CN107523544B - 一种肿瘤细胞球的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种肿瘤细胞球的制备方法和应用。所述制备方法按照如下步骤进行：首先将肿瘤细胞悬液逐滴滴入细胞培养板中，再将PBS溶液滴到板盖相应位置，倒扣培养板于板盖之上培养，即可得到成球的肿瘤细胞；其次，弃PBS，将培养板置于冰上，逐孔加入Matrigel，培养，用以形成Matrigel包被的肿瘤细胞球。所述肿瘤细胞球可以用于判断肿瘤细胞迁移和侵袭能力以及用于筛选肿瘤细胞迁移和侵袭相关小分子药物。所述肿瘤细胞球用于肿瘤细胞迁移和侵袭的实验，操作简单、速度快、效率高并且成本低廉，只要能进行细胞操作的实验室或公司均可使用。

Description

一种肿瘤细胞球的制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种肿瘤细胞球的制备方法和其在肿瘤细胞迁移和侵袭实验中的应用。

背景技术

肿瘤的侵袭和转移(invasion&metastasis)是多种肿瘤的中晚期重要特征，也是临床上导致大部分病人死亡的主要原因。肿瘤侵袭和转移的实质其实是肿瘤细胞的迁移和侵袭。目前，国际国内都已经开展了大量针对抑制肿瘤细胞迁移和侵袭能力的科学研究，发现了很多与迁移和侵袭相关的基因，如KAI-1、nm23、KISS-1和BrMS1等，为治疗肿瘤提供了潜在的靶点。

在诸多抗肿瘤制剂，如重组细胞因子/抗体、过继细胞疗法和治疗性疫苗以及小分子药物中，小分子化合物有着其独特的优势：(1)能够穿过细胞膜，影响细胞内靶点的表达和功能；(2)经化学修饰后具有良好的口服生物利用度；(3)对生产/合成工艺、运输条件的要求较抗体等生物制剂宽松，因此售价也较为低廉；(4)在剂型和给药方式上的研究更为成熟。截止2016年7月，美国FDA一共批准了43个抗肿瘤小分子靶向药物，大部分都具有较好的疗效。因此，研究针对小分子化合物影响肿瘤致死主因的侵袭和转移具有重要的现实意义和潜在价值。

而小分子化合物，种类繁多，浩如烟海。目前，针对小分子药物的筛选主要是基于高通量芯片、质谱、虚拟计算等，需要专业的精密仪器，门槛高、耗费昂贵。

发明CN103627635B公开了一种用于细胞迁移和侵袭实验的多功能微流控芯片，包括第一PDMS薄膜层、第二PDMS薄膜层和玻璃底层，第一PDMS薄膜层、第二PDMS薄膜层和玻璃底层依次不可逆键合成一整体结构，第一PDMS薄膜层上设有第一微阀和第二微阀；第二PDMS薄膜层上开设有第一细胞培养通道、第二细胞培养通道和第三细胞培养通道；第一微阀位于第一细胞培养通道与第二细胞培养通道连接处上部，第二微阀位于第二细胞培养通道与第三细胞培养通道连接处上部。该发明提供的多功能微流控芯片具有操作灵活、多功能的优点，但同时时间长，成本较高，制备复杂。

发明CN103911344B公开了一种细胞侵袭趋化模型及其制备方法，包括以下步骤：(1)细胞培养；(2)下层基质胶配置；(3)maker1配置；(4)中间细胞层配置；(5)maker2配置；(6)上层基质胶配置。该发明所制备细胞侵袭趋化模型能够在克服重力的基础上直观得出细胞趋化和迁移的有力证据而且可以进行HE染色。但是该制备方法仍然较为复杂。

