CN111116550A - 一种光感应型活细胞核糖核酸荧光探针 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及探针领域,尤其涉及一种光感应型核糖核酸荧光探针及应用。
背景技术
核糖核酸在蛋白质合成过程中起着重要作用,其中核糖体核糖核酸是细胞合成蛋白质的主要场所,信使核糖核酸是合成蛋白质的模板,转移核糖核酸功能是携带和转移活化氨基酸。光辐照对活细胞等生物样品有重要影响,例如某些光响应型细胞中光敏蛋白的表达对其光感应性起着关键作用,开发光响应型核糖核酸探针对于研究光感应细胞生命活动与蛋白表达、对生物样品的光辐照监测具有重要意义。
目前已报道的核糖核酸探针不具有光响应性质,而且大多发绿色荧光。而长波长红色荧光具有更好的细胞和组织穿透性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种光感应型核糖核酸荧光探针及其制备方法和应用,旨在解决现有技术中的核糖核酸荧光探针不具备光响应性质且发光颜色单一的问题。
为实现上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
一种光感应型核糖核酸荧光探针,所述光感应型核糖核酸荧光探针的结构如下式I所示:
其中,所述R1选自氢、烷基、烷氧基、醚基的任意一种;所述R2选自氢、烷基、烷氧基、醚基的任意一种;所述R3选自氢、烷基、烷氧基、醚基的任意一种;所述X选自卤元素。
以及,一种光感应型核糖核酸荧光探针的应用,所述光感应型核糖核酸荧光探针在鉴别活细胞是否经过光辐照中的应用,和在成像经过光辐照后活细胞中核糖核酸分布的应用。
本发明提供的吲哚喹啉盐类荧光探针是一类新型的细胞中核糖核酸专一性识别荧光探针分子,与其功能相近的光感应型核糖核酸荧光探针比,本发明所述探针的独特之处在于具有良好的感光性,在光辐照后与细胞中的核糖核酸特异性结合,而且与核糖核酸结合后发射与商业核糖核酸探针RNA-select绿色荧光不同的红色荧光;同时光稳定性较强、膜通透性好、复染兼容性好。
本发明所提供的光感应型核糖核酸荧光探针,可作为荧光探针进行标记光辐照后的活细胞中核糖核酸的分布和相关生命活动的应用,能够为光辐照导致的细胞核仁和核糖核酸相关的生理和病理学研究提供简捷、直观的生物检测试剂,也可开发应用于避光活生物样本的光辐照监控,应用广泛,作用效果较佳。
附图说明
图1是(E)-4-(2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-)乙烯基)-1-甲基喹啉碘盐对HeLa活细胞染色后光辐照前和辐照后在488nm激光激发下的共聚焦荧光显微照片,图1A、图1B、图1C为黑暗中孵化(未经过光辐照)的显微图片,图1D、图1E、图1F为汞灯辐照5min后的显微图片。左图(AD)为荧光显微照片;中图(BE)为明场微分干涉显微照片;右图(CF)为左中两图的合并图(共定位图)。
图2是(E)-4-(2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-)乙烯基)-1-甲基喹啉碘盐对HeLa活细胞在黑暗中进行染色不同时间(10-120min)后的荧光显微照片,图2A为染色10min的荧光显微照片;图2B为染色30min的荧光显微照片;图2C为染色60min的荧光显微照片;图2D为染色120min的荧光显微照片。
图3是(E)-4-(2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-)乙烯基)-1-甲基喹啉碘盐对HeLa活细胞在黑暗中进行染色后用汞灯绿光510-560nm辐照不同时间后的荧光显微照片,图3A为汞灯绿光510-560nm辐照10s的荧光显微照片;图3B为汞灯绿光510-560nm辐照1min的荧光显微照片;图3C为汞灯绿光510-560nm辐照2min的荧光显微照片;图3D为汞灯绿光510-560nm辐照3min的荧光显微照片;图3E为汞灯绿光510-560nm辐照4min的荧光显微照片;图3F为汞灯绿光510-560nm辐照5min的荧光显微照片。
