体运输。这样，可降低不希望的副作用的发生率。
示例性肽部分包括包含具有选自表1和表2中所列的那些氨基酸的氨基酸残基的任何序列：
表1
表2
因此，所述肽部分可具有(即，包含)这样的序列，在所述序列中位置1选自氨基酸残基(K、R、H、Q、A)；位置2选自氨基酸残基(K、R、H、Q、A)；位置3选自氨基酸残基(L、H、Q、A)；位置4选自氨基酸残基(L、H、Q、A)；位置5选自氨基酸残基(K、R、H、Q、A、L)；位置6选自氨基酸残基(K、R、H、Q、A、L)；位置7选自氨基酸残基(L、H、Q、A、W)；位置8选自氨基酸残基(L、H、Q、A、W)；位置9选自氨基酸残基(K、R、H、Q、A、L)；位置10选自氨基酸残基(L、H、Q、A、W)；位置11选自氨基酸残基(L、H、Q、A、W)；位置12选自氨基酸残基(K、R、H、Q、A、L)；位置13选自氨基酸残基(K、R、H、Q、A、L)；位置14选自氨基酸残基(L、H、Q、A)；位置15选自氨基酸残基(L、H、Q、A)；位置16选自氨基酸残基(K、R、H、Q、A)；以及位置17选自氨基酸残基(K、R、H、Q、A).
此外，所述肽部分可包含这样的序列，在所述序列中位置1选自氨基酸残基(R、K、H、L)；位置2选自氨基酸残基(R、K、H)；位置3为氨基酸残基(L)；位置4为氨基酸残基(L)；位置5选自氨基酸残基(H、K、R、L、A、P)；位置6为氨基酸残基(A)；位置7选自氨基酸残基(H、K、R、L、A、P)；位置8为氨基酸残基(L)；位置9选自氨基酸残基(A、K、R、H)；位置10为氨基酸残基(L)；位置11选自氨基酸残基(H、K、R、L、A、P)；位置12为氨基酸残基(A)；位置13选自氨基酸残基(H、K、R、L、A、P)；位置14为氨基酸残基(L)；位置15为氨基酸残基(L)；位置16选自氨基酸残基(R、K、H)；以及位置17选自氨基酸残基(R、K、H、L)。
具体地，所述肽部分可包含以下序列之一：
替代地，所述肽部分可包含选自上述肽序列中任一序列的截短的序列。例如，所述肽部分可包含来自上述序列之任一序列的9个或更多，10个或更多，11个或更多，12个或更多，13个或更多，14个或更多，15个或更多，或16个连续氨基酸的截短的序列。具体地，所述截短的序列可包含上述序列之任一序列中的位置P5-P13的9个连续氨基酸。
所述肽部分可包含与上述序列中的至少一个序列具有75％个或更多，80％个或更多，85％个或更多，90％或更多或95％或更多的序列同一性的序列。例如，所述肽部分可包含与来自SEQ ID N°1至SEQID N°35中的任一序列的位置P5-P13的9个连续氨基酸具有至少80％同一性的序列。
另外，所述肽部分中的一个或多个亮氨酸氨基酸(L)可被具有类似物理化学性质的脂肪族、芳香族或硫醚氨基酸替代。此类脂肪族、芳香族或硫醚氨基酸的实例为异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)和甲硫氨酸(M)。例如，亮氨酸氨基酸可被异亮氨酸氨基酸(I)和被缬氨酸氨基酸(Ⅴ)替代。例如，在表1和表2的示例性肽部分中，任何L可被I、V、W、Y、F和M中的任一氨基酸替代(例如，任何L可以被I或被V替代)。
更进一步，特别优选的肽部分可具有这样的氨基酸序列，其中式RR、RK、KR、KK、HR、RH、HK、KH或HH的二元序列(dibasic sequence)(其中二元序列更优选选自RR、RK、KR、KK，还更优选为RR)存在于该序列的N-末端和C-末端之一或两者上。例如，在表1和表2中的示例性肽部分中，特别优选的肽部分可在位置1和2上，或位置16和17上，或在位置1、2、16和17中的所有位置上具有此类二元序列。此类二元序列的存在可在配制过程中有利地作用于肽的溶解度。
表1和表2的特别优选的肽部分具有其中75％或更少的氨基酸残基具有疏水侧链的氨基酸序列(例如，其中具有疏水侧链的氨基酸残基选自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸和甘氨酸)。
所述肽部分可在序列的N-末端或C-末端包含附加氨基酸残基。具体地，此类附加氨基酸可被掺入来帮助肽部分的制造或纯化。可用于此类目的的附加氨基酸序列的实例在本领域中是已知的。
在一个方面，本发明涉及肽用于降低免疫刺激剂在细胞外液中的溶解度的用途，其中将所述肽共价连接于免疫刺激剂。为避免疑义，如上所述，所述肽和免疫刺激剂则将分别形成化合物的所述肽部分和免疫刺激性部分。细胞外液可以是血液、血清或组织间隙液。免疫刺激剂在细胞外液中的溶解度的降低可以例如，包括降低的体内扩散/身体分布，和/或局部施用部位截留，和/或在较高分子量结构或超分子结构的整个形成过程中减弱的促炎细胞因子应答的全身性激活，和/或与注射部位上的分子或细胞的物理接触，和/或被免疫活性细胞或淋巴器官捕获/摄取。免疫刺激剂在细胞外液中的溶解度的降低还可包括在体外条件下在细胞外液中降低的溶解度(例如，较高分子量的结构或超分子结构的形成)。“降低的溶解度”意指相较于免疫刺激剂本身(即，当未共价连接于肽时)的溶解度降低。
在另一个方面，本发明涉及肽用于在细胞外液中增加免疫刺激剂的疫苗佐剂性的用途，其中所述肽相较于免疫刺激剂本身(即，当未共价连接于肽时)共价地连接于免疫刺激剂。
在这些涉及与肽的用途的方面，优选地所述用途是肽用于降低免疫刺激剂在细胞外液中的溶解度和增强其佐剂性的用途，其中其中所述肽被共价地连接于所述免疫刺激剂。
将肽偶联于免疫刺激剂可以例如相较于‘游离’免疫刺激剂降低免疫刺激剂的致热原性，和/或降低体内炎症指标(诸如循环中的IL-1、TNF-α、IL-6和/或IL-8)的水平。在本发明的另一个方面，所述肽用于相较于‘游离’免疫刺激剂的作用增强免疫刺激剂对特定免疫应答的免疫刺激作用。例如，所述免疫刺激剂-肽化合物可促进比‘游离’免疫刺激剂更好的体内细胞介导的针对共施用的抗原的免疫应答和/或体液应答。
为避免疑义，在所述肽部分(a)不是疾病相关抗原；(b)具有其中75％或更少的氨基酸残基是疏水性的氨基酸序列；和/或(c)具有为5或更大的等电点的情况下，所述肽部分必须具有特征(a)并且具有特征(b)和(c)的至少一个特征。优选地，所述肽部分既具有其中75％或更少的氨基酸残基为疏水性的氨基酸序列，又具有为5或更大的等电点。
载体部分
本发明的化合物可包含载体部分。如本文中所用，术语载体部分是指适于与非水性环境缔合的化合物的部分。优选地，所述载体可包含选自烃、氟碳和脂质的一个或多个部分。
烃部分可以是由氢和碳组成的任何基团，但通常会包含碳链，诸如3-30个碳原子，5-25个碳原子，或8-20个碳原子的链。所述碳链可以是直链或支链的，但优选是直链的，并且可是饱和的或不饱和的，但优选是饱和的。
在一些实施方案中，所述烃部分可具有以下化学结构：
CyHx-
或其衍生物，其中y＝3-30，并且x≤2y+1。通常x和y满足关系2y-1≤x≤2y+1，和优选地x＝2y+1。优选CyHx部分是直链的。
优选的是，y为5-25，更优选为8-20。优选的是，CyHx部分是饱和的(即，x＝2y+1)和直链的，并且y＝8-18或8-16。
包含烃部分的载体可以特别适合于与疏水环境(诸如富含烃的环境)的相互作用。在本发明的上下文中，可修饰所述烃部分，使得载体仍然能够与非水性环境缔合。例如，所述烃部分可包含一个或多个杂原子而不消除烃部分与非水性环境缔合的能力。然而，通常所述烃部分会由元素碳和氢组成。
氟碳部分可以是如上定义的任何烃部分，其中一个或多个氢原子已被氟所替代。具体地，氟碳部分可被全氟化，或部分氟化。因此，氟碳部分通常会包含碳链，诸如3-30个碳原子，5-25个碳原子或8-20个碳原子的链。所述碳链可以是直链或支链的，但优选是直链的，并且可以是饱和的或不饱和的，但优选是饱和的。
在一些实施方案中，所述氟碳部分可具有以下化学结构：
CmFn-CyHx-
或其衍生物，其中m＝3-30，n≤2m+1，y＝0-15，x≤2Y，以及(m+y)＝3-30。通常m和n满足关系2m-1≤n≤2m+1，并且优选n＝2m+1。通常x和y满足关系2y-2≤x≤2y，并且优选x＝2y。优选CmFn-CyHx部分是直链的。
优选的是，m为5-15，更优选8-12。还优选的是，y为0-8，更优选0-6或0-4。优选的是，CmFn-CyHx部分是饱和的(即，n＝2m+1并且x＝2y)和直链的，并且m＝8-12以及y＝0-6或0-4。
在具体的实例中，所述氟碳部分衍生自下式的2H、2H、3H、3H-全氟癸酸：
因此，优选氟碳部分是直链饱和的部分C8F17(CH2)2-。
氟碳部分的其它实例具有下式：C6F13(CH2)2-、C7F15(CH2)2-、C9F19(CH2)2-、C10F21(CH2)2-、C5F11(CH2)3-、C6F13(CH2)3-、C7F15(CH2)3-、C8F17(CH2)3-和C9F19(CH2)3-，其分别来源于C6F13(CH2)2COOH、C7F15(CH2)2COOH、C9F19(CH2)2COOH、C10F21(CH2)2COOH、C5F11(CH2)3COOH、C6F13(CH2)3COOH、C7F15(CH2)3COOH、C8F17(CH2)3COOH和C9F19(CH2)3COOH。