目前，体外有几种常用的研究细胞迁移和侵袭的模型，例如划痕实验和transwell小室的跨膜检测等被广泛的用来研究细胞迁移和侵袭。细胞划痕法是研究细胞迁移的常规方法，是当细胞在培养介质上汇合形成一单层时，用移液枪头等在细胞上划出一道伤痕，然后观察细胞迁移情况。但是这种方法会造成细胞机械性的损伤，且精确性与每次照相的位置密切相关。Transwell小室的跨膜检测方法用来研究细胞侵袭的常规方法，是将基质胶等涂与上层小室，然后将细胞加入小室中然后计算侵袭的细胞数。这种方法在去除细胞的过程容易造成误差，且Transwell小室价格普遍较高。

因此有必要开发一种快速、低成本，在普通实验室或中小企业也可以进行的检测肿瘤细胞迁移和侵袭的方法。本发明方法使用肿瘤细胞球检测肿瘤细胞的迁移和侵袭，所述肿瘤细胞球制备简单，成本较低，且5天内即可取得结果，可用于筛选肿瘤细胞迁移和侵袭相关小分子药物。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种肿瘤细胞球的制备方法，该制备方法简单、迅速。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述制备方法按照如下步骤进行：

①将消化后的肿瘤细胞重悬于培养基中，再将其加入细胞培养板中；再将PBS溶液逐滴滴到板盖相应位置，每孔一滴；然后倒扣培养板于板盖之上，培养，即可得到成球的肿瘤细胞。

②弃去培养板盖上的PBS，将培养板正置并放在冰上，逐孔加入Matrigel，培养，用以形成Matrigel包被的肿瘤细胞球。

作为优选的方案，所述培养基为DMEM培养基，并添加有10％胎牛血清、青霉素100U/ml和链霉素100U/ml。

作为优选的方案，所述肿瘤细胞为MHCC97H和U87。

作为优选的方案，所述培养板盖上每孔的PBS量为50μl。

作为优选的方案，所述肿瘤细胞个数为100个，细胞培养板为48孔板。

作为优选的方案，步骤①所述培养时间为48小时。

作为优选的方案，所述Matrigel添加量为5μl/孔。

作为优选的方案，加入Matrigel后37℃培养时间为30分钟。

本发明的目的之二在于提供一种Matrigel包被成球的肿瘤细胞的方法，该方法可迅速得到Matrigel包被的肿瘤细胞球，操作简单。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

包括以下步骤：

①将具有成球的肿瘤细胞的培养板正置并放在冰上，逐孔加入Matrigel；

②培养，Matrigel包被成球的肿瘤细胞得到Matrigel包被的肿瘤细胞球。

作为优选的方案，所述Matrigel添加量为5μl/孔。

作为优选的方案，加入Matrigel后培养时间为30分钟。

本发明的目的之三在于提供一种肿瘤细胞球。该肿瘤细胞球可用于检测肿瘤细胞的迁移和侵袭。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述肿瘤细胞球由目的一或目的二提供的方法制备得到。

本发明的目的之四在于提供一种肿瘤细胞球在用于判断肿瘤细胞迁移和侵袭能力的用途，肿瘤细胞球用于该用途时无需特殊处理，方法简单，且结果直观。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

肿瘤细胞球在判断肿瘤细胞迁移侵袭能力发挥作用，所述肿瘤细胞球在培养基中培养后观察。

本发明的目的之五在于提供一种肿瘤细胞球用于判断肿瘤细胞迁移和侵袭能力的方法，其用于判断肿瘤细胞的迁移和侵袭操作简单、快速，且结果直观。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述方法包括以下步骤：

①每次实验设置三个复孔，每孔加入培养基，立即在显微镜下观察拍照，拍得照片组1；

②培养48h，显微镜下观察并选择与步骤①相同的视野拍照，拍得照片组2；

③根据步骤①和②的照片，画出每张照片中肿瘤细胞球和肿瘤细胞的存在区域，计算其面积；

④在上述③的照片中，将培养48h的肿瘤细胞的面积计算平均值，标为Q48h；将培养0h的面积平均值标记为Q0h,Q＝Q48h/Q0h；

⑤若Q>2，表明肿瘤细胞具有迁移和侵袭能力；若Q<1，表明肿瘤细胞无迁移和侵袭能力。

作为优选的方案，所述肿瘤细胞为MHCC97H和U87。

作为优选的方案，所述培养基为DMEM培养基，并添加有10％胎牛血清、青霉素100U/ml和链霉素100U/ml。

作为优选的方案，步骤②所述培养时间为48小时。

本发明的目的之六在于提供一种肿瘤细胞球在用于筛选细胞迁移和侵袭相关小分子药物的用途。其用于筛选小分子药物操作简单，过程迅速，且成本较低。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