图4是对用多聚甲醛溶液固定的HeLa细胞分别经脱氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶(RNase)处理后,用(E)-4-(2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-)乙烯基)-1-甲基喹啉碘盐对HeLa细胞进行染色,在510-560nm汞灯激发下得到的荧光显微照片,图4A为对照组(未经处理组)的细胞的荧光显微照片,图4B为经DNase处理后的细胞的荧光显微照片,图4C为经RNase处理后的细胞的荧光显微照片。
图5是(E)-4-(2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-)乙烯基)-1-甲基喹啉碘盐与核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)作用前后的吸收谱和荧光谱,图5A为探针分子本身和与核糖核酸、脱氧核糖核酸分别混合后的紫外可见吸收光谱;图5B为探针本身和与核糖核酸、脱氧核糖核酸分别混合后的荧光发射光谱。
图6是(E)-4-(2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-)乙烯基)-1-甲基喹啉碘盐与细胞核探针Hoechst33342对HeLa细胞进行共染色后在汞灯辐照下得到的荧光显微照片,图6A为所述探针的红色荧光显微照片;图6B为Hoechst33342的蓝色荧光显微照片;图6C为图6A和图6B的叠加图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中,需要理解的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中,“多个”的含义是两个或两个以上,除非另有明确具体的限定。
本发明实例提供一种光感应型核糖核酸荧光探针,所述光感应型核糖核酸荧光探针的结构如下式I所示:
其中,所述R1选自氢、烷基、烷氧基、醚基的任意一种;所述R2选自氢、烷基、烷氧基、醚基的任意一种;所述R3选自氢、烷基、烷氧基、醚基的任意一种;所述X选自卤素原子。
本发明提供的吲哚喹啉盐类荧光探针是一类新型的细胞中核糖核酸专一性识别光感应型荧光探针分子,与其功能相近的核糖核酸荧光探针比,本发明所述探针的独特之处在于具有良好的感光性,在光辐照下探针从细胞质线粒体中释放出来,与细胞中的核糖核酸特异性结合,而且与核糖核酸结合后发射与商业核糖核酸探针RNA-select绿色荧光不同的红色荧光;同时光稳定性较强、膜通透性好、复染兼容性好。
上述结构式I中,优选的,所述R1选自氢、C1-C5的烷基、C1-C5的烷氧基、脂肪醚基的任意一种;所述R2选自氢、C1-C5的烷基、C1-C5的烷氧基、脂肪醚基的任意一种;所述R3选自氢、C1-C5的烷基、C1-C5的烷氧基、脂肪醚基的任意一种;所述X选自碘、溴、氯。
进一步优选的,所述R1中,所述C1-C5的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基;所述C1-C5的烷氧基包括羟甲基、羟乙基、羟丙基、羟丁基、羟戊基;所述脂肪醚基中,脂肪烃为C1-C5的脂肪烃。
进一步优选的,所述R2中,所述C1-C5的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基;所述C1-C5的烷氧基包括羟甲基、羟乙基、羟丙基、羟丁基、羟戊基;所述脂肪醚基中,脂肪烃为C1-C5的脂肪烃。
进一步优选的,所述R3中,所述C1-C5的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基;所述C1-C5的烷氧基包括羟甲基、羟乙基、羟丙基、羟丁基、羟戊基;所述脂肪醚基中,脂肪烃为C1-C5的脂肪烃。
优选的,所述R1选自氢;所述R2选自甲氧基;所述R3选自甲基;所述X选自碘。在本发明优选实施例中,当所述R1选自氢;所述R2选自甲氧基;所述R3选自甲基;所述X选自碘时,得到的所述光感应型核糖核酸荧光探针为(E)-4-(2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-)乙烯基)-1-甲基喹啉碘盐。
本发明所提供的光感应型核糖核酸荧光探针由以下光感应型核糖核酸荧光探针的制备方法制备得到。