氟碳载体部分的合适结构的优选实例具有下式：
其中Sp为如本文中定义的间隔子，波浪线表示至分子的其余部分的附接点。优选地，Sp衍生自赖氨酸残基并且具有式-CONH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-。肽，诸如本发明的化合物或肽抗原的肽部分的N-末端氨基酸的氨基基团从而可与式-CONH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-的间隔子的C-末端羧基基团形成酰胺键。
包含氟碳部分的载体可以特别适合用于与氟化环境(诸如富含氟碳的环境)的相互作用。具有包含氟碳部分的载体部分的化合物可因此而自身缔合以在极性(质子和非质子的)溶剂和非极性溶剂两者中形成基于氟碳的多分子胶束。
已知基于氟碳的载体在提高抗原的递送中是有用的。WO2005/099752和WO 2009/027688中给出了氟碳连接的肽的实例，其中提供了在针对所述肽的免疫应答的增强中由氟碳附接提供的有利方面。为了改善此类氟碳连接的肽的溶解度，WO 2012/090002(通过引用整体并入本文)描述了用于处理氟碳连接的肽以促进基于氟碳的多分子胶束样结构形成的方法。因此，氟碳载体部分在本发明的化合物的中的使用使得所述化合物可被掺入此类胶束。
在本发明的上下文中，可修饰氟碳载体部分，使得载体仍然能够与氟化环境缔合。例如，氟碳部分可包含一个或多个杂原子而不消除氟碳与非水性环境缔合的能力。类似地，一个或多个氟原子可被其它卤原子(诸如氯、溴或碘)替代，而不消除氟碳与氟化环境缔合的能力。然而，通常氟碳部分会由元素碳、氟和任选的氢组成。
脂质部分可以是可通过去除氢原子从脂质衍生的任何合适的基团。脂质可以是任何合适的脂质，并且可以是天然存在的或非天然的。合适的脂质包括脂肪、蜡、甾醇、脂溶性维生素、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯和磷脂。合适的脂质可以被分类为脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮化合物、甾醇脂质和异戊烯醇脂质(prenollipid)。甾醇脂质是优选的。具体地，所述脂质部分可从胆固醇衍生。
包含脂质部分的载体可以特别适合于与脂质环境相互作用。
化合物结构
本发明的化合物包含免疫刺激性部分和肽部分，并且可进一步包含载体部分。免疫刺激性部分可在所述肽部分的氨基酸序列的任何位置连接至所述肽部分，但优选每一个连接至离序列的一个末端不超过5个位置，不超过4个位置，不超过3个位置，或不超过2个位置，或为末端氨基酸残基的氨基酸残基。
具体地，所述化合物可基本上由，或由免疫刺激性部分、肽部分和载体部分组成。
当所述载体部分存在时，优选的是免疫刺激性部分和载体部分被独立地连接至在氨基酸序列中间隔至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少95％的序列长度的氨基酸残基。特别优选地，免疫刺激性部分和载体部分各自被连接至所述肽部分序列的不同的末端氨基酸残基。因此，例如，免疫刺激性部分可被连接至C-末端氨基酸残基，和/或所述载体部分可被连接至N-末端氨基酸残基。
免疫刺激性部分和载体部分(在存在载体部分的情况下)可通过单个共价键直接连接至所述肽部分，或可经一个或多个中间原子通过共价键连接。免疫刺激性部分可通过间隔子部分被连接至所述肽部分。优选地，所述间隔子部分是亲水性的。例如，所述间隔子部分可包含β-丙氨酸、氨基丁酸、氨基戊酸和氨基己酸的一种或多种。
替代地或另外，间隔子部分可包含至少3单体单位的聚合物部分，诸如聚乙二醇部分。例如，间隔子部分可包含具有3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多或9个或更多单体单位的聚乙二醇部分。所述聚乙二醇部分可具有15个或更少、14个或更少、13个或更少、12个或更少、11个或更少、10个或更少、9个或更少，或8个或更少的单体单位。任何端点可以与任何其它端点被组合以定义一个合适的聚合物长度范围。例如，所述聚乙二醇部分也可具有5-15个单体单位。
包含间隔子部分可以给免疫刺激性部分提供相对于肽部分的自由度。因此，在所述肽部分在特定的环境中不溶的情况下，间隔子部分可使得免疫刺激性部分被溶剂化，并且能够被提呈至合适的细胞上的受体。
优选地，间隔子部分包含可切割的接头。接头可以是，例如，酸可切割的接头或酶可切割的接头。示例性酸可切割的接头包括亚胺、腙、缩酮或缩醛、酰腙、cis-aconity和三苯甲基。示例性酶可切割的接头包括肽序列ALALX(可由组织蛋白酶B切割的)、β-D-葡萄糖醛酸酯(可由β-葡糖醛酸糖苷酶切割的)、偶氮苯，诸如偶氮苯-2-羧酸甲酯(可由偶氮还原酶切割的)、酯(可由酯酶切割的)、磷酸酯(可由酸性磷酸酶切割的)和γ-谷氨酰酰胺(可由γ-谷氨酰转肽酶切割的)。
该化合物可使用标准合成化学路线来制备。例如，可在合适的树脂珠支持物上使用固相肽合成(SPPS)来制备所述肽部分。一旦完成所述肽部分的合成，而所述肽部分仍附接于支持物时，所述化合物的第二部分可经由所述肽链的末端或经由氨基酸残基的侧链附接于肽部分的游离末端或其附近。所述化合物的第三部分可经由氨基酸残基的侧链或通过所述肽部分从树脂的伴随切割附接在肽部分的结合的末端或其附近。替代地，可在第二部分附接后从树脂切割所述肽部分，以及在溶液中进行第三部分的附接。
优选地，在合适的树脂支持物上从C-末端至N-末端生长所述肽部分，随后将载体部分偶联至去保护的N-末端。随后将预先制备好的免疫刺激剂(任选地具有附接的间隔子)偶联至C-末端氨基酸残基的侧链。最后，从树脂支持物切割肽。
可使用导致共价键形成的任何合适的化学反应将免疫刺激性部分和化合物的其它部分(在存在其它部分的情况下)偶联至所述肽部分。优选地，使用亲核基团与羧基基团的反应来偶联这些部分。例如，一个部分上的胺可与第二部分上的羧酸反应以形成酰胺。
所述化合物可具有为至少1000Da，优选至少1700Da，更优选至少2100Da，诸如至少2500Da的分子量。所述化合物可具有10000Da或更小，优选8000Da或更小，更优选6500Da或更小，诸如5000Da或更小的分子量。可将任何终点与任何其它终点组合以确定合适的分子量范围。例如，所述化合物可具有1700-8000Da，或2100Da-6500Da的分子量。
药物组合物
可将本发明的化合物与可药学上可接受的载体或稀释剂组合配制为药物组合物。
替代地，可将本发明的化合物与免疫原一起(任选地与药学上可接受的载体或稀释剂组合)配制为药物组合物。
所述化合物在所述药物组合物的环境中是可溶的。因此，在一些实施方案中，在施用所述药物组合物后，所述化合物在施用环境中的溶解度下降，从而减弱了人体或动物体将化合物从施用部位运离的能力。
稀释剂可包含进行高效冷冻干燥所必需的稳定剂或填充剂。实例包括山梨糖醇、甘露糖醇、聚乙烯吡咯烷酮及其混合物，优选甘露糖醇。可以存在的其它赋形剂包括防腐剂，诸如本领域中众所周知的抗氧化剂、润滑剂、冷冻保存剂和粘合剂。
所述药物组合物可包含不止一种免疫刺激性化合物，诸如本发明的不止一种化合物。不同免疫刺激性化合物可具有不同的免疫刺激活性，并且可以例如作为针对不同受体的激动剂。所述化合物可用作针对选自TLR、TLE和NOD的两种或更多种受体的激动剂。例如，所述药物组合物可包含为TLR7的激动剂的含有免疫刺激性部分的第一化合物，和为TLR8和/或NOD2的激动剂的含有免疫刺激性部分的第二化合物。这样，所述组合物的免疫原性可得以改善，和/或免疫原性应答偏向某些细胞类型，诸如例如Th1和/或Th17。
所述药物组合物还可包含一种或多种佐剂。佐剂是能够调节针对共同施用的抗原的免疫应答，同时当提供时就其本身而言几乎不具有(如果有的话)任何直接影响的试剂。此类佐剂可以能够在强度和/或细胞因子谱方面加强免疫应答。佐剂的实例包括：细菌的天然成分的天然或合成衍生的精炼物，诸如弗氏佐剂及其衍生物、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG、单磷酰脂质A；其它已知的佐剂或增效剂，诸如皂苷、铝盐和细胞因子；水包油佐剂、油包水佐剂、免疫刺激复合物(ISCOM)、脂质体、配制的纳米颗粒和微米颗粒；细菌毒素和类毒素；菊粉，尤其是γ菊粉；和TLR激动剂。
