CN111647561A - 纳米抗体在细胞特异性捕获和细胞释放中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及纳米抗体在细胞特异性捕获和细胞释放中的应用。本发明首次将纳米抗体用于细胞特异性捕获和细胞释放。通过制备的纳米抗体定向固载表面能够高效、快速的在平面表面捕获和释放循环肿瘤细胞，克服了传统抗体捕获循环肿瘤细胞需借助微流控等提高捕获效率的弊端，且纳米抗体生产成本低，稳定性好，是替代传统抗体的最佳选择。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及纳米抗体的新应用，即在细胞特异性捕获和后续的细胞释放中的应用。
背景技术
癌症是全球最严重的致死性疾病之一，90％的癌症患者因癌症转移而死亡，癌症转移是导致癌症复发率和死亡率居高不下的主要原因。循环肿瘤细胞(Circulating tumorcells，CTCs)是从原发病灶脱落侵袭进入外周血循环并可能在远处建立新的癌变病灶的一类癌细胞的统称。从患者血液中分离和分析CTCs不仅对了解肿瘤的发生、侵袭和转移过程具有重要的临床意义，还对癌症患者的临床诊断和术后评估有重要的指导意义。
目前CTCs的捕获方法主要有物理分离法和免疫亲和分离法两种，其中物理分离法主要是利用癌细胞的物理性质(大小、电荷、密度)与血细胞不同而分离癌细胞，该方法简单、快速、无需标记，但是缺乏特异性，捕获纯度低；免疫亲和分离法主要依靠抗体、核酸适配体、多肽等特异性识别细胞表面的蛋白标志物来分离癌细胞，是目前最常用、最有效的检测方法。在不同的免疫亲和试剂中单克隆抗体(如上皮细胞黏附因子(Epithelial celladhesion molecule，EpCAM的特异性抗体：抗EpCAM抗体)是最常用且已经商业化的，但是其分子量较大(约35kDa)限制了其在材料表面的高通量固载，通常需要结合微流控、微纳米结构基底等使用以提高捕获率，所以通常伴随着一系列设备组装、微加工技术等制备流程，过程繁琐、耗时，不利于大规模推广使用。
将捕获后的CTCs释放并进行体外培养，结合基因测序和体外药敏实验，有助于对原发性肿瘤提供个性化的治疗。目前CTCs的释放方法主要包括酶解释放、电化学解析释放、光敏诱导裂解释放、温敏释放和化学竞争触发释放，利用电化学、光敏诱导释放及温敏释放可以实现精准释放，但对材料的要求却极为严格。采用胰酶释放的方法虽然简单易行，但是选择性较差，释放的细胞纯度低，不易获得高纯度的CTCs。利用酶切释放仅适用于利用核酸适配体作为捕获试剂的体系，竞争触发释放仅适用于存在竞争作用的体系，都限制了CTCs释放的发展。基于以上的问题，需要开发一种温和、高效的CTCs释放方法。
纳米抗体(Nanobody,Nb,VHH)是一种仅由单个可变结构域(重链)组成的新型抗原结合片段，是最小的可以与抗原结合的天然抗体片段，其分子量大小为15kDa，仅为传统抗体的1/10。纳米抗体具有以下优点：1)尺寸小，可以在材料表面实现高密度固载。2)具有高特异性、耐高温及化学构象稳定，对降解和变性的抵抗力强。3)成本低，在大肠杆菌和啤酒酵母菌中易生产。纳米抗体的实际应用与传统抗体类似，但因其具有尺寸小、稳定性好、穿透性强等优势，比传统抗体的应用更加广泛，主要应用于肿瘤靶向检测和治疗、中和毒素、和构建融合分子。目前关于纳米抗体用于捕获及释放循环肿瘤细胞的研究还未见报道。
发明内容
本发明是基于解决现有的技术问题而完成的，其目的在于，提供纳米抗体在细胞特异性捕获和后续的释放中的应用。
本发明提供了纳米抗体在细胞特异性捕获和后续的细胞释放中的应用。
上述技术方案中，进一步地，所述纳米抗体为特异性结合肿瘤标志物的纳米抗体。
上述技术方案中，进一步地，所述细胞为循环肿瘤细胞或干细胞。
上述技术方案中，进一步地，用于细胞特异性捕获时，将纳米抗体定向固载；用于细胞释放时，利用咪唑、乙二胺四乙酸(EDTA)释放定向固载的纳米抗体。
上述技术方案中，进一步地，所述纳米抗体定向固载的方法包括以下步骤：
(1)在基底材料表面制备亲水聚合物；
(2)亲水聚合物上连接螯合配体；螯合金属离子；
(3)定向固载带有组氨酸标签的纳米抗体。