肿瘤细胞球在具有小分子药物的培养基中培养，可用于筛选与肿瘤细胞迁移和侵袭相关的小分子药物。

本发明的目的之七在于提供一种肿瘤细胞球用于筛选肿瘤细胞迁移和侵袭相关小分子药物的方法，该方法操作简单，成本较低，并且结果直观。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述方法包括以下步骤：

①加入培养基，分为实验组和对照组，同样每组设置3个复孔，显微镜下观察并拍照，拍得照片组1；

②向实验组培养基中加入待筛选小分子药物，对照组中只加入小分子药物的溶剂。培养，显微镜下观察并选择与步骤①相同的视野拍照，拍得照片组2；

③根据照片组1组2，画出每张照片中肿瘤细胞球和肿瘤细胞的存在区域，计算其面积。

④将组1中实验组的面积平均值标为S1，组2中实验组面积平均值标为S2，组1中对照组面积平均值标为D1，组2中对照组面积平均值标为D2，S＝S2/S1，D＝D2/D1；

⑤差异显著性分析，若D显著高于S，P<0.05，表明小分子药物具有抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的效果；若D与S无显著性差异，P>0.05，表明小分子药物对肿瘤细胞的迁移和侵袭无影响；若D显著低于S，P<0.05，表明小分子药物增强了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。

作为优选的方案，所述培养基为DMEM培养基，并添加有10％胎牛血清、青霉素100U/ml和链霉素100U/ml。

作为优选的方案，所述肿瘤细胞为MHCC97H和U87。

作为优选的方案，步骤②所述培养时间为48小时。

作为优选的方案，所述小分子药物在培养基中的浓度为0.01-100μM。

本发明的有益效果在于：本发明提供的一种肿瘤细胞球以及该肿瘤细胞球在用于肿瘤细胞迁移和侵袭实验的用途，使用所述肿瘤细胞球检测肿瘤细胞的迁移和侵袭，操作简单、速度快、效率高并且成本低廉。本发明所述成球培养为普通DMEM悬滴培养，较其它方法如无血清低黏附培养板等简便、成本低；在48孔板中直接培养，每孔一球，省去其它方法中成球再分配不均等问题；本发明所述Matrigel包被的肿瘤细胞球，能快捷、直观的在显微镜下观察到肿瘤细胞迁移和侵袭情况，无需其它检测试剂和复杂的计算方式等。肿瘤细胞球对肿瘤细胞迁移和侵袭能力的检测还可以用于筛选肿瘤细胞迁移和侵袭相关小分子药物。本发明提供的实验方法不仅适用于利用高侵袭性细胞株筛选抑制迁移和侵袭相关小分子药物，也适用于利用低侵袭性细胞株筛选增强迁移和侵袭能力的小分子药物。利用本发明，5天内即可取得小分子化合物作用结果，较为快捷。综上所述，本发明提供的筛选方法，简单、快速而且成本低，为普通实验室和中小公司前期研发抗肿瘤相关小分子药物提供了的一条可行途径。

附图说明

图1为肿瘤细胞球悬滴培养和Matrigel包被培养图(A：48孔板盖上加注PBS；B：倒置培养的肿瘤细胞球；C、D：Matrigel包被的肿瘤细胞球)。

图2为肿瘤细胞球在Matrigel中迁移和侵袭的显微镜观察结果及侵袭迁移能力确认。

图3为不同浓度的小分子药物M16处理MHCC97H细胞的显微镜观察结果和数据处理。

图4为不同浓度的小分子药物M23处理MHCC97H细胞的显微镜观察结果和数据处理。

图5为不同浓度的小分子药物M23处理U87细胞的显微镜观察结果和数据处理。

图6为Transwell实验验证小分子药物M16和M23抑制肿瘤细胞MHCC97H迁移和侵袭的作用(A：25μM的M16和M23处理后，迁移和侵袭至下室的肿瘤细胞染色图；B：25μM的M16和M23处理后，迁移和侵袭至下室的肿瘤细胞个数统计)。