优选地，所述佐剂可选自肽聚糖(例如TDM、MDP、胞壁酰二肽、莫拉丁酯)；明矾溶液(诸如氢氧化铝、ADJUMERTM(聚磷腈)或磷酸铝凝胶)；葡聚糖；algammulin；表面活性剂(如角鲨烷、吐温80、Pluronic或角鲨烯)；磷酸钙凝胶；细菌毒素或类毒素(诸如霍乱全毒素、霍乱毒素-A1-蛋白-A-D-片段融合蛋白、霍乱毒素的亚单位B或嵌段共聚物)；含细胞因子的脂质体；油包水佐剂(诸如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂或Montanide诸如ISA 51或ISA 720)；水包油佐剂(诸如MF-59)；基于菊粉的佐剂；细胞因子(诸如干扰素γ；白介素-1β；白介素-2；白介素7或白介素-12)；ISCOM(诸如iscomatrix)；任意组合物的微球和微粒；和Toll-样受体激动剂(诸如CpG、人TLR 1-10的配体、鼠TLR 1-13的配体、ISS-1018、IC31、咪唑并喹啉、聚(I:C)、单磷酰脂质A、Ribi529、霍乱毒素、不耐热毒素、Pam3Cys或鞭毛蛋白)。
所述药物组合物可包含悬浮在连续相中的离散相。替代地，所述组合物可包含固体或液体，当被制备用于施用时，其包含悬浮在连续相中的离散相。例如，所述药物组合物可包含乳液，诸如油包水乳液或水包油乳液。替代地或另外，所述药物组合物可包含胶束或脂质体。
具体地，所述连续相可以是水性的，并且离散相可以是非水性的。在这种情况下，可将所述化合物局限于离散相，从而不能通过独立于离散相的连续相自由扩散。例如，所述化合物的至少部分可附着至离散相的表面或嵌入离散相中。该排布可通过离散相的成分对化合物该部分的溶剂化来稳定。同时，所述化合物的另一部分可暴露于连续相或位于连续相中。具体地，免疫刺激性部分可位于连续相中，这使得免疫刺激性部分通常被连续相包围。
具体地，在所述化合物包含载体部分的情况下，所述载体部分可附着至离散相的表面或嵌入离散相中。例如，在所述载体部分包括烃部分的情况下，所述离散相可包含疏水相，使得所述载体被至少部分地嵌入疏水相中。在所述载体部分包含氟碳部分的情况下，所述离散相可包含氟化相，使得所述载体部分被至少部分地嵌入氟碳相中。在所述载体部分包含脂质部分的情况下，所述离散相可包含脂质相，使得所述载体被至少部分地嵌入所述脂质相中。在每一种情况下，所述化合物的免疫刺激性部分和肽部分可被暴露于连续相，所述连续相可以是水性连续相。
医学用途
本发明提供了本发明的化合物和组合物用于医学治疗的用途。
因此，本发明提供了刺激对免疫原的免疫应答的方法，其包括向人或动物施用本发明的化合物或药物组合物。所述方法可包括将免疫原与所述化合物或药物组合物同时或相继施用。例如，所述药物组合物可包含免疫原以及本发明的化合物。优选地，向人体或动物体上的相同部位施用所述免疫原和所述化合物或药物组合物。
替代地，所述方法可包括施用无免疫原的化合物或药物组合物。本发明的化合物可用于非特异性抗病毒、抗肿瘤和/或抗炎疗法。
因此，本发明还提供了含有本发明的化合物和用于疾病治疗中同时、分开或相继使用的免疫原的产品。
所述方法还可包括将另外的免疫刺激性化合物与所述化合物或药物组合物同时或相继地施用。所述另外的免疫刺激性化合物可以是本发明的第二化合物。如上所述，所述化合物可具有不同的免疫刺激活性。例如，所述药物组合物可包含两种免疫刺激性化合物，诸如本发明的两种化合物。所述化合物可在一个或多个特征上不同，特别地在免疫刺激性部分的性质上。优选地，向人体或动物体上相同的部位施用所述另外的免疫刺激性化合物和所述化合物或药物组合物。
因此，本发明还提供了含有本发明的化合物和用于疾病治疗中同时、分开或相继使用的另外的免疫刺激性化合物的产品。
如本文中所用，术语‘刺激……免疫应答’可指在个体中引发对免疫原的免疫应答，其中这样的免疫应答先前不存在。替代地或另外，该术语可指激起现有免疫应答。在任一情况下，预期所述免疫系统与免疫原的反应的能力得到增强，使得对该免疫原的后续免疫应答(即使与本发明的化合物的施用无关)会更有效。所述免疫应答在疾病的治疗或预防中可以是有效的。
所述疾病通常是感染性疾病、自身免疫性疾病、变态反应、激素疾病或癌症。在将所述化合物或药物组合物与免疫原一起施用的情况下，所述免疫原被选择来包含一个或多个表位，所述表位来自引起感染性疾病的病原体、牵涉自身免疫性疾病或激素性疾病的自体蛋白质、引发变态反应的变应原或在癌细胞上表达的肿瘤抗原。
可使用本发明的化合物或组合物治疗或预防的感染性疾病的实例包括、但不限于由以下病毒、细菌、分枝杆菌、寄生虫和真菌引起的感染：流感病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、甲型肝炎病毒(HAV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、日本脑炎病毒(JEV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、疱疹病毒(HSV-1或HSV-2)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、登革热病毒、西尼罗河和黄热病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、军团病杆菌属(Legionella)，立克次氏体科(Rickettsiae)、衣原体科(Chlamydiae)和单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和疟原虫科的其它种、白色假丝酵母(Candida albicans)、隐球菌属(Cryptococcus)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、红酵母属(Rhodotorula)和肺囊虫属(Pneumocystis)。
可使用本发明的化合物或组合物治疗或预防的癌症的实例包括乳腺癌、黑素瘤、结直肠癌、鼻咽癌、伯基特淋巴瘤和其他人类癌症。
本发明的化合物或组合物可用于治疗流感或接种疫苗抗流感。可将流感疫苗制剂与抗病毒治疗性组合物(包括神经氨酸酶抑制剂治疗诸如金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦或奥司他韦)组合施用。可将流感疫苗制剂与其它流感疫苗(诸如常规的抗体产生性流感疫苗)组合施用。其他流感疫苗优选是季节性流感疫苗。
施用可以是同时发生的或时间上分开的。可在抗病毒治疗性组合物和/或其他流感疫苗之前、与之一起或之后施用本发明的化合物或组合物。
所述方法可具有如上所定义的治疗或预防应用。
将在诊所确定待向患者施用的预防性或治疗性组合物的合适的剂量。然而，作为指导，可取决于优选施用途径的合适的人剂量可为1-1000μg，例如约100μg、200μg或500μg。多次剂量可能是获得免疫或临床效果所需要的，必要时，通常间隔2-12周施用所述多次剂量。在需要在较长时期上加强免疫应答的情况下，可应用间隔1个月至5年的重复剂量。
在将第二治疗剂或第二预防剂与本发明的化合物或组合物结合使用的情况下，施用可以是同时发生的或时间上分开的。可在第二治疗剂之前、与之一起或之后施用本发明的组合物。因此，本发明还提供了含有本发明的化合物和用于在治疗癌症、病原体感染或自身免疫性疾病中同时、分开或相继使用的免疫原的产品。
可使用各种已知途径和技术向人或动物受试者体内施用本发明的组合物。例如，可将所述组合物提供为注射液、悬浮液或乳液，并且使用常规针头和注射器或使用液体射流注射系统，通过肠胃外、皮下、口服、经表皮、皮内、肌内、动脉内、腹膜内、静脉内注射来进行施用。可向皮肤或粘膜组织局部(经鼻、气管内、肠内、舌下、经直肠或阴道)施用所述组合物，或以适合于呼吸道或肺部施用的细碎喷雾的方式提供所述组合物。优选地，肌内施用所述组合物。
可以与剂量组合物相容并且在预防和/或治疗上是有效的量向受试者施用所述组合物。本发明的组合物的施用可以是为了“预防”或“治疗”目的。如本文中所用，术语“治疗的”或“治疗”包括以下方面的任一个或多个方面：阻止感染或再感染；症状的减轻或消除；以及病原体的减少或完全消除。治疗可预防性(感染前)或治疗性(感染后)起作用。
载体的选择(必要时)通常依赖于组合物的递送途径而变化。在本发明内，组合物可被配制用于任何适当的施用途径和装置。药学上可接受的载体或稀释剂包括适合用于口服、经眼、经直肠、经鼻、局部(包括口腔和舌下)、经阴道或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、透皮)施用的组合物中使用的那些载体或稀释剂。
可以任何适当的形式，例如作为液体、固体或气溶胶来施用所述组合物。例如，口服制剂可采取乳液、糖浆或溶液或片剂或胶囊的形式，所述形式可被包被肠溶衣以保护活性成分免于在胃中降解。鼻制剂可以是喷雾剂或溶液。透皮制剂可适合用于其特定递送系统，并且可包括贴剂。注射用制剂可以是蒸馏水或另一种药学上可接受的溶剂或助悬剂中的溶液或悬浮液。
免疫原
免疫原是当单独施用时、或当与合适的佐剂和/或免疫刺激剂组合施用时能够诱导动物(诸如人)中免疫应答的抗原或变应原。因此，向人或动物施用药物组合物为人体或动物体提供了免疫原和免疫刺激剂二者，其可刺激人体或动物体对该免疫原的免疫应答。