上述技术方案中，进一步地，所述步骤(1)中亲水聚合物为聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)、多糖、多聚甘油、聚乙二醇或两性离子聚合物；所述亲水聚合物的厚度为1-500nm。
上述技术方案中，进一步地，所述步骤(2)螯合配体为氨基三乙酸(NTA)或亚氨基二乙酸(IDA)；所述金属离子为Cu2+、Ni2+、Zn2+。
上述技术方案中，进一步地，所述纳米抗体的组氨酸标签为4-8个组氨酸。
上述技术方案中，进一步地，所述咪唑溶液浓度为0.1-200mmol/L。
本发明的有益效果：本发明首次提出了将纳米抗体应用于细胞的捕获和释放中。通过制备的纳米抗体定向固载表面能够高效、快速的在平面表面捕获和释放循环肿瘤细胞，克服了传统抗体捕获循环肿瘤细胞需借助微流控等提高捕获效率的弊端，且纳米抗体生产成本低，稳定性好，是替代传统抗体的最佳选择。纳米抗体定向固载表面可捕获外周血体系中的循环肿瘤细胞，有望应用于癌症患者的早期诊断、检测及分析。经咪唑溶液洗脱后的纳米抗体可逆释放表面可高效释放捕获后的循环肿瘤细胞，有望收集释放的细胞进行培养及检测分析以便对癌症患者进行个性化治疗。
附图说明
图1是本发明实施例1制备的PHEMA聚合物刷的原子力显微镜照片；
图2是本发明实施例1制备的抗EGFR纳米抗体定向固载的QCM-D实时检测的数据图像。
图3是本发明实施例2制备的抗EGFR纳米抗体可逆定向固载的QCM-D实时检测的数据图像，其中(a)QCM-D在线检测抗EGFR纳米抗体的释放；(b)QCM-D在线检测抗EGFR纳米抗体的可逆释放。
图4是本发明实施例3中得到的纳米抗体定向固载表面捕获A431癌细胞的结果数据；(a)是捕获后的激光共聚焦显微镜照片；(b)是捕获率。
图5是本发明实施例4中不同捕获时间下PHEMA-aEGFR表面对A431细胞的捕获效率，PHEMA基底作为对照。
图6是本发明实施例5中纳米抗体定向固载表面上捕获的A431细胞的活性数据；(a)是TCPS表面和纳米抗体定向固载表面上捕获的细胞的活性；(b)是在TCPS表面和纳米抗体定向固载表面上捕获的细胞的荧光显微镜照片。
图7是本发明实施例6中捕获外周血体系中A431细胞的捕获率。
图8是本发明实施例7中释放捕获后的A431细胞的释放率。
具体实施方式
以下通过实施例来说明本发明的具体实施方式，但下述实例是说明性的，而非限定性，可在不影响本发明所要达到的技术效果的范围内做出任意选择和变更。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
定向固载纳米抗体表面的制备方法包括以下步骤：
(1)在基底材料表面制备亲水聚合物；基底材料选用硅片，亲水聚合物选用聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)；使用表面原子转移自由基聚合(SI-ATRP)的方法制备聚合物；亲水聚合物的厚度优选为20-40nm；
(2)亲水聚合物上连接螯合配体；螯合金属离子；螯合配体选用氨基三乙酸(NTA)；金属离子选用Ni2+；
(4)定向固载带组氨酸标签的纳米抗体；组氨酸标签选用6个组氨酸标签。
释放带组氨酸标签的纳米抗体时，使用咪唑溶液；咪唑溶液浓度选自0.1-200mmol/L，优选为200mmol/L。
实施例1
本实施例为制备一种用于细胞特异性捕获的定向固载纳米抗体涂层，为后续捕获循环肿瘤细胞做准备，包括以下步骤：
1.亲水聚合物PHEMA的制备
将硅片放置于沸腾的食人鱼溶液(30％H2O2：98％H2SO4＝3：7，v：v)中清洗，用大量的去离子水清洗硅片，氮气吹干备用。
将清洗后的硅片浸泡在APTES溶液(APTES：无水乙醇＝1：15，v：v)中于室温反应5h，然后依次用无水乙醇和二氯甲烷清洗，氮气吹干备用。
进一步将硅片放置在含1.2mL三乙胺的30mL二氯甲烷溶液中，然后在冰浴条件下将30mL含有1.2mL BIBB的二氯甲烷溶液滴加进去，25℃过夜反应，依次用二氯甲烷、无水乙醇、去离子水清洗后，氮气吹干备用。