所述光感应型核糖核酸荧光探针的制备方法如下:吲哚-3-甲醛盐与4-甲基喹啉盐按照摩尔比1:(1.0~2)混合溶解于甲醇/乙醇中,得淡黄色透明溶液,滴加少量哌啶,加热回流反应6-12h,产生深红色沉淀,冷却至室温,过滤真空干燥得到所述光感应型核糖核酸成像的荧光探针。
在本发明优选实施例中,所述吲哚-3-甲醛选自5-甲氧基-3-甲酰基吲哚;所述4-甲基喹啉盐选自N-甲基-4-甲基喹啉碘盐。以所述5-甲氧基-3-甲酰基吲哚、所述N-甲基-4-甲基喹啉碘盐作为反应物,所述光感应型核糖核酸荧光探针的制备方法如下:
配置5-甲氧基-2-甲酰基吲哚与N-甲基-4-甲基吡啶的乙醇溶液;
在所述乙醇混合溶液中加入催化剂哌啶,将所述加了哌啶的有机混合物进行85℃加热回流反应12小时,冷却至室温,得到红色有机沉淀物;
将所述红色有机沉淀物进行过滤、用少量二氯甲烷进行洗涤,干燥得到深红色的粉末,所述深红色粉末为所述光感应型核糖核酸荧光探针。所述光感应型核糖核酸荧光探针为(E)-4-(2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-)乙烯基)-1-甲基喹啉碘盐。
本发明所提供的光感应型核糖核酸荧光探针,可作为荧光探针进行标记光辐照后活细胞中核糖核酸的分布和相关生命活动的应用,能够为光辐射导致的细胞核仁和核糖核酸相关的生理和病理学研究提供简捷、直观的生物检测试剂,也可开发应用于避光活生物样本的光辐照监控,应用广泛,作用效果较佳。
下面以具体实施例进一步进行说明。
实施例1
(E)-4-(2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-)乙烯基)-1-甲基喹啉碘盐的合成
将5-甲氧基-2-甲酰基吲哚与N-甲基-4-甲基吡啶溶于乙醇,得淡黄色透明溶液,加4~5滴哌啶,溶液逐渐变红色。回流反应12h,有红色沉淀析出。冷却,过滤,少量二氯甲烷洗涤,得深红色粉末,产率41%。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):12.09(s,1H),9.10(d,J=4.0Hz,1H),8.97(d,J=8.0Hz,1H),8.61(d,J=16.0Hz,1H),8.46(d,J=4.0Hz,1H),8.42(s,1H)8.34(d,J=8.0Hz,1H),8.23(d,J=4.0Hz,1H),8.02(t,J=8.0Hz,2H),7.71(d,J=4.0Hz,1H),7.43(d,J=8.0Hz,1H),6.92(dd,J=4.0,1.7Hz,1H),4.44(s,3H),3.90(s,3H)。13C NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):155.71,154.06,146.87,139.31,138.81,135.01,132.45,128.92,127.25,126.62,125.82,119.48,114.98,113.79,112.96,112.79,102.70,56.08,44.30。
实施例2
HeLa细胞培养
将HeLa细胞贴壁培养于内含10%胎牛血清培养液中,在37℃,5%CO2的饱和湿度孵箱中培养,每2~3天传代1次。
待细胞生长到对数期,接片培养:将100mL细胞瓶中长满的细胞用PBS洗三遍,用1mL 0.25%胰酶消化1分钟,去除胰酶,加入新鲜培养基吹打均匀并细胞计数,以培养基的添加量控制细胞密度,使细胞终浓度为1x105,然后接种至内无菌盖玻片的培养皿中,放入5%CO2培养箱中培养,使细胞爬片生长。待细胞爬片生长并长满盖玻片后,用于实验。
实施例3
(E)-4-(2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-)乙烯基)-1-甲基喹啉碘盐对HeLa细胞的染色观察
将实施例2制备的分别长满HeLa细胞的爬片用PBS洗三遍,然后用以培养液稀释的浓度为10μM的(E)-4-(2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-)乙烯基)-1-甲基喹啉碘盐荧光探针溶液在CO2培养箱中,细胞分别避光染色10-120min,然后用汞灯分别辐照0-5min。包括以下三组试验:
试验一:
(1)将细胞避光染色30分钟,再用汞灯白光进行光辐照5分钟;
(2)将细胞避光染色30分钟,不进行光辐照。
试验二:
(1)将细胞避光染色10分钟。
(2)将细胞避光染色30分钟。