免疫原通常与特定疾病状态(诸如病原性疾病)或肿瘤相关。因此，所述药物组合物的施用可触发或增强人体或动物体对该疾病状态的免疫应答。在此类情况下，本发明化合物的肽部分可以不是与相同疾病状态相关联的免疫原。例如，所述肽部分可以是非免疫原性的，或可以是不与该疾病状态相关的免疫原。替代地，免疫原可以是共价地连接于免疫刺激剂和载体的肽。
所述免疫原可来源于传染原(病原体)，诸如病毒、细菌、分枝杆菌属(mycobacterium)、寄生虫或真菌，来源于自体蛋白质，诸如癌抗原(来源于肿瘤细胞的蛋白质)或来自变应原。
因此，本发明提供了在有此需要的受试者中刺激免疫应答和/或治疗病原体感染、癌症或自身免疫性疾病的方法。所述受试者可以是人或动物，优选是人。动物通常是脊椎动物，诸如有颔下门(jawedvertebrate)。
病毒的实例包括并且不限于动物和人类的病毒，诸如：流感病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、甲型肝炎病毒(HAV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)、日本脑炎病毒(JEV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、疱疹病毒(HSV-1或HSV-2)、埃博拉病毒、马尔堡病毒、登革热病毒、西尼罗河和黄热病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。
细菌和分枝杆菌的实例包括、但不限于：结核分枝杆菌、军团病杆菌属、立克次氏体科、衣原体科和单核细胞增生利斯特菌。
寄生虫的实例包括、但不限于恶性疟原虫和疟原虫科的其它种。
真菌的实例包括、但不限于白色假丝酵母、隐球菌属、红酵母属和肺囊虫属。
自体或自身抗原包括、但不限于与癌症相关的以下抗原：P53、MAGE-A3、NY-ESO-1、存活蛋白、WT1、HER-2/neu、MUC 1、hTERT、MAGE-1、LAGE-1、PAP、T21、TRP-2、PSA、生存蛋白、HAGE、SSX-1、PRAME、PASD1、IMP-3、SSX-4、CDCA-1和/或BAGE。
变应原包括、但不限于：与对蜜蜂的严重反应相关的磷脂酶A2(APIm1)、与针对屋尘螨(house-dust mite)屋尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)的反应相关的Derp-2、Der p 2、Der f、Der p 5和Der p 7、蟑螂变应原Bla g 2和主桦树花粉变应原Bet v 1。
在一个实施方案中，所述免疫原是衍生自流感病毒的肽。该流感肽抗原可包含来自甲型流感病毒蛋白、乙型流感病毒蛋白或丙型流感病毒蛋白的一种或多个表位。来自甲型和乙型流感病毒二者的流感病毒蛋白的实例以任意这样的组合包括：血凝素、神经氨酸酶、基质(M1)蛋白、M2、核蛋白(NP)、PA、PB1、PB2、NS1或NS2。在WO 2009/027688和WO 2012/090002(其两者通过引用整体并入本文)中给出了流感肽抗原的实例。
如本文中所用，术语免疫原是指具有被免疫受体(诸如T细胞受体(TCR)或B细胞受体(BCR或抗体))识别的能力的分子。所述免疫原可以是天然的或是非天然的，只要其提呈至少一个表位，例如T细胞和/或B细胞表位。T细胞和B细胞表位代表了免疫原的活性部分，其为由适应性免疫系统识别的这些表位。所述肽可含有一个或多个T细胞表位，包括T辅助细胞表位和/或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位，和/或1或多个B细胞表位或T和B细胞表位的组合，诸如MHC I类或MHC-II类表位。用于鉴定表位的方法在本领域中是众所周知的。表位可以是重叠的线性表位，使得所述肽包含一簇密集堆积的多特异性表位。
所述药物组合物可以包括不止一种免疫原，或所述方法可涉及利用不止一种免疫原的施用。所述免疫原可与相同的疾病状态相关，或与不同疾病状态相关，并且可具有相同或不同类型的免疫活性。例如，所述免疫原可以是能够刺激T细胞应答的肽免疫原，以及B细胞抗原。疫苗设计者将理解的是，可能需要不止一种免疫原来提供更广泛的预防或免疫治疗作用。由于在引发适当的免疫方面它们可能更有效，因而此类多组分产品是想要的。例如，流感疫苗的最佳制剂可包含来自不同流感蛋白的许多肽表位或HBV免疫治疗的最佳制剂可包含来自不同的HBV蛋白的许多表位。替代地，可将多个表位掺入制剂以赋予针对一系列病原体的免疫力。例如呼吸道感染疫苗可含有来自流感病毒和呼吸道合胞病毒的表位。
本发明的药物组合物可包含多种免疫原性肽，或本发明的方法可包括多种免疫原性肽的施用。通常，每种肽包含不同的表位。
所述免疫原可以是本领域中已知的任何合适的免疫原。优选地，所述免疫原为肽抗原。所述肽抗原可包含至少1种长度为15-60个氨基酸的肽。因此，所述肽通常具有15-60个或20-60个氨基酸，诸如25-50个氨基酸，优选30-40个氨基酸，例如，31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个或39个氨基酸的长度。
所述肽抗原必须包括至少一个表位，但可包括附加氨基酸。所述附加氨基酸可有利于肽的制造或配制或增强肽的稳定性。例如，所述肽可通常在N-末端和/或C-末端上包含一个或多个附加氨基酸，以增加所述肽的净正电荷和/或减弱所述肽的的疏水性。可增加净正电荷，使得所述肽具有大于或等于7的等电点。
所述肽抗原可具有1个或多个，诸如2个或3个添加至N-和/或C-末端的带正电荷的氨基酸(精氨酸和/或赖氨酸)。例如，可将3个赖氨酸残基添加至所述肽中一种或多种的N-末端和/或C-末端。通常在具有超过65％的总体疏水性，小于0的净电荷和/或包括疏水性氨基酸的簇的肽的末端上添加带正电荷的氨基酸。
所述肽抗原可包含一个或多个长度(大致35-聚体)的肽，其包含短的最小表位。这些肽通常是比由所述最小表位组成的肽更有效的免疫原。所述肽抗原可具有可保护其免受外肽酶介导的降解的三级结构，并且可能太长以至于不能直接在HLA上被提呈；因此其必须通过专职APC进行内化和被加工以用于提呈。所述肽抗原可各自包含至少1个CD8+T细胞(HLA I类)和至少1个CD4+T细胞(HLA II类)表位。
与短肽不同，此类长肽在小鼠中在重复接种疫苗后诱导了得以大大增强的记忆CD8+T细胞应答，并相较于利用短肽的接种疫苗诱发显著改善的肿瘤控制。与所述长肽内的表位具有反应性的CD4+辅助T-细胞的诱导也是长期T细胞记忆所必需的。疫苗(并优选疫苗中的每种肽)含有在具有不同HLA背景的个体中激活CD8+和CD4+T细胞应答的表位。因此，本发明的疫苗具有广泛的群体覆盖度，并诱导针对肿瘤抗原的持久免疫应答。
所述肽抗原可包含融合肽，其中混杂T辅助细胞表位被共价连接(任选经由多肽接头或间隔子)至抗原共有序列。作为一个实例，混杂T辅助细胞表位可以是PADRE肽、破伤风类毒素肽(830-843)或流感血凝素，HA(307-319)。
免疫原可包含另外的(非免疫原性)部分。例如，所述免疫原(无论是基于肽还是基于非肽抗原部分的)还可包含一个或多个非肽部分。可修饰任何肽部分(无论是免疫原性的还是非免疫原性的)的氨基酸残基，诸如修饰免疫原的物理化学性质。具体地，可添加或修饰末端氨基酸。在所需的肽对于肽酶切割敏感的情况下，可用不可切割的肽模拟物替代正常肽键。这样的键和合成方法在本领域中是众所周知的。
所述免疫原可包含载体部分，诸如上文中针对本发明的化合物所描述的载体部分。具体地，所述免疫原可包含具有如上所述的氟碳载体部分的一种或多种肽免疫原。可修饰所述氟碳载体部分，使得所得的化合物仍能够将肽递送至抗原提呈细胞。因此，例如，可用其它卤原子(诸如氯、溴或碘)替代若干氟原子。另外，用甲基替代若干氟原子并仍保留本文所述分子的性质是有可能的。
在所述药物组合物包含悬浮在连续相中的离散相的情况下，可将所述免疫原局限于离散相。例如，所述免疫原可包含以与上文中针对本发明的化合物所描述的方式类似的方式附着于离散相的表面、或嵌入离散相的载体部分。
可将每种肽连接至共同的氟碳载体部分。更实际地，氟碳连接的肽的组合可存在于本发明的制剂中，其中不同的肽被独立地连接至氟碳链。在氟碳连接的肽的混合物中，每种肽可被连接至单个结构氟碳链。替代地，所述混合物可包含被连接至具有不同结构的氟碳链的肽。
优选地，在所述免疫原为氟碳连接的肽的情况下，用于增强对免疫原的免疫应答的免疫刺激剂还包含氟碳载体。
药物组合物中的化合物和免疫原的浓度可以是使得离散相的每个实例与至少一种本发明的化合物和至少一种免疫原相关联的浓度。这样，所述化合物和免疫原被一起递送至人或动物，并且可因它们与离散相的相互缔合而施用后在人体或动物体内保持紧密靠近。同时，因为在所述免疫原与化合物之间不存在共价键，因而有可能根据每一个接受者或接受者组的要求，配制具有不同的相对量的免疫原和免疫刺激剂的药物组合物。
制备
可以本领域中已知的任何标准方式制备本发明的药物组合物。例如，可将所述药物组合物的组分溶解，以分散组分和形成澄清的均匀溶液。可将该溶液灭菌(诸如通过过滤)，然后干燥。