将HEMA(500mmol/L)单体溶液加到10mL去离子水中，吹入氮气30min使溶液脱氧。然后在氮气保护下加入终浓度分别为10mmol/L，5mmol/L，和5mmol/L的抗坏血酸钠、BPY和氯化铜，继续吹入氮气直至溶液变为深褐色。氮气保护下，将溶液转移至含有BIBB修饰硅片的橡胶-隔膜小瓶中(小瓶事先用真空/氮气循环填充三次进行脱气除氧)，30℃反应30min后依次用二氯甲烷、去离子水、丙酮清洗(清洗过程中丙酮的浓度逐渐增加)，氮气吹干备用。
原子力显微镜(AFM)表征了PHEMA聚合物刷的表面形貌(图1)，可见PHEMA聚合物刷表面非常光滑平整，表面平均粗糙度(Ra)为0.8±0.1nm，这排除了纳米特征对后续细胞粘附的影响。
2.抗EGFR纳米抗体的定向固载
用CDI对PHEMA聚合物刷进行活化：将PHEMA修饰的硅片放置于20mmol/L的CDI溶液(丙酮配制)中25℃活化3h，依次用丙酮、去离子水清洗硅片，氮气吹干备用。
将CDI活化的硅片放置于NH2-NTA(5mg/mL)和乙醇胺的混合溶液(pH＝8.5)中37℃反应过夜，PBS溶液洗涤三次后氮气吹干，得到的硅片命名为PHEMA-NTA。
将PHEMA-NTA硅片浸泡在200mmol/L的EDTA溶液中以除去表面残留的铜离子，去离子水清洗三次后，将硅片转移至100mmol/L的氯化镍溶液(去离子水配制)中37℃反应2h，去离子水清洗三次后氮气吹干，得到的硅片命名为PHEMA-Ni2+。
将PHEMA-Ni2+放置于500μg/mL的抗EGFR纳米抗体溶液(PBS配制)中反应2h，PBS清洗三次，将得到的表面命名为PHEMA-aEGFR。抗EGFR纳米抗体具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
抗EGFR纳米抗体的定向固载过程用QCM-D进行了表征(图2)，用Q-Sence E4系统于25℃下以100μL/min的流速在线检测抗EGFR纳米抗体的定向固载，具体操作如下：将PHEMA-Ni2+芯片放置于QCM-D仪器中，通入PBS溶液直至建立稳定的基线，然后依次通入500μg/mL的抗EGFR纳米抗体和50mg/mL的BSA溶液。从图2可知，在PHEMA-Ni2+表面通入抗EGFR纳米抗体后，振动频率(Δf)急剧下降表明芯片上质量增加，经Voigt模型拟合得到纳米抗体在PHEMA-Ni2+表面上的固载量为350ng/cm2。纳米抗体的直径约为2.5nm，经计算单层纳米抗体的理论固载量为400ng/cm2。纳米抗体在PHEMA聚合物刷上形成了高密度的特异性结合。随后将5mg/mL的BSA溶液通入PHEME-aEGFR表面后，振动频率(Δf)的变化可忽略不计，表明PHEME-aEGFR表面具有出色的抗蛋白粘附特性。
实施例2
本实施例为定向固载纳米抗体表面释放的方法，具体为以下的步骤：
1.根据上述实施例1中PHEMA聚合物刷的制备及抗EGFR纳米抗体的定向固载步骤，制备抗EGFR纳米抗体定向固载的表面。
2.将固载有纳米抗体的硅片放置于24孔板内，每孔加入1mL 200mmol/L的咪唑溶液，将24孔板放置于摇床内，37℃，200r/min处理1h后PBS清洗三次。
抗EGFR纳米抗体的可逆释放过程用QCM-D进行了表征(图3)，用Q-Sence E4系统于25℃下以100μL/min的流速在线检测抗EGFR纳米抗体的可逆释放，具体操作如下：将PHEMA-Ni2+硅片放置于QCM-D仪器中，通入PBS溶液直至建立稳定的基线，然后依次通入500μg/mL的抗EGFR纳米抗体和200mmol/L的咪唑溶液，该过程重复进行7次。从图3a可知，用200mmol/L咪唑溶液处理PHEMA-aEGFR表面后，振动频率(Δf)增加表明芯片上的质量减少，经计算咪唑处理后释放了约80％的纳米抗体，表明Ni2+和纳米抗体的组氨酸标签之间的相互作用可以被咪唑竞争性的破坏。再次将纳米抗体溶液通入PHEMA-Ni2+硅片(图3b)，Δf降低表明纳米抗体又重新固载到了材料表面上，第二次的固载量较第一次固载略有减少(约为第一次固载量的84％)。再次通入咪唑溶液，释放了约81％的纳米抗体。如此循环七次纳米抗体仍能固载到材料表面上，但是固载量较第一次固载有所下降(约为第一次固载量的50％)，释放了本次固载量的95％以上。纳米抗体定向固载表面具有可逆性，经咪唑溶液处理，可以循环使用多次。
实施例3