具体实施方式

以下将(参照附图)对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本发明实施例中，DMEM培养基(Gibco)，10％胎牛血清(Gibco，10099-133)。

48孔板购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

Matrigel(Corning，356230)购自Corning，USA。

PBS购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

所述肿瘤细胞为肝癌细胞株MHCC97H和胶质瘤细胞U87。MHCC97H细胞株来自中国科学院细胞库，上海，中国；U87细胞株来自ATCC，VA，USA。

实施例1

1.MHCC97H和U87悬滴成球

将消化后的肝癌细胞MHCC97H和胶质瘤细胞U87重悬于DMEM培养基中，浓度调整为5x 10³个/ml，吸取20μl滴入48孔细胞培养板中，每孔一滴；再将PBS溶液逐滴(每滴50μl)滴到板盖相应空位正中，每孔一滴；然后倒扣培养板于板盖之上，如图1所示。37℃，5％CO₂培养48小时，得到成球的肿瘤细胞，用于下一步实验。

2.MHCC97H和U87细胞球的Matrigel包被

弃去上述培养板盖上的PBS，将培养板正置并放在冰上，逐孔加入预先在冰上融化的Matrigel，每孔加入5μl。加入时动作要轻柔，以免破坏细胞球。然后在37℃培养30分钟，使Matrigel包被MHCC97H和U87细胞球。

3.培养观察

分别在MHCC97H和U87培养板中，每孔加入100μl DMEM培养基，在培养12小时、24小时和48小时后用显微镜观察。计算得出，Q(MHCC97H)＝6.82±0.55，Q(U87)＝61.45±7.02，两种细胞的Q值均大于2，表明二者均具备侵袭迁移能力。结果如图2所示。

实施例2

1.MHCC97H悬滴成球

同实施例1。

2.MHCC97H细胞球的Matrigel包被

同实施例1。

3.加入小分子药物M16

在MHCC97H培养板中，每孔加入100μl DMEM培养基和浓度分别为25μM和50μM的小分子药物M16，培养48小时。显微镜下观察，结果如图3所示。D值与S值相差不大，表明M16不影响MHCC97H细胞的侵袭迁移。

实施例3

1.MHCC97H悬滴成球

同实施例1。

2.MHCC97H细胞球的Matrigel包被

同实施例1。

3.加入小分子药物M23

在MHCC97H培养板中，每孔加入100μl DMEM培养基和浓度分别为25μM和50μM的小分子药物M23，培养48小时。显微镜下观察，结果如图4所示。D值显著高于S值，表明M23可以抑制MHCC97H细胞的侵袭迁移。

实施例4

1.U87悬滴成球

同实施例1。

2.U87细胞球的Matrigel包被

同实施例1。

3.加入小分子药物M23

在U87培养板中，每孔加入100μl DMEM培养基和浓度分别为25μM和50μM的小分子药物M23，培养48小时。显微镜下观察，结果如图5所示。D值显著高于S值，表明M23可以抑制U87细胞的侵袭迁移。

对比实施例1

使用Transwell小室检测迁移和侵袭。

1.Transwell小室制备

①包被基底膜：

用50mg/L Matrigel 1:4稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。

②水化基底膜：

吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/L BSA的无血清培养液，37℃，30min。

2.制备细胞悬液

将消化后的肝癌细胞MHCC97H重悬于DMEM无血清培养基中，浓度调整为1x 10⁵个/ml。

3.接种细胞

①弃去小室内液体，取细胞悬液200μl加入Transwell小室，加入对照试剂DMSO(其加入量与加入的溶解小分子机制剂的量相当)；

②24孔板下室加入500μl含10％FBS的DMEM培养基。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板；