术语“增溶”在本文中用于指化合物和任选地组合物的其它组分在溶剂中的分散，以形成在无菌过滤后不损失材料的视觉上澄清的溶液。“分散体”意指所述化合物和任选地组合物的其它组分的溶解，以分散(disrupt)微粒和获得溶解性。
溶液中化合物的浓度通常为约0.1mM至约10mM，诸如约0.5mM、1mM、2mM、2.5mM或5mM。合适浓度的实例为约10mg/mL。
可将用于药物组合物的输入组分均匀地共混在一起至所需的比，使任何聚集体分散，使其无菌，并以用于施用的合适形式提供。此类实例可包括共混或稀释阶段后的涡旋和/或超声处理的引入，以促进增溶。制造过程流程的其它排列可包括在过程的早期阶段进行的无菌过滤，或省略冷冻干燥以允许最终液体呈现。
可用于在共混物中分散化合物的溶剂的实例包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)、丙-2-醇、叔丁醇、丙酮、乙酸和其它有机溶剂。
在将不止一种溶剂用于制造过程的情况下，每种所用的溶剂通常：能够增溶其被用于在相对高的浓度(例如，至多10毫摩尔，诸如至多2毫摩尔)下增溶的组分；与水混溶以在冷冻干燥之前有利于用水稀释；与可用于制造过程的冷冻干燥稳定剂(诸如甘露醇)相容；具有药品监管部门可接受的安全性特征，例如，符合ICH Q3C(注：有关杂交质：残留溶剂的指南)的要求和III类溶剂的要求，如由USP残留溶剂<467>定义的(终产品中50mg/日或少于5000ppm或0.5％的残留溶剂限)；易于冷冻干燥，即，一旦冷冻干燥则充分挥发以被除去以达到安全水平；能够以可再生和均匀的方式高效分散组分分子使得在灭菌级过滤后产量损失被最小化；不能与所述化合物或组分反应，或促进其降解；和/或与常规用于药品生产的材料(容器/滤膜/管道系统等)相容。
在所述化合物和其它组分(诸如免疫原)例如分别在不同溶剂中或在不同浓度的乙酸中被增溶的情况下，将所述增溶的化合物和其它增溶的组分共混以产生混合物。
通常将所述化合物干燥。一般将包含短于20个氨基酸和/或具有少于50％的疏水性残基的肽部分的化合物在除乙酸外的溶剂中增溶。在所述肽部分具有超过20个氨基酸和/或具有超过50％的疏水残基的情况下，通常使用乙酸。
在增溶和共混后，可将所述化合物和任选地其它组分的溶液进行稀释。例如，可在水中稀释所述共混物。
优选对含有所述化合物的溶液进行灭菌。在意欲将制剂用于全身性使用的情况下，灭菌是特别优选的。可使用任何适合的灭菌方式，诸如UV灭菌或过滤灭菌。优选地，使用过滤除菌。无菌过滤可包括0.45μm的过滤器，随后通过0.22μm的灭菌级滤器系列。可在添加任何赋形剂和/或佐剂之前或之后进行灭菌。
所述药物组合物可呈干燥(诸如冻干)的形式。本发明的组合物可以是水性溶液，例如通过将冻干或其它干燥的制剂溶解在水性介质中形成的水性溶液。所述水性溶液通常是pH中性的。
干燥所述制剂有助于长期存储。可使用任何合适的干燥方法。冻干是优选但也可使用其它合适的干燥方法，诸如真空干燥、喷雾干燥、喷雾冷冻-干燥或流化床干燥。干燥操作可导致在其中掺入了本发明的化合物的无定形滤饼的形成。
为了长期储存，可冻干无菌组合物。可通过冷冻-干燥来实现冻干。冷冻-干燥通常包括冷冻，随后干燥。例如，可将组合物组分混合物在-80℃冷冻2小时，和在冷冻干燥机中冷冻-干燥24小时。
如对于本领域技术人员来说是已知的，允许对过程流程进行的变化，以获得相同的所得产物的特征；即，将输入组分均匀地共混在一起至所需比，使任何聚集体分散，使其无菌，并以用于施用的合适的形式提供。这样的实例可包括共混或稀释阶段后的涡旋和/或超声处理的引入，以促进增溶。制造过程流程的其它排列可包括在过程的早期阶段进行的无菌过滤，或省略冷冻干燥以允许最终液体呈现。
本发明的药学上可接受的组合物可以是固体组合物。所述组合物可以干粉形式获得。可将冻干得到的饼碾磨成粉剂形式。根据本发明的固体组合物因此可以采取自由流动颗粒的形式。所述固体组合物通常被作为粉剂在密封小瓶、安瓿或注射器中提供。如果用于吸入，可在干粉吸入器中提供粉剂。替代地，以贴剂形式提供固体基质。可将粉剂压制成片剂形式。
可在施用之前重构干燥(例如，冷冻干燥)的组合物。如本文中所用，术语“重构”被理解为意指在使用之前溶解干燥的疫苗产品。在干燥(诸如冷冻干燥)后，优选将所述化合物重构以形成等渗的、中性pH的均匀悬浮液。通常在水性相中，例如通过添加注射用水、组氨酸缓冲液(如28mM L-组氨酸缓冲液)、碳酸氢钠、Tris-HCl或磷酸缓冲盐水(PBS)来重构所述制剂。通常将重构的制剂分配至无菌容器(诸如小瓶、注射器)或用于存贮或施用的任何其它适合的形式中。
可在使用之前将所述组合物贮存在容器(诸如无菌小瓶或注射器)中。
在所述组合物包含氟碳的情况下，所述含氟碳化合物可存在于多分子胶束结构中。含氟碳化合物可以是本发明的化合物(诸如具有基于氟碳的载体部分)或含氟碳免疫原或两者。可将这些组分在乙酸中增溶以促进胶束形成。具体地，在WO2012/090002中描述了用于增溶氟碳载体-肽缀合物的方法，诸如当所述化合物包含含有氟碳部分的载体时是相关的。
实施例
以下实施例举例说明本发明。
实施例1
按照方案1的反应方案制备免疫刺激剂：
方案1
随后按照方案2将间隔子部分附接至免疫刺激性部分：
方案2
使用固相肽合成制备肽部分，用氟碳载体部分在N-末端官能化所述肽部分，用上述免疫刺激剂-间隔子部分在C-末端功能化所述肽部分，随后将其从树脂切割以产生本发明的化合物，如方案3中显示的：
方案3
使该化合物溶解于乙酸中，使得氟碳载体部分自组装成多分子胶束样结构。用水稀释溶液，过滤灭菌，随后冷冻干燥，以获得干粉。
实施例2
材料和方法
免疫刺激剂
化合物“R848”为1-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并〔4,5-c]喹啉-1-基]-2-甲基-2-丙醇，HCl，其具有以下结构
在下面的化合物中，“FA1”为C8F17(CH2)2CO-、“Ac”＝CH3CO-、“PEG”为-CO((CH2)2O)3NH-，以及“FIM”为1-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]-丙氨基二羟乙酰基-。
化合物“PEG-FIM-01”为K(Ac)RRLLHAHLALHAHLLRRLK(PEG-FIM)-NH2，其具有如下结构：
化合物“FA-PEG-FIM-01”为K(FA1)RRLLHAHLALHAHLLRRLK(PEG-FIM)-NH2，其具有如下结构：
化合物“FA-FIM-01”为K(FA1)RRLLHAHLALHAHLLRRLK(FIM)-NH2，其具有如下结构：
化合物“RLK-PEG-FIM-01”为RLK(PEG-FIM)-NH2，其具有如下结构：
血凝素抗原
从Protein Sciences Corporation(Protein sciences,Cat#IT-003-SW12DTMp)获得在昆虫细胞中生产的重组血凝素抗原HA(甲型流感/California/07/2009H1N1序列)。该抗原具有大于90％的纯度，并测试其无菌性和致热原性。在注射之前于28mM组氨酸中重构HA抗原。
FP-02.2疫苗的组成和制造
FP-02.2为由9种在32-41个氨基酸的范围内变化的长肽(表3)组成的疫苗。使用Fmoc(芴甲氧羰酰氯)固相肽合成来制造每种肽。在树脂上完成肽延伸后，将氟碳载体附接至附加N-末端赖氨酸的ε侧链。在切割和去保护之后，通过RP-HPLC纯化每种肽。在乙酸盐交换之后，将每种肽冷冻干燥并贮存于-20℃。以>95％的纯度制备所有肽。对于FP-02.2的制造，将每种肽重悬浮于水+乙酸盐中。在用甘露醇/水溶液混合和稀释后，使用0.22μm的过滤器过滤该制剂。该过滤的溶液在玻璃小瓶中等分，随后冷冻干燥。在注射之前于28mM的L-组氨酸中重构FP-02.2疫苗(除非另有说明)。
表3
FA-P113 K(FA1)-VGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIK-CONH2
FA-P151 K(FA1)-PEHVVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASF-CONH2
FA-P277(K) K(FA1)-RVSWPKFAVPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDVSAAFYHKKK-CONH2
FA-P376 K(FA1)-KLHLYSHPIILGFRKIPMGVGLSPFLLAQFTSAISSVVRR-CONH2
FA-P753(K) K(FA1)-KKKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYR KKK-CONH2
FA-P797(K) K(FA1)-SPHHTALRQAILSWGELMTLATWVGSNLEDPASRDKKK-CONH2