本实施例为利用制备的定向固载纳米抗体涂层特异性捕获循环肿瘤细胞，以购买于中科院细胞库的人表皮癌细胞(A431细胞)为待捕获的循环肿瘤细胞模型，对本发明的捕获体系作进一步阐述，包括以下步骤：
1.根据上述实施例1中PHEMA聚合物刷的制备及抗EGFR纳米抗体的定向固载步骤，制备抗EGFR纳米抗体定向固载的表面。
2.准备待测的循环肿瘤细胞样品：
取A431细胞悬浮液100μL，用细胞计数仪计数并计算其浓度，吸取一定量的上述细胞悬浮液，用DMEM细胞培养基稀释至5×104个细胞/mL。
3.细胞捕获实验：
将PHEMA-aEGFR修饰的硅片放置于24孔细胞培养板中，加入1mL上述步骤(2)制备的细胞悬浮液，细胞培养箱中捕获30min。作为对照实验组1，对PHEMA聚合物刷修饰的硅片表面，对A431细胞也同样进行相同的捕获循环肿瘤细胞实验。
捕获结束后，将捕获有循环肿瘤细胞的纳米抗体定向固载表面用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗3次。加入4％的多聚甲醛溶液(PBS配制)固定细胞30min，PBS清洗3次后加入10μg/mL的DAPI溶液对捕获的癌细胞进行染色。PBS溶液清洗3次后，在倒置荧光显微镜下观察捕获的癌细胞并拍照记录，用Image Pro软件对捕获的细胞进行计数，计算捕获率。对照实验组也按照上述步骤进行，并计算捕获率。同时对捕获后的细胞进行免疫荧光染色：将捕获后的细胞依次用4％多聚甲醛溶液固定30min，0.2％的Triton X-100溶液透化5min，1％的BSA溶液封闭1h。然后分别用200nM罗丹明标记的鬼笔环肽溶液(PBS配制)和10μg/mL的DAPI溶液(PBS配制)染色30min，PBS清洗3次后，用激光共聚焦显微镜观察并拍照记录捕获的癌细胞。其中，细胞核被染成蓝色(DAPI)，细胞骨架被染成红色(罗丹明标记的鬼笔环肽)。
捕获率的计算方法如下：
捕获率＝n/N×100％ (式1)
n：基底捕获的癌细胞的数量；
N：投入的癌细胞的总数量(本实施例中为“5×104个细胞/mL”)
上述实验结果表明，A431细胞在纳米抗体定向固载表面分布了大量的丝状伪足且伸展状态良好(图4a)，体现了A431细胞与纳米抗体定向固载表面的强相互租用。而在PHEMA表面A431细胞呈球形且几乎没有丝状伪足，表明癌细胞与PHEMA表面的相互作用很弱，不利于癌细胞在PHEMA表面上的粘附。纳米抗体定向固载表面对A431细胞的捕获率达80％以上(图4b)，而对照实验组1中，PHEMA表面对A431细胞的捕获率仅为1％不到，表明该纳米抗体定向固载表面可以实现循环肿瘤细胞的高效捕获。
实施例4
本实施例为优化定向固载纳米抗体涂层特异性捕获循环肿瘤细胞的时间，以购买于中科院细胞库的人表皮癌细胞(A431细胞)为待捕获的循环肿瘤细胞模型，对本发明的捕获体系作进一步阐述，包括以下步骤：
1.根据上述实施例1中PHEMA聚合物刷的制备及抗EGFR纳米抗体的定向固载步骤，制备抗EGFR纳米抗体定向固载的表面。
2.根据上述实施例3中准备待测的循环肿瘤细胞样品的步骤，准备待测循环肿瘤细胞样品。
3.细胞捕获实验：
将PHEMA-aEGFR修饰的硅片放置于24孔细胞培养板中，加入1mL上述步骤(2)制备的细胞悬浮液，细胞培养箱中捕获10-240min。
捕获结束后，将捕获有循环肿瘤细胞的纳米抗体定向固载表面用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗3次。加入4％的多聚甲醛溶液(PBS配制)固定细胞30min，PBS清洗3次后加入10μg/mL的DAPI溶液对捕获的癌细胞进行染色。PBS溶液清洗3次后，在倒置荧光显微镜下观察捕获的癌细胞并拍照记录，用Image Pro软件对捕获的细胞进行计数，计算捕获率。捕获率的计算方法同实施例3。
上述实验结果表明，PHEMA-aEGFR表面对A431细胞的捕获率随着时间的增长而增加，30min时达到最大捕获率约为81％±6％(图5)，继续增加捕获时间并不能明显提高A431细胞的捕获率。这可能是由于纳米抗体的位点特异性固载所实现的高密度和大量暴露活性位点的协同作用。
实施例5