(3)将细胞避光染色60分钟。
(4)将细胞避光染色120分钟。
试验三:
(1)将细胞染色30分钟,再用汞灯510-560nm进行光辐照10秒。
(2)将细胞染色30分钟,再用汞灯510-560nm进行光辐照1分钟。
(3)将细胞染色30分钟,再用汞灯510-560nm进行光辐照2分钟。
(4)将细胞染色30分钟,再用汞灯510-560nm进行光辐照3分钟。
(5)将细胞染色30分钟,再用汞灯510-560nm进行光辐照4分钟。
(6)将细胞染色30分钟,再用汞灯510-560nm进行光辐照5分钟。
将染色后的爬片在荧光显微镜和激光扫描共聚焦镜下观察,记录细胞中着色部位,荧光分布及亮度变化等。
试验一结果见图1、试验二结果见图2、试验三结果见图3。图1、图2和图3荧光图像显示不经过光辐照的活细胞,细胞质区域有较弱的红色荧光,而经过光辐照之后,在细胞质和核仁区有强的红色荧光分布,明确提示本发明的探针对光感应敏感,能够在光辐照后的活细胞中专一性的成像细胞质和核仁。
图1为试验一染色后光辐照前和辐照后在488nm激光激发下的共聚焦荧光显微照片。图1A、图1B、图1C为黑暗中孵化(未经过光辐照)的显微图片,图1D、图1E、图1F为汞灯辐照5min后的显微图片。图1A、图1D为荧光显微照片;图1B、图1E为明场微分干涉显微照片;图1C、图1F为左中两图的合并图(共定位图)。不经过光辐照的活细胞,仅在细胞质区域有较弱的红色荧光,而经过光辐照之后,在细胞质和核仁区有强的红色荧光分布,
图2为试验二(E)-4-(2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-)乙烯基)-1-甲基喹啉碘盐对HeLa活细胞在黑暗中进行染色不同时间(10-120min)后的荧光显微照片。图2A为染色10min的荧光显微照片;图2B为染色30min的荧光显微照片;图2C为染色60min的荧光显微照片;图2D为染色120min的荧光显微照片。图片显示,黑暗中染色的活细胞,随着染色时间加长,仅仅在细胞质区域有较弱的红色荧光。
图3为试验三(E)-4-(2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-)乙烯基)-1-甲基喹啉碘盐对HeLa活细胞在黑暗中进行染色后用汞灯绿光510-560nm辐照不同时间后的荧光显微照片。图3A为汞灯绿光510-560nm辐照10s的荧光显微照片;图3B为汞灯绿光510-560nm辐照1min的荧光显微照片;图3C为汞灯绿光510-560nm辐照2min的荧光显微照片;图3D为汞灯绿光510-560nm辐照3min的荧光显微照片;图3E为汞灯绿光510-560nm辐照4min的荧光显微照片;图3F为汞灯绿光510-560nm辐照5min的荧光显微照片。图片显示,随着光辐照时间的增加,荧光逐渐增强,而且从仅仅在细胞质中转移到细胞质和核仁区都有强的红色荧光分布。
实施例4
(E)-4-(2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-)乙烯基)-1-甲基喹啉碘盐荧光探针对HeLa细胞、和经DNase和RNase处理后的HeLa细胞(DNase和RNase消化实验)的染色观察。
固定细胞制备:首先将实施例2制备的长满HeLa细胞的盖玻片(爬片)浸泡于4%多聚甲醛溶液30min,然后用0.5%Triton X-100室温通透2min,得待染色固定细胞。
取上述三组固定细胞,其中一组中加入2U/mL不含RNase的DNase,一组加入50μg/mL不含DNase的RNase在培养箱中消化2h;然后对三组固定细胞用PBS清洗3遍,并同时都用浓度为10μM的(E)-4-(2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-)乙烯基)-1-甲基喹啉碘盐荧光探针溶液在CO2培养箱中孵化染色30min。
将染色后的爬片在宽场荧光显微镜下观察,记录细胞中着色部位,荧光分布及亮度变化等。