FA-P856(K) K(FA1)-LTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTKKK-CONH2
FA-P877 K(FA1)-PPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRR-CONH2
FA-P1266(K) K(FA1)-KKKGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLKKK-CONH2
用于体外再刺激的肽抗原
使用Fmoc固相化学合成表4中描述的每一种肽。在从树脂切割和脱保护后，通过RP-HPLC进行肽纯化。在乙酸交换后，将每一种肽冷冻干燥并于-20℃下贮存。以>90％的纯度产生所有肽。
表4
P113 VGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIK
P151 PEHVVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASF
P277(K) RVSWPKFAVPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDVSAAFYHKKK
P376 KLHLYSHPIILGFRKIPMGVGLSPFLLAQFTSAISSVVRR
P753(K) KKKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYRKKK
P797(K) SPHHTALRQAILSWGELMTLATWVGSNLEDPASRDKKK
P856(K) LTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTKKK
P877 PPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRR
P1266(K) GPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLKKK
CTL表位151 HYFQTRHYL
动物免疫、血液取样和脾收获
用50μL含25mcg/肽FP-02.2或12.5mcg的重组蛋白±测试佐剂的疫苗或仅用媒介物在后腿内侧肌内免疫雌性BALB/c小鼠。对于血清细胞因子分析，通过在颈椎脱位后尾静脉穿刺或心脏穿刺在免疫后1或4小时采集血样。通过以14000rpm离心凝结的血样10分钟来分离血清并将其贮存于-20℃。对于免疫原性分析，在最后一次免疫后11或14天挑选小鼠，收集脾，并制备单脾细胞悬浮液至107个细胞/mL的密度。所有动物操作均按照内政部规定进行。
IFN-γELISpot测定
在IFN-γELISpot测定(BD Biosciences)中，用10mcg各FP-02.2组分肽或5mcg HA抗原在37℃/5％CO2中体外再刺激5×105个脾细胞，持续18小时。使用自动化平板计数系统(CTL Europe)计数IFN-γ斑点形成细胞(SFC)的数目，并将其针对SFC/106个脾细胞进行标准化。
抗体滴度
通过ELISA测量血浆HA特异性总IgG、IgG1或IgG2a。在4℃用0.22mg/mL的来自甲型流感/California/7/2009(Protein sciences,Cat#IT-003-SW12DTMp)的rHA过夜包被Maxisorb(nunc)板。在室温下用2％FCS/PBS将板封闭2小时。对于个体小鼠血浆，始于1:100的稀释度，在1％BSA/PBS中进行血浆的7倍1:10连续稀释。将稀释的血浆在室温下温育4小时。洗涤板，并将山羊抗小鼠IgG1-HRP或IgG2a-HRP(两者均来自AbD Serotech)或IgG-HRP(KPL)的1:4000稀释物在室温下应用1.5小时。洗涤板，添加100mL的底物溶液(1-stepultra TMB-ELISA,Thermo Scientific)。3分钟后，添加50mL的2M硫酸，并在450nm处读取吸光度。
用于血清样品的细胞因子分析的细胞计数珠阵列和ELISA
将血清样品在PBS中1:4稀释，使用细胞计数珠阵列(BDBiosciences)测量可溶性细胞因子的浓度(IFN-γ、TNF-α、MCP-1、IL-6和IL-10)。IFN-α通过ELISA(eBioscience Platinum ELISA)进行测量。
人TLR7和TLR8报告基因测定
使用人TLR-特异性HEK-BlueTM报告基因测定(Invivogen,France)测试不同TLR-7或TLR-8激动剂的活性。通过将人TLR7基因或人TLR8基因和诱导型SEAP(分泌型胚性碱性磷酸酶)报告基因共转染入HEK293来获得HEK-BlueTM-hTLR7细胞和HEK-BlueTM-hTLR8细胞。将SEAP基因置于与5个NF-κB和AP-1-结合位点融合的IFN-β最小启动子的控制之下。利用TLR配体的刺激激活NF-κB和AP-1，所述NF-κB和AP-1诱导SEAP的产生。将细胞维持在含杀稻瘟素、吉欧霉素和Normocin的HEK-BlueTM选择培养基中。将HEK-BlueTM细胞以105个细胞/mL的密度(于200ul的体积中)在96孔板中进行温育。在HEK-BlueTM检测介质存在的情况下，在620nm处定量SEAP的分泌(与NF-κB诱导成比例)。
结果
与不同的免疫刺激物-肽缀合物组合的重组蛋白的免疫原性的改善
利用单独的12.5mcg HA(组1)或其加上对应于等摩尔剂量的13.2μg PEG-FIM-01(组2)或15μg PEG-FIM-01(组3)免疫雌性BALB/c小鼠(n＝6或7/组)两次(间隔2周)。免疫后11天，收集脾细胞，用HA抗原体外再刺激脾细胞，随后通过IFN-γELISpot测定测量免疫应答。结果示于图1中。
共配制重组血凝素(来自甲型流感H1N1)与FA-PEG-FIM-01或PEG-FIM-01分别使免疫原性相较于单独的重组血凝素[P值：p＝0.0316(组2:组1)；p<0.0001(组3:组1)]显著增强了25.2倍和15.3倍。该结果证明共价连接至肽部分的咪唑并喹啉部分的强免疫刺激性质。另外，在免疫刺激性肽缀合物(FA-PEG-FIM-01)的N-末端上疏水性载体(FA1)的存在导致相较于PEG-FIM-01的71％的细胞介导的免疫应答的改善。
还测量血浆HA特异性总IgG、IgG1或IgG2a(图2)。结果显示，当施用FA-PEG-FIM-01或PEG-FIM-01时，针对HA抗原的体液应答的显著改善。
预期两种免疫刺激性肽缀合物不结合HA抗原。当共配制免疫刺激性肽缀合物和抗原时，未观察到可视的表观变化。这表明，这两种免疫刺激性缀合物在如先前由Wille-Reece等，Proc Natl Acad Sci US A.2005Oct 18；102(42):15190-4)假设的免疫刺激剂与抗原之间的物理相互作用不存在的情况下改善了免疫应答。
与不同免疫刺激剂-肽缀合物组合的肽疫苗的免疫原性的改善
利用单独的FP-02.2(25mcg/肽)(组1)、FP-02.2(25mcg/肽)+FA-FIM-01(5mcg)(组2)、FP-02.2(25mcg/肽)+FA-PEG-FIM-01(5mcg)(组3)单次免疫雌性BALB/c小鼠(n＝6/组)。免疫后14天，收集脾细胞，用FP-02.2肽抗原体外再刺激所述细胞，随后通过IFN-γELISpot测定测量免疫应答。结果示于图3中。
与FP-02.2组合的FA-PIM-01和FA-PEG-PIM-01均分别使应答的强度相较于单独的FP-02.2增强2.4倍和3.1倍。相较于FA-FIM-01，FA-PEG-FIM-01构建体内的聚乙二醇化部分的存在进一步使总体免疫应答改善了26％。更具体地，对于肽P113、P151、P376、P856和P1266(K)，聚乙二醇化部分的存在分别使免疫应答增加40％、9％、117％、41％和60％。
在不同剂量的免疫刺激剂-肽缀合物存在的情况下的改善的疫苗免疫原性
利用单独的FP-02.2(25mcg/肽)(组1)或其与0.5、1.58、5、15.8和50mcg(分别为组2、3、4、5和6)的不同剂量的FA-PEG-FIM-01的组合单次免疫雌性BALB/c小鼠(n＝6/组)。免疫后14天，收集脾细胞，用FP-02.2肽抗原体外再刺激所述细胞，随后通过IFN-γELISpot测定测量免疫应答。结果示于图4中。
向FP-02.2添加不同剂量的FA-PEG-FIM-01相较于单独的FP-02.2显著增强了总体疫苗免疫原性。[P值：P＝0.0191(组2:组1)；P＝0.0409(组3:组1)；P＝0.004(组4:组1)；P<0.0001(组5:组1)；P＝0.0004(组6:组1)。应答的强度在15.8μg FA-PEG-PIM-01时达到峰值。这提供了相对于非佐剂化的FP-02.2的强度的总体增强5.9倍。免疫刺激剂的存在也增加了应答的宽度，从单独的FP02.2中的3种免疫原性肽增加至较高剂量的FA-PEG-PIM-01下的6种免疫原性肽。