本实施例为检测定向固载纳米抗体涂层特异性捕获循环肿瘤细胞的活性，以购买于中科院细胞库的人表皮癌细胞(A431细胞)为待捕获的循环肿瘤细胞模型，对本发明的捕获体系作进一步阐述，包括以下步骤：
1.根据上述实施例1中PHEMA聚合物刷的制备及抗EGFR纳米抗体的定向固载步骤，制备抗EGFR纳米抗体定向固载的表面。
2.根据上述实施例3中准备待测的循环肿瘤细胞样品的步骤，准备待测循环肿瘤细胞样品。
3.细胞捕获实验：
将PHEMA-aEGFR修饰的硅片放置于24孔细胞培养板中，加入1mL上述步骤(2)制备的细胞悬浮液，细胞培养箱中捕获30min。
捕获结束后，将捕获有循环肿瘤细胞的纳米抗体定向固载表面用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗3次。加入1mL PBS配制的FDA(1μg/mL,活细胞为绿色)和PI(1μg/mL,死细胞为红色)的混合溶液染色5min，PBS清洗3次后在倒置荧光显微镜下观察并计数。根据以下公式计算细胞活力：
细胞活力＝n/(n+m)×100％ (式2)
N：捕获的活细胞的数量；
m：捕获的死细胞的数量
上述实验结果表明，在TCPS板中直接培养的A431细胞的存活率接近100％，而纳米抗体定向固载表面A431细胞的存活率高于90％，表明纳米抗体定向固载表面具有较好的细胞相容性(图6)。
实施例6
本实施例为利用制备用于细胞特异性捕获的定向固载纳米抗体涂层特异性捕获向外周血单核细胞中加入的购买于中科院细胞库的人表皮癌细胞(A431细胞)为待捕获的循环肿瘤细胞模型，对本发明的捕获体系作进一步阐述，包括以下步骤：
1.根据上述实施例1中PHEMA聚合物刷的制备及抗EGFR纳米抗体的定向固载步骤，制备抗EGFR纳米抗体定向固载的表面。
2.准备待测的循环肿瘤细胞样品：
取5mL新鲜抗凝血，向血液中加入外周血单核细胞分离液(北京索莱宝生物科技)，采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞，得到的外周血单核细胞悬浮液密度为1×106个细胞/mL。取事先用1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚菁高氯酸盐(Dil)预染的A431细胞悬浮液100μL，用细胞计数仪技术并计算其浓度，向外周血单核细胞悬浮液中加入1～50个细胞/mL的A431细胞，混合均匀得到细胞混合溶液。
3.捕获实验：
将步骤1中得到的PHEMA-aEGFR修饰的硅片放置于24孔细胞培养板中，加入1mL上述步骤(2)制备的细胞混合液，细胞培养箱中捕获30min。
捕获结束后，将捕获有循环肿瘤细胞的纳米抗体定向固载表面用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗3次。加入4％的多聚甲醛溶液(PBS配制)固定细胞30min，PBS清洗3次后加入10μg/mL的DAPI溶液对捕获的癌细胞进行染色。PBS溶液清洗3次后，在倒置荧光显微镜下观察捕获的癌细胞并拍照记录，用Image Pro软件对捕获的细胞进行计数，计算捕获率，捕获率的计算方法同实施例3。
上述实验结果表明，纳米抗体定向固载表面对外周血样本中A431细胞的平均捕获率为76％±7％(图7)，在不同投放量的A431细胞的情况下，均可在外周血样本中实现高效捕获。
实施例7
本实施例为利用制备的可逆定向固载纳米抗体涂层高效释放循环肿瘤细胞，以购买于中科院细胞库的人表皮癌细胞(A431细胞)为释放的循环肿瘤细胞模型，对本发明的释放体系作进一步阐述，包括以下步骤：
1.根据上述实施例1中PHEMA聚合物刷的制备及抗EGFR纳米抗体的定向固载步骤，制备抗EGFR纳米抗体定向固载的表面。
2.准备待测的循环肿瘤细胞样品：
取A431细胞悬浮液100μL，用细胞计数仪技术并计算其浓度，吸取一定量的上述细胞悬浮液，用DMEM细胞培养基稀释至5×104个细胞/mL。
3.细胞捕获实验：
将PHEMA-aEGFR修饰的硅片放置于24孔细胞培养板中，加入1mL上述步骤(2)制备的细胞悬浮液，细胞培养箱中捕获30min。
4.细胞释放实验：