③培养细胞48h。

4.结果统计

①取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定20分钟，将小室适当风干；

②0.1％结晶紫染色5min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍；

③显微镜下，随机五个视野观察细胞，记数。

对比实施例2

与对比实施例1实验方法相同，加入的小分子药物为M16，浓度为25μM。

对比实施例3

与对比实施例1实验方法相同，加入的小分子药物为M23，浓度为25μM。

对比实施例1、对比实施例2和对比实施例3结果见图6。

实施例1结果中观察到随着时间的推移，MHCC97H和U87细胞的迁移和侵袭过程也在推进。实施例2和3分别向MHCC97H中加入了M16和M23，结果发现M16对MHCC97H细胞的迁移和侵袭无显著性抑制效果(P>0.05)，而M23对MHCC97H细胞迁移和侵袭的抑制效果明显(P<0.01)，浓度25μM时即可实现抑制其迁移和侵袭。实施例4则向U87中加入了M23，结果表明M23对U87细胞迁移和侵袭的抑制效果也具有显著性(P<0.05)。

通过比较实施例2、3与对比实施例2、3的结果可以发现，虽然实施例与对比实施例采用实验方法不同，但是观察到的实验结果是一致的。因而本发明所述肿瘤细胞球用于判断肿瘤细胞的迁移和侵袭能力是可行的。而实施例较对比实施例操作更加简单、迅速，成本更低，且更为直观，有利于提高筛选小分子药物的效率、降低筛选小分子药物的成本，为普通实验室和小公司前期研发抗肿瘤相关小分子药物提供了的一条可行途径。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.一种肿瘤细胞球的制备方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为MHCC97H和U87，所述方法包括以下步骤：

①将消化后的肿瘤细胞重悬于培养基中，再将其加入细胞培养板中；将PBS溶液逐滴滴到板盖相应位置，每孔一滴；然后倒扣培养板于板盖之上，培养，即可得到成球的肿瘤细胞；

②弃去培养板盖上的PBS，将培养板正置并放在冰上，逐孔加入Matrigel，培养，用以形成Matrigel包被的肿瘤细胞球；

所述肿瘤细胞MHCC97H的Q值为6.82±0.55，肿瘤细胞U87的Q值为61.45±7.02；步骤①加入细胞培养板中的肿瘤细胞的数量为100个；所述肿瘤细胞与Matrigel的体积比为4:1；将培养48h的肿瘤细胞的面积计算平均值，标为Q48h；将培养0h的面积平均值标记为Q0h，所述Q＝Q48h/Q0h。

2.由权利要求1所述的方法制备的肿瘤细胞球。

3.权利要求2所述的肿瘤细胞球在用于筛选细胞迁移和侵袭相关小分子药物的用途。

4.权利要求2所述的肿瘤细胞球用于筛选肿瘤细胞迁移和侵袭相关小分子药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

①每孔加入培养基，分为实验组和对照组，同样每组也设置三个复孔；显微镜下观察并拍照，拍得照片组1；

②向实验组培养基中加入待筛选小分子药物，对照组中只加入小分子药物的溶剂；培养，显微镜下观察并选择与步骤①相同的视野拍照，拍得照片组2；

③根据照片组1组2，画出每张照片中肿瘤细胞球和肿瘤细胞的存在区域，计算其面积；

④将组1中实验组的面积平均值标为S1，组2中实验组面积平均值标为S2，组1中对照组面积平均值标为D1，组2中对照组面积平均值标为D2，S＝S2/S1，D＝D2/D1；

⑤差异显著性分析，若D显著高于S，P<0.05，表明小分子药物具有抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的效果；若D与S无显著性差异，P>0.05，表明小分子药物对肿瘤细胞的迁移和侵袭无影响；若D显著低于S，P<0.05，表明小分子药物增强了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述小分子药物在培养基中的浓度为0.01-100μM。

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