免疫刺激剂-肽缀合物相较于游离免疫刺激剂R848的更优的佐剂性
利用单独的FP-02.2 25mcg/肽(组1)或其与FA-PEG-FIM-0115mcg(组2)、R848 1.5mcg(组3)、R848 10mcg(组4)和R848 50mcg(组5)的组合单次免疫雌性BALB/c小鼠(n＝4/组)。免疫后14天，收集脾细胞，用FP-02.2肽抗原体外再刺激所述细胞，随后通过IFN-γELISpot测定测量免疫应答。结果示于图5中。
令人惊讶的是，与R848相反，向FP-02.2添加FA-PEG-FIM-01相较于单独的FP-02.2显著增强了总体疫苗免疫原性。在等摩尔剂量下，而且在较高剂量下观察到免疫刺激性肽优于游离免疫刺激剂的优越性。
所述肽部分在免疫刺激剂-肽缀合物的疫苗佐剂性中所起的关键作用
利用单独的FP-02.2 25mcg/肽(对照组)或其与对应于等摩尔剂量的FA-PEG-FIM-01 15mcg(组1)、PEG-FIM-01 13.15mcg(组2)、(3)RLK-PEG-FIM-01 4.3mcg(组3)或(4)R848 1.5mcg(组4)的组合单次免疫雌性BALB/c小鼠(n＝8/组)。结果示于图6中。
相较于-PEG-PIM-01和PEG-FIM-01，FA-PEG-PIM-01和PEG-FIM-01均相对于FP-02.2增强了应答的强度。这确立了由所述肽部分在免疫刺激性肽缀合物的佐剂性中所起的关键作用。如在图6观察到的，在免疫刺激性肽缀合物(FA-PEG-FIM-01)的N-末端上疏水性载体(FA1)的存在导致相较于PEG-FIM-01的细胞介导的免疫应答的改善。
与游离免疫刺激剂对应物R848相反的免疫刺激性肽缀合物不存在全身性促炎应答
利用对应于等摩尔剂量的(1)单独的28mM L-组氨酸媒介物、(2)28mM L-组氨酸中的R848(1.5mcg)、(3)28mM L-组氨酸中的FA-PEG-FIM-01(15mcg)、(4)磷酸盐10mM中的FA-PEG-FIM-01(15mcg)(n＝4/组)单次注射雌性BALB/c小鼠(n＝4/组)。在第1和4小时采集血液样品。使用细胞计数珠阵列(MCP-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-10和IL-12p70)或ELISA(IFN-α)测量血清细胞因子浓度。结果示于图7中。
令人惊讶的是，只在接受R848的动物中在第1或4小时观察到促炎细胞因子。IFN-α(8851±2641pg/mL)、IL-6(15±7pg/mL)和TNF-α(9±10pg/mL)的产量在第1小时的时候达到峰值，而MCP-1(4749±2083pg/mL)和IFN-γ(20±13pg/mL)的产量在第4小时的时候达到峰值。在任何组中在这两个时间中的任一时间点未检测到IL-10和IL-12p70。利用R848对促炎细胞因子的诱导反映了小分子的快速全身扩散。
在免疫刺激性肽缀合物存在的情况下改善的疫苗诱导的CTL应答
利用单独的FP-02.2 25mcg/肽或其与FA-PEG-FIM-01 15mcg的组合单次免疫雌性BALB/c小鼠(n＝8/组)。免疫后14天，收集脾细胞，用CTL表位151体外再刺激所述细胞，随后通过IFN-γELISpot测定测量免疫应答。结果示于图8中。该结果表明了FA-PEG-PIM-01增强由FP-02.2诱导的CTL应答的能力。
免疫刺激性肽缀合物对于TLR-7和TLR-8的特异性
在表达TLR-7和TLR-8的HEK-293细胞中测试FA-PEG-FIM-01、FA-FIM-01、RLK-PEG-FIM-01和PEG-FIM-01相较于R848的诱导NF-κB活化的能力(参见图9)。如所预期的，R848在两个细胞系中具有高活性。FA-PEG-FIM-01、FA-FIM-01、RLK-PEG-FIM-01和PEG-FIM-01在TLR-7和TLR-8细胞系中也具有活性，但相较于R848程度低得多。根据上述体内佐剂性数据，这些结果是令人惊讶的，其显示相较于R848，显著改善的体内佐剂性通过肽缀合物实现。
结论
本实施例证明免疫刺激剂-肽缀合物的佐剂性可显著增强针对基于肽或蛋白质的疫苗的免疫应答。
该作用是在不存在免疫刺激剂-肽缀合物与抗原之间的物理相互作用的情况下获得的。
该实施例还表明，免疫刺激剂-肽缀合物的佐剂性主要由以其整体存在的所述肽部分的存在驱动。
如果疏水性载体附接于肽的末端和/或如果在肽与免疫刺激性部分之间引入PEG间隔子，则该佐剂性可得到进一步增强。
令人惊讶的是，免疫刺激剂-肽缀合物显著优于几乎不提供至不提供佐剂性的游离的小免疫刺激分子(R848)。
此外，与游离的小免疫刺激分子(R848)相反，免疫刺激剂-肽缀合物不促进全身性促炎细胞因子的诱导。小免疫刺激剂对全身性促炎细胞因子的诱导已与人中的严重不良事件相关。
被选择来掺入免疫刺激剂-肽缀合物的肽部分支持构建体在施用部位的保留。该作用可由所述肽部分在相较于重构建条件升高的pH和/或离子强度条件下驱动聚集体的形成的物理化学性质来提供。
佐剂性的改善和与免疫刺激剂-肽缀合物相关的全身性促炎应答的不存在支持它们在动物和人中用作疫苗佐剂以及用作在局部起作用的免疫调节剂(通过瘤内、经肺、鼻内或膀胱内施用的递送)。
作为肽部分的物理化学性质(疏水性、电荷)的结果，免疫刺激剂-肽缀合物在重构条件下具有优良的溶解度。
实施例3-肽的一级序列对作为pH和离子强度变化的结果的聚 集体的形成的影响
材料和方法
肽和肽-缀合物
本实施例中使用的化合物示于下表5中。肽16和16'对应于实施例2的缀合物中掺入的肽。肽6、8和10具有其中75％或更多的氨基酸残基是疏水性的氨基酸序列。
表5
A：RP-HPLC纯度(％)；B：疏水性(％)；C：带正电荷的氨基酸残基的数目。
FA1＝C8F17(CH2)2CO-；Ac＝CH3CO-；PEG＝-CO((CH2)2O)3NH-；FIM＝1-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]-丙氨基-二羟乙酰基-
*基于疏水残基(L、A、G、W、Y、I、F、V、M)的数目除以肽序列中的残基总数计算疏水性程度，并且计算每种肽的疏水性程度
**乙酰化赖氨酸被认为是疏水的
***仅对所述肽部分进行计算
使用固相合成法(Fmoc chemistry)制造所有肽并利用RP-HPLC来纯化。利用TFA作为抗衡离子来产生肽。平均纯度为97％，范围为92.3-99.5％。对所有肽进行氨基酸分析，从结果计算净质量。将所有肽贮存于-20℃。
肽溶液的制备
在层流通风橱柜中制备所有溶液和样品。在分析前一天制备水、28mM L-组氨酸缓冲液(HIST)、0.9％氯化钠(NaCl)、28mM L-组氨酸中0.9％的氯化钠(NaCl/HIST)和1X磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)。使用0.22mcm过滤器将水性溶液过滤2次，超声处理30分钟，并保持于室温下。用过滤的水洗涤用于肽溶液的制备的所有硼硅玻璃容器中3次。用不同的水性溶液重悬肽以获得2mg净质量/ml的浓度，并涡旋30秒。测定所有肽溶液的样品的pH。肽/水溶液的pH值范围为3.1-4.1。不同的肽/28mM L-组氨酸溶液的pH值范围为5.9-6.4。肽/0.9％氯化钠溶液的pH值范围为3.3-4.2。28mM L-组氨酸溶液中的肽/0.9％氯化钠的pH值范围为5.9-6.3。肽/PBS溶液的pH值范围为6.9-7.5。在室温下平衡肽溶液30分钟，并目测检查不溶性聚集体的存在。使用0.45mcm PVDF过滤器(弃去初滴)过滤目测澄清的肽溶液。将150mcL的肽溶液小心地分配在单独包装的一次性微量比色池(ultra-micro z8.5mm,Brandtech,Lot 412806)，盖上盖子，并在室温下放置30分钟。
粒度测量(动态光散射)
将使得能够测量0.6nm-6微米的颗粒的Zetasizer NanoS(Malvern Instruments,UK)用于监测粒度。在20+/-0.1℃下进行测量。利用Dispersion Technology软件(Malvem Instruments,UK)进行分析。将平衡时间设定为2分钟。激光衰减由Zetasizer Nano S自动地设定。取决于样品的性质，基于每运行10秒和每个测量总共10-40个运行确定相关时间。重复测量至多3次。利用60nM的校准乳胶珠和2％牛血清白蛋白/PBS溶液进行校准。仅测试具有良好表观溶解度(apparent solubility)的肽溶液的粒度测量。将显示可见的不溶性聚集体的存在的样品表示为INS。将无可测量的颗粒的样品表示为0(零)。
结果