结果如图4所示,图4A为对照组(未经处理组)的细胞的荧光显微照片,图4B为经DNase处理后的细胞的荧光显微照片,图4C为经RNase处理后的细胞的荧光显微照片。由图4中可发现,经DNase处理后的细胞组显微镜下的荧光(图4B)较对照组(未经处理组)(图4A)荧光类似,仍然集中在细胞质和核仁区域,在核区基本看不到荧光;经RNase处理后的细胞在显微镜下的荧光(图4C)较对照组(未经处理组)(图4A)荧光大大减弱,基本看不到荧光。由于DNase和RNase分别可以消化水解掉细胞中的脱氧核糖核酸和核糖核酸,因此,从此角度可证实并验证本发明的探针能够专一性成像细胞中的核糖核酸。
实施例5
(E)-4-(2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-)乙烯基)-1-甲基喹啉碘盐在溶液中对核糖核酸、脱氧核糖核酸的识别作用
将10μM探针与120μg/mL的核糖核酸/脱氧核糖核酸的PBS溶液分别混合均匀,作用5分钟,测定紫外可见吸收光谱和488nm激发下荧光光谱。结果见图5,图5A为探针分子本身和与核糖核酸、DNA分别混合后的紫外可见吸收光谱;图5B为探针本身和与核糖核酸、脱氧核糖核酸分别混合后的荧光发射光谱,可发现,与核糖核酸作用后的荧光发射峰在600nm附近,与探针本身相比,荧光强度增加了~40倍,而且明显强于与脱氧核糖核酸结合后的荧光。
实施例6
(E)-4-(2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-)乙烯基)-1-甲基喹啉碘盐与Hoechst33342对HeLa细胞的共染色观察
将实施例2制备的分别长满HeLa细胞爬片用PBS洗三遍,然后用以培养液稀释的浓度为10μM的(E)-4-(2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-)乙烯基)-1-甲基喹啉碘盐荧光探针溶液在CO2培养箱中,细胞染色30min。然后再用以PBS稀释的浓度为2μg/mL的Hoechst33342在CO2培养箱中染色30min。
将染色后的爬片洗去未结合的多余染液,汞灯白光下辐照5min后,在荧光显微镜下观察,记录细胞中着色部位,荧光分布及亮度变化等。
结果见图6,图6A为所述探针的红色荧光图;图6B为Hoechst33342的蓝色荧光图;图6C为图6A和图6B的叠加图,图6C可以明显的看出红色荧光和蓝色荧光互不影响,说明本发明所述荧光探针与Hoechst33342共染色时互不干扰,具有良好的复染兼容性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
2.根据权利要求1所述的光感应型核糖核酸荧光探针,其特征在于,所述R1选自氢、C1-C5的烷基、C1-C5的烷氧基、脂肪醚基的任意一种;所述R2选自氢、C1-C5的烷基、C1-C5的烷氧基、脂肪醚基的任意一种;所述R3选自氢、C1-C5的烷基、C1-C5的烷氧基、脂肪醚基的任意一种;所述X选自碘、溴、氯。
3.根据权利要求2所述的光感应型核糖核酸荧光探针,其特征在于,所述R1中,所述C1-C5的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基;所述C1-C5的烷氧基包括羟甲基、羟乙基、羟丙基、羟丁基、羟戊基;所述脂肪醚基中,脂肪烃为C1-C5的脂肪烃。
4.根据权利要求2所述的光感应型核糖核酸荧光探针,其特征在于,所述R2中,所述C1-C5的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基;所述C1-C5的烷氧基包括羟甲基、羟乙基、羟丙基、羟丁基、羟戊基;所述脂肪醚基中,脂肪烃为C1-C5的脂肪烃。
5.根据权利要求2所述的光感应型核糖核酸荧光探针,其特征在于,所述R3中,所述C1-C5的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基;所述C1-C5的烷氧基包括羟甲基、羟乙基、羟丙基、羟丁基、羟戊基;所述脂肪醚基中,脂肪烃为C1-C5的脂肪烃。
6.根据权利要求1~5任一所述的光感应型核糖核酸荧光探针,其特征在于,所述光感应型核糖核酸荧光探针包括(E)-4-(2-(5-甲氧基-1H-吲哚-3-)乙烯基)-1-甲基喹啉碘盐。
7.一种如权利要求1-6任一项所述光感应型核糖核酸荧光探针的应用,所述光感应型核糖核酸荧光探针作为荧光探针进行标记光辐照后活细胞中核糖核酸的分布和相关生命活动的应用。
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