将不同浓度的咪唑溶液(0、50、100、150、200mmolL-1)与上述步骤3中捕获的A431细胞于37℃，200r/min的摇床中反应1h(图6)，PBS清洗3次后，硅片上剩余的细胞用10μg/mL的DAPI溶液(PBS配制)染色30min。PBS溶液清洗3次，在倒置荧光显微镜下观察并计数剩余的细胞。根据以下公式计算细胞的释放率：
释放率＝(n-m)/n×100％ (式3)
n：捕获的癌细胞数；
m：剩余的癌细胞数。
上述实验结果表明，A431细胞的释放率呈剂量依赖性，随咪唑浓度的升高而增加，当咪唑浓度为200mmol/L时释放率可达86％±4％(图8)，通过咪唑竞争性结合Ni2+，可以轻松的释放由免疫亲和分离法捕获的A431细胞。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 大连理工大学
<120> 纳米抗体在细胞特异性捕获和细胞释放中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Glu Phe Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln
1 5 10 15
Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser
20 25 30
Arg Ser Tyr Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
35 40 45
Glu Phe Val Ser Gly Ile Ser Trp Arg Gly Asp Ser Thr Gly Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
65 70 75 80
Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Ser Ala Trp Tyr Gly Thr Leu Tyr
100 105 110
Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Pro
115 120 125
Arg Leu Cys Thr Pro Ser Arg Pro Arg His His His His His His
130 135 140
Claims (9)
1.纳米抗体在细胞特异性捕获和后续的细胞释放中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米抗体为特异性结合肿瘤标志物的纳米抗体。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞为循环肿瘤细胞或干细胞。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用于细胞特异性捕获时，将纳米抗体定向固载；用于细胞释放时，利用咪唑、乙二胺四乙酸释放定向固载的纳米抗体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述纳米抗体定向固载的方法包括以下步骤：
(1)在基底材料表面制备亲水聚合物；
(2)亲水聚合物上连接螯合配体；螯合金属离子；
(3)定向固载带有组氨酸标签的纳米抗体。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中亲水聚合物为聚甲基丙烯酸羟乙酯、多糖、多聚甘油、聚乙二醇或两性离子聚合物；所述亲水聚合物的厚度为1-500nm。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)螯合配体为氨基三乙酸(NTA)或亚氨基二乙酸(IDA)；所述金属离子为Cu2+、Ni2+、Zn2+。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述纳米抗体的组氨酸标签为4-8个组氨酸。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述咪唑溶液浓度为0.1-200mmol/L。
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