粒度测量的结果示于6中。发现具有>75％的疏水性的所有肽(肽6、8和10)在所有5种不同的水性溶液(包括水、28mM L-组氨酸和0.9％NaCl)中是不溶性的，这与具有>75％的疏水性程度的所有其它肽相反。
肽1-5、7、9和11-19具有<75％的疏水性程度，>5的等电点和在水、28mM L-组氨酸和具有升高的较高的离子强度和/或pH的最终其它水性溶液中的表观溶解度。
表6
INS.＝可见的不溶性聚集的存在(未测量的)；0＝无可检测的颗粒；
*＝表观溶解度
如所预期的，肽16、肽16′以及免疫刺激性-肽构建体PEG-FIM-01和FA-PEG-FIM-01(各自含有肽16或肽16′)在该粒度测定中表现类似，显示了在水、28mM L-组氨酸和0.9％NaCl中的表观溶解度(在28mML-组氨酸/NaCl或PBS中形成较大的颗粒或不溶性聚集体)。
在实施例2中，已证明PEG-FIM-01和FA-PEG-FIM-01产生生物学效应，尤其是当在全身性促炎应答不存在(如与游离的小免疫刺激剂相反)的情况下与肽或重组抗原疫苗组合时，促进改善的抗体或T细胞应答的能力。实施例3表明从上表5中显示的其它测试肽衍生的免疫刺激性肽缀合物会具有与从肽16衍生的PEG-FIM-01类似的生物学效应。
在低于它们各自的pKa的pH下，带正电荷的残基(R、K和H)是疏水性的，并且可取决于它们在肽序列中的位置和其它氨基酸的作用而有助于肽的溶解度。该实施例显示，存在于N-末端和C-末端侧的二元序列(RR)有助于肽的溶解度。例如，如果总体疏水性>75％，则分别得到肽6、8和10(参见下文)的亮氨酸残基(L)对肽11、13和15中的位置1和17上的精氨酸(R)的取代使得它们在水和具有较高的pH和离子强度的其它水性溶液中变得不溶。
肽11 RRLLHALLALLAHLLRRL
-RLLHALLALLAHLLR-L
肽6 LRLLHALLALLAHLLRLL
肽13 RRLLHAALALAAHLLRRL
-RLLHAALALAAHLLR-L
肽8 LRLLHAALALAAHLLRLL
肽15 RRLLAAHLALHAALLRRL
-RLLAAHLALHAALLR-L
肽10 LRLLAAHLALHAALLRLL

Claims (31)

1.一种包含免疫刺激性部分和肽部分的免疫刺激性化合物，其中所述肽部分：
(a)不是疾病相关免疫原；
(b)具有其中75％或更少的氨基酸残基是疏水性的氨基酸序列；和/或
(c)具有为5或更大的等电点。
2.权利要求1的化合物，其还包含载体部分。
3.一种免疫刺激性化合物，其包含免疫刺激性部分、肽部分和载体部分。
4.权利要求2或权利要求3的化合物，其中所述载体部分包含烃、氟碳或脂质。
5.权利要求4的化合物，其中所述氟碳部分具有化学结构：
CmFn-CyHx-
其中m＝3-30，n≤2m+1，y＝0-15，x≤2y以及(m+y)＝3-30。
6.权利要求1至5中的任一项的化合物，其中所述肽部分的75％或更少的氨基酸残基选自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸。
7.权利要求2至5中的任一项的化合物，其中所述免疫刺激性部分在第一氨基酸残基上附接于所述肽部分，并且所述载体部分在第二氨基酸残基上附接于所述肽部分，并且所述第一和第二氨基酸残基间隔所述肽部分的至少50％的氨基酸序列。
8.权利要求1至7中的任一项的化合物，其中所述肽部分由至多100个氨基酸残基组成。
9.权利要求1至8中的任一项的化合物，其还包含所述免疫刺激性部分与所述肽部分之间的间隔子部分。
10.权利要求9的化合物，其中所述间隔子部分包含可切割的键。
11.权利要求1至10中的任一项的化合物，其中所述免疫刺激性部分具有小于5000Da的分子量。
12.权利要求1至11中的任一项的化合物，其中所述免疫刺激性部分选自Toll-样受体(TLR)激动剂、NOD-样受体(NLR)激动剂以及树突状细胞表面特异性细胞间黏附因子3结合非整合素分子、树突状细胞相关C型凝集素-1、树突状细胞相关C型凝集素-2、巨噬细胞诱导的C型凝集素、DDX41和STRING中的一种或多种的激动剂。
13.权利要求12的化合物，其中所述免疫刺激性部分选自TLR7和/或TLR8的激动剂。
14.权利要求1至13中的任一项的化合物，其中所述免疫刺激性部分包含咪唑并吡啶部分、咪唑并喹啉部分、胞壁酰二肽部分、胞壁酰三肽部分、和γ-D-谷氨酰-meso-二氨基庚二酸部分中的至少一种。
15.权利要求14的化合物，其中免疫刺激性部分具有根据式(I)、(IIa)、(IIb)、(IIIa)、(IIIb)或(IV)中的任一式的结构：
其中R1、R4和R5各自独立地选自H或C1-C6支链或无支链烷基或烯基，或R4和R5与它们所附接的碳原子一起形成4-元、5-元、6-元、7-元或8-元环烷基、环烯基或芳烃环，
R1、R4、和R5中的每一个以及组合的R4和R5中有至多2个碳原子可被选自O、N和S的杂原子替代；和
所述波浪线表示至所述化合物的其余部分的附接点。
16.权利要求15的化合物，其中免疫刺激性部分具有根据式(VI)的结构：
17.权利要求1至16中的任一项的化合物，其中所述肽部分具有其中75％或更少的氨基酸残基为疏水性的氨基酸序列，并且其中所述氨基酸序列包含：
(I)其中位置1选自氨基酸残基(R、K、H、L)；位置2选自氨基酸残基(R、K、H)；位置3为氨基酸残基(L)；位置4为氨基酸残基(L)；位置5选自氨基酸残基(H、K、R、L、A、P)；位置6为氨基酸残基(A)；位置7选自氨基酸残基(H、K、R、L、A、P)；位置8为氨基酸残基(L)；位置9选自氨基酸残基(A、K、R、H)；位置10为氨基酸残基(L)；位置11选自氨基酸残基(H、K、R、L、A、P)；位置12为氨基酸残基(A)；位置13选自氨基酸残基(H、K、R、L、A、P)；位置14为氨基酸残基(L)；位置15为氨基酸残基(L)；位置16选自氨基酸残基(R、K、H)；以及位置17选自氨基酸残基(R、K、H、L)的序列；或者
(II)其中位置1选自氨基酸残基(K、R、H、Q、A)；位置2选自氨基酸残基(K、R、H、Q、A)；位置3选自氨基酸残基(L、H、Q、A)；位置4选自氨基酸残基(L、H、Q、A)；位置5选自氨基酸残基(K、R、H、Q、A、L)；位置6选自氨基酸残基(K、R、H、Q、A、L)；位置7选自氨基酸残基(L、H、Q、A、W)；位置8选自氨基酸残基(L、H、Q、A、W)；位置9选自氨基酸残基(K、R、H、Q、A、L)；位置10选自氨基酸残基(L、H、Q、A、W)；位置11选自氨基酸残基(L、H、Q、A、W)；位置12选自氨基酸残基(K、R、H、Q、A、L)；位置13选自氨基酸残基(K、R、H、Q、A、L)；位置14选自氨基酸残基(L、H、Q、A)；位置15选自氨基酸残基(L、H、Q、A)；位置16选自氨基酸残基(K、R、H、Q、A)；以及位置17选自氨基酸残基(K、R、H、Q、A)的序列。
18.肽用于降低免疫刺激剂在细胞外液中的溶解度的用途，其中所述肽被共价连接至所述免疫刺激剂。
19.权利要求18的用途，其中所述用途也增强所述免疫刺激剂在细胞外液中的佐剂性。
20.一种药物组合物，其包含权利要求1至17中的任一项的化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。
21.权利要求20的药物组合物，其还包含第二化合物，其中所述第二化合物包含免疫刺激性部分。
22.权利要求20或权利要求21的药物组合物，其还包含免疫原。
23.权利要求22的药物组合物，其中所述化合物包含氟碳载体部分，并且所述免疫原包含共价结合至氟碳的抗原性肽。
24.权利要求22或权利要求23的药物组合物，其中所述免疫原选自肿瘤抗原、病原体的抗原以及自身抗原。
25.权利要求1至17中的任一项的化合物或权利要求20至24中的任一项的药物组合物，其用于通过疗法治疗人体或动物体的方法。
26.权利要求1至17中的任一项的化合物，或权利要求20至24中的任一项的药物组合物，其用于刺激免疫应答的方法。
27.权利要求1至17中的任一项的化合物，或权利要求20至24中的任一项的药物组合物，其用于治疗癌症、病原性感染或自身免疫性疾病的方法。
28.一种刺激免疫应答的方法，其包括向有此需要的受试者施用根据权利要求20至24中的任一项的药物组合物。
29.一种治疗癌症、病原性感染或自身免疫性疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用根据权利要求20至24中的任一项的药物组合物。
30.权利要求1至17中的任一项的化合物，其用于制造用于刺激免疫应答的药剂。
31.用于根据权利要求27的用途的权利要求20至24中的任一项的药物组合物，根据权利要求28的刺激免疫应答的方法，或用于根据权利要求30的用途的根据权利要求1至17中的任一项的化合物，其中所述免疫应答是对疾病相关免疫原的免疫应答